Protocol
Etikk Uttalelse: Studien ble utført i henhold til internasjonale retningslinjer og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av National Chiayi University, godkjenning ID: 99022. Den cetacean prøven bruk ble tillatt ved Council of Agriculture Taiwan (Research Permit 100M-02.1-C-99).
1. Muskelprøvepreparering og SDS-PAGE
Merk: Muskelprøver fra 23 arter inkludert 16 arter av sjøpattedyr, 5 arter av landlevende pattedyr, ble tunfisk og kylling brukt i denne studien (tabell 1). De cetacean muskelprøver ble innhentet fra strandet enkeltpersoner, fiskeri bifangst og inndragning. Kanin, rotte, hund og kylling muskel vev ble hentet fra Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi University. Prøver av oksekjøtt, svinekjøtt, lam og tunfisk ble kjøpt fra et lokalt supermarked. Muskelen prøve av steinkobbe (Phoca vitulina
- Lagre alle prøvene ved -20 ° C inntil bruk.
- Pre-kule mørtel ved -20 ° C. Deretter satte 3 g frosne muskelprøven inn i den.
- Homogenisere prøven med 10 ml kald fosfatbufret saltoppløsning (PBS) ved anvendelse av en vevshomogenisator.
- Sentrifuger homogenisert prøve ved 10.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Samle supernatants og lagre det ved -20 ° C inntil bruk.
- Forbered 5 ml 5% stable gel (3,07 ml destillert vann, 1,25 ml 4 x øvre gel-buffer med pH 6,8, 625 ul av 40% akrylamid, 50 ul 10% ammoniumpersulfat (APS), og 5 ul tetrametyletylendiamin ( TEMED)) og 10 ml 15% separering gel (3,65 ml destillert vann, 2,5 ml av 4x nedre gel-buffer med pH 8,8, 3,75 ml av 40% akrylamid, 100 ul 10% APS,og 4 ul TEMED).
- I elektroforese celle, pour stable gel (5% akrylamid) på toppen av skille gel (15% akrylamid) etter at sistnevnte har størknet. Sett inn en gel kam i stabling gel.
- Utfør PAGE henhold til følgende vilkår: første kjøring tilstand: 100 volt, 20 min og endelig tilstand: 120 volt, 40 min.
- Flekk gelen med Coomassie brilliant blue ved romtemperatur i 30 min inntil gelen er jevnt blå i farge.
Merk: Farging er fullført når gelen ikke lenger er synlig i fargestoffoppløsningen. - Destain det med eddiksyreløsning (10%) ved romtemperatur i 1 time. Band vil begynne å dukke opp. Fortsett avfarging ved 4 ° C over natten inntil bakgrunnen er klar.
2. Peptide Synthesis og monoklonalt antistoff produksjon
- Hent aminosyresekvensene av Mb fra GenBank inkludert tunfisk, kylling, struts, innenlands pattedyr, sel og 18 arterav hvaler (tabell 2).
- Juster sekvenser ved hjelp av riktig programvare 16:
- Start Alignment Utforsker ved å velge Juster: Rediger / Bygg Alignment på startlinjen; velg Create New Alignment og klikk på OK. En dialogboks som ber "Er du bygge en DNA eller protein sekvens justering?"
- Klikk på knappen merket "Protein"; Velg Data: Åpen: Hent sekvenser fra Fil og velg sekvens fil; velg Edit: Merk alt menykommandoen for å velge alle områder for hver sekvens i datasettet for å lage en multippel sekvenssammenstilling.
- Velg Justering: Rett ved ClustalW fra hovedmenyen for å justere de valgte sekvensene data ved hjelp av ClustalW algoritmen; velg "BLOSUM" som Protein Weight Matrix klikk deretter på OK-knappen.
- Analyser sekvenssammenstillingen:
- Fokus på fem antigen reaktive sites 17: site 1 (AKVEADVA, 15-22), side 2 (KASEDLK, 56-62), side 3 (ATKHKI, 94-99), side 4 (HVLHSRH, 113-119) og nettstedet 5 (KYKELGY, 145- 151) og finne fragment konservert blant hvaler. An * (stjerne; konsensus symbol i innretting (Protocol 2.2.3)) indikerer posisjoner som har en enkelt, fullstendig konservert rest. Følgende konserverte fragmenter i hvaler ble funnet: sekvens KASEDLKKHG (som inkluderer stedet 2) og sekvens HVLHSRHP (som inkluderer stedet 4).
- Syntetisere kandidatsekvensfragmenter i henhold til sekvensanalyse, og konjugat med en ovalbumin protein (OVA) som bærerprotein ved hjelp av kommersielle tjenester.
- Legg hydrofobe aminosyrer (f.eks metionin) til den N-terminale av antigenisk reaktivt sete for å hindre peptidet fra nedbryting (f.eks M-KASEDLKKHG).
- Forlenge C-terminal av antigenisk reaktivt sete for å utsette kjernen antigeniske setet til immunocytt. Videre conjugate peptidet med OVA ved å legge til et cystein (Cys, C) til den C-terminale (for eksempel M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulgere Freunds fullstendige adjuvans for en immunogen eller ufullstendig Freunds adjuvans for immunogen 2 med et like stort volum av hver syntetisk peptid i PBS (3 ml, sluttkonsentrasjon 30-50 ug / 100 ul).
- Inokuler immunogen 1 (0,1 mg) subkutant inn i hver av fem BALB / c-mus.
- Utfør subkutane vaksinasjoner fem ganger med immunogen 2 med to ukers mellomrom og samle testsera etter halen klippet sampling fra musene før hver booster.
- Bestem sera titer for første screening.
- Oppløs 100 ug fritt peptid i 25 ml reaksjonsbuffer og aliquot 50 ul av oppløsningen i hver brønn av en 96-brønns plate. Tilsett 10 mL koblingsreagens løsning i hver brønn, og bland platen. Inkuber platen i 2 timer ved romtemperatur.
- Fjerne innholdet fra brønnen,vask hver brønn 3 ganger med destillert vann, og blokkere platen ved å tilsette 200 ul blokkeringsløsning. Inkuber i 1 time ved romtemperatur. Fjerne innholdet og vask hver brønn 3 ganger med destillert vann.
- Utføre indirekte ELISA (Protocol 5/1 til 5/7) for å bestemme sera titer for den første screening. Velg musen med den høyeste titer (høyest optisk tetthet) for milt samling.
- Tre dager før milt samling, inokulering av 0,1 mg av en immunogen subkutant i mus som presenterer den høyeste titer.
- Samle miltcellene fra de valgte immuniserte mus og sikringen med muse-myelomceller F0 (SP2 / 0-Ag14) under dannelse av hybridomceller for mAb generasjon 18.
- 14 dager etter fusjon, velger de positive kloner ved screening reaktiviteten hybridomsupernatanter mot gratis syntetisk peptid ved hjelp av indirekte ELISA (protokoll 05.01 til 05.07).
- Fortynn cellene til et passende antall per brønn for maximizing andelen av brønnene som bare inneholder en enkelt klon (fortynning kloning).
- Tilsett 100 ul av cellekulturmedium til alle brønnene i 96-brønns plate, bortsett fra brønn A1 som er tomt.
- Tilsett 200 ul av cellesuspensjonen til godt A1. Så raskt overføre 100 ul fra A1 til B1 og bland forsiktig pipettering. Gjenta disse 1: 2 fortynninger ned hele kolonnen, og deretter kaste 100 ul fra H1 slik at det ender opp med samme volum som brønnene over den.
- Legg ytterligere 100 mL av medium til kolonne 1 med en 8-kanals mikropipette. Så raskt overføre 100 ul fra hver av brønnene i kolonne 1 med de i kolonne 2 ved hjelp av den samme pipette, og bland ved forsiktig pipettering.
- Ved hjelp av de samme tipsene, gjenta disse 1: 2 fortynninger over hele platen. Kasser 100 ul fra hver av brønnene i den siste kolonnen.
- Bring sluttvolumet til alle brønnene til 200 ul ved tilsetning av 100 ul medium til hver brønn. Inkuber plate uforstyrret ved 37 ° C i en fuktet CO2-inkubator.
- Sjekk hver brønn og merke alle brønner som inneholder bare en enkelt koloni. Utføre to eller flere clonings inntil> 90% av brønnene inneholdende enkle kloner er positive for antistoffproduksjon.
- Screen kloner av western blot og dot blot (protokoll 03.01 til 04.06). Deretter subkultur kolonier fra brønnene inn større skip for å utvide celler for å skaffe mAb. Vanligvis er hver klon blir overført inn i en enkelt brønn i en 12- eller 24-brønners plate.
- Mål affinitet mellom mAbs og muskel utdrag fra ku, geit, gris, hund, kanin, tunfisk, kylling, sel, og fire representative cetacean arter av western blot og dot blot (protokoll 03.01 til 04.06).
- Inokuler markerte hybridomceller (opp til 3 x 10 6) intraperitonealt i mus for å indusere ascites. Abdominal hevelse er vanligvis synlig i løpet av 7-10 dager etter hybridom injeksjon. Samle væske ved hjelp av en hypodermisk nål(Mindre enn 20 gauge).
- Sentrifuge ascites fluid (10 000 xg i 10 min) for å fjerne celler og rester. Filtrer gjennom et 0,45 um filter. Legg til en til 20 ml av prøven, 15 ml bindingsbuffer, og 3 til 5 ml av elueringsbufferen til proteinet G-Sepharose-kolonne. Samle elueringen fraksjon inneholdende renset antistoff fra muse ascites fluid.
- Bestem antistoff isotype av antistoffet isotyping kit bruker produsentens instruksjoner.
3. Western Blot
- Forbered 2x ladningsbuffer inneholdende β-merkaptoetanol (BME) ved å blande 950 ul av 2x Laemmli-prøvebuffer med 50 ul BME. Fortynn muskel supernatanter (protokoll 1,1-1,4) i lasting buffer med passende forhold for å oppnå gode signaler: 1:50 (hvaler og sel) og 1: 5 (husdyr og tunfisk) ved bruk av polyklonale kanin anti-human Mb antistoff, og 1: 1 (gris, kanin, kylling og tunfisk), 1: 5 (ku, geit og hund), og 1:25 (hvaler og tetning) når enntibody er fra hybridomsupernatant.
- Varme prøven ved 95 ° C i 5 min. Belastningsprøver i brønnene av SDS-PAGE-gel (4% akrylamid stabling og 12% akrylamid separer) sammen med molekylvektmarkører. Kjør gelen i 5 min ved 50 V og deretter øke spenningen til 150 V for å fullføre løp i omtrent 1 time.
- Plassere gelen på 1x overføringsbuffer i 15 min. Overfør det utskilte proteinet til nitrocellulose (NC) membraner etter at de er separert ved PAGE. Transfer kan gjøres på 100 V for 60-90 min.
- Forbered blokkeringsløsning: 1 x PBS inneholdende 0,1% Tween 20 med 5% fettfri tørrmelk. Blokker NC membranen i 25 ml blokkeringsløsning ved romtemperatur i 1 time. Vask tre ganger i 5 minutter hver med 15 ml fosfat-bufret saltvann med Tween 20 (PBST).
- Inkuber membranen og primære antistoff (ascites-væske eller hybridomsupernatant) i 10 ml antistoff-fortynningsbuffer fortynnet med 5% blokkeringsløsning ved 4 ° C over natten.
- Vask membrane tre ganger igjen med PBST å vaske av overdreven antistoff.
- Inkuber membranen med alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus IgG ved 1: 1250 i blokkeringsløsning med forsiktig omrøring i 1 time ved romtemperatur.
- Vask membranen igjen og inkuberes det i den 5-brom-4-klor-3-indolyl fosfat / p-nitro-tetrazoliumklorid (BCIP / NBT) fosfatasesubstrat blandingen i 10 til 20 min inntil fargeutvikling.
- Stopp reaksjonen ved å vaske membranen i flere endringer av destillert vann.
4. Dot Blot
- Fortynn muskel supernatantene (protokoll 1,1-1,4) i 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBST med egnet forhold for å oppnå gode signaler: 1: 5 for husdyr og tunfisk, og 1:25 for hval og tetning. Spot 5 mL av prøvene ut mot membran. Minimer området at løsningen penetrerer (vanligvis 3-4 mm diameter) ved å bruke den sakte.
- Tørk membranen ved romtemperatur (for eksempel </ Em> i en laminær strøm i 30-60 min), blokkere den med blokkeringsløsning i petriskål i 1 time ved romtemperatur, og vaske det med PBST.
- Inkuber membranen med primært antistoff (mAb fra hybridomsupernatant på 1: 10.000 eller ascites fluid ved 1: 100 000 fortynnet i 5% blokkeringsløsning) i 1 time ved romtemperatur.
- Bruk PBST å vaske membranen tre ganger i 5 minutter hver til å fjerne overskudd av antistoff, og så inkuberes det med sekundært antistoff (alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus IgG ved 1: 1250 i 5% blokkeringsløsning) i 1 time ved romtemperatur .
- Vask membranen igjen og inkuberes den i BCIP / NBT fosfatasesubstrat blandingen i løpet av 10 til 20 min inntil fargeutvikling.
- Stopp reaksjonen ved å vaske membranen i flere endringer av destillert vann.
5. Indirekte ELISA
- Tilberede vaskebuffer (0,002 M imidazol bufret saltvann med 0,02% Tween 20). Vask platen 3 ganger med vaskebuffer mellom hvert følgende trinn (protokoll 5,2-5,5).
- Forbered 1:25 fortynning av muskel supernatanter (protokoll 1,1-1,4) i coating buffer. Belegge en 96-brønns ELISA-plate med 100 ul fortynnede supernatanter ved 4 ° C over natten og blokkere det med blokkeringsbuffer (1% BSA i PBS) i 1 time ved romtemperatur.
- Forbered 1: 2000 fortynning av det rensede mAb med fortynnet buffer og tilsett 100 ul av fortynnet mAb til hver brønn. Inkuber platen i 1 time ved romtemperatur.
- Legg geit-anti-mus-IgG konjugert med pepperrot peroksidase (1: 200 fortynning i fortynnet buffer) for ytterligere inkubering.
- Legg peroksidasesubstrat til hver brønn (100 ul / brønn) og inkuberes i 10-15 min.
- Stoppe enzymreaksjonen av peroksidase stoppoppløsning (100 ul / brønn) når fargeutvikling observeres.
- Les den optiske tettheten ved 450 nm ved bruk av en mikroplate-spektrofotometer.
6. Utarbeidelse av kolloidalt gull-merket mAb Merk: Fargen av kolloidalt gull-løsning, og blandingen bør alltid være rød. Juster pH, konsentrasjon av mAb, sentrifuge hastighet når svart bunnfall lagt merke til. Trinn 6,1 og 6,2 er optimalisering trinn.
- Legg rensede detektere mAb (50 ug / ml, 3 ul) til 100 ul av kolloidalt gull oppløsning med pH-verdier varierende fra 5-9. Den minimale pH-verdi som holder den røde fargen i to timer er ansett som den optimale pH. Merk: I denne studie ble 0,1 M kaliumkarbonat brukes til å justere kolloid gull (40 nm) oppløsning til pH 8,0 (pH-optimum).
- Legg forskjellige mengder renset detektere mAb (500 ug / ml, 1-20 ul) til 100 ul av kolloidalt gull-løsning ved pH 8,0. Merk: Den optimale konsentrasjonen i denne studien er 6 mikrogram / ml (ingen svart bunnfall).
- Ifølge resultatene ovenfor, legger 60 mikrogram renset påvise mAb dråpevis til 10 ml kolloid gull løsning. Emulgere blandingen forsiktig ved romtemperatur i 10 min. Add 2 ml 5% BSA-oppløsning i PBS (pH 7,4) til blandingen og bland forsiktig ved romtemperatur i 15 min for å redusere bakgrunnsinterferens.
- Sentrifuger blandingen ved 10 000 xg i 30 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten med ukonjugert antistoff omhyggelig og suspendere de resulterende pellets i 4 ml PBST inneholdende 1% BSA og 0,1% Tween 20, og gjenta sentrifugering og suspensjons flere ganger.
- Heng den endelige bunnfall i en ml PBST og lagre det ved 4 ° C inntil bruk.
7. Bygging av immun Strip
Merk: Figur 1 viser immun stripe design. Forbered og montere strimlene i en lav luftfuktighet laboratorium miljøtilstand (<20% relativ fuktighet) for lengre holdbarhet (> 1 år). Dimensjonene på puter og membranen er: konjugatområdet 300 mm x 10 mm, absorberende puten 300 mm x 24 mm, prøveputen 300 mm x 24 mm, NC membran 300 mm x 25 mm, 300 montasjebordetmm x 80 mm.
- Legg kolloid gull-merket mAb løsning fra trinn 6.6 med en mikropipette for å mette puten konjugatet og deretter tørke det ved 37 ° C i 1 time før montering.
- Fordel det spesifikke antigen-oppfangende mAb (500 ug / ml) på testsonen, og kanin-anti-muse-IgG (500 ug / ml) på kontrollsonen for detektering av mAb på NC membranen ved hjelp av en pipette eller immunostrip skriver. Opprettholde avstand (> 5 mm) mellom de to soner for å unngå interferens.
- Lim konjugert pad, absorberende puten og NC membran på papp med dobbeltsidig tape.
Merk: Overlapping putene på hver side av NC membran med ca 2 mm. Upassende strimmel konstruksjon vil resultere i en ufullstendig test. - Plasser prøven puten over konjugerte pad (2 mm) og lim den på papp.
- Lag 6 mm brede strimler med en papirkniv. Pakk strimlene i aluminiumfolieposen med tørkemiddel, og lagre dem ved 4 ° C inntil anvendelse.
8. Kryssreaksjoner Test
- Homogen 0,03 g av rå muskelprøven med 1 ml PBS (inneholdende 0,1% BSA) i en 1,5 ml sentrifugerør ved hjelp av en bambus pinne eller malelegeme.
- Hold strimmel ved enden motsatt til testområdene og dyppe prøven puten del inn i prøven i 5-10 min og observere resultatet direkte.
- Valgfritt: Samle 500 mL supernatant og overføre den til en ny sentrifugerør.
Merk: Dette trinnet er foreslått hvis signalet er ikke åpenbar når remsen er direkte dyppet inn i supernatanten.
- Valgfritt: Samle 500 mL supernatant og overføre den til en ny sentrifugerør.
- Test forskjellige muskelprøver i tre eksemplarer.
Merk: Her testet vi tunfisk, kylling, sel, 15 arter av hvaler og 5 arter av landlevende pattedyr. - Har fem uavhengige inspektører gjenta 8,3 for fem ganger, dvs. bruke 575 strips totalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monoklonale antistoffer egenskaper
Vi har utviklet to IgG-1 mAb (CGF5H9 og CSF1H13) som gjenkjenner to syntetiske peptider (MKASEDLKKHGNTVLC og AIIHVLHSRHPAEFGC), henholdsvis, av hval Mb, og disse ble anvendt for å konstruere en sandwich-type kolloidalt gull Immunokromatografisk teststrimmel for rask påvisning av cetacean Mb. Figur 2 viser at CGF5H9 registrerer hval og andre pattedyr som en enkelt farget bånd ved en antatt molekylvekt på tilnærmet 17 kDa. Den vågehval (Balaenoptera acutorostrata) viser en forholdsvis svakere bånd enn bånd andre hvaler. Band er fraværende for tunfisk, høner og sel, mens et band på ca 50 kDa er observert for griser. Selv om det er flere ikke-spesifikke bånd til griser og tunfisk, er CSF1H13 meget spesifikk fordi det reagerer bare med hvaler og tetninger som et bånd ved en antatt molekylvekt på omtrent 17 kDa. Vågehval bare viser et sterkt signal på 1:10 (data ikke vist) uten signaler observert ved 01:25. Figur 2 viser identiske resultater i dot blot.
Figur 3A viser at CGF5H9 viser positivt signal for hvaler, kaniner, hunder, geiter og kyr (OD verdi> 3,0); svakt positivt signal for griser (OD verdi = 1,5); negativt signal for sel, høner og tunfisk. Figur 3B viser at CSF1H13 uttrykker høy affinitet mot hvaler og seler (OD verdi> 3,0). Både CSF1H13 og CGF5H9 kan reagere sterkt med alle fire cetacean arter. Disse fire artene er fra ulike familier (vågehval: Balaenopteridae, bottlenose delfin: Delphinidae; dverg spermhval: Kogiidae; finless nise: Phocoenidae), indikerer bred reaktivitet til ulike cetacean arter.
For stripen konstruksjon, CGF5H9, som anerkjenner than Mbs av hval og andre pattedyr, i kolloid gull-merket og anvendt som påvisningsantistoff til å binde myoglobin, og CSF1H13 er belagt på testlinjen bare å fange MBS av hvaler og tetninger. Derfor testlinjen er laget for å vise et positivt signal når begge mAbs oppdage cetacean Mb. Fordi Mb fra ikke-cetacean dyr som bare kan påvises ved en av disse to mAb, viser testlinjen et negativt resultat når muskelprøver fra andre dyr testes. Styreledningen alltid viser et positivt resultat fordi kanin-anti-mus-IgG bindes kolloid gull-merket CGF5H9. En mislykket resultat i styreledningen viser at kvaliteten på materialene på stripe er dårlig.
Strip test
Figur 4 viser signal bånd ved både test- linje og styreledningen når cetacean muskelprøver blir anvendt. Når prøven er ikke fra hvaler, er det bare en eneste band på styreledningen with fravær av båndet ved testlinjen. Et vellykket resultat kan observeres direkte i 5-10 min etter homogenisering av 0,03 g av muskelen med 10 ml PBS inneholdende 0,1% BSA ved bruk av en plast eller bambus stokk og suger av båndet inn i blandingen. Etter å ha testet 15 cetacean arter og åtte ikke-cetacean arter i tre eksemplarer, spesifisitet (andelen av ikke-cetacean prøver korrekt identifisert) og følsomhet (andelen av cetacean prøver korrekt identifisert) er begge 100%.
Figur 1. Utforming av immun strimmel. Alle komponentene er nøye lagvis på den plaststøtten kortet slik at de overlapper hverandre. Dette gjør at reagensene og prøven strømmer opp gjennom membranen, og til den absorberende puten. T: test sone. C: kontrollsone. Dette tallet er gjengitt fra Lo, C. et al. Rapid immun kolloidalt gull stripefor hvalkjøtt besøksforbud ulovlig handel og forbruk. implikasjoner for bevaring og folkehelse PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Western blot, og dot blot-analyse ved bruk av hybridom-supernatanter. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Begge hybridomsupernatanter kan detektere hvaler som en enkelt farget bånd ved en antatt molekylvekt på tilnærmet 17 kDa. MW: vågehval, BND: bottlenose delfin, DSW: dverg spermhval, FP: finless nise, PKW: pygmé spekkhogger, N: PBS (negativ kontroll). Dette tallet er gjengitt fra Lo, C. et al. Rapid immun kolloidalt gull stripe for cetacean kjøtt begrensende ulovlig handel og forbruk. implikasjoner for bevaring og folkehelse PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Indirekte ELISA av muskel ekstrakter av forskjellige arter ved å bruke rensede mAbs. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Bare hvaler kan produsere sterke positive signaler i begge mAbs. Dette tallet er gjengitt fra Lo, C. et al Rapid immun kolloidalt gull stripe for hvalkjøtt besøksforbud ulovlig handel og forbruk.. Implikasjoner for bevaring og folkehelse PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10,1371 / journal.pone.0060704. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Spesifisitet av immun kolloidalt gull strimmel. T: testlinjen. C: kontrolledning. Bare når cetacean muskelprøver blir anvendt, kan et vellykket resultat (signal bånd ved både test- linje og styreledningen) holdes. (A) Ikke-cetacean prøver: 1: Cow. 2: Goat. 3: Pig. 4: Dog. 5: Rabbit. 6: Tuna. 7: Chicken. 8: Steinkobbe (Phoca vitulina). (B) Cetacean prøver: 1: vågehval (Balaenoptera acutorostrata). 2: Omura hval (Balaenoptera omurai). 3: bottlenose dolphin (Tursiops aduncus). 4: bottlenose dolphin (T. truncatus). 5: Fraser dolphin (Lagenodelphis hosei </ Em>). 6: Indo-Pacific knølhval dolphin (Sousa chinensis). 7: arrdelfin (Grampus griseus). 8: Pantropical flekket delfin (Stenella attenuata). 9: Grov-toothed dolphin (Steno bredanensis). 10: Pygmy spekkhogger (Feresa attenuata). 11: Short-finned pilot whale (Globicephala macrorhynchus). 12: Melon-ledet hval (Peponocephala electra). 13: Dwarf spermhval (Kogia sima). 14: Pygmy spermhval (K. breviceps). 15: Finless nise (Neophocaena phocaenoides). Dette tallet er gjengitt fra Lo, C. et al Rapid immun kolloidalt gull stripe for hvalkjøtt besøksforbud ulovlig handel og forbruk.. Implikasjoner for bevaring og folkehelse PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cetacean arter | Non-cetacean arter |
| Pygmy spermhval (Kogia breviceps) | Steinkobbe (Phoca vitulina) |
| Dwarf spermhval (Kogia sima) | Hund (Canis lupus familiaris) |
| Short-finned pilot whale (Globicephala macrorhynchus) | Rabbit (Oryctolagus cuniculus) |
| Melon-ledet hval (Peponocephala electra) | Pig (Sus scrofa) |
| Pygmy spekkhogger (Feresa attenuata) | Goat (Capra hircus) |
| Pantropical flekket delfin (Stenella attenuata) | Storfe (Bos Taurus) |
| Bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) | Kylling (Gallus gallus) |
| Tumler (Tursiops aduncus) | Gulfinnetun (Thunnus albacares) |
| Fraser dolphin (Lagenodelphis hosei) | |
| Indo-Pacific knølhval dolphin (Sousa chinensis) | |
| Grov-toothed dolphin (Steno bredanensis) | |
| Arrdelfin (Grampus griseus) | |
| Finless nise (Neophocaena phocaenoides) | |
| Vågehval (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Omura hval (Balaenoptera omura i) |
Tabell 1. Artene som muskel var collected og testet i denne studien. Arter inkluderer tunfisk, kylling, sel, 5 arter av landlevende pattedyr, og 15 arter av hvaler (4 familier).
| arter | Tiltredelse nei. |
| Vågehval (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Pygmy brydehval (Balaenoptera Edeni) | Q0KIY2 |
| Knølhval (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Grå hval (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Spermhvalen (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Pygmy spermhval (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| Dwarf spermhval (Kogia sima) | P02184 |
| Short-beaked vanlig delfin (Delphinus delphis) | P68276 |
| Grindhval (Globicephala melas) | P02174 |
| Spekkhogger (Orcinus orca) | P02173 |
| Melon-ledet hval (Peponocephala electra) | Q0KIY3 |
| Pantropical flekket delfin (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Tumler (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Spankulerte (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Amazon river dolphin (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Longman er nebbhvaler (Indopacetus pacificus) | Q0KIY9 |
| Hubbs 'nebbhvaler (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Gåsenebbhval (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Steinkobbe (Phoca vitulina) | P68080 |
| Storfe (Bos Taurus) | P02192 |
| Goat (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Horse (Equus caballus) | P68082 |
| Pig (Sus scrofa) | P02189 |
| Hund (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Kylling (Gallus gallus) | P02197 |
| Ostrich (Struthio camelus) | P85077 |
| Gulfinnetun (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabell 2. myoglobin-sekvenser brukt i denne studien med respektive GenBank deponeringsnummer. Art omfatter tunfisk,kylling, struts, innenlands pattedyr, sel og 18 arter av hvaler (7 familier). Denne tabellen er gjengitt fra Lo, C. et al Rapid immun kolloidalt gull stripe for hvalkjøtt besøksforbud ulovlig handel og forbruk. Implikasjoner for bevaring og folkehelse PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10,1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av et syntetisk peptid konjugert til bærerprotein er bemerkelsesverdig mer effektiv sammenlignet med beslektet protein. For en sandwich-basert teknikk, fordi mAb er utviklet ved hjelp av epitoper med kjente relative steder, de to mAb'er i denne studien er ikke sannsynlig å forstyrre hverandre interaksjon med målet antigen epitop. Videre kan reaktiviteten mellom det native proteinet og antistoffet av mus immunisert med det syntetiske peptid-konjugatet sterkere enn reaktiviteten mellom det native proteinet og antistoffet produsert fra det native protein 19. Bruken av syntetiske peptid konjugater er derfor anbefalt for effektive immuniseringsprosedyrer og generering av passende anti-peptid-mAb.
Strukturen av et protein omfatter hovedsakelig sekvensen av aminosyrer i polypeptidkjeden. Hver aminosyre har en sidekjede som fører til spesifikke egenskaper, og lett endring av amino acid sekvens resulterer i strukturen endres. Fordi peptider med en lengde på 10-20 aminosyrer er ideelle for antistoff-preparat, ble lengden av de syntetiske peptider (immunogen) ved den C-terminale område økes for å sikre at kjerneantigene region ville bli gjenkjent. Derfor kan de aminosyrerester mellom Mbs av ulike dyr resulterer i ulike epitop konstruksjoner effektivt differensieres. For eksempel, viser figur 3A den nevnte peptid utforming bidrar til CGF5H9 reagere sterkt med hvaler men negativt med tetninger. Et annet eksempel er de forskjellige affiniteter mot høner og hunder av CGF5H9 selv om kyllingen har en identisk sekvens til den av hunden i kjernen antigeniske setet 2. Dette tyder på at sekvensen forskjell i det ytre område kan føre til strukturen endring og således variabel bindingsaffiniteten mellom antigen og antistoff.
Western blot, dot blot, og indirekte ELISA ble anvendt ivår metode for screening egnede mAbs. Western blot er mye brukt for å påvise spesifikke proteiner i vev-ekstrakt eller homogenat. I denne teknikk blir gelelektroforese anvendes for å separere denaturerte proteiner ved lengden av polypeptidet. Derfor er det mulig å bekrefte at signalet som angir den antatte proteinet molekylvekt. Imidlertid kan deteksjonsresultatet (positiv eller negativ, sterk eller svak signal) ikke har vist den virkelige situasjon av antigen-antistoff-binding fordi denaturerte proteinene brukes. Følgelig kan dot blot benyttes til andre-trinns screening. Dot blot er en teknikk for detektering av proteiner. Det representerer en forenkling av western blot metode. I dot blot, blir en blanding inneholdende molekylet som skal påvises, påføres direkte på en membran som en prikk. Dette skiller seg fra en western blot fordi proteinprøver ikke blir denaturert. Legg merke til at denne teknikken gir ingen informasjon om størrelsen på målbiomolekylet, og et enkelt punkt vises hvis to molecules av forskjellige størrelser blir detektert. Til slutt blir indirekte ELISA anvendes for en ligand-bindingsanalyse for å generere et signal som kan bli skikkelig kvantifiseres. Det gir mer informasjon til MAB egenskaper og dermed letter stripen konstruksjon.
Konsentrasjoner av Mb i muskelen er variabel avhengig av innsamlingssted. For eksempel, svømme muskler (aksiale muskler) i hvaler har et betydelig høyere innhold av Mb sammenlignet med ikke-svømming muskler, og prøver fra unge hvaler ville ha lavere Mb konsentrasjon fordi Mb konsentrasjonen øker gjennom et dyrs liv 20. Til å begynne med CSF1H13, hvor kun fanger Mb av hval, sel, var ment å være kolloid gull-merket og være detektering av antistoff, og CGF5H9, som gjenkjenner Mb fra mange arter, ville være fangst-antistoff på testlinjen. Vi antok at det å påvise antistoff bør være mer spesifikke og fangst antistoff børvære mer generelt. Men et svakt positivt signal ble funnet på testlinjen når cetacean prøver med lave Mb konsentrasjoner ble anvendt (data ikke vist). Problemet ble løst ved posisjonene til de to mAbs ble reversert som beskrevet i de representative resultater. Et godt signal ble også vist til en nyfødt hvaler (en strandet Omura hval) (figur 4). Det er uklart om egenskapene og konsentrasjonen av mAb bidrar til dette fenomen.
I denne studien ble frosset-tint muskelprøver homogenisert med PBS som brukes på stripe test. Andre eksempler på forhold og tilberedningsmetoder kan påvirke resultatet. For eksempel bør saltoppløselige proteiner som Mb hentes ut ved bruk av PBS i stedet for rent vann. Ellers kan ekstraksjonen være utilstrekkelig, noe som kan føre til en avvikende resultat. Den riktige ekstraksjonsbuffer: kjøtt sample-forholdet er delvis ansvarlig for en vellykket tolkning av strimmelen resultat. stor Amount (0,3 g i 1 ml buffer) av kontrollprøver (f.eks husdyr) kan føre til positivt resultat og uskarp bakgrunn. Imidlertid er forholdet anvendt i denne studien (1: 0.03) ga riktige resultater. Bare fersk muskelprøver kan anvendes for denne stripe testen. Protein kan bli hydrolysert eller denaturert etter visse behandlinger (for eksempel herding av soyasaus og koking), noe som kan føre til positive resultater ikke bare for cetacean muskelprøver, men også prøver fra andre dyr (data ikke vist). Derfor er det foreslått at variable prøvekilder og ulike bygge design planer bør brukes under stripe utvikling.
Som konklusjon, beskriver denne protokollen utviklingen av to mAbs sterkt reaktive til MB hvaler, og disse mAbs er brukt på en rask test stripe å differensiere MB hvaler fra sel og andre dyr. Selv om pålitelige PCR-baserte DNA-analyse for identifikasjon av hvalkjøtt er tilgjengelig 12, det jegs arbeidskrevende og tidkrevende. Den rask test stripen er en pålitelig og rask teknikk som kan brukes i felt for å identifisere cetacean kjøtt, noe som er svært ønskelig for tilsynsorganer 21. Det er sannsynlig at strimmelen kan utvikles for detektering av spesifikke Mbs fra dyr som hester og griser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
