Summary
L'objectif de ce protocole est de démontrer comment surveiller la dynamique des protéines étiquetées par fluorescence sur des surfaces de cellules végétales avec angle variable épifluorescence microscopie, montrant clignoter points de GFP-tagged PATR1, une protéine de trafic membranaire, dans le cortex cellulaire du complexe stomatique dans Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Préparation de semis
- Stériliser les graines.
- Préparer la solution de stérilisation en ajoutant 500 ul de NaClO (chlore disponible: 5,0%) et 1 ul de 10% de Triton X-100 à 500 pi d'eau stérile.
- Lieu ca. 10 transgénique A. thaliana graines transportant GFP-PATR1 8 dans un tube de 1,5 ml.
- Ajouter une solution d'éthanol 1 ml de 70%, et bien mélanger en inversant cinq fois. Laissez pendant 1 min.
- Observer les graines tombent au fond du tube. Dans une hotte à flux laminaire propre, retirez délicatement l'éthanol à 70% à l'aide d'une micropipette, et ajouter 1 ml de solution de stérilisation. Mélangez bien en inversant cinq fois et laisser reposer pendant 5 min.
- Laver les graines. Je travaille toujours dans des conditions aseptiques sur un banc propre, retirez délicatement la solution à l'aide d'une micropipette, et ajouter 1 ml d'eau stérile. Répétez cette opération cinq fois. Les graines stérilisées peuvent être stockés dans de l'eau stérile à 4 ° C pendant 2 jours.
- Ainsiw les graines stérilisées sur une augmentation de 0,5% de gomme de gellane solidifié 1/2 Murashige et Skoog plaque de milieu (pH 5,8) 9. Tape le couvercle sur la plaque à l'aide de deux couches de ruban adhésif chirurgical.
- Incuber la plaque à l'obscurité à 4 ° C avec une chambre de stockage à froid, O / N.
- Transférer la plaque dans une chambre de croissance fixé à 23,5 ° C avec un cycle lumière-obscurité / 12 h-12 h en utilisant 100-pmol m -2 s -1 lumières blanches, et incuber pendant 7 jours. Les semis avec cotylédons d'environ 1 mm de long peuvent alors être récoltées.
2. Sky Goutte montage des spécimens Cotylédon
REMARQUE: Un facteur important dans la préparation des échantillons pour l'observation VAEM est d'éviter l'inclusion de bulles d'air entre l'échantillon et le verre de protection. Bubbles réduisent considérablement la qualité de l'image en VAEM provoquant des différences dans l'indice de réfraction. Une méthode simple, que nous avons appelé «chute de ciel» de montage, peut être utilisé pour éviter les bullesentre l'A. cotylédons thaliana et le verre de protection. Cela devrait être fait immédiatement avant l'observation.
- Placer 30 ul de tampon de base de [5 mM de 2- (N-morpholino) -éthanesulfonique Tris-acide (MES-Tris) à pH 6,5, KCl 50 mM, CaCl2 100 pM] sur le centre d'une lame de verre (taille: 76 × 26 mm, épaisseur: 1,0-1,2 mm).
- Retirer les cotylédons d'un semis 7-day-old avec des ciseaux de dissection. Flotteur cotylédon avec la face d'observation tournée vers le haut sur la chute de la mémoire tampon de base (figure 1, étape 1).
- Placez 30 pi de tampon de base sur le centre d'un verre de couverture (taille: 18 × 18 mm, épaisseur: 0,12-0,17 mm) (figure 1, étape 2). Tournez le couvercle en verre à l'envers doucement. La tension superficielle empêche la chute de tampon de tomber. Tenez le couvercle en verre avec des pincettes sur un bord. Placez le bord opposé de la lame de verre de telle sorte que la chute de tampon est d'environ au-dessus du cotylédon.
- Avec le bord du verre de couverture encore sur la diapositive, et tenant toujours le bord opposé avec des pincettes, ajuster la position de la chute de tampon sous le couvercle en verre de sorte qu'il est directement au-dessus de l'échantillon des cotylédons (figure 1, étape 3). Lâchez le couvercle en verre. Monter une goutte sur l'échantillon résultant à une préparation sans bulles d'air.
- Essuyez l'excès de tampon en utilisant des tissus non pelucheux. Observez la préparation immédiatement (voir étape 3).
NOTE: Il n'y a pas besoin pour sceller les échantillons.
3. VAEM Observation et Movie Acquisition
Remarque: Le système de microscope TIRF 9 utilisé dans la présente étude est décrite comme suit: Un microscope inversé est équipé d'une unité de TIRF et une lentille d'objectif TIRF avec une ouverture numérique de 1,49. Pour le contrôle informatisé de l'angle d'entrée de laser, une boîte de contrôle est utilisé. La protéine fluorescente verte (GFP) est excité avec un 488 nm à pompage optique laser semi-conducteur, et til fluorescence est détectée à travers un filtre passe-bande de 510 à 550 nm pour empêcher autofluorescence de chloroplastes. La valeur maximale mesurée de la puissance de sortie de la fibre est de 13,0 à 13,5 mW. Pour la détection, une multiplication d'électrons dispositif à couplage de charge (CCD-EM) système de tête de caméra et une unité C-mount changement caméra de grossissement sont utilisés.
- Calibrer le laser de centrage et en se concentrant selon les instructions du fabricant.
REMARQUE: Cette étape est cruciale pour les observations de VAEM précises. Il est fortement recommandé que des contrôles périodiques des procédures d'ajustement de chemin de laser, appropriée à votre microscope, sont effectuées.- Déterminer la position centrale illuminée avec un chemin de lumière sans lentille objective sur le plafond de la salle de microscopie. Pour marquer la position centrale, mettre un joint de cercle de couleur sur le plafond (Figure 2, étape 1, 2).
- Éclairer le plafond avec une lentille d'objectif (figure 2, étape 3, 4). Déplacez le illuminated région de la position centrale (figure 2, étape 5). Concentrer le laser (Figure 2, étape 6). Peaufinez la position du laser focalisé au centre (Figure 2, étape 7).
- Définir un échantillon sur la platine du microscope et de sélectionner des cellules d'observation en utilisant un éclairage à fond clair.
- Vérifier que la protéine fluorescente peut être observé dans les cellules, et mis en la position de la z à la surface cellulaire en utilisant un éclairage à épifluorescence (figure 3A).
- Effectuer des observations VAEM.
- Incliner l'angle du faisceau laser d'entrée progressivement avec le boîtier de commande. Dans le même temps, de surveiller attentivement l'image en direct. Initialement, l'image sera floue (figure 3B).
- Comme le laser angle augmente, l'image VAEM deviendra moins floue, éventuellement produire une image claire (figure 3C et D). À ce stade, arrêter Increachanter l'angle laser. Si le signal de fluorescence est perdue, pour diminuer un angle moins profond.
- Peaufinez l'angle d'entrée laser pour obtenir une meilleure image. Fine-tuning de la position de la z peut également améliorer l'image. Si nécessaire, ajuster les paramètres optiques (puissance de laser, longueur d'onde et de jeux de filtres) et des paramètres de capteur d'image [taille de l'image, le temps d'exposition, gain, numériseur et électrons multipliant (EM) Gain].
Remarque: dans le cas de l'équipement de microscope TIRF décrit ci-dessus, les paramètres représentatifs sont les suivants. Grossissement de lentille juste en face de la caméra: 2X; Sortie laser: 1,0 mW; Taille de l'image: 512 x 512 pixels; Temps d'exposition: 100 ms; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; et EM Gain: 100.
- Acquérir un film comme un fichier image TIFF multi-page à l'aide du logiciel de microscope commerciale. Ici, le film est de points GFP marquée à clignoter sur la surface des cellules des stomates.
REMARQUE: les conditions d'acquisition d'image représentatifs sont comme folbas. Mode d'acquisition: Stream RAM; Nombre de cadres: 600; et la taille multi-page du fichier TIFF: ~ 302 MB.
4. Analyse kymographe pour la quantification de la GFP marquée Dot Temps de résidence Utilisation Fidji Software
- Installez Fidji (Fidji est Juste ImageJ ') 10 logiciels en utilisant les instructions des auteurs (http://fiji.sc/Fiji).
- Exécutez Fidji et ouvrir le multi-page du fichier TIFF acquise en utilisant le menu Fidji "Fichier-Ouvrir".
- Placez une ligne sur le site d'intérêt, en utilisant l'outil barre de menu Fidji outil "Sélection de droite". Eventuellement, utiliser l'outil "Sélection de ligne sectorielle» ou «Outil de sélection Freehand Line". Dans les résultats présentés ici, une ligne droite de 100 pixels (correspondant à 8,0 um) a été placée sur une cellule filiale (figure 4A).
- Faire une image en utilisant le menu kymographe Fidji "Image-Piles-dynamique trancher de nouveau (figure 4B). Eventuellement, "Retourner verticalement" et "pivoter de 90 degrés" dans une fenêtre de case sont également disponibles (non utilisé dans les résultats présentés ici). X et Y-axe dans l'image de kymographe indiquent la position de la ligne (100 pixels correspondant à 8,0 um) et l'heure d'observation (600 pixels correspondant à 60 sec), respectivement. Si l'image de kymographe est pas satisfaisante, la position et le type (droite, segmentés et à main levée) de la ligne sur l'image multi-pages peuvent être modifiées. Comme les changements de ligne, l'image de kymographe change dynamiquement. enregistrer une image de kymographe comme un fichier TIFF en utilisant le menu Fidji "File-Save As-Tiff".
- Mesurer la longueur de la goutte dans l'orientation de l'axe des temps.
- Pour effectuer la réduction du bruit, appliquer un filtre gaussien aux images kymographe en utilisant le menu Fidji "processus Filtres-Flou gaussien". Le «Sigma (Radius) "paramètre est accordable (1 rayon de pixel est utilisé pour les résultats présentés).
- Segment les régions de signal par un seuil, en utilisant le menu Fidji "Image-Adjust-Threshold".
NOTE: Il ya plusieurs algorithmes de seuillage à choisir. Dans les résultats présentés, l'algorithme "Yen" a été choisi (figure 4C). - Préparez-vous à mesurer le temps (y) -axis longueur du blob en utilisant le menu "Analyser Set-mesures". Cochez la case "rectangle englobant" dans la fenêtre "Set Mesures". Idéalement, l'ensemble de la zone doit être aussi petit que possible, d'exclure le bruit. Ici, la superficie minimale a été fixée à 50 pixels. Mesurer le temps (y) -axis longueur du blob en utilisant le menu "Analyze-analyser des particules". Pour obtenir les valeurs de résultat et de prouver la crédibilité des régions de mesure, vérifier les «Résultats» et «Ajouter au Gestionnaire </ em> "boîtes.
- Les valeurs dans la colonne «Hauteur» sont le temps (y) axe des x longueurs pour le blob mesurée (Figure 4D). Enregistrer les valeurs en utilisant le menu de la table des résultats "File-Save As» et de calculer et de traiter l'ensemble de données de durées d'image de blob en utilisant un logiciel d'analyse statistique et / ou d'un tableur (figure 4E).
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Representative Results
Dans cet article, de la vidéo, les protocoles d'observation VAEM de GFP-PATR1 dans A. cellules complexes thaliana cotylédons stomates sont fournis. Montage de chute de Sky est une méthode de préparation simple qui peut aider à réduire l'apparition de bulles d'air dans les préparations VAEM de A. cotylédons thaliana (Figure 1). Une inclinaison trop importante du laser d'entrée et / ou z-positionnement des spécimens pour VAEM fournira une image claire. Si cela se produit, il est recommandé de commencer à nouveau à partir d'une position située immédiatement au-dessus de l'échantillon, à en juger par l'éclairage à épifluorescence. Après l'expérience de l'observation VAEM de quelques jours, il devrait être possible d'acquérir des films VAEM succès et régulièrement, comme celui représenté ici de la GFP-PATR1 point clignotant. Utilisation de l'analyse de kymographe présenté à la figure 4, les temps de séjour de 185 points GFP-PATR1 à partir de 12 cellules auxiliaires indépendants A. cotylédons thaliana ont été mesurées. La densité équipéefonction révélé que la plupart des points GFP-PATR1 résidaient dans une cellule filiale pour entre 2 et 10 secondes, avec un pic d'environ 3,5 sec (figure 4E), suggérant l'exocytose rapide / endocytose des protons pompes sur la surface de la cellule filiale.
Figure 1. Schéma de la méthode de montage chute ciel. Étape 1: Echantillon Arabidopsis thaliana cotylédons sont flottés sur une goutte de tampon de base sur une lame de verre. Etape 2: Une goutte goutte de tampon de base est placée sur une lamelle couvre-objet. Etape 3: Le cache de verre avec la goutte est tourné à l'envers et la goutte est placée au-dessus de l'échantillon sur la lame de verre. Etape 4: Le verre de protection est libérée et tombe sur la goutte de l'échantillon. (Haut) Vue à vol d'oiseau. (Bottom) latérale et vue agrandie. Please cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Etalonnage du centrage et la focalisation du laser. Etape 1: La position du revolver vide du microscope est choisie pour envoyer de la lumière laser sur le plafond au-dessus du microscope. Étape 2: La position centrale est marquée à l'aide d'un joint de cercle de couleur sur le plafond. Étape 3: Un objectif est sélectionné. Étape 4: Vérifier la position éclairée par la lumière laser à travers l'objectif. Etape 5: L'illumination est ajustée à la position centrale marqué. Étape 6: La lumière laser est focalisé. Étape 7:. La lumière laser focalisé est déplacé à la position centrale marqué S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Comparaison de la microscopie à épifluorescence et microscopie à épifluorescence à angle variable (VAEM). (A) Représentation schématique de la trajectoire de la lumière du laser en microscopie à épifluorescence. (B) de l'image d'épifluorescence Représentant de la GFP-PATR1 à la surface des cotylédons à 7 jours-vieux plants d'Arabidopsis thaliana. La barre d'échelle indique 5 um. (C) Schéma de la trajectoire de la lumière du laser dans VAEM. Notez que l'entrée du laser est incliné, et il éclaire la surface de l'échantillon avec une profondeur variable. Images (D) VAEM de la même région que représenté en (b). La barre d'échelle indique 5 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Analyse kymographe de quantifier le temps de séjour d'un GFP-PATR1 dot. Image (A) VAEM avec une ligne droite placée pour apporter une kymographe. La barre d'échelle indique 5 um. (B) Une image de kymographe long de la ligne indiquée en (A). (C) Une image binaire de (B) basé sur l'algorithme de Yen, généré dans le logiciel Fidji. Les lignes jaunes montrent la région automatiquement détecté le signal de la GFP-PATR1. (D) Capture d'écran de tableau des résultats de la Fiji "analyser des particules" fonction. (E) Un histogramme de résidence le temps de GFP-PATR1 point dans les cellules subsidiaires. La ligne rouge montre la fonction de densité. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans cet article, de vidéo, les protocoles sont donnés pour surveiller et mesurer le comportement dynamique des points GFP-PATR1 sur le complexe stomatique de Arabidopsis thaliana. Comme indiqué ici, l'observation VAEM est un outil puissant pour l'imagerie en direct de la surface des cellules de la plante. Dans les conditions expérimentales utilisées ici pour la surveillance GFP-PATR1, il y avait très peu de photoblanchiment de fluorescence dans l'échantillon utilisé pendant 1 min de capture vidéo, parce que l'EM-CCD très sensible permet l'utilisation d'une relativement faible laser d'excitation dans l'optique VAEM. Laser de centrage et de focalisation, avant le début de chaque expérience, sont importantes pour l'observation de VAEM succès. Les utilisateurs doivent être formés par le personnel professionnel de la société de microscope choisi avant d'utiliser VAEM.
VAEM révèle que GFP-PATR1 a une localisation dynamique avec un compartiment de points comme immobile clignotant sur la membrane plasmique. Les mis-l membrane plasmique pompe à protons Aha1 marqués par fluorescenceocalizes dans PATR1 mutant cellules de garde et les cellules subsidiaires, comme précédemment rapporté 8,9. Ainsi, la dynamique de points GFP-PATR1 VAEM-visualisées peuvent représenter le refoulement de la pompe à protons dans la membrane plasmique. Ce comportement dynamique de la GFP-PATR1 est difficile à visualiser à l'aide de type miroir classique galvanomètre à balayage laser microscopie confocale, indiquant l'utilité du VAEM dans la découverte de la dynamique des protéines en temps réel sur les surfaces de cellules végétales. Observation GFP-PATR1 est juste un exemple d'application VAEM en biologie cellulaire de la plante. VAEM serait applicable à la surveillance de nombreux événements dans la couche corticale mince du cytoplasme des cellules végétales (par exemple, la sécrétion d'enzymes dans la synthèse de la paroi cellulaire ou de modification 11,12, la membrane plasmique dynamique des protéines 7,13,14, la dynamique des microtubules corticaux 4, réarrangement des microfilaments d'actine et 4,15 organite mouvement 6). Un large éventail de scientifiques de cellules végétales devrait bénéadapter des techniques VAEM.
L'évaluation quantitative des données d'image biologiques a récemment pris de l'importance, entraîné par les progrès dans les équipements de microscope et de l'informatique. Données de film VAEM contenant 512 (x) × 512 (y) × 600 pixels (t) peuvent être facilement obtenus en seulement quelques minutes. L'analyse d'image contribue non seulement à la mesure de la durée de vie ou le mouvement d'une protéine marquée par fluorescence, mais aussi dans l'exploitation minière des informations biologiques provenant de grands ensembles de données, d'images multidimensionnelles. Un kymographe est une base, mais précieux, approche pour déterminer le mouvement de protéine cible à partir de données de films VAEM, comme indiqué par le recrutement séquentiel des protéines sur des membranes de plasma 2. Le kymographe a permis la visualisation des temps de séjour des points GFP-de PATR1 de, et de leur faible mobilité sur des membranes de plasma, comme représenté sur la Figure 4. À l'inverse, une kymographe a une efficacité limitée pour l'évaluation de mouvements plus complexes, tels que le streaming cytoplasmique. Pour plus complimouvement CATED, autre analyse d'image des approches telles que le flux optique 16 serait utile.
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Disclosures
L'auteur n'a rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
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