Abstract
환경 물 샘플의 고체 상 추출 (SPE)을위한 새로운 방법을 제안한다. 개발 된 프로토 타입은 비용 효율적이고 사용자 친화적이며, 신속한 자동화 및 간단한 SPE을 수행 할 수 있습니다. 예비 농축액 낮은 유기 용매 함량, 면역 측정법에 의한 분석과 호환 가능하다. 방법은 100 mL의 물을 샘플에 천연 호르몬 17β-에스트라 디올의 추출 및 미리 농도를 설명한다. 역상 SPE는 옥타 - 실리카 흡착제로 수행되고 용출 메탄올 50 % V / V를 200 μL로 이루어집니다. 용출액은 메탄올의 양을 낮추는 디 물을 첨가하여 희석한다. 수동 SPE 칼럼을 준비한 후, 전체 절차는 1 시간 이내에 자동으로 수행된다. 프로세스의 끝에서, 에스트라 디올 농도 상업용 효소 결합 면역 흡착제 분석법 (ELISA)을 이용하여 측정된다. 100 배 사전 농도를 달성하고 10 %의 V / V에서 메탄올 내용. 분자의 전체 복구1 NG로 달성된다 / L은 드 이온화 및 합성 해수 샘플을 아군.
Introduction
샘플은 분석 준비 과정에서 중요한 단계이다. 특히, 매트릭스 효과, 간섭의 감소, 및 분석 물의 농축 제거하여 정확한 결과를 획득하고 검출 하한에 도달하는 데 필요한. 내분비 방해 화합물 (EDCs)은 인해 생물에 대한 자신의 행동에 특별한 관심의 경우에도 환경에서 현재 매우 낮은 수준. 천연 호르몬 17β-에스트라 디올은 유럽 물 기본 지침에 의해 규제되는 우선 순위 물질 목록에 추가 할 수있는 유럽 연합 (EU)의 수질 오염 감시 목록에 현재와 경향이있다. 고체 상 추출 (SPE)는 일반적으로 화학 양 1-5 (크로마토 그래피, 질량 분광 분석) 6-9 및 면역 학적 검출 방법으로, 작은 물 오염 물질의 분석에 적용된다. 후자는 면역이 형식의 대형 다양한에서 사용할 수있는 TA에 고유 한, 환경 모니터링 분야에 대한 관심을 얻었다피검 rget 및 검출 하한에 도달한다. 6, 7, 10, 11, 각종 효소 결합 면역 분석법 (ELISA)은 시판되고 멀티 웰 플레이트에 한 번에 여러 개의 시료를 분석 가능하게한다. 절차는 몇 시간이 걸릴 수있는 연속 반응 단계에있다. 반응의 최종 생성물은 검량선에 기초하여 상기 표적 분자의 농도를 결정하기 위해 광학적으로 검출 할 수있다.
고전 SPE 절차는 용출액의 증발에 의해 흡착 프리 컨디셔닝 (pre-conditioning), 샘플 추출, 세척, 용출 및 농도를 포함한다. 이 추출물을 희석에 사용되는 용제는 검출 방법에 따라 선택된다. 면역 학적 방법에 대해서는, 강하게 유기 용매의 영향에있어서의 감도의 양. 12
회수 및 미리 농도 성능 외에도, 방법은 간단하고 효율적인 비용이 필요하다. procedur의 자동화전자는 인간의 관련 오류를 줄일 수 있습니다. 우리의 이전 연구 13에서 우리는 자동화 된 SPE에 대한 우리의 프로토 타입을 소개하고, 우리의 방법은 해수 시료에서 자연 호르몬 17β-에스트라 디올의 분석에 적용 하였다. 본 동영상으로 우리는 SPE 및 면역 반응에 의해 감지와의 특별한 호환성 기존의 오프라인과 온라인에 비해 우리의 방법의 기술적 인 장점을 강조하고 싶습니다. 우리는 17β-에스트라 디올의 검출 물 샘플에 적용된 프로토콜을 설명한다. SPE는 옥타 데실 실리카 (C18) 흡수제 및 용출 단계가 희석 된 메탄올 행한다 행한다.
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Protocol
참고 : 다음 프로토콜은 SPE가 50 % v / V를 메탄올로 C18 흡착제 및 용출 100 ml의 물 샘플에서 수행에 대해 설명합니다. 농축 샘플 (ELISA) 키트를 분석 면역 연결 효소 분석하기 전에 10 % v / V를 메탄올에 도달하기 위해 희석한다.
1. 시약 준비
- 물 샘플을 준비
- 이전의 임의의 다른 단계에, 0.2 ㎛의 공극 크기의 필터를 각각 100 ml의 물 샘플을 필터링.
- 물의 부피 기준으로 용액의 적절한 용적을 희석하여 목적하는 농도를 갖는 샘플 스파이크. 예를 들어, 300 μg의 / L의 농도에서 E2 참조 용액 3.3 μL 희석 E2 100 겨 / L의 물 샘플을 100㎖를 준비한다. 샘플 10 NG / L (E2)와 아군 얻기 위해이 솔루션을 10 번을 희석. 1 NG / L E2와 100 ㎖의 샘플을 얻기 위해 후자의 또 다른 열 배 희석.
- G와 유리 병 (수정되지 않은 또는 아군) 필터 샘플을 배치L45 스레드. 같은 날 샘플을 사용합니다. 작은 부분을 가지고하는 초기 농도를 추정하기 위해 ELISA로 분석된다.
- 타이트한 튜브에 50 % v / V를 탈 이온화 (디) 물에 메탄올을 희석하여 리제 300 μl를 준비합니다.
SPE 열 2. 준비
- 첫번째 메탄올 1,600 μL 후 역상 흡착제의 40 mg의 디 물 400 μl를 첨가하여 옥타 데실 실리카 흡착제 입자의 20 ㎎ / ㎖ 현탁액을 제조. 단단히 뚜껑을 닫고 소용돌이로 교반.
- 열에서 바닥 막 설치
- 기공 크기 11 μm의 한 나일론 막을 선택 및 안티 먼지 조직의 더블 레이어에 놓습니다. 3mm 직경의 펀치로, 막에서 두 개의 작은 부분을 절단.
- 평면 엔드 필터 집게와 작은 막 중 하나를 잡고 컬럼의 한쪽에 놓습니다.
- 튜브 평면 하단 커넥터 나사 조이. 멤브레인은 N이고아우 제자리에 안전하게 흡수제 첨가 할 수있다. 막 배치 된 곳 끝으로 열 가리키는 몸에 화살표를 그립니다.
- 포장 흡수제 열 준비
- 바닥을 향해 가리키는 화살표와 홀더에 열을 고정합니다. 열은 수직으로 가능한 설정해야합니다.
- 루어 락 커넥터를 사용함으로써, 컬럼 튜브의 단부에 빈 10 ㎖를 일회용 주사기를 첨부.
- , 20 ~ 200 μL 팁과 마이크로 피펫을 준비 100 μL에 볼륨을 설정합니다. 이 피펫 팁 포맷이 제조 될 흡착제 컬럼의 크기로 구성된다. 절차는 1 ml의 피펫에 사용되는 것과 같은 큰 피펫 팁을 더 어렵다.
- 소용돌이와 흡착제 서스펜션을 선동하고, 빠르게 열에서 중앙에 100 μl를 피펫. 주입하는 동안, 모든 흡 부드럽게 피펫 팅 용액을 다른 손으로 주사기를 사용하여 멤브레인을 물마루. 본 보안 목표 명세서에서연령, 주사기를 채우는 용액 입자의 명확해야하고, 입자 베드 결국 열에서 관찰 될 수있다.
- 용액에서 입자의 균일 한 현탁액을 보장하기 위해 모든 피펫 팅 단계 사이의 주식 현탁액을 교반하여이 과정을 2 번 이상 반복합니다. 그 결과 열은 흡착제의 6 밀리그램이 포함되어 있습니다.
- 현탁액 300 ㎕를 로딩하고 주사기로 흡입하여 건조되었을 때, 위치에 주사기를 유지하고 다른 손의 집게를 이용하여 상부에 제 나일론 막을 배치했다.
- 튜브와 제 2 커넥터를 나사와 주사기를 폐기하십시오. SPE 열을 사용할 준비가되었습니다.
3. 시스템 준비
- 루어 잠금 커넥터를 사용하여 장치의 SPE 열을 조입니다. 화살표는 장치에 표시된 것과 같은 방향을 가리키고 있어야한다.
- 나사 결합 장치로 샘플을 함유하는 병을 연결그것에 GL45 안전 캡을 제공했다.
- '리제'저수지에서 리제 200 μl를로드합니다.
- 로드 '희석'저수지에서 디 물 800 μL.
- 추출 단계에서 처리 된 물을 수집하는 폐기물 출구에 병을 놓습니다. 형식은 중요하지 않지만 볼륨 샘플 량에 대해서는 충분히 크게 할 필요가있다.
- 1.5 ml의 최소 볼륨 용량 센서 출구에 작은 유리 병을 놓습니다. 풍부한 출제 및 희석 버퍼를 수집 할 때 거품이 출구에 형성되므로 1 ml의 최대 볼륨이 너무 작은 것입니다.
- 압력 조정기가 수동으로 설정하여 폐쇄 위치에 확인한 역 시계 방향으로 더 이동이 불가능해질 때까지.
프로토 타입 4. SPE
- 뒷면의 버튼을 눌러 프로토 타입 전환합니다.
- 사용자 인터페이스를 준비하고 프로그램을 선택
- 사용자 인터페이스를 엽니 다. 고른컴퓨터의 통신 포트는 장치 목록에서 접속되고, 버튼 '다음'을 클릭하도록한다.
- 값 PSET 580 및 dpset 30을 입력합니다. 펌프는 실행시 580 ± 30 mbar에서 가압 시스템 및 저수지의 압력을 유지하기 위해 조정됩니다.
- 자동 모드를 선택합니다.
- 자동 모드 구석에, 상자 '구성 파일 경로'의 프로그램 파일을로드.
- 압력 조정기를 조정
- 펌프를 시작합니다.
- 레그에 대한 읽기 값이 열등하지만 320 밀리바에 가까운 때까지 수동 압력 조절기를 돌립니다.
- 펌프를 중지합니다.
- SPE의 절차를 시작하기
- 자동 모드 모서리를 눌러 '시작'. 펌프에 전환하고 추출, 용출 및 희석 단계는 자동으로 서로를 따를 것이다. 100 ml의 시료에 대한 전체 공정 50 분에서 수행된다.
- 레그의 값을 확인합니다. 최적의 유량을 보장하기 위해 추출 공정 동안 350 밀리바 - 그것은 320의 범위에 있어야한다.
- 분석 할 때까지 어둠 속에서 4-5 ° C에있는 작은 유리 병 및 저장을 닫습니다. 분석 물질의 열화를 방지하기 위해 다음 30 시간에서 분석을 수행한다.
- 처리 된 물을 폐기하십시오.
- 시스템 청소
주의 : 시스템이 필요한 각 추출 과정은 교차 오염을 방지하기 위해 세정되어야 할 후에.- GL (45) 유리 병에 메탄올 70 %의 v / V의 10 ml의 솔루션을 준비합니다.
- SPE 열을 분리 및 커넥터와 튜브를 연결합니다.
- 자동 모드에서, '청소'파일을 선택하고 동일한 압력 설정으로 시작합니다.
ELISA와 에스트라 디올 농도의 5 검출
- 사용되는 ELISA 키트와 함께 제공되는 프로토콜에 표시된 농도 교정 샘플을 준비합니다. 하나 CALIBRA 준비메탄올 10 %의 v / v를 설정 한 것과 같은 샘플로 매트릭스, 한 교정 설정 기.
- 제조업체의 지시에 따라, 플레이트에 웰에서 샘플의 필요한 양을 분배. 교정 샘플을 여과하지만 메탄올 10 % 절에서 샘플을 SPE로 처리하고, 농축되지 않은 수정되지 않은 및 아군 물 샘플을 사용하여 / V. 분석과 관련된 오류를 줄이기 위해 샘플 당 3 우물을 사용합니다.
- 효소와 반응물의 첨가 용 키트, 배양 시간, 세정 및 상기 반응 구비 프로토콜의 표시를 따르.
- 플레이트 리더 악기와 장비 제조업체의 지침에 따라 각 웰에 광 신호를 읽고 데이터를 수집합니다.
- 메탄올 10 % v를 농축 시료를 검량선과 맞 같은 매트릭스와 초기 시료 E2의 농도를 측정하고,하기에서 플레이트 판독기 기기의 소프트웨어를 사용 / V.
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Representative Results
흡착재 충전부의 재현성이 건조에 의해 평가하고 유리 바이알에 피펫 흡착제 가중치 및 초기 및 사전에도 2. 농도로 나타낸 바와 같이 결과는, 100 mL의 시료에 대해 시험 하였다 주입시의도 1. 재현성에 도시 된 농축 된 샘플은 17β-에스트라위한 상용 ELISA 키트를 사용하여 측정하고,도 3에 도시되어 아군.
제안 된 방법은 흡착제의 제조 단계 (도 1)의 사용자를 포함한다. 흡착제 입자를 기계적 안정성 개의 막 사이에 유지되는 조밀 열의 피펫 팅하면서 현탁액을 주사기로 가해지는 압력에 의해 포장된다. 그 결과 열은이 값에 6 % 오차 선택 흡착제의 6 mg을 최적화 된 금액이 포함되어 있습니다. 이 단계는 또한 작용흡착제 조절로서, 현탁액을 충당 용매 조건으로 제조된다.
제조 및 시스템 SPE 칼럼을 설치하고, 해당 저수지 솔루션을로드 한 후, 미리 농도 절차는 완전히 자동화되고 100 mL의 샘플 (도 2)에 대한 전체 미만으로 1 시간에 요구한다. 추출은 40 ± 8 분에서 수행된다. 두 개의 파라미터들이 여전히 사용자, 포장 흡수제의 제조 및 유량의 설정에 의해 영향을 받는다. 첫번째 칼럼 제조에 대규모 방법을 적용함으로써 해결할 수있다. 둘째는 시스템을 통해 솔루션을 구동하는데 사용되는 압력 값을 결정하는 압력 조정기의 수동 조정에 관한 것이다. 에러의 소스는 전자 압력 조정기를 구현하여 제거 될 것이다.
공연에 대해서는, 홍보달성 전자 집중 계수는 우선 100, 500 배 미리 농도 50 % v / v의 메탄올로 흡착제로부터 추출물을 용출함으로써 수행된다. 이어서 5 배 희석 디 물을 첨가함으로써 수행된다. 이 희석 용제 함량을 감소시키고, 면역 측정 감도를 유지. ELISA (도 3a)의 보정 곡선을 보면, 상기 농축 된 시료 중의 메탄올 비가 면역의 감도에 영향을주지 않는 것이 분명하다. 전 농도의 대표적인 결과가도 3에 도시되어있다. 방법 1 NG / 17β-에스트라 디올의 L 타서 디 물 및 인공 해수 시료에 적용 하였다. (- 30,000 겨 / L의 30) 시료의 농도는 검출 한계 이하이지만, 미리 농도 방법 성공적 분석의 범위 내에서 그 샘플을 가져온다. 회수율은 이론적 아군 농도 최종 농도를 비교함으로써 얻어졌다. 22 %와 107% ± ± 1백28퍼센트의 회수율6 % 각각 디 - 물과 인공 해수 (그림 3B)에 대해 계산 하였다.
그림 1. 그림과 흡수제 포장 방법의 재현성. 상기 제 1 커넥터와 제 나일론 막을 확보 흡착제 현탁액을 주입하고, 상기 제 막과 커넥터를 삽입하여 열을 닫는 세 단계가있다. 그 결과 열이 6 %, 표준 편차 (N = 준비 (6) 및 가중 열)와 흡착제의 6 밀리그램이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 단계별시료 주입 시간의 재현성 절차의 그림.이 솔루션 입력은 저수지 또는 병에로드됩니다. 두 출력이 낮은 용매 함량과 면역 측정법에 의한 분석을위한 호환 처리 된 샘플 (폐기물)과 농축 샘플입니다. 전체 절차는 자동화 약간 미만 1 시간 (N = 31, 표준 편차)를 취한다. 유량의 사용자의 영향은 파란색 문자로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 ELISA에 의한 E2 사전 농도 분석 3. 결과. 1 겨 / 리터 측정 ELISA 및 포인트 (A) 교정 곡선 ENR 후 디 물 (I) 및 인공 해수 (II)를 아군ichment. (B)은 1 ng의 회수율에 대해 획득 / L이 디 - 물 (I) 및 인공 해수 아군 (ⅱ) 샘플을 농축 한 후 (N = 4). 오차 막대는 복제의 수와 각 시료의 농도를 결정하는 데 사용 된 ELISA 플레이트에 웰 (3)으로부터 발생하는 표준 편차이다. 이 수치는 (13)에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
면역 분석을 사용하여 분석 하였다 물 샘플의 제조를위한 새로운 방법이 제안되었다. 악기가 자동 사용자 친화적 방식으로 고체상 추출을 수행 할 수있다.
종래의 시스템에 주입 물 샘플의 여과는 매우 중요하다. 용액에 존재하는 임의의 미립자는 여전히 잠재적으로 유체 망의 막힘을 일으키고 SPE 칼럼을 방해한다. 다른 중요한 단계는 SPE 칼럼의 제조이다. 열에있는 입자의 양이 최상의 성능을 달성하기 위해 중요하다. 입자의 응집을 방지하기 위해, 흡수제 입자의 현탁액을 제조하는 경우에 특별한주의를 기울여야한다. 이는 디 물 분획을 건조 흡착제에 제 용매 분획을 첨가 한 다음에 의해 달성된다. 이어서, 포장 공정 중에, 상기 피펫 100 μl를 잘 흡입하면서 현탁액을 혼합하는 것이 중요하다. SPE 프로의 끝에서시저, 제대로 시스템을 청소하는 것은 매우 중요하다. 다른 샘플로 작업 할 때 첫째, 교차 오염을 방지하고, 사용하지 않을 때, 둘째로는 악기의 생물 오염의 위험을 피할 수있다.
서두에서 언급 한 바와 같이, 환경 오염 물질의 작은 분자 분석 용 면역 검출 방법의 사용이 확대되고있다. 그 방법은 낮은 NG의 /의 L 레벨 7, 11 탐지의 한계에 도달하고 매우 구체적인 있다는 장점이있다. 이러한 방법은 화학적 방법, 주로 질량 분석법 관련 기술과 조합하여 사용된다. 14, 15, 후자를 필요한 높은 사전 집중 계수 도달 에이블 자동화 SPE 시스템으로부터 유기 용매 및 혜택의 사용을 제한하지 않는다. 이에 비해,이 면역 분석 완충액 조성물에 더 민감하고, 처리를 용이하게하기 위하여 시료 전처리 기술을 적응 부족. 우리의 모듈의 분석에 전념면역에 의한 쇼핑몰 분자.
우리의 자동화 된 방법으로, 샘플의 100 배 농축을 달성하고 허가 ELISA 농도 범위의 분석 물질을 검출하기 위해. 이러한 사전 농도 공연 전통적인 SPE에 비해 낮은 보일 경우, 완벽 면역 검출을위한 요구 사항을 충족. 더욱이, 장비가 전형적인 수동 또는 자동 SPE 셋업에 비해 작은 크기 (25cm X 15cm X 10cm) 및 낮은 비용을 갖는다. 13 필요한 경우, 여러 개의 시료 분석을위한 처리량 따라서 몇 장치를 사용함으로써 증가 될 수있다 병행하여. 또 다른 가능성은 절차에 필요한 시간을 단축 할 샘플 및 용리액의 작은 부피를위한 방법을 설계하는 것이다. 어떤 다른 제한이 결과의 설명을 통해 설명되었다. 사용자가 관여하는 두 단계 모두가이 프로토 타입의 진행 정도와 연결된 AC 향해 진일보함으로써 해결 될 것이다 여전히 존재ommercial 장치. 흡착제의 패킹 위상은 수동으로 수행된다. 그러나이 방법은 간단하고 재현 가능한 것으로 나타났다. 우리는 시스템이 높은 규모로 생산된다면 일회용 컬럼을 제조 할 수 있다는 것을 확신한다.
요약하면, 우리는 컴팩트, 자동화 장치의 SPE를 수행하는 새로운 방법을 설명 하였다. 우리는 상업 ELISA 키트에 의해 17β-에스트라 디올의 검출에 적용 추출 및 사전 농도 방법에 대한 설명을 통해 면역에 의해 물 샘플의 분석을위한 가능성을 증명하고있다. 상기 방법은 사용자 친화적이고 비용 효과적이고, 향후 바이오 센서 (진행중인 작업)으로 줄 적용될 수있다. 우리는 플랫폼이 식품 또는 소변 등의 EDCs 모니터링 높은 관련성 더 복잡한 샘플 행렬에 유사한 고체 상 추출 절차를 수행 할 수있게 예상된다. 우리는 우리의 시스템에 설립 곧 면역 검출 방법의 응용 프로그램을 지원하는 확신환경 분석 분야.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
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