Protocol
Etik uttalande: Studien genomfördes i enlighet med internationella riktlinjer och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av National Chiayi universitet, godkännande ID: 99022. Det valar prov bruk tilläts av rådet för jordbruk i Taiwan (Research Tillstånd 100M-02.1-C-99).
1. Muskelprovberedning och SDS-PAGE
Obs: Muskelprover från 23 arter, inklusive 16 arter av marina däggdjur, 5 arter av landlevande däggdjur, var tonfisk och kyckling som används i denna studie (Tabell 1). Valar muskelprover erhölls från strandade individer, fiske bifångst och förverkande. Kanin, råtta, hund och kyckling muskelvävnad erhölls från djursjukdomar Diagnostic Center of National Chiayi universitet. Prover av nöt, fläsk, lamm och tonfisk köptes från en lokal stormarknad. Muskel prov av knubbsäl (Phoca vitulina
- Förvara alla prover vid -20 ° C fram till användning.
- Pre-cool murbruk vid -20 ° C. Lägg sedan 3 g frusen muskel provet i det.
- Homogenisera provet med 10 ml kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med användning av en vävnadshomogenisator.
- Centrifugera den homogeniserade provet vid 10.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Samla supernatanterna och förvara den vid -20 ° C fram till användning.
- Förbereda 5 ml 5% stackningsgel (3,07 ml destillerat vatten, 1,25 ml 4x övre gel buffert med pH 6,8, 625 ul av 40% akrylamid, 50 pl 10% ammoniumpersulfat (APS), och 5 | il av tetrametyletylendiamin ( TEMED)) och 10 ml av 15% separerande gel (3,65 ml destillerat vatten, 2,5 ml av 4x lägre gel-buffert med pH 8,8, 3,75 ml 40% akrylamid, 100 pl av 10% APS,och 4 ul av TEMED).
- I elektroforescell, pour stapling gel (5% akrylamid) ovanpå det separerande gel (15% akrylamid) efter att den senare har stelnat. Infoga en gel kam i stapling gel.
- Utför PAGE enligt följande villkor: inkörning skick: 100 volt, 20 min och sista villkoret: 120 volt, 40 min.
- Fläcka gelén med Coomassie brilliant blue vid rumstemperatur under 30 min tills gelén är likformigt blå i färgen.
Obs: Färgning är klar när gelén inte längre syns i färglösningen. - Avfärgning den med ättiksyralösning (10%) vid rumstemperatur under en timme. Band kommer att börja visas. Fortsätta avfärgning vid 4 ° C över natten tills bakgrunden är klar.
2. Peptidsyntes och Monoclonal Antibody Production
- Hämta aminosyrasekvenserna för Mb från GenBank inklusive tonfisk, kyckling, struts, tama däggdjur, tätning och 18 arterav valar (tabell 2).
- Rikta in sekvenser med hjälp av rätt programvara 16:
- Starta Alignment Explorer genom att välja Justera: Edit / Bygg Justering i startfältet; välj Skapa ny justering och klicka på OK. En dialogruta som frågar "Är du bygga en DNA eller protein sekvensinpass?"
- Klicka på knappen "Protein"; välj Data: Öppet: Hämta sekvenser från fil och välj sekvens fil; Välj Redigera: Välj alla menykommando för att välja alla platser för varje sekvens i datauppsättningen för att skapa en multipel sekvensinpassning.
- Välj Justering: Justera med ClustalW från huvudmenyn för att justera den valda sekvenser data med hjälp av ClustalW algoritmen; välj "BLOSUM" som Protein Vikt Matrix klicka sedan på OK.
- Analysera sekvensinpassning:
- Fokus på fem antigen reaktiv sites 17: plats 1 (AKVEADVA, 15-22), plats två (KASEDLK, 56-62), plats 3 (ATKHKI, 94-99), plats fyra (HVLHSRH, 113-119) och plats 5 (KYKELGY, 145- 151) och hitta fragment konserverade bland valar. En * (asterisk; konsensus symbol i anpassningen (Protokoll 2.2.3)) indikerar positioner som har en enda, helt bevarade rester. Följande konserverade fragment i valar påträffades: sekvens KASEDLKKHG (som inkluderar site 2) och sekvens HVLHSRHP (som inkluderar site 4).
- Syntetisera kandidatsekvensfragment enligt sekvensanalys, och konjugatet med ett ovalbumin-protein (OVA) som bärarprotein med användning av kommersiella tjänster.
- Lägga hydrofoba aminosyror (t ex metionin) och den N-terminala av antigent reaktivt ställe för att förhindra peptiden från nedbrytning (t.ex. M-KASEDLKKHG).
- Förlänga C-terminalen av antigent reaktivt ställe för att exponera kärnan antigenstället till immunocyt. Vidare conjugrind peptiden med OVA genom tillsats av en cystein (Cys, C) till den C-terminala (t.ex. M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulgera fullständigt Freunds adjuvans för immunogen 1 eller ofullständigt Freunds adjuvans för immunogen 2 med en lika stor volym av varje syntetisk peptid i PBS (3 ml, slutlig koncentration 30 till 50 | j, g / 100 | il).
- Inokulera immunogen 1 (0,1 mg) subkutant i var och en av fem BALB / c-möss.
- Utför subkutana boosterinjektioner fem gånger med immunogen 2 vid två-veckors intervall och samlar testsera genom svansklämma provtagning från mössen före varje booster.
- Bestämma serum titer för den första screeningen.
- Lös upp 100 | j, g av fri peptid i 25 ml reaktionsbuffert och alikvot 50 pl av lösningen i varje brunn i en 96-brunnsplatta. Tillsätt 10 | il kopplingsreagenslösning i varje brunn och blanda plattan. Inkubera plattan under 2 h vid rumstemperatur.
- Ta bort innehållet i brunnen,tvätta varje brunn 3 gånger med destillerat vatten, och blockerar plattan genom att tillsätta 200 pl blockeringslösning. Inkubera under en timme vid rumstemperatur. Ta bort innehållet och tvätta varje brunn 3 gånger med destillerat vatten.
- Utför indirekt ELISA (Protokoll 5,1-5,7) för att bestämma serum titer för den första screeningen. Välj musen med den högsta titer (högsta optiska densiteten) för mjälte samling.
- Tre dagar före mjälte samling, ympa 0,1 mg immunogen 1 subkutant i musen presenterar den högsta titer.
- Samla mjältcellerna från de valda immuniserade möss och säkring med murina myelomceller F0 (sp2 / 0-Ag14) för erhållande av hybridomceller för mAb generation 18.
- 14 dagar efter fusion, väljer de positiva kloner genom screening av reaktiviteten hos hybridomsupernatanter mot fri syntetisk peptid med indirekt ELISA (protokoll 5,1-5,7).
- Späd cellerna till ett lämpligt antal per brunn för maximizing andelen brunnar som endast innehåller en enda klon (utspädningskloning).
- Tillsätt 100 pl cellodlingsmedium till alla brunnar i 96-brunnar utom väl A1 som lämnas tomt.
- Tillsätt 200 | il av cellsuspension till väl A1. Sedan snabbt överföra 100 ul från A1 till B1 och blanda genom att försiktigt pipettera. Upprepa dessa 1: 2 utspädningar ner hela kolumnen, och sedan kasta 100 pl från H1 så att det slutar med samma volym som brunnarna ovanför.
- Tillsätt ytterligare 100 pl medium till kolumn 1 med en 8-kanals mikropipett. Därefter snabbt överföra 100 ni från varje brunn i kolumn 1 till de i kolumn 2 med användning av samma pipett, och blanda genom att försiktigt pipettera.
- Genom att använda samma tips, upprepa dessa 1: 2 späd över hela plattan. Kasta 100 l från varje brunn i den sista kolumnen.
- Bringa den slutliga volymen av alla brunnar till 200 pl genom att tillsätta 100 | il medium till varje brunn. inkubera plate ostört vid 37 ° C i en fuktad CO2-inkubator.
- Kontrollera varje brunn och markera alla brunnar som innehåller bara en enda koloni. Utföra två eller flera kloningar tills> 90% av brunnarna innehållande enkla kloner är positiva för antikroppsproduktion.
- Screena kloner genom western blot och dot blot (protokoll 3,1-4,6). Då subkultur kolonier från brunnarna till större fartyg för att expandera celler för att erhålla mAb. Vanligtvis varje klon överförs till en enda brunn i en 12- eller 24-brunnars platta.
- Mät affinitet mellan mAbs och muskelextrakt från ko, get, gris, hund, kanin, tonfisk, kyckling, tätning och fyra representativa valarter genom Western blöt och dot blot (protokoll 3,1-4,6).
- Ympa valda hybridomceller (upp till 3 x 10 6) intraperitonealt i möss för att framkalla ascites. Buken svullnad är typiskt påtaglig inom 7-10 dagar efter hybridom injektion. Samla vätska med hjälp av en injektionsnål(Mindre än 20 gauge).
- Centrifug ascitesvätska (10.000 x g under 10 min) för att avlägsna celler och skräp. Filtrera genom ett 0,45 pm filter. Lägg 1 till 20 ml av provlösningen, 15 ml bindningsbuffert, och 3 till 5 ml elueringsbuffert in i protein G Sepharose-kolonn. Samla elueringen fraktionen innehållande renad antikropp från möss ascitesvätska.
- Bestäm antikroppsisotyp genom antikropps Isotypning satsen med tillverkarens instruktioner.
3. Western blot
- Förbered 2x buffert innehållande β-merkaptoetanol (BME) genom att blanda 950 pl 2x Laemmli provbuffert med 50 pl BME. Späd muskel supernatanterna (protokoll 1,1-1,4) i buffert med lämpligt förhållande för att erhålla goda signaler: 1:50 (valar och tätnings) och 1: 5 (tamdjur och tonfisk) vid användning av polyklonala kanin-anti-human Mb antikropp, och 1: 1 (gris, kanin, kyckling och tonfisk), 1: 5 (ko, get och hund), och 1:25 (valar och tätning) när enntibody är från hybridomsupernatant.
- Värme provet vid 95 ° C under 5 min. Belastningsprover i brunnarna på SDS-PAGE-gel (4% akrylamid stapling och 12% akrylamid separerande) tillsammans med molekylviktsmarkörer. Köra gelén under 5 min vid 50 V för att öka då spänningen till 150 V för att avsluta körningen i ca 1 tim.
- Placera gelén i 1x överföringsbuffert under 15 min. Överföra den separerade proteinet till nitrocellulosa (NC) membran efter det att de är åtskilda med PAGE. Transfer kan göras på 100 V för 60-90 min.
- Förbered blockerande lösningen: 1 x PBS innehållande 0,1% Tween 20 med 5% fettfri torrmjölk. Blockera NC membran i 25 ml blockeringslösning vid rumstemperatur under 1 timme. Tvätt tre gånger under 5 min vardera med 15 ml fosfatbuffrad saltlösning med Tween 20 (PBST).
- Inkubera membranet och primär antikropp (ascitesvätska eller hybridomsupematant) i 10 ml antikroppsutspädningsbuffert utspädd med 5% blockeringslösning vid 4 ° C över natten.
- Tvätta membrane tre gånger igen med PBST att rensa bort överdriven antikropp.
- Inkubera membranet med alkaliskt fosfatas-konjugerad get-anti-mus-IgG vid 1: 1250 i blockeringslösning under försiktig omrörning under 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet igen och inkubera den i 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat / p-nitroblå tetrazoliumklorid (BCIP / NBT) fosfatassubstrat blandningen under 10 till 20 min tills färgutveckling.
- Stoppa reaktionen genom tvättning av membranet i flera byten av destillerat vatten.
4. Dot Blot
- Späd muskel supernatanterna (protokoll 1,1-1,4) i 5% bovinserumalbumin (BSA) i PBST med lämpligt förhållande för att erhålla goda signaler: 1: 5 för husdjur och tonfisk, och 1:25 för valar och tätning. Spot 5 pl prov på membranet. Minimera det område som lösningen penetrerar (vanligtvis 3-4 mm i diameter) genom att tillämpa det långsamt.
- Torka membranet vid rumstemperatur (t.ex. </ Em> i ett laminärt flöde under 30-60 min), blockera det med blockerande lösning i petriskål under 1 h vid rumstemperatur, och tvätta den med PBST.
- Inkubera membranet med primär antikropp (mAb från hybridom supernatanten vid en: 10000 eller ascitesvätska vid 1: 100.000 utspädd i 5% blockeringslösning) under 1 h vid rumstemperatur.
- Använd PBST att tvätta membranet tre gånger under 5 min vardera för att avlägsna överskott av antikropp, och sedan inkubera det med sekundär antikropp (alkaliskt fosfatas-konjugerad get-anti-mus-IgG vid 1: 1250 i 5% blockeringslösning) i 1 h vid rumstemperatur .
- Tvätta membranet igen och inkubera den i BCIP / NBT fosfatassubstrat blandningen inom 10 till 20 min tills färgutveckling.
- Stoppa reaktionen genom tvättning av membranet i flera byten av destillerat vatten.
5. Indirekt ELISA
- Förbered tvättbuffert (0,002 M imidazol-buffrad saltlösning med 0,02% Tween 20). Tvätta plattan 3 gånger med tvättbuffert mellan varje följande steget (protokoll 5,2-5,5).
- Bered 1:25 utspädning av muskel supernatanter (protokoll 1,1-1,4) i beläggningsbuffert. Coat en 96-brunnars ELISA-platta med 100 | il utspädda supernatanter vid 4 ° C över natten och blockera den med blockeringsbuffert (1% BSA i PBS) under 1 h vid rumstemperatur.
- Förbereda en: 2000-spädning av den renade mAb med utspädd buffert och tillsätt 100 pl av utspätt mAb till varje brunn. Inkubera plattan i 1 h vid rumstemperatur.
- Add get-anti-mus-IgG konjugerat med pepparrotsperoxidas (1: 200 spädning i utspädd buffert) för ytterligare inkubation.
- Lägg peroxidassubstrat till varje brunn (100 | il / brunn) och inkubera under 10-15 min.
- Stoppa enzymreaktionen genom peroxidas stopplösning (100 | j, l / brunn) vid färgutveckling observeras.
- Läs av den optiska densiteten vid 450 nm med användning av en mikroplatt spektrofotometer.
6. Beredning av kolloidalt guld-märkt mAb Obs: Färgen på kolloidalt guld och blandningen bör alltid vara röd. Justera pH, koncentration av mAb, centrifughastigheten när svart fällning märkt. Steg 6,1 och 6,2 är optimeringssteg.
- Lägga renat detektering mAb (50 | ig / ml, 3 | il) till 100 | il kolloidalt guld lösning med pH-värden som varierar från 5-9. Den minsta pH-värde som håller färgen rött i två timmar anses som det optimala pH-värdet. Obs: I denna studie var 0,1 M kaliumkarbonat används för att justera kolloid guld (40 nm) till pH 8,0 (optimalt pH).
- Lägga olika mängder av renade detektera mAb (500 | ig / ml, 1-20 ^ il) till 100 | il kolloidalt guld lösning vid pH 8,0. Obs: Den optimala koncentrationen i denna studie är 6 | ig / ml (ingen svart fällning).
- Enligt ovanstående resultat, tillsätt 60 mikrogram av renat upptäcka mAb droppvis till 10 ml kolloid guldlösning. Emulgera blandningen försiktigt vid rumstemperatur under 10 min. A.dd 2 ml 5% BSA-lösning i PBS (pH 7,4) till blandningen och emulgera försiktigt vid rumstemperatur under 15 min för att reducera bakgrundsinterferens.
- Centrifugera blandningen vid 10.000 xg under 30 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten med okonjugerad antikropp försiktigt och avbryta de resulterande pellets i 4 ml PBST innehållande 1% BSA och 0,1% Tween 20, och upprepa centrifugering och upphängnings flera gånger.
- Upphäva de slutliga fällningarna i en ml PBST och förvara den vid 4 ° C tills de användes.
7. Konstruktion av immun Strip
Obs: Figur 1 visar immun strip design. Förbereda och montera remsorna i en låg luftfuktighet laboratorium miljöförhållanden (<20% relativ fuktighet) för förlängd hållbarhetstid (> 1 år). Dimensionerna för kuddar och membran är: konjugatinlägget 300 mm x 10 mm, absorberande dyna 300 mm x 24 mm, provdynan 300 mm x 24 mm, NC membran 300 mm x 25 mm, monteringsbordet 300mm x 80 mm.
- Lägga kolloid guldmärkt mAb lösningen från steg 6,6 med en mikropipett för att mätta konjugatinlägget och sedan torka den vid 37 ° C under 1 h före montering.
- Distribuera det specifika antigenet fångande mAb (500 ^ g / ml) på testzonen, och kanin-anti-mus-IgG (500 | j, g / ml) på kontrollzonen för detektering mAb på NC-membran med användning av en pipett eller immunostrip skrivare. Behåll avstånd (> 5 mm) mellan de två zonerna för att undvika störningar.
- Klistra den konjugerade pad, absorberande dyna och NC membranet på monteringsbordet med dubbelhäftande tejp.
Notera: Överlappning dynorna på varje sida av NC-membranet med ca 2 mm. Olämplig remsa konstruktion kommer att resultera i en ofullständig test. - Placera provdynan över konjugatinlägget (2 mm) och klistra in den på monteringsbordet.
- Skapa 6-mm-breda remsor med en pappersskärare. Packa remsorna i aluminiumfolien påse med torkmedel, och förvara dem vid 4 ° C tills de användes.
8. Korsreaktivitet Test
- Homogenisera 0,03 g råa muskel provet med 1 ml PBS (innehållande 0,1% BSA) i en 1,5 ml centrifugrör med användning av en bambukäpp eller slipstaven.
- Håll remsan genom den ände som är motsatt till testområdena och doppa provdynan delen i provet under 5-10 min och observera resultatet direkt.
- Valfritt: Samla 500 pl supernatant och överföra den till en ny centrifugrör.
Obs: Detta steg föreslås om signalen är inte självklart när bandet direkt indränkt i supernatanten.
- Valfritt: Samla 500 pl supernatant och överföra den till en ny centrifugrör.
- Testa olika muskelprover i tre exemplar.
Obs: Här har vi testat tonfisk, kyckling, försegla, 15 arter av valar och 5 arter av landlevande däggdjur. - Har fem oberoende inspektörer upprepa 8,3 för fem gånger, det vill säga att använda 575 remsor totalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monoklonala egenskaper antikropps
Vi utvecklade två IgG 1 mAbs (CGF5H9 och CSF1H13) som känner igen två syntetiska peptider (MKASEDLKKHGNTVLC och AIIHVLHSRHPAEFGC), respektive, av valar Mb, och dessa användes för att konstruera en sandwich-typ kolloidalt guld immunokromatografisk testremsa för snabb detektion av valar Mb. Figur 2 visar att CGF5H9 detekterar valar och andra däggdjur som en enda färgade band vid en förutsagd molekylvikt på approximativt 17 kDa. Den vikval (Balaenoptera acutorostrata) visar en jämförelsevis svagare band än banden av andra valar. Band är frånvarande för tonfisk, kycklingar och tätningar, medan ett band vid ca 50 kDa observeras för grisar. Även om det finns flera ospecifika band för svin och tonfisk, är CSF1H13 mycket specifik eftersom den endast reagerar med valar och tätningar som ett band vid en förutsagd molekylvikt på ungefär 17 kDa. Vikval bara visar en stark signal vid 1:10 (data ej visade) med ingen signal observerades vid 01:25. Figur 2 visar samma resultat i dot blot.
Figur 3A visar att CGF5H9 visar positiv signal för valar, kaniner, hundar, getter och kor (OD-värde> 3,0); svagt positiv signal för svin (OD-värde = 1,5); negativ signal för tätningar, höns och tonfisk. Figur 3B visar att CSF1H13 uttrycker hög affinitet gentemot valar och tätningar (OD-värde> 3,0). Både CSF1H13 och CGF5H9 kan reagera starkt med alla fyra valarter. Dessa fyra arter är från olika familjer (vikval: Balaenopteridae, flasknosdelfin: Delphinidae, dvärgkaskelot: Kogiidae, asiatisk tumlare: Phocoenidae), vilket tyder på en bred reaktivitet mot olika valarter.
För band konstruktion, CGF5H9, som känner igen than Mbs av valar och andra däggdjur, är kolloid guldmärkt och användes som detektionsantikroppen att binda myoglobin, och CSF1H13 beläggs på testlinjen bara för att fånga Mbs av valar och sälar. Därför testlinjen är utformad för att visa en positiv signal när båda mAbs upptäcka valar Mb. Eftersom Mb från icke-valar djur endast kan detekteras genom en av dessa två mAb, visar testlinjen ett negativt resultat när muskelprover från andra djur testas. Styrledningen visar alltid ett positivt resultat eftersom kanin-anti-mus-IgG binder kolloid guldmärkt CGF5H9. En misslyckad resultat i manöverledningen indikerar att kvaliteten på det material på remsan är dålig.
bandtest
Figur 4 visar de signalbanden på både testlinjen och manöverledningen när valar muskelprover används. När provet inte är från valar, det finns bara ett enda band vid manöverledningen with frånvaron av bandet vid testlinjen. Ett lyckat resultat kan observeras direkt i 5-10 minuter efter homogenisering 0,03 g muskel med 10 ml PBS innehållande 0,1% BSA med hjälp av en plast eller bambukäpp och blötläggning remsan i blandningen. Efter att ha testat 15 valarter och åtta icke-valarter i tre exemplar, specificitet (andelen icke-valar prover korrekt identifierats) och känslighet (andelen valar prov korrekt identifierats) är båda 100%.
Figur 1. Design av immun remsan. Alla komponenter är noggrant skiktas på till plaststödkortet, så att de överlappar varandra. Detta gör det möjligt för reagens och prov strömma upp genom membranet och till den absorberande dynan. T: testzon. C: kontrollzonen. Denna siffra har reproducerats från Lo, C. et al. Rapid immun kolloidalt guld bandför valarnas kött hållande illegal handel och konsumtion. konsekvenser för bevarande och folkhälsa PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Western blöt och dot blot-analys med användning av hybridomsupernatanterna. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Båda hybridomsupernatanter kan detektera valar som en enda färgade band vid en förutsagd molekylvikt på approximativt 17 kDa. MW: vikval, BND: flasknosdelfin, DSW: dvärgkaskelot, FP: asiatisk tumlare, PKW: pygmé späckhuggare, N: PBS (negativ kontroll). Denna siffra har reproducerats från Lo, C. et al. Rapid immun kolloidalt guld band för cetacean kött hållande illegal handel och konsumtion. konsekvenser för bevarande och folkhälsa PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Indirekt ELISA av muskelextrakt av olika arter med användning av renade mAbs. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Endast valar kan producera starka positiva signaler i båda mAbs. Denna siffra har reproducerats från Lo, C. et al Rapid immun kolloidalt guld band för valar kött hållande illegal handel och konsumtion.. Konsekvenser för bevarande och folkhälsa PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Specificitet av immun kolloidalt guld band T:. Test linje. C: manöverledningen. Endast när valar muskelprover används, kan observeras lyckade resultat (signalband på både testlinje och styrledning). (A) icke-valar prover: 1: ko. 2: Goat. 3: Pig. 4: Dog. 5: Kanin. 6: tonfisk. 7: Kyckling. 8: Knubbsäl (Phoca vitulina). (B) Cetacean prover: 1: vikval (Balaenoptera acutorostrata). 2: balaenoptera omurai (Balaenoptera omurai). 3: Bottle delfin (Tursiops aduncus). 4: Bottle delfin (T. truncatus). 5: Fraser delfin (Lagenodelphis Hosei </ Em>). 6: Indo-Pacific puckelrygg delfin (Sousa chinensis). 7: Rissos Delfin (Grampus griseus). 8: betseldelfin (Stenella attenuata). 9: näbbdelfin (Steno bredanensis). 10: Pygmy späckhuggare (Feresa attenuata). 11: Short-finned pilot whale (Globicephala macrorhynchus). 12: melonhuvudval (Peponocephala electra). 13: dvärgkaskelot (Kogia sima). 14: pygmékaskelot (K. breviceps). 15: asiatisk tumlare (Neophocaena phocaenoides). Denna siffra har reproducerats från Lo, C. et al Rapid immun kolloidalt guld band för valar kött hållande illegal handel och konsumtion.. Konsekvenser för bevarande och folkhälsa PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| valarter | Icke-valarter |
| Pygmékaskelot (Kogia breviceps) | Knubbsäl (Phoca vitulina) |
| Dvärgkaskelot (Kogia sima) | Hund (Canis lupus familiaris) |
| Kortfenad pilot whale (Globicephala macrorhynchus) | Kanin (Oryctolagus cuniculus) |
| Melonhuvudval (Peponocephala Electra) | Gris (Sus scrofa) |
| Pygmy späckhuggare (Feresa attenuata) | Get (Capra hircus) |
| Betseldelfin (Stenella attenuata) | Nötkreatur (Bos Taurus) |
| Flasknosdelfin (Tursiops truncatus) | Chicken (Gallus gallus) |
| Flasknosdelfin (Tursiops aduncus) | Gulfenad tonfisk (Thunnus albacares) |
| Frasers delfin (Lagenodelphis Hosei) | |
| Indo-Pacific puckelrygg delfin (Sousa chinensis) | |
| Näbbdelfin (Steno bredanensis) | |
| Rissos Delfin (Grampus griseus) | |
| Asiatisk tumlare (Neophocaena phocaenoides) | |
| Vikval (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Omura s (Balaenoptera omura i) |
Tabell 1. De arter som muskel var Collected och testades i denna studie. Arter inkluderar tonfisk, kyckling, försegla, 5 arter av landlevande däggdjur och 15 arter av valar (4 familjer).
| Arter | Accessionsnr. |
| Vikval (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Pygmy Bryde s (Balaenoptera Edeni) | Q0KIY2 |
| Knölval (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Grå whale (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Kaskelot (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Pygmékaskelot (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| Dvärgkaskelot (Kogia sima) | P02184 |
| Kort Beaked vanlig delfin (Delphinus delphis) | P68276 |
| Långfenad grindval (Globicephala melas) | P02174 |
| Späckhuggare (Orcinusorca) | P02173 |
| Melonhuvudval (Peponocephala Electra) | Q0KIY3 |
| Betseldelfin (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Flasknosdelfin (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Tumlaren (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Amazondelfin (Inia geoffrensisen) | P02181 |
| Longman s näbbvalar (Indopacetus pacificus) | Q0KIY9 |
| Bågnäbbval (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Småhuvudval (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Knubbsäl (Phoca vitulina) | P68080 |
| Nötkreatur (Bos Taurus) | P02192 |
| Get (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Häst (Equus caballus) | P68082 |
| Gris (Sus scrofa) | P02189 |
| Hund (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Chicken (Gallus gallus) | P02197 |
| Struts (Struthio camelus) | P85077 |
| Gulfenad tonfisk (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabell 2. myoglobin sekvenser som används i denna studie med resp GenBank accessionsnummer. Arter inkluderar tonfisk,kyckling, struts, tama däggdjur, tätning och 18 arter av valar (7 familjer). Denna tabell har reproducerats från Lo, C. et al Rapid immun kolloidalt guld band för valar kött hållande illegal handel och konsumtion. Konsekvenser för bevarande och folkhälsa PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10,1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med användning av en syntetisk peptid konjugerad till bärarprotein är anmärkningsvärt effektivare jämfört med dess besläktade protein. För en sandwich-baserad teknik, eftersom mAb utvecklas med hjälp av epitoper med kända relativa lägen, de två mAb i denna studie är inte troligt att störa varandra interaktion med målet antigenepitop. Dessutom kan reaktiviteten mellan det nativa proteinet och antikroppen av möss som immuniserats med den syntetiska peptiden-konjugat vara starkare än reaktiviteten mellan det nativa proteinet och antikroppen som produceras från det nativa proteinet 19. Användningen av syntetiska peptidkonjugat rekommenderas därför effektiva immuniseringsförfaranden och generering av lämpliga anti-peptid mAb.
Strukturen av ett protein innebär främst den sekvens av aminosyror i polypeptidkedjan. Varje aminosyra har sin sidokedja som leder till specifika egenskaper, och något ändra amino acid-sekvens resulterar i strukturändringar. Eftersom peptider med en längd av 10-20 aminosyror är idealiska för antikroppspreparat, var längden på syntetiska peptider (immunogena) vid C-terminala regionen ökat för att säkerställa att kärnantigen regionen skulle erkännas. Därför kunde de aminosyrarester bland Mbs av olika djur som resulterar i olika epitop-strukturer effektivt differentierade. Till exempel visar figur 3A nämnda peptid utformning bidrar till CGF5H9 reagerar starkt med valar, men negativt med tätningar. Ett annat exempel är de distinkta affiniteter mot kycklingar och hundar av CGF5H9 även om kycklingen har en identisk sekvens med den hos hunden i kärnantigenstället 2. Detta indikerar att sekvensen skillnaden i den yttre regionen kan leda till att strukturen förändringarna och därmed variabel bindningsaffiniteten mellan antigen och antikropp.
Western blöt, dot blöt, och indirekt ELISA användes ivår metod för att screena lämpliga mAbs. Western blöt används ofta för att detektera specifika proteiner i vävnadsextrakt eller homogenat. I denna teknik är gelelektrofores används för att separera denaturerade proteiner av längden av polypeptiden. Därför är det möjligt att bekräfta om signalen indikerar det förutsagda proteinet molekylvikt. Emellertid kan detekteringsresultatet (positiv eller negativ, stark eller svag signal) inte ha representerat den verkliga situationen för antigen-antikroppsbindning eftersom denaturerade proteiner används. Följaktligen kan dot blot användas för andra etappen screening. Dot blot är en teknik för att detektera proteiner. Det innebär en förenkling av western blot-metoden. I dot blot, är en blandning innehållande den molekyl som skall detekteras appliceras direkt på ett membran som en punkt. Detta skiljer sig från en western blöt eftersom proteinprover inte denatureras. Observera att denna teknik ger ingen information om storleken på målbiomolekylen, och en enda prick visas om två molecules av olika storlekar detekteras. Slutligen är indirekt ELISA användes för ett ligand-bindningsanalys för att generera en signal som kan vara ordentligt kvantifieras. Det ger mer information om mAb egenskaper och därigenom underlättar remsan konstruktion.
Koncentrationer av Mb i muskeln är variabla beroende på insamling plats. Till exempel simning muskler (axiella muskler) i valar har en betydligt högre halt av Mb jämfört med icke-simning muskler, och prover från unga valar skulle ha lägre Mb koncentration eftersom koncentrationen ökar Mb under ett djurs liv 20. Inledningsvis CSF1H13, som endast fångar Mb av valar och sälar, var avsedd att vara kolloid guldmärkt och vara upptäcka antikropp, och CGF5H9, som erkänner Mb många arter skulle vara infångande antikropp på testlinjen. Vi antar att den detekterande antikroppen bör vara mer specifik och den infångande antikroppen börvara mer allmänt. Emellertid var en svag positiv signal på testlinjen när valar prover med låga Mb koncentrationer användes (data ej visade). Problemet löstes när positionerna för de båda mAbs var omvänd såsom beskrivits i de representativa resultat. En bra signal även visas för en nyfödd valar (en tvinnad balaenoptera omurai) (Figur 4). Det är oklart om de egenskaper och koncentration av mAbs bidrar till detta fenomen.
I denna studie, frystes-tinades muskelprover homogeniserades med PBS används på bandtest. Andra provförhållanden och beredningsmetoder kan påverka resultatet. Till exempel bör saltlösligt protein såsom Mb extraheras med användning av PBS i stället för rent vatten. I annat fall kan utvinningen vara otillräckliga, vilket skulle kunna leda till ett avvikande resultat. Den lämpliga extraktionsbuffert: köttprovkvot är delvis ansvarig för den framgångsrika tolkning av remsan resultatet. stor amount (0,3 g i 1 ml buffert) av kontrollprov (t.ex. tamdjur) kan orsaka positivt resultat och suddig bakgrund. Men förhållandet användes i denna studie (1: 0,03) gav korrekt resultat. Endast färska muskelprover kan användas för detta bandtest. Proteinet kunde hydrolyseras eller denatureras efter vissa behandlingar (såsom härdning genom sojasås och kokning), vilket skulle kunna orsaka positiva resultat inte bara för cetacean muskelprover men också prover från andra djur (data ej visade). Därför föreslås det att rörliga källor prov och olika design planer konstruktion ska användas under strip utveckling.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll utvecklingen av två mAbs starkt reaktiva till Mb av valar, och dessa mAbs appliceras på en snabb testremsa för att differentiera Mb valar från tätning och andra djur. Även om pålitliga PCR-baserad DNA-analys för identifiering av valar kött är tillgänglig 12, det jags arbetsintensiv och tidskrävande. Det snabba testremsa är en pålitlig och snabb teknik som kan användas på fältet för att identifiera cetacean kött, vilket är mycket önskvärt för tillsynsmyndigheter 21. Det är troligt att remsan kan utvecklas för att detektera specifika Mbs från djur såsom hästar eller grisar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
