Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के रंध्र संबंधी परिसर के सेल कोर्टेक्स में में, GFP टैग PATROL1, एक झिल्ली की तस्करी प्रोटीन की डॉट्स निमिष दिखा चर कोण epifluorescence माइक्रोस्कोपी के साथ संयंत्र सेल सतहों पर fluorescently टैग प्रोटीन की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है Arabidopsis thaliana।
Protocol
पौध की 1. तैयारी
- बीज जीवाणुरहित।
- और 1 μl 10% ट्राइटन X-100 से 500 μl बाँझ पानी: 500 μl NaClO (5.0% उपलब्ध क्लोरीन) जोड़कर नसबंदी समाधान तैयार है।
- प्लेस सीए 10 ट्रांसजेनिक ए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में GFP-PATROL1 8 ले जाने thaliana बीज।
- 1 मिलीलीटर 70% इथेनॉल समाधान जोड़ें, और पांच बार inverting द्वारा अच्छी तरह मिला लें। 1 मिनट के लिए छोड़ दें।
- बीज ट्यूब के नीचे डूब का निरीक्षण करें। एक साफ लामिना का प्रवाह कैबिनेट में, धीरे से एक micropipette का उपयोग 70% इथेनॉल हटाने, और 1 मिलीलीटर नसबंदी समाधान जोड़ें। पांच बार inverting द्वारा अच्छी तरह मिक्स और 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
- बीज को धो लें। अभी भी एक साफ बेंच पर सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत काम कर रहे हैं, धीरे एक micropipette का उपयोग कर समाधान निकालने के लिए, और 1 मिलीलीटर बाँझ पानी जोड़ें। इस पाँच बार दोहराएँ। निष्फल बीज 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पानी में संग्रहित किया जा सकता है।
- ऐसाएक 0.5% Gellan गम-जम 1/2 Murashige और Skoog मध्यम प्लेट (पीएच 5.8) 9 पर निष्फल बीज डब्ल्यू। सर्जिकल टेप की दो परतों का उपयोग कर प्लेट पर ढक्कन टेप।
- एक कोल्ड स्टोरेज चैम्बर हे / एन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में थाली सेते हैं।
- 100 μmol मीटर -2 सेकंड -1 सफेद रोशनी का उपयोग कर एक 12 घंटा / 12 घंटे की प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ 23.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक विकास कक्ष में थाली हस्तांतरण, और 7 दिनों के लिए सेते हैं। लंबे समय लगभग 1 मिमी बीजपत्र साथ Seedlings तो काटा जा सकता है।
2. स्काई ड्रॉप गर्भदल नमूने के बढ़ते
नोट: VAEM अवलोकन के लिए नमूना तैयार करने में एक महत्वपूर्ण कारक नमूना और गिलास को कवर के बीच हवा के बुलबुले के शामिल किए जाने से परहेज है। बुलबुले बहुत अपवर्तनांक में मतभेद के कारण द्वारा VAEM की छवि गुणवत्ता को कम। हम बढ़ते 'आकाश बूंद' कहा जाता है, जो एक सरल विधि है, बुलबुले से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताए के बीच thaliana बीजपत्र और गिलास को कवर। इस अवलोकन करने के तुरंत पहले किया जाना चाहिए।
- 76: बेसल बफर [5 मिमी 2- (एन -morpholino) -ethanesulfonic पीएच 6.5 पर एसिड Tris (एमईएस-Tris), 50 मिमी KCl, 100 माइक्रोन CaCl 2] एक गिलास स्लाइड के केंद्र पर (आकार के 30 μl रखें × 26 मिमी, मोटाई: 1.0-1.2 मिमी)।
- विदारक कैंची का उपयोग कर एक 7 दिन पुरानी अंकुर से एक गर्भदल निकालें। अवलोकन पक्ष बेसल बफर ड्रॉप (चित्रा 1, चरण 1) पर ऊपर का सामना करना पड़ के साथ गर्भदल फ्लोट।
- एक गिलास को कवर के केंद्र पर बेसल बफर के 30 μl प्लेस (आकार: 18 × 18 मिमी, मोटाई: 0.12-0.17 मिमी) (चित्रा 1, चरण 2)। उल्टा धीरे गिलास को कवर कर दें। सतह तनाव से गिरने से बफर ड्रॉप कर पाएगा। एक किनारे पर चिमटी के साथ कवर कांच पकड़ो। बफर बूंद लगभग गर्भदल ऊपर इतना है कि कांच की स्लाइड पर विपरीत किनारे रखें।
- यह गर्भदल नमूना (चित्रा 1, चरण 3) सीधे ऊपर इतना है कि स्लाइड पर अभी भी कवर कांच के किनारे, और अभी भी चिमटी के साथ विपरीत किनारे रखने के साथ, कांच कवर के तहत बफर बूंद की स्थिति को समायोजित। कवर कांच के चलते हैं। हवा के बुलबुले के बिना एक तैयारी में जिसके परिणामस्वरूप नमूना पर एक बूंद माउंट।
- एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतकों का उपयोग अतिरिक्त बफर से साफ कर लें। तुरंत तैयारी का निरीक्षण करें (चरण 3 देखें)।
नोट: नमूने सील करने की कोई जरूरत नहीं है।
3. VAEM अवलोकन और मूवी अधिग्रहण
एक औंधा माइक्रोस्कोप एक TIRF इकाई और 1.49 की एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक TIRF उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित है: नोट: इस प्रकार के रूप वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल TIRF माइक्रोस्कोप प्रणाली 9 में वर्णित है। लेजर प्रविष्टि कोण के कम्प्यूटरीकृत नियंत्रण के लिए, एक नियंत्रण बॉक्स प्रयोग किया जाता है। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एक 488 एनएम ऑप्टिकली पंप अर्धचालक लेजर, और टी के साथ उत्साहित हैवह प्रतिदीप्ति क्लोरोप्लास्ट से autofluorescence रोकने के लिए एक 510-550 एनएम बैंड पास फिल्टर के माध्यम से पता चला है। फाइबर बिजली उत्पादन की मापा अधिकतम मूल्य 13.0-13.5 मेगावाट है। पता लगाने के लिए, एक इलेक्ट्रॉन इस्तेमाल कर रहे हैं (ईएम सीसीडी) कैमरा सिर प्रणाली और एक सी-माउंट कैमरा बढ़ाई परिवर्तन इकाई आरोप डिवाइस युग्मित गुणा।
- लेजर निर्माता के निर्देशों के अनुसार केंद्रित है और ध्यान केंद्रित जांचना।
नोट: यह कदम सटीक VAEM टिप्पणियों के लिए महत्वपूर्ण है। यह जोरदार लेजर पथ समायोजन की प्रक्रिया में से समय-समय पर चेक, अपने खुर्दबीन के लिए उपयुक्त हो, बाहर किया जाता है की सिफारिश की है।- माइक्रोस्कोपी कमरे की छत पर एक उद्देश्य लेंस मुक्त प्रकाश पथ के साथ प्रबुद्ध केंद्रीय स्थिति निर्धारित करें। केंद्रीय स्थान को चिह्नित करने के लिए, छत पर एक रंग का चक्र मुहर लगा (चित्रा 2, चरण 1, 2)।
- एक उद्देश्य लेंस (चित्रा 2, चरण 3, 4) के साथ छत रोशन। मैं स्थानांतरितकेंद्र की स्थिति (चित्रा 2, चरण 5) के लिए इस क्षेत्र lluminated। लेजर (चित्रा 2, चरण 6) ध्यान दें। ठीक धुन केंद्र (चित्रा 2, चरण 7) के लिए ध्यान केंद्रित लेजर की स्थिति।
- माइक्रोस्कोप के मंच पर एक नमूना सेट और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर अवलोकन के लिए कक्षों का चयन करें।
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोशिकाओं में मनाया जा सकता है कि चेक, और epifluorescence रोशनी (चित्रा 3) का उपयोग कोशिका की सतह पर z अक्ष स्थिति निर्धारित किया है।
- VAEM टिप्पणियों को पूरा करें।
- नियंत्रक बॉक्स के साथ धीरे-धीरे लेजर बीम के प्रवेश के कोण लगाओ। इसी समय, ध्यान से लाइव छवि की निगरानी। प्रारंभ में, छवि (चित्रा 3 बी) धुंधला हो जाएगा।
- लेजर कोण बढ़ जाती है, VAEM छवि के अंत में एक साफ छवि (चित्रा -3 सी और डी) के उत्पादन, कम धुंधला हो जाएगा। इस बिंदु पर, increa रोकलेजर कोण गाते हैं। प्रतिदीप्ति संकेत खो दिया है, एक shallower कोण करने के लिए कम।
- ठीक धुन लेजर प्रविष्टि कोण एक बेहतर छवि प्राप्त करने के लिए। ठीक ट्यूनिंग Z धुरी स्थिति की भी छवि में सुधार हो सकता है। यदि आवश्यक हो, ऑप्टिकल मानकों (लेजर शक्ति, तरंग दैर्ध्य और फिल्टर सेट) और छवि संवेदक पैरामीटर [छवि का आकार, जोखिम समय, लाभ, अंकरूपक और इलेक्ट्रॉन गुणा (ईएम) लाभ] समायोजित।
नोट: TIRF माइक्रोस्कोप उपकरण के मामले ऊपर वर्णित में इस प्रकार के रूप में, प्रतिनिधि मानकों हैं। सिर्फ कैमरे के सामने लेंस की बढ़ाई: 2X; लेजर उत्पादन: 1.0 मेगावाट; छवि का आकार: 512 × 512 पिक्सल; एक्सपोज़र समय: 100 मिसे; लाभ: 5 ×; अंकरूपक: 11 मेगाहर्ट्ज; और ईएम लाभ: 100।
- वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक बहु-पृष्ठ झगड़ा छवि फ़ाइल के रूप में एक फिल्म का मोल। इधर, फिल्म रंध्र संबंधी कोशिकाओं की सतह पर निमिष GFP लेबल डॉट्स की है।
नोट: प्रतिनिधि छवि अधिग्रहण की स्थिति में fol के रूप में कर रहे हैंचढ़ाव। अधिग्रहण मोड: स्ट्रीम राम को; फ्रेम की संख्या: 600; और बहु पृष्ठ झगड़ा फ़ाइल का आकार: ~ 302 एमबी।
4. Kymograph विश्लेषण मात्रा के लिए GFP लेबल डॉट निवास समय से फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग
- फिजी स्थापित लेखक 'निर्देशों का उपयोग सॉफ्टवेयर 10 (' फिजी बस ImageJ है ') (http://fiji.sc/Fiji)।
- फिजी चलाने के लिए और फिजी मेनू "फ़ाइल खोलें" का उपयोग कर हासिल बहु पृष्ठ झगड़ा फ़ाइल खोलें।
- फिजी उपकरण पट्टी मेनू "सीधे लाइन चयन उपकरण" का उपयोग कर, ब्याज की साइट पर एक लाइन रखें। वैकल्पिक रूप से, "खंडों लाइन चयन उपकरण" या "मुक्तहस्त लाइन चयन उपकरण" का उपयोग करें। यहाँ प्रस्तुत परिणामों में, (8.0 माइक्रोन के लिए इसी) 100 पिक्सल के एक सीधी रेखा में एक सहायक कंपनी सेल (चित्रा 4 ए) पर रखा गया था।
- फिजी मेनू "छवि ढेर-गतिशील Reslice का उपयोग कर एक kymograph छवि बनाते हैं (चित्रा 4 बी)। वैकल्पिक रूप से, एक चेक बॉक्स विंडो में और "घुमाएँ 90 डिग्री" "खड़ापलटें" भी (100 पिक्सल के लिए इसी (यहाँ प्रस्तुत परिणामों में इस्तेमाल नहीं) kymograph छवि में। एक्स और वाई अक्ष रेखा स्थिति का संकेत उपलब्ध हैं 8.0 माइक्रोन) और प्रेक्षण के समय (600 पिक्सल, क्रमशः) 60 सेकंड के लिए इसी। kymograph छवि को संतोषजनक नहीं है, तो स्थिति और प्रकार (सीधे, खंडों और बहु-पृष्ठ छवि पर लाइन की मुक्तहस्त) के रूप में। बदला जा सकता है लाइन में परिवर्तन, kymograph की छवि गतिशील रूप से बदल जाता है। फिजी मेनू "फ़ाइल के रूप में बचा-झगड़ा 'का उपयोग कर एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में एक kymograph छवि को बचाओ।
- समय धुरी के अभिविन्यास में बूँद की लंबाई मापने।
- शोर में कमी करने के लिए, फिजी मेनू "प्रक्रिया फिल्टर गाऊसी कलंक" का उपयोग kymograph छवियों के लिए एक गाऊसी फिल्टर लागू होते हैं। "सिग्मा (रेडIUS) "पैरामीटर ट्यून करने योग्य (1 पिक्सेल त्रिज्या प्रस्तुत परिणामों के लिए प्रयोग किया जाता है) है।
- खंड फिजी मेनू का उपयोग thresholding द्वारा संकेत क्षेत्रों, "छवि-समायोजित दहलीज"।
नोट: से चुनने के लिए कई thresholding एल्गोरिदम रहे हैं। प्रस्तुत परिणाम में, "येन" एल्गोरिथ्म (चित्रा 4C) चुना गया था। - मेनू का उपयोग बूँद की धुरी लंबाई समय (वाई) को मापने के लिए तैयार "विश्लेषण सेट माप"। "सेट माप" विंडो में "bounding आयत" की जाँच करें। आदर्श रूप में क्षेत्र सेट शोर बाहर करने के लिए संभव के रूप में छोटा होना चाहिए। इधर, कम से कम क्षेत्र में 50 पिक्सल में स्थापित किया गया था। समय (वाई) मेनू का उपयोग बूँद की धुरी लंबाई मापने "विश्लेषण विश्लेषण कण"। प्रबंधक को जोड़ें "परिणाम मूल्यों को प्राप्त और माप क्षेत्रों की विश्वसनीयता को साबित," प्रदर्शन के परिणाम "जाँच करने के लिए और </ Em> "बक्से।
- "ऊँचाई" स्तंभ में मानों (y) मापा बूँद (चित्रा 4D) के लिए लंबाई की धुरी समय कर रहे हैं। परिणाम तालिका मेनू "फ़ाइल-रूप में सहेजें" का उपयोग कर मूल्यों को बचाने और गणना और एक सांख्यिकीय पैकेज और / या स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर (चित्रा 4E) का उपयोग बूँद छवि की अवधियों की डाटासेट प्रक्रिया।
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Representative Results
इस वीडियो लेख, ए में GFP PATROL1 की VAEM अवलोकन के लिए प्रोटोकॉल में thaliana गर्भदल रंध्र संबंधी जटिल कोशिकाओं प्रदान की जाती हैं। स्काई बूंद बढ़ते ए के VAEM तैयारी में हवा के बुलबुले की घटना को कम करने में मदद मिल सकती है कि एक साधारण तैयारी विधि है thaliana बीजपत्र (चित्रा 1)। प्रविष्टि लेजर और / या VAEM के लिए नमूनों की जेड-स्थिति की Overtilting एक अस्पष्ट छवि प्रदान करेगा। अगर ऐसा होता है, यह epifluorescence रोशनी से न्याय के रूप में, तुरंत नमूना ऊपर एक स्थान से फिर से शुरू करने के लिए सिफारिश की है। VAEM अवलोकन के कुछ ही दिनों के अनुभव के बाद, यह इस तरह निमिष डॉट GFP-PATROL1 के यहां दिखाया गया है एक के रूप में, सफलतापूर्वक और नियमित VAEM फिल्में प्राप्त करने के लिए संभव होना चाहिए। चित्रा 4, ए में 12 स्वतंत्र सहायक कोशिकाओं से 185 GFP-PATROL1 डॉट्स के निवास समय में प्रस्तुत kymograph विश्लेषण का उपयोग thaliana बीजपत्र मापा गया। फिट घनत्वसमारोह में सबसे GFP-PATROL1 डॉट्स तेजी एक्सोसाइटोसिस / प्रोटॉन की endocytosis सहायक कोशिका की सतह पर पंप, सुझाव लगभग 3.5 सेकंड (चित्रा 4E) के एक चोटी के साथ, बीच 2 और 10 सेकंड के लिए एक सहायक कंपनी सेल में निवासी थे कि पता चला।
। आकाश की चित्रा 1. योजनाबद्ध विधि बढ़ते ड्रॉप चरण 1: नमूना Arabidopsis thaliana बीजपत्र एक गिलास स्लाइड पर बेसल बफर की एक बूंद पर जारी कर रहे हैं। चरण 2: बेसल बफर बूंद की एक बूंद एक गिलास को कवर पर रखा गया है। चरण 3: गिरावट के साथ कवर कांच उल्टा हो गया है और ड्रॉप गिलास स्लाइड पर नमूना ऊपर रखा गया है। चरण 4: कांच कवर जारी किया है और ड्रॉप नमूना करने पर पड़ता है। (शीर्ष) पक्षी की आंखों को देखने। (नीचे) पार्श्व और बढ़े देखें। मिसालएएसई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. लेजर एकत्रित की कैलिब्रेशन और ध्यान केंद्रित चरण 1:। माइक्रोस्कोप रिवाल्वर के खाली स्थिति माइक्रोस्कोप के ऊपर छत पर लेजर प्रकाश भेजने के लिए चुना जाता है। चरण 2: केंद्रीय स्थिति छत पर एक रंग का चक्र मुहर का उपयोग कर के रूप में चिह्नित किया गया है। चरण 3: एक उद्देश्य चयनित है। चरण 4: उद्देश्य लेंस के माध्यम से लेजर प्रकाश से प्रकाशित की स्थिति की जाँच करें। चरण 5: रोशनी चिह्नित केंद्रीय स्थिति के लिए निकाला जाता है। चरण 6: लेजर प्रकाश ध्यान केंद्रित किया है। चरण 7:। केंद्रित लेजर प्रकाश चिह्नित केंद्रीय स्थिति में ले जाया जाता है, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Epifluorescence माइक्रोस्कोपी और चर कोण epifluorescence माइक्रोस्कोपी (VAEM) की चित्रा 3. तुलना करें। (ए) epifluorescence माइक्रोस्कोपी में लेजर का प्रकाश पथ के योजनाबद्ध। (बी) Arabidopsis thaliana के 7 दिन पुरानी पौध में गर्भदल सतहों पर GFP-PATROL1 के प्रतिनिधि epifluorescence छवि। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन इंगित करता है। VAEM में लेजर का प्रकाश पथ (सी) योजनाबद्ध। लेजर के प्रवेश झुका हुआ है कि ध्यान दें, और यह चर गहराई के साथ नमूना की सतह उजागर करता है। (बी) के रूप में दिखाया गया एक ही क्षेत्र (डी) VAEM छवियों। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. Kymograph विश्लेषण एक GFP-PATROL1 डॉट के निवास समय यों की। (ए) VAEM छवि एक kymograph बनाने के लिए रखा एक सीधी रेखा के साथ। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन इंगित करता है। (बी) (ए) में दिखाया रेखा के साथ एक kymograph छवि। (बी) (सी) एक द्विआधारी छवि फिजी सॉफ्टवेयर में उत्पन्न येन के एल्गोरिथ्म पर आधारित है। पीला लाइनों GFP-PATROL1 संकेत के स्वत: पता लगाया क्षेत्र दिखा। (डी) स्क्रीनशॉट फिजी के परिणाम तालिका के समारोह "कणों का विश्लेषण"। (ई) सहायक कोशिकाओं में GFP PATROL1 डॉट के निवास समय की एक हिस्टोग्राम। लाल लाइन घनत्व समारोह से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस वीडियो लेख में, प्रोटोकॉल, निगरानी और Arabidopsis thaliana के रंध्र संबंधी जटिल पर GFP-PATROL1 डॉट्स के गतिशील व्यवहार को मापने के लिए दिया जाता है। यहाँ दिखाया गया है, VAEM अवलोकन संयंत्र सेल सतहों का जीना इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। अत्यधिक संवेदनशील ईएम सीसीडी VAEM प्रकाशिकी में एक अपेक्षाकृत कमजोर उत्तेजना लेजर का उपयोग परमिट क्योंकि GFP-PATROL1 निगरानी के लिए यहां इस्तेमाल प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, वीडियो पर कब्जा के 1 मिनट के लिए इस्तेमाल किया नमूने में बहुत कम प्रतिदीप्ति photobleaching, वहाँ था। लेजर केंद्रित है और प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत से पहले, ध्यान केंद्रित कर, सफल VAEM अवलोकन के लिए महत्वपूर्ण हैं। उपयोगकर्ता VAEM उपयोग करने से पहले चुना माइक्रोस्कोप कंपनी से पेशेवर कर्मचारियों द्वारा प्रशिक्षित किया जाना चाहिए।
VAEM GFP-PATROL1 प्लाज्मा झिल्ली पर निमिष एक स्थिर डॉट तरह डिब्बे के साथ एक गतिशील स्थानीयकरण है कि पता चलता है। fluorescently लेबल प्लाज्मा झिल्ली प्रोटॉन पंप AHA1 गलत एल, गार्ड कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं patrol1 उत्परिवर्ती में ocalizes पहले से 8,9 सूचना दी। इस प्रकार, VAEM-कल्पना की GFP-PATROL1 डॉट गतिशीलता प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटॉन पंप के वितरण का प्रतिनिधित्व कर सकते। GFP-PATROL1 की यह गतिशील व्यवहार संयंत्र सेल सतहों पर वास्तविक समय प्रोटीन की गतिशीलता को उजागर करने में VAEM की उपयोगिता का संकेत है, पारंपरिक बिजली दर्पण प्रकार कोंफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कल्पना करना मुश्किल है। GFP-PATROL1 अवलोकन संयंत्र कोशिका जीव विज्ञान में VAEM आवेदन की सिर्फ एक उदाहरण है। VAEM (संयंत्र कोशिकाओं में कोशिका द्रव्य के पतले cortical परत में कई घटनाओं की निगरानी करने के लिए लागू होगी जैसे, एंजाइम कोशिका दीवार संश्लेषण में स्राव या संशोधन 11,12, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन गतिशीलता 7,13,14, cortical सूक्ष्मनलिका गतिशीलता 4, actin microfilaments 4,15 के पुनर्निर्माण और organelle आंदोलन 6)। संयंत्र सेल के वैज्ञानिकों की एक विस्तृत श्रृंखला बेने चाहिएVAEM तकनीक से फिट बैठते हैं।
जैविक छवि डेटा की मात्रात्मक मूल्यांकन हाल ही में माइक्रोस्कोप उपकरण और कंप्यूटिंग के क्षेत्र में प्रगति के द्वारा संचालित, महत्वपूर्ण बन गया है। 600 (टी) पिक्सल × 512 (वाई) × 512 (एक्स) युक्त VAEM फिल्म डेटा आसानी से केवल कुछ ही मिनटों में प्राप्त किया जा सकता है। छवि विश्लेषण एक fluorescently लेबल प्रोटीन के जीवनकाल या आंदोलन को मापने में न केवल मदद करता है, लेकिन यह भी बड़े, बहुआयामी छवि के डेटासेट से जैविक जानकारी खनन में। एक kymograph प्लाज्मा झिल्ली 2 पर प्रोटीन के अनुक्रमिक भर्ती द्वारा दिखाया गया है, VAEM फिल्म डेटा से लक्ष्य प्रोटीन आंदोलन का निर्धारण करने के लिए एक बुनियादी, लेकिन मूल्यवान, दृष्टिकोण है। चित्रा 4 में दिखाया गया है kymograph, GFP PATROL1 डॉट्स 'निवास बार के दृश्य, और प्लाज्मा झिल्ली पर उनके कम गतिशीलता की अनुमति दी। इसके विपरीत, एक kymograph ऐसे साइटोप्लास्मिक स्ट्रीमिंग के रूप में और अधिक जटिल आंदोलनों, मूल्यांकन के लिए प्रभावशीलता सीमित है। अधिक compli के लिएऑप्टिकल प्रवाह 16 मददगार होगा के रूप में लिखे आंदोलन, अन्य छवि विश्लेषण इस तरह के दृष्टिकोण।
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Disclosures
लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215 (2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
