Summary
Цель этого протокола заключается в демонстрации того, как контролировать флуоресцентно-меченого динамики белков на завод клеточной поверхности с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии, показывающие мигать точками GFP-тегами ПАТРУЛЬ 1, белка через мембрану, в клеточной коре устьичного комплекса в Резуховидка Таля.
Protocol
1. Подготовка рассады
- Стерилизовать семена.
- Приготовьте раствор стерилизации путем добавления 500 мкл NaClO (активного хлора: 5,0%) и 1 мкл 10% Triton X-100 до 500 мкл стерильной воды.
- Место около 10 трансгенных А. THALIANA семена, несущие GFP-ПАТРУЛЬ 1 8 в 1,5 мл трубки.
- Добавить 1 мл 70% раствора этанола и тщательно перемешать путем обращения в пять раз. Оставить на 1 мин.
- Заметим, семена опускаются на дно пробирки. В чистом шкафу с ламинарным потоком, осторожно удалите 70% этанола, используя микропипетку, и добавить 1 мл раствора стерилизации. Все хорошо перемешать путем обращения в пять раз и оставить на 5 мин.
- Вымойте семена. Тем не менее работы в асептических условиях на чистом столе, аккуратно удалите раствор, используя микропипетку, и добавить 1 мл стерильной воды. Повторите это пять раз. В стерилизованные семена могут храниться в стерильной воде при 4 ° С в течение 2 дней.
- ТакW стерилизованных семян на 0,5% геллановой камеди-затвердевает 1/2 среды Мурашига и Скуга пластины (рН 5,8) 9. Лента крышку на пластине с помощью двух слоев хирургической ленты.
- Инкубируйте планшет в темноте при 4 ° С с холодильной камере для хранения, O / N.
- Передача пластины в камере роста, установленной на 23,5 ° С с 12-часовой / 12-часовой цикле свет-темнота с использованием 100 мкмоль м-2 с-1 белые огни, и инкубируют в течение 7 дней. Саженцы с семядолей около 1 мм длиной, то могут быть собраны.
2. Небо падение Монтаж семядольных образцов
Примечание: важным фактором в подготовке образцов для наблюдения VAEM избегает включения пузырьков воздуха между образцом и покровным стеклом. Пузыри значительно снизить качество изображения VAEM вызывая различия показателя преломления. Простой метод, который мы назвали «Небо падение" монтажа, могут быть использованы, чтобы избежать пузыреймежду А. THALIANA семядоли и защитное стекло. Это должно быть сделано непосредственно перед наблюдения.
- Поместите 30 мкл буфера базальной [5 мМ 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic кислоты-трис (MES-трис) при рН 6,5, 50 мМ КСl, 100 мкМ CaCl 2] в центре предметное стекло (размер: 76 × 26 мм, толщина: 1,0-1,2 мм).
- Снимите семядолей от 7-дневных рассады с использованием рассекает ножницы. Поплавок семядолей с наблюдения стороной вверх на базальной капли буфера (рис 1, шаг 1).
- Поместите 30 мкл буфера базальной по центру покровным стеклом (размер: 18 × 18 мм, толщина: 0.12-0.17 мм) (рис 1, этап 2). Поверните крышку стекла вниз мягко. Поверхностное натяжение предотвратит падение буфера от падения. Держите покровного стекла с помощью пинцета на одном краю. Поместите противоположный край на предметное стекло так, чтобы падение буфера составляет примерно выше семядоли.
- С краю покровного стекла еще на слайде, и все еще держа противоположный край с помощью пинцета, отрегулируйте положение капли буфера под покровного стекла так, чтобы он непосредственно над семядолей образца (рис 1, шаг 3). Отпусти покровного стекла. Установите падение на образец, в результате препарата без пузырьков воздуха.
- Протрите избыточного буфер, используя безворсовые ткани. Сразу Соблюдайте подготовку (см шаг 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет необходимости, чтобы запечатать образцов.
3. VAEM Наблюдательные Приобретение Кино
Примечание: Система TIRF микроскоп 9 используется в настоящем исследовании описывается следующим образом: инвертированный микроскоп оснащен блоком TIRF и TIRF объектив с числовой апертурой 1,49. Для компьютерного управления угла лазерного входа, используется блок управления. Зеленый флуоресцентный белок (GFP), возбуждается с 488 нм оптической накачкой полупроводниковым лазером, и тон флуоресценции детектируется посредством 510-550 нм полосового фильтра, чтобы предотвратить флуоресценции от хлоропластов. Измеренная максимальная величина выходного волокна власти 13.0-13.5 мВт. Для обнаружения, электрон умножения прибор с зарядовой связью (ПЗС-ЭМ) головка камеры системы и C-Mount блок изменения увеличения камеры используются.
- Калибровка лазерной центровки и фокусировки в соответствии с инструкциями изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является решающим для точными наблюдениями VAEM. Настоятельно рекомендуется, что периодические проверки процедур настройки лазера пути, соответствующие вашим микроскопом, осуществляются.- Определите центральную позицию подсветкой с пути света линзы объектива без на потолке микроскопии комнате. Чтобы отметить центральное положение, положить цветную печать круг на потолке (рис 2, стадии 1, 2).
- Осветите потолок с объективом (рис 2, стадия 3, 4). Перемещение IСветовая область в центральное положение (рисунок 2, пункт 5). Фокус лазер (рисунок 2, шаг 6). Тонкая настройка позиции сфокусированного лазерного к центру (рис 2, шаг 7).
- Установите образец на столик микроскопа и выберите ячейки для наблюдения с использованием яркое освещение поля.
- Убедитесь, что флуоресцентный белок можно наблюдать в клетках, и установите Z ось позицию на поверхности клеток с использованием эпифлуоресцентной освещения (рис 3а).
- Выполните VAEM наблюдения.
- Наклоните угол входа лазерного луча постепенно с коробкой управления. В то же время, мониторинг в режиме реального изображения тщательно. Первоначально изображение будет смазанным (3В).
- По мере увеличения угла лазерных изображение VAEM станет менее размыты, в конечном итоге производить четкое изображение (рис 3C и D). В этот момент, остановить increaпеть угол лазерного. Если сигнал флуоресценции теряется, уменьшается до меньшим углом.
- Тонкая настройка угол лазерного запись, чтобы получить лучшее изображение. Тонкая настройка г -Axis положение может также улучшить изображение. При необходимости, отрегулируйте параметры (оптические мощности лазера, длина волны и наборов фильтров) и параметры датчика изображения [размер изображения, время экспозиции, усиления, дигитайзер и электронно-умножения (EM) GAIN].
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае с TIRF микроскоп оборудования описано выше, представитель параметры следующим образом. Увеличение объектива только в передней части камеры: 2X; Мощность лазера: 1,0 мВт; Размер изображения: 512 × 512 пикселей; Время экспозиции: 100 мс; Выигрыш: 5 ×; Дигитайзер: 11 МГц; Е. М. усиления: 100.
- Приобретать фильм как мульти-страницы файл изображения в TIFF, используя коммерческое программное обеспечение микроскопа. Здесь, фильм из GFP-меченых точек мигающих на поверхности клеток устьичные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные условия захвата изображений являются ВОЛСминимумы. Режим съемки: поток в ОЗУ; Количество кадров: 600; и размер многостраничный файл TIFF: ~ 302 Мб.
4. Анализ кимографе для количественного определения GFP-меченых Dot Residence времени, используя программное обеспечение Фиджи
- Установите Фиджи ('Фиджи Просто ImageJ "), программное обеспечение, следуя инструкциям 10 авторов (http://fiji.sc/Fiji).
- Запустите Фиджи и открыть полученную многостраничный файл TIFF с помощью меню Фиджи "Файл-Открыть".
- Поместите линию на участке интерес, используя инструмент Фиджи барное меню "Прямая линия Выбор инструмента". При желании, использовать "Сегментированный Line Tool Selection" или "Freehand Tool Line Selection". В результатах, представленных здесь, прямая линия 100 пикселей (что соответствует 8,0 мкм) помещали на дочерней клетки (фиг.4А).
- Сделать кимографе изображение, используя меню "Изображение Fiji-Стеки-динамический Reslice (4В). При желании, "Отразить по вертикали" и "Поворот на 90 градусов" в окне флажок, также доступны (не используется в результатах, представленных здесь). X- и Y-ось в кимографа изображения указывают на положение линии (100 пикселей, соответствующее 8.0 мкм) и время наблюдения (600 пикселей, соответствующее 60 сек), соответственно. Если кимограф изображения не является удовлетворительным, положение и тип (прямой, сегменты и от руки) линии на изображении мульти-страницы могут быть изменены. В изменения линии, кимограф изображения динамически меняется. Сохранить кимографе изображение в виде файла TIFF с помощью меню "Файл Фиджи-Сохранить как-Tiff".
- Измерение длины сгустка в ориентации оси времени.
- Для выполнения уменьшения шума, применить Gaussian фильтр к кимографе изображений с помощью меню Фиджи "Process-Фильтры-Gaussian Blur". К "Сигма (РадВМС) "параметр перестраиваемый (1 Радиус пикселя используется для представленных результатов).
- Сегмент сигнальные регионы по пороговой, используя меню "Изображение Fiji-Adjust-Порог".
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько алгоритмов Thresholding, чтобы выбрать из. В представленных результатов, "Йен" алгоритм был выбран (рис 4C). - Подготовьте для измерения времени (у) ось длину BLOB с помощью меню "Анализ-Set измерений". Проверьте "прямоугольник", ограничивающие в окне "Набор измерений». В идеале набор зона должна быть как можно меньше, чтобы исключить шум. Здесь минимальная площадь была установлена на уровне 50 пикселей. Измерьте время (у) ось длину BLOB с помощью меню "Анализ-Анализ частиц". Для получения значения результат и доказать достоверность регионов измерения, проверить "Показывать результаты" и "Добавить в менеджера </ EM> "коробки.
- Значения в колонке «Рост» являются время (у) ось длины для измеряемой каплю (рис 4D). Сохраните значения с помощью меню Таблица результатов "Файл-Сохранить как" и рассчитать и обрабатывать набор данных BLOB изображения продолжительности с использованием статистического пакета и / или электронных таблиц (рис 4д).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом видео статьи, протоколы для VAEM наблюдения GFP-ПАТРУЛЬ 1 в А. THALIANA семядолей устьичных сложные клетки обеспечены. Небо падение монтаж простой способ получения, которые могут помочь уменьшить возникновение воздушных пузырьков в VAEM препаратов А. THALIANA семядоли (Рисунок 1). Слишком сильный лазера входа и / или г-позиционирования образцов для VAEM обеспечит нечетких снимков. Если это произойдет, то рекомендуется, чтобы начать снова с позиции непосредственно над образцом, судя по эпифлуоресцентной освещения. После опыта на несколько дней в VAEM наблюдения, она должна быть возможность приобрести VAEM фильмы успешно и регулярно, такие, как показано здесь GFP-ПАТРУЛЬ 1 точка мигает. Использование анализа кимографе представлено в рисунке 4, времени пребывания 185 GFP-ПАТРУЛЬ 1 точек из 12 независимых дочерних клеток в А. THALIANA семядоли были измерены. Приталенный плотностьФункция показало, что большинство GFP-ПАТРУЛЬ 1 точки проживали в подсобном камере между 2 и 10 сек, с пиком около 3.5 сек (рис 4E), предполагая, быстро экзоцитоз / эндоцитоз протона насосы на дочерней клеточной поверхности.
Рисунок 1. Схема неба упасть способ монтажа Шаг 1:. Образца Arabidopsis THALIANA семядоли плавали по капле базальной буфера на стекле. Шаг 2: капля базальной капли буфера помещают на покровного стекла. Шаг 3: защитное стекло с падением с ног на голову, и капля помещается над образцом на стекле. Шаг 4: Защитное стекло снимают и падение падает на образец. (Топ) вид птичьего полета. (Внизу) Боковые и увеличенный вид. Плеазы нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Калибровка лазерной центровки и фокусировки Шаг 1:. Пустое положение микроскопа револьвера выбран для отправки света лазера на над микроскопом потолка. Шаг 2: Центральное положение отмечено с помощью цветной круг печать на потолке. Шаг 3: Выбран цель. Шаг 4: Проверьте положение освещенной лазерным излучением через линзу объектива. Шаг 5: Подсветка доводили до отмеченной центральном положении. Шаг 6: Лазерный свет фокусируется. Шаг 7:. Сфокусированный лазерный луч перемещается в отмеченной позиции центрального Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Сравнение эпифлуоресцентной микроскопии и переменным углом наклона эпифлуоресцентной микроскопии (VAEM). (А) Схема пути света лазера в эпифлуоресцентной микроскопии. (B), представитель эпифлуоресцентной образ GFP-ПАТРУЛЬ 1 на семядольных поверхностей в 7-дневных проростков Arabidopsis THALIANA. Масштабная линейка показывает 5 мкм. (С) Схема пути света лазера в VAEM. Обратите внимание, что запись лазерного наклонена, и он освещает поверхность образца с переменной глубиной. (D), VAEM изображения одного и того же региона, как показано в (б). Масштабная линейка показывает 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Анализ кимографе количественно время на пребывание GFP-ПАТРУЛЬ 1 Dot в. (А) VAEM изображение с прямой линии, расположенной сделать кимографе. Масштабная линейка показывает 5 мкм. (B) кимограф изображения по линии, показанной на (А). (C) бинарное изображение (б) на основе алгоритма иены, генерируемого в программном обеспечении Фиджи. Желтые линии показывают автоматически обнаруженной область GFP-ПАТРУЛЬ 1 сигнала. (D) Скриншот результатов таблицы Фиджи "Анализ частиц" функцию. (Е) Гистограмма времени пребывания GFP-ПАТРУЛЬ 1 Dot в дочерних клетках. Красная линия показывает функции плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео статьи, протоколы приведены для мониторинга и измерения динамических характеристик GFP-ПАТРУЛЬ 1 точек на устьичного комплекса Arabidopsis THALIANA. Как показано здесь, VAEM наблюдения является мощным инструментом для живых изображений клеток растений поверхностей. В условиях эксперимента, используемых здесь для контроля GFP-ПАТРУЛЬ 1, было очень мало флуоресценции фотообесцвечивание в образце, используемом в течение 1 мин захвата видео, потому что очень чувствительны EM-ПЗС позволяет использовать лазер относительно слабой возбуждения в VAEM оптики. Лазерное центрирование и фокусировка, перед началом каждого эксперимента, важны для успешного наблюдения VAEM. Люди должны быть обучены профессиональным персоналом от выбранной микроскопа компании перед использованием VAEM.
VAEM показывает, что GFP-ПАТРУЛЬ 1 имеет динамический локализацию с неподвижным точечными отсеке мигает на плазматической мембране. Флуоресцентно меченные плазматическая мембрана протонного насоса AHA1 неправильно лocalizes в ПАТРУЛЬ 1 мутант замыкающие клетки и вспомогательные клетки, как сообщалось ранее 8,9. Таким образом, VAEM-визуализированы динамика точка GFP-ПАТРУЛЬ 1 может представлять доставку протонного насоса в плазматической мембране. Это динамическое поведение GFP-ПАТРУЛЬ 1 трудно визуализировать с помощью обычного гальванометра зеркала типа конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, указывая полезность VAEM в раскрытии динамики белков в режиме реального времени на поверхности клеток растений. GFP-ПАТРУЛЬ 1 наблюдение является лишь одним примером применения VAEM в завод клеточной биологии. VAEM будет применяться к мониторингу многочисленных мероприятий в тонком коркового слоя цитоплазмы в клетках растений (например фермент секреции в синтезе клеточной стенки или изменение 11,12, динамика плазмы мембранного белка 7,13,14, корковой динамики микротрубочек 4, перестановка актина микрофиламентов 4,15 и органелл движения 6). Широкий ассортимент ученых клеток растений должны Beneподходят от методов VAEM.
Количественная оценка данных биологических изображений в последнее время стал важным, движимый достижений в микроскоп оборудования и вычислительной техники. Данные VAEM кино, содержащие 512 (X) × 512 (Y) × 600 (Т) пикселей могут быть легко получены в течение всего нескольких минут. Анализ изображений не только помогает в измерении времени жизни или движение флуоресцентно-меченого белка, но также и в горнодобывающей промышленности биологическую информацию от больших, многомерных изображений наборов данных. Кимографе является основным, но ценный, подход к определению движения белка мишени от видеоданных VAEM, как показано на последовательном набора белков на плазматических мембранах 2. Кимограф разрешается визуализацию раз на жительство GFP-ПАТРУЛЬ 1 точек ", и их низкую подвижность на плазменных мембран, как показано на рисунке 4. И наоборот, кимограф ограничил эффективность для оценки более сложные движения, такие как потоковое цитоплазматической. Для получения более подробной следующлаборантом движение, другой анализ изображений подходов, таких как оптический поток 16 было бы полезно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215 (2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
