Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Простой метод Автоматизированная твердофазной экстракции водных образцов для анализа иммунологических малых загрязнителях

Published: January 1, 2016 doi: 10.3791/53438

Abstract

Новый метод для извлечения твердой фазы (SPE) в пробах окружающей среды, водных предлагается. Разработанная прототип является экономически эффективным и удобным, а также позволяет выполнять быстрый, простой и автоматизированной SPE. Предварительно концентрированный раствор совместим с помощью иммунологического анализа, с содержанием низкой органическом растворителе. Описан метод для извлечения и предварительной концентрации естественного гормона 17 -эстрадиола в пробах воды 100 мл. С обращенной фазой НПП выполняется с октадецил-кремнезема сорбента и элюирование проводится с 200 мкл метанола 50% об / об. Элюент разбавляют добавлением ди-воды, чтобы снизить количество метанола. После подготовки вручную столбец SPE, общая процедура выполняется автоматически в течение 1 часа. В конце процесса, концентрация эстрадиола измеряется с использованием коммерческого энзим-связанного иммунного-сорбента анализа (ELISA). 100-кратное предварительно концентрация достигается и содержание метанола в только 10% объем / объем. Полное восстановление молекулыдостигаются с 1 нг / л шипами образцы деионизированной и синтетические морской воды.

Introduction

Подготовка образца является важным шагом в любом аналитическом процессе. В частности, удаление матричных эффектов, уменьшения помех, и обогащение аналита необходимы для получения точных результатов и достичь низких пределов обнаружения. Эндокринные нарушения соединения (СЭД) имеют особый интерес в связи с их действием на живые организмы, даже когда присутствующие на очень низких уровней в окружающей среде. Естественный гормон эстрадиол 17β-присутствует на загрязнение воды ЕС Наблюдать список и склонны быть добавлены в список приоритетных веществ, регулируемых в рамках Рамочной директивы Европейской Водной. Твердофазная экстракция (ТФЭ) обычно применяется для анализа малых загрязняющих веществ в воде, как с химической 1-5 (хроматографии, масс-спектрометрии) и иммунологических методов обнаружения 6-9. Последнее получила интерес в области мониторинга окружающей среды, а иммунологические доступны в большом разнообразии форматов, являются специфическими для ТАrget аналита, и достичь низких пределов обнаружения. 6, 7, 10, 11 Различные твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) являются коммерчески доступными и позволяют проанализировать несколько образцов сразу на нескольких луночный планшет. Процедура состоит в последовательных стадий, которые могут занять несколько часов. Конечный продукт реакции может быть обнаружено оптически для определения концентрации молекулы-мишени на основе калибровочной кривой.

Классические процедуры SPE включают сорбента предварительного кондиционирования, извлечение пробы, промывку, элюирование и концентрации путем выпаривания элюента. Растворитель, используемый для разбавления экстракта выбирают в зависимости от способа обнаружения. Для иммунологических методов, количество органических растворителей сильно влияет на чувствительность метода. 12

В дополнение к восстановлению и предварительно концентрации выступлений, метод также должен быть простым и экономически эффективным. Автоматизация procedurЕ помогает уменьшить количество ошибок человека, связанных с. В нашей предыдущей работе мы ввели 13 наш прототип автоматизированного SPE, и наш метод был применен к анализу естественного гормона 17 -эстрадиола в пробах морской воды. С помощью настоящего видео мы хотели бы подчеркнуть технические преимущества нашего метода по сравнению с традиционной офф-лайн и он-лайн SPE, и его совместимости с конкретной обнаружения по иммуно-реакции. Мы опишем протокол применяется к проб воды для определения 17 -эстрадиола. SPE осуществляется с октадецил-кремнезема (С18) фазы сорбента и элюирование осуществляется с помощью разбавленной метанола.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Следующий протокол описывает SPE выполнены на 100 мл воды образца с C18 сорбента и элюирование 50% об / об метанол. Обогащенный образец разбавляют, чтобы достичь 10% об / об метанол перед анализом с твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) комплект.

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка проб воды
    1. Перед любой другой стадии, фильтрации каждой выборки 100 мл воды с размером 0,2 мкм фильтров пор.
    2. Шип образца с требуемой концентрации разбавлением соответствующего объема раствора сравнения в объеме воды. Например, приготовить 100 мл пробы воды с 100 нг / л Е2 разбавлением 3,3 мкл контрольного раствора Е2 в концентрации 300 мкг / л. Развести это решение в десять раз, чтобы получить образец с шипами 10 нг / л Е2. Развести этот последний еще десять раз, чтобы получить выборку из 100 мл с 1 нг / л Е2.
    3. Поместите образец отфильтрованного (немодифицированного или шипами) в стеклянной бутылке с GL45 нить. Используйте образец в тот же день. Возьмем небольшую часть для анализа ELISA с оценить начальную концентрацию.
  2. Подготовьте 300 мкл элюента разбавлением метанола в деионизированной (ди) воды до 50% объем / объем в жесткой трубке.

2. Подготовка колонке SPE

  1. Подготовка 20 мг / мл суспензии октадецил-кремнезема частицы сорбента, добавив первые 1600 мкл метанола, а затем 400 мкл ди-вода до 40 мг сорбента с обращенной фазой. Плотно закрыть крышкой и агитировать с вихрем.
  2. Установка нижнюю мембрану в колонке
    1. Выберите один нейлоновую мембрану с размером пор 11 мкм и поместить его на двойной слой анти-пыль ткани. С диаметром 3 мм удар, вырезать две небольшие части в мембране.
    2. Возьмите одну из маленьких мембран с плоским конечных фильтров пинцетом и поместить его на одной стороне колонны.
    3. Винт с плоским дном разъем с трубкой и затяните. Мембрана нвл на месте, а сорбент может быть добавлен надежно. Draw стрелкой на корпусе, указывающей на колонке к концу, где мембрану помещали.
  3. Подготовка насадочной колонны сорбента
    1. Закрепите колонку на держателе с стрелкой в ​​направлении снизу. Колонка должна быть установлена ​​как вертикально, насколько это возможно.
    2. Приложить пустой 10 мл одноразовый шприц к концу трубки колонны, с помощью разъемов Луера.
    3. Подготовка микро-пипетки с наконечником в 20-200 мкл, установите громкость на 100 мкл. Этот формат наконечник пипетки приспособлен к размеру колонки сорбента, который будет подготовлен. Процедура будет сложнее с большими наконечники пипеток, таких как те, которые используются с 1 мл пипетки.
    4. Перемешивают сорбента суспензии с вихрем, и быстро пипетки 100 мкл в центре на колонке. При введении, аспирация аккуратно все пипетировали решение корыта мембрану с помощью шприца с другой стороны. В этом говозраст, раствор заполнение шприца должно быть ясно из частиц, а слой частиц в конечном итоге может наблюдаться в колонке.
    5. Повторите этот процесс еще 2 раза посредством перемешивания смеси суспензии между всеми шагами пипеток, чтобы обеспечить гомогенную суспензию частиц в растворе. Полученную столбец содержит 6 мг сорбента.
    6. Когда 300 мкл суспензии были загружены и сушат отсасыванием шприцем, держать шприц в положении, и поместить второй нейлоновую мембрану в верхней с помощью щипцов с другой стороны.
    7. Заверните второй разъем с трубкой и распоряжаться шприц. Колонка SPE готов к использованию.

3. Подготовка системы

  1. Затянуть колонку SPE на устройстве с помощью разъемов Луера. Стрелка должна указывать на ту же сторону, показанному на устройстве.
  2. Подключите бутылку, содержащую образец для устройства на закручиваниипри условии, GL45 защитный колпачок на нем.
  3. Загрузка 200 мкл элюента в резервуаре '' элюента.
  4. Нагрузка 800 мкл ди-вода в "разбавления" резервуара.
  5. Поместите бутылку на выходе отходов для сбора обработанной воды во время стадии экстракции. Формат не важен, но объем должен быть достаточно большим по отношению к объему пробы.
  6. Поместите маленький пузырек на выходе датчика с минимальным объемом мощностью 1,5 мл. Максимальный объем 1 мл будет слишком мал, как пузырьки образуют в этой розетке при сборе обогащенного элюент и буфер для разведения.
  7. Убедитесь, что регулятор давления находится в закрытом положении, повернув его вручную, обратный по часовой стрелке до тех пор, дальнейшее движение не возможно.

4. SPE с Prototype

  1. Переключение на прототипе, нажав на кнопку на задней.
  2. Подготовка пользовательский интерфейс и выбора программы
    1. Открыть пользовательский интерфейс. Выбратькоммуникационный порт на компьютере, к которому подключено устройство из списка, и нажмите кнопку «Далее».
    2. Введите значения для 580 PSET и 30 для dpset. Насос будет регулировать, чтобы поддерживать давление в системе под давлением и резервуаров 580 ± 30 мбар при запуске.
    3. Выберите автоматическом режиме.
    4. В автоматическом режиме угол, загрузите файл программы в «пути файла конфигурации" окно.
  3. Регулировка регулятора давления
    1. Запустите насос.
    2. Поверните вручную регулятор давления, пока значение читать пропитанного связующим веществом, не уступает, но близко к 320 мбар.
    3. Остановите насос.
  4. Запуск процедуры SPE
    1. Нажмите 'Start' в автоматизированном режиме углу. Насос включается и добыча, и элюции разведение шаги автоматически следуют одна за другой. Вся процедура для образца 100 мл выполняется в 50 мин.
    2. Проверьте значение пропитанного связующим веществом,. Она должна быть в диапазоне 320 - 350 мбар в течение стадии экстракции, чтобы обеспечить оптимальную скорость потока.
    3. Закройте маленький пузырек и хранить при 4-5 ° С в темноте до анализа. Выполнить анализ в следующей 30 часов, чтобы предотвратить деградацию вещества.
    4. Избавьтесь от обрабатываемой воды.
  5. Очистка системы
    Примечание: После каждой процедуры экстракции система должна быть очищена, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
    1. Приготовьте 10 мл раствора метанола, 70% об / об в стеклянной бутылке GL 45.
    2. Отключите колонку SPE и подключить трубку с разъемами.
    3. В автоматическом режиме, выберите файл "Очистка" и начать его с теми же настройками давления.

5. Обнаружение эстрадиола концентрации с ELISA

  1. Подготовка калибровочных образцов с концентрацией, как указано в протоколе, снабженный набором ELISA, который используется. Подготовьте Calibraции устанавливается в такое же матрицы, что и образец, и один калибровочный набор с метанолом 10% об / об.
  2. Нанесите необходимое количество образца в лунки на тарелку, в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте калибровочные образцы, немодифицированные и шипами образцы воды, которые были отфильтрованы, но не обработанные SPE, и обогащенные образцы в метаноле 10% об / об. Использование 3 скважины на образец, чтобы уменьшить ошибку, связанную с анализом.
  3. Выполните указания на протокол, который снабжен комплектом для добавления реагентов, времени инкубации, промывки и дальнейшей реакции с ферментом.
  4. Read оптический сигнал в каждую лунку в соответствии с инструкциями изготовителя комплекта с помощью планшет-ридера инструмента и сбора данных.
  5. Использование программного обеспечения в планшет-ридере инструмента, чтобы соответствовать калибровочных кривых и определения концентрации E2 в исходном образце с той же матрицей, и в обогащенном метанолом образцы 10% об / об.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Воспроизводимость сорбента упаковки оценивали путем сушки и взвешивания пипеткой сорбента в стеклянных флаконах, и результат показан на рисунке 1. Воспроизводимость момент инъекции тестировали на образцах 100 мл, как показано на рисунке 2. Концентрация в начальной и предварительно Концентрированный шипами образцы определяется с использованием коммерческого ELISA комплекта для 17 -эстрадиола и показаны на рисунке 3.

Предложенная процедура включает в себя пользователя для подготовки фазе сорбента (рис 1). Частицы сорбента удерживается между двумя мембранами на механическую стабильность и плотно упакованы с давлением, приложенным со шприцем, а пипетки суспензии в колонне. Полученную столбец содержит оптимизированную количестве 6 мг выбранного сорбента с только 6% ошибки на этом значении. Этот шаг также действуета сорбента кондиционирования, как суспензию получают в условиях, выделяемых растворителей.

После подготовки и установки колонки SPE в системе, и загрузка решения в соответствующих резервуарах, процедура предварительного концентрация полностью автоматизирован и требует в общем меньше, чем 1 час в течение 100 мл образца (рис 2). Экстракция выполняется в 40 ± 8 мин. Только два параметры еще находится под влиянием пользователем, при подготовке упакованной сорбентом и настройки скорости потока. Первый будет решена путем применения больших масштабах методами для изготовления колонны. Второй связан с ручной регулировкой регулятора давления, который определяет значение давления используется для привода решения через систему. Этот источник ошибки будут устранены путем внедрения электронного регулятора давления.

Что касается характеристик, то прКоэффициент электронной концентрации достигается 100. Во-первых, 500-кратный заранее концентрация осуществляется элюирование экстракт из сорбента с 50% об / об метанол. Затем разбавление в 5 раз выполняется путем добавления ди-вода. Это разбавление снижает содержание растворителя и сохраняет чувствительность иммуноанализа. Если посмотреть на калибровочных кривых ELISA (фиг.3А), ясно, что отношение метанолом в обогащенном образце не влияет на чувствительность иммуноанализа. Представитель результат предварительной концентрации показана на рисунке 3. Метод был применен к образцам ди-воды и искусственный морской воды с шипами 1 нг / л 17 -эстрадиола. В то время как концентрация образца были ниже предела обнаружения, метод предварительной концентрации успешно приводит эти образцы в диапазоне анализа (30 - 30 000 нг / л). В восстановление были получены путем сравнения конечной концентрации с теоретической концентрации шипами. Восстановление 128% ± 22% и 107% ±6% были рассчитаны по ди-воды и искусственной морской воды соответственно (фиг.3В).

Рисунок 1

Рисунок 1. Иллюстрация и воспроизводимость метода для сорбента упаковки. Есть три шага: обеспечение первого нейлоновую мембрану с первого разъема, инъекционных сорбента подвеску, и закрытие, вставив вторую мембрану и разъем колонки. В результате столбец содержит 6 мг сорбента с 6% стандартного отклонения (N = 6, подготовленный и взвешенных столбцов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Шаг за шагомИллюстрация процедуры с воспроизводимости времени для инъекций образца. Входы решение загружаются в водоемах или бутылки. Два выхода являются Обработанный образец (отходы) и обогащенного образца, который совместим для анализа иммуноферментного анализа с низким содержанием растворителя. Вся процедура автоматизирована и занимает немного меньше, чем 1 час (N = 31 со стандартным отклонением). Влияние пользователя на расходе подсвечивается голубыми символами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Результаты предварительной концентрации Е2 и анализа ELISA. (A) калибровочные графики в ELISA и точек измерений за 1 нг / л шипами ди-вода (I) и искусственной морской воды (II) после того, как ENRichment. (B) Восстановление получены в течение 1 нг / л шипами ди-вода (I) и искусственной морской воды (II) образцов после обогащения (п = 4). Столбики ошибок являются стандартные отклонения, возникающие из числа повторов и 3 скважин на ELISA пластины, которые были использованы для определения концентрации в каждом образце. Эта цифра была изменена с (13). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Предложен новый способ получения проб воды с последующим анализом с помощью иммуноферментного анализа. Прибор позволяет выполнять извлечение твердой фазы в автоматизированном и удобный способ.

Фильтрация пробы воды до его введения в систему является критическим. Любые частицы, все еще присутствующие в растворе потенциально вызвать засорение жидкостного сети и препятствуют колонку SPE. Еще одним важным шагом является подготовка колонке SPE. Количество частиц в колонке решающее значение для достижения лучших спектаклей возможно. Особое внимание должно быть принято при подготовке суспензии частиц сорбента, чтобы избежать агломерации частиц. Это достигается путем добавления сначала фракции растворител в сухом сорбента, а затем фракцию ди-воды. Затем в течение этапа упаковки, важно, чтобы смешать подвески, а также аспирации 100 мкл с помощью пипетки. В конце про SPEметку в надлежащей очистки системы имеет решающее значение. Во-первых, она предотвращает перекрестное загрязнение при работе с различными образцами, а во-вторых это позволяет избежать риска биологическим загрязнением инструмента, когда он не используется.

Как было сказано во введении, использование методов иммуно-обнаружения для анализа молекул малого загрязняющих веществ в окружающую среду расширяется. Эти методы достигают предела обнаружения в низких уровнях нг / л 7, 11 и имеют то преимущество, что очень специфична. Такие методы используются в комбинации с химическими методами, главным образом масс-спектрометрии, связанных методов. 14, 15 последние не ограничивают использование органического растворителя и выгоды от автоматизированных систем, которые позволяют SPE достижения требуемого высокие показатели предварительного концентрирования. Для сравнения, иммунологические более чувствительны к буферной тест-композиции и отсутствие адаптированы методы подготовки образца, чтобы облегчить процесс. Наш модуль посвящен анализу сМолекулы торговый центр по иммунологического.

С нашей автоматизированный метод, обогащение в 100 раз образца достигается и разрешения для обнаружения аналита в диапазоне концентраций ELISA. Если эти предварительно концентрации выступления кажутся низкими по сравнению с традиционными SPE, они прекрасно соответствуют требованиям для иммуно-обнаружения. Кроме того, прибор имеет небольшой размер (25 см х 15 см х 10 см) и низкую стоимость по сравнению с обычными ручные и автоматические SPE установок. 13 При необходимости, пропускная для многократного анализа проб, следовательно, может быть увеличена с помощью нескольких устройств в параллели. Другой возможностью было бы разработать метод для небольших объемов образца и элюента, который уменьшит время, необходимое для процедуры. Некоторые другие ограничения были обсуждены через описание результатов. Есть еще два шага, где участвует пользователь, и связанные со степенью развития этого прототипа и будет решаться путем на один шаг дальше в сторону переменного токаommercial устройство. Упаковка фазе сорбента производится вручную. Метод Однако показано, что легко и воспроизводимым. Мы уверены, что одноразовые колонны может быть произведено, если система были произведены на более высоком уровне.

В целом, мы описали новый метод для выполнения SPE на компактном автоматизированной устройства. Мы показали свой потенциал для анализа проб воды с помощью иммунологического анализа через описание способа экстракции и концентрации предварительно приложенного к обнаружению 17 -эстрадиола от коммерческого набора ELISA. Метод является удобным и экономически эффективным, и может в будущем применяться в линии с биосенсоров (работа в процессе). Мы ожидаем, что наша платформа позволит выполнять подобные процедуры извлечения твердой фазы на более сложных образцов матриц, имеющих большое значение для мониторинга ЭЭС, таких как продукты питания или мочи. Мы убеждены, наша система будет поддерживать приложения установленных и предстоящих методы иммуно-обнаружения вполе экологического анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size Merck Millipore GNWP04700 For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size Merck Millipore NY1104700 For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm Medical Budget 39302439
Nucleodur C18 ec  Macherey Nagel 713550.01 50 μm particle diameter
Synthetic sea water Sigma Aldrich SSWS500-500ML
Methanol VWR
17beta-estradiol standard Enzo Life Science 300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit Enzo Life Science ADI-900-008 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
  2. Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
  3. Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
  4. Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
  5. Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
  6. Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
  7. Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
  8. Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
  9. Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
  10. Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
  11. Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
  12. Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
  13. Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
  14. Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
  15. Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 107 пробоподготовки экстракция твердой фазы Автоматизация анализ воды Эстрадиол иммуноферментный
Простой метод Автоматизированная твердофазной экстракции водных образцов для анализа иммунологических малых загрязнителях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heub, S., Tscharner, N., Kehl, F.,More

Heub, S., Tscharner, N., Kehl, F., Dittrich, P. S., Follonier, S., Barbe, L. A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants. J. Vis. Exp. (107), e53438, doi:10.3791/53438 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter