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Environment

对水样的自动固相萃取小污染物的免疫学分析的简单方法

Published: January 1, 2016 doi: 10.3791/53438

Abstract

对环境水样的固相萃取(SPE)的新方法。所开发的原型是成本效益和用户友好的,并能进行快速,自动化和简单的SPE。预浓缩的溶液与通过免疫测定分析兼容,具有低的有机溶剂含量。一种方法被描述为天然激素17β雌二醇在100ml水样提取和预浓缩。反相SPE执行与十八烷基二氧化硅吸附剂和洗脱用200μl甲醇50%体积/体积的完成。洗脱剂是通过将二 - 水,以降低甲醇的量稀释。手动制备SPE柱后,整体过程1小时内自动执行。在该过程结束时,雌二醇浓度通过使用市售酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测定。 100倍预浓缩得以实现,在只有10%体积/体积的甲醇含量。完全恢复的分子用1ng得以实现/升掺入去离子和合成海水样品。

Introduction

样品制备是在任何分析过程中的重要一步。特别是,除去基体效应,干扰的缩减,且分析物的富集是必要的,以获得精确的结果,并达到检测的低限。内分泌干​​扰化合物(内分泌干扰物)是特别值得关注的,因为它们对活的生物体的动作,即使在环境中存在的非常低的水平。天然激素17β雌二醇存在于欧盟水污染的收藏和容易被加入到根据欧洲水框架指令调节优先物质清单。固相萃取(SPE)通常适用于小的污染物在水中的分析,与两个化学1-5(色谱,质谱)和免疫6-9检测方法。后者积累了环境监测领域的兴趣,如免疫测定法是在大量的各种格式提供,特定于たrget分析物,和达到低检测极限。6,7,10,11的各种酶联免疫吸附测定(ELISA)是可商购,并使得能够分析多个样品同时上的多孔板。该过程包括在连续的反应步骤,可能需要几个小时。反应的最终产物,可以检测光学来确定基于校准曲线对目标分子的浓度。

经典的SPE程序包括吸附剂预调节,样品萃取,清洗,洗脱,浓缩由洗脱液蒸发。用于稀释该提取物的溶剂选自根据检测方法。对于免疫学方法中,有机溶剂的影响强烈的方法的灵敏度的量。12

除了回收和预浓缩的表演中,该方法也需要简单和成本效益。在再修改的自动化Ë有助于减少人类相关的错误。在我们以前的工作13我们推出了样机的自动固相萃取,而我们的方法适用于天然激素17β雌二醇海水样品中的分析。在本视频中,我们想强调我们方法的技术优势相对于传统的离线和在线SPE,以及它与通过检测免疫反应的具体的兼容性。我们描述适用于水样品17β雌二醇的检测的协议。 SPE与十八烷基硅胶(C18)吸附剂相和洗脱用稀甲醇进行执行。

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Protocol

注意:下面的协议说明了SPE 100毫升的水样品与C18的吸附剂和洗脱用50%体积/体积甲醇进行。富集的样品稀释分析用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒的酶之前达到10%体积/体积甲醇。

1.准备试剂

  1. 制备水样
    1. 之前的任何其它步骤,筛选各100毫升的水样品与0.2μm孔径的过滤器。
    2. 通过稀释的参考溶液适当体积入水体积穗与期望浓度的样品。例如,制备100毫升的水样品与E2的100纳克/升的稀释3.3微升的E2参考溶液在300微克/升的浓度。稀释此溶液十次以获得一个样品掺入10纳克/升的E2。稀释后者另一个十倍,得到100ml的样品与1纳克/升的E2。
    3. 放置过滤后的样品(未修饰的或加标)在玻璃瓶中以GL45线程。使用示例在同一天。取一小部分,以与ELISA法进行分析,来估计初始浓度。
  2. 通过在去离子(二 - )水在紧管稀释甲醇至50%体积/体积制备300μl的洗脱液。

2.制备固相萃取柱的

  1. 通过加入第一1600微升甲醇中,然后加入400μl的二 - 水至40mg反相吸附剂的制备20毫克/毫升悬浮十八烷基二氧化硅吸附剂颗粒。盖紧盖子,搅拌用旋涡。
  2. 安装在塔底部的膜
    1. 选择一个尼龙膜孔径为11微米,将其放置在防尘组织构成的双层。用3毫米直径冲头,切断在膜2的小零件。
    2. 抓住小膜用平头镊子过滤器之一,并将其​​放置在列的一侧。
    3. 拧平底接头与管并拧紧。该膜为n流到位和吸着能够可靠地加入。上朝向的最后一列指示的体绘制的箭头,其中膜置于。
  3. 准备填充吸附柱
    1. 固定柱向底部的箭头指向在支架上。列必须是垂直地设置。
    2. 附加空10毫升一次性注射器到列的管的端部,通过使用鲁尔锁定连接​​器。
    3. 准备微量移液器用20-200微升小费,定容至100微升。此枪头格式适于吸附剂柱的要制备的大小。该程序将具有较大的枪头,如用1毫升吸管中使用的那些更加困难。
    4. 搅动吸附剂悬浮液用涡旋,并迅速吸管100微升在中心上的列。同时注入,吸轻轻所有移液溶液通过使用注射器用另一只手槽膜。在这届年龄,溶液灌装注射器必须明确微粒,粒子床最终可以在列中观察到。
    5. 通过搅拌所有移液步骤之间的纸浆悬浮液,以确保在溶液中的颗粒的均匀悬浮液重复此过程2次。由此产生的列包含吸附剂6毫克。
    6. 当将300μl悬浮液已被加载并通过用注射器抽吸干燥,保持注射器在适当位置,并放置在顶部的第二尼龙膜通过使用钳子用另一只手。
    7. 拧紧第二个连接器管和处置注射器。该固相萃取柱就可以使用了。

3.准备系统

  1. 通过使用鲁尔锁接头拧紧设备上的固相萃取柱。箭头必须是指向相同的方向在设备上显示的。
  2. 通过拧紧连接含有样品到装置中的瓶它提供了GL45安全帽。
  3. 加载200微升洗脱液中的“淋洗液”水库。
  4. 负载800微升二水的“稀释”水库。
  5. 将一个瓶在排污口在提取步骤收集处理过的水。格式并不重要,但体积需要足够大的方面的样品体积。
  6. 将小瓶在1.5毫升体积最小容量的传感器出口。 1 mL的最大容积将过小,收集丰富洗脱液和稀释液时气泡会形成在该出口。
  7. 验证压力调节器处于关闭位置时通过手动转动它,反向旋转,直至进一步的移动是不可能的。

4. SPE与原型

  1. 通过按下背面的按钮开关上的原型。
  2. 制备用户界面和选择程序
    1. 打开用户界面。选择计算机的通讯端口来进行设备从列表连接,然后点击按钮“下一步”。
    2. 输入值580 PSET和30 dpset。泵将调整运行时,以维持在加压系统和储层压力,在580±30毫巴。
    3. 选择自动模式。
    4. 在自动模式下的角落,装入箱子“配置文件路径”程序文件。
  3. 调节压力调节器
    1. 启动泵。
    2. 手动转动压力调节器,直到读取预浸料值小于但接近320毫巴。
    3. 停止泵。
  4. 启动SPE程序
    1. 按在自动模式下的角落“开始”。泵将接通和提取,洗脱和稀释步骤将自动跟随另一个。在50分钟中进行,整个过程在100毫升样品。
    2. 验证预浸的值。它必须是在范围320 - 350毫巴在提取步骤以确保最佳的流速。
    3. 关闭小瓶并储存在4-5°C黑暗直至分析。在下面的30小时进行分析,以防止分析物的降解。
    4. 处置处理过的水。
  5. 清洁系统
    注意:在待清洁每次萃取步骤的系统需要防止交叉污染。
    1. 制备甲醇70%体积/体积的在一个GL 45玻璃瓶10ml的溶液中。
    2. 拔下固相萃取柱和插头与连接器的管道。
    3. 在自动模式下,选择“清洗”文件和相同的压力设置启动。

5.检测与ELISA雌二醇浓度

  1. 制备校准样品浓度在设有所使用的ELISA试剂盒的协议表示。准备一张CALIBRA中置具有相同的矩阵作为样品,和一个校准设置用甲醇10%体积/体积。
  2. 分配在盘上的孔中的样品的所需量,根据制造商的说明。使用校准样品,过滤但未处理与SPE,和丰富的样品甲醇10%V不变并加标水样/ V。使用每样本3个孔,以减少与测定相关的误差。
  3. 遵循即随试剂盒提供的反应物的加入,培养时间,洗涤和进一步反应与酶的协议的指示。
  4. 读出的光信号在每个孔中根据试剂盒制造商的用酶标仪仪器指令和收集数据。
  5. 使用平板读取器仪器的软件,以适合校准曲线,并确定与相同矩阵的初始样品中的E2浓度,并且在富集样品用甲醇10%体积/体积。

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Representative Results

吸附剂填料的再现性通过干燥评价和加权在玻璃小瓶的移液吸附剂,结果于图1。重复性的喷射时100ml中的样品进行了测试,如在初始和预如图 2所示。浓度浓缩加标样品通过使用商业ELISA试剂盒17β雌二醇测定,并于图3。

所提出的方法包括在制备吸附剂相( 图1)的用户。吸附剂颗粒被两膜之间保持机械稳定性,并且密集通过施加与注射器而吹打悬浮液在塔中的压力。所得列包含所选择的吸附剂6毫克,只有6%的误差在此值的优化量。此步骤还充当作为吸附剂调节,在悬浮液中拨溶剂条件制备。

制备和系统上安装SPE柱,和装载在适当的水库解决方案之后,在预浓缩过程是完全自动化的,并且需要在总小于1小时为100毫升的样品( 图2)。提取是40±8分钟完成。只有两个参数由用户,制剂填充吸附剂和的流量设定仍然影响。首先将运用大规模方法列制造来解决。第二是与压力调节器,它决定用于通过该系统来驱动的溶液中的压力值的手动调整。这种错误将通过实施电子压力调节器来消除。

至于演出,公关实现电子浓度因子为100。首先,500倍预浓度通过从用50%体积/体积甲醇的吸附剂洗脱提取物完成的。然后有5倍的稀释,加入二 - 水进行。这种稀释减少溶剂含量,并保留免疫测定的灵敏度。当观察的ELISA(图3A)的校正曲线,很显然,富集样品中的甲醇比例不影响免疫测定的灵敏度。预浓缩的代表性结果示于图3,该方法应用到二-水和人工海水样品添加用1ng / L的17β雌二醇的。而样品浓度低于检测限,在预浓缩方法成功地使这些样品在测定的范围内(30 - 30000纳克/升)。回收率是由终浓度与理论加标浓度比较得到。 128%回收率±22%和107%±6%,计算为二-水和人工海水分别图3B)。

图1

图1.插图的方法中吸附剂包装的可重复性。有三个步骤:将第一尼龙膜与所述第一连接器,注射吸附剂悬浮液,并关闭所述柱通过插入第二膜和连接器。由此产生的列包含6毫克的吸附剂有6%的标准偏差(n = 6编制和加权列)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2步骤一步插图与再现性时间用于样品注射过程中,将溶液输入加载在储器或瓶子。两个输出是处理后的样品(废物)和富集样品,这对于通过免疫测定具有低溶剂含量的分析相容。总体过程是自动的,略需要不到1小时(31具有标准差)。对流量的用户的影响高亮蓝字。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图中的预浓缩的E2和分析通过ELISA 3.结果。测定1纳克/升(A)的校准的ELISA和点的曲线ENR后掺入二-水(i)和人造海水(ⅱ)ichment。为1毫微克(B)得到的回收率/ L掺入二-水(i)和人造海水(ⅱ)样品富集后(4例)。误差棒为从重复数和3个孔上被用于确定每个样品中的浓度的ELISA板所产生的标准偏差。这个数字已经被修改(13)。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

提出了水样然后分析使用免疫的制备新方法。该仪器能够以自动化和用户友好的方式进行固相萃取。

水样其注射之前到系统的过滤是非常关键的。溶液中存在的任何微粒仍然会潜在地引起流体网络的堵塞和阻碍SPE柱。另一个重要步骤是在SPE柱的制备。在列颗粒的量是至关重要的,以达到最佳的性能成为可能。制备吸附剂颗粒的悬浮液时,避免了粒子的附聚特必须小心​​。这是通过添加第一溶剂部分到干吸附剂,然后将二 - 水部分来实现的。然后,在包装工序中,以混合悬浮液以及同时吸取100μl的用吸管是很重要的。在SPE亲的结束cedure,正确清洗系统是至关重要的。首先,它可以防止交叉污染具有不同样品时,其次它避免了当不使用生物污染仪器的风险。

正如在介绍中所讨论的,使用的免疫检测方法的小分子污染物的环境中的分析正在扩大。这些方法达到的检测中的低纳克/升的水平7,11限制和有被非常具体的优点。这样的方法结合使用的化学方法,大多质谱相关技术。14,15,后者不限制使能达到所需的高预浓缩因子使用有机溶剂和效益的从自动化固相萃取的系统。相比较而言,免疫测定至测定缓冲组合物更敏感和缺乏适于样品制备技术,以促进该过程。我们的模块是专门为s的分析商场分子通过免疫。

与我们的自动方法,所述样品的100倍富集实现和许可证,以检测在ELISA浓度范围被分析物。如果这些预浓缩的表现似乎比较低的传统SPE,他们完全匹配免疫检测的要求。此外,该仪器具有小尺寸(25厘米×15厘米×10厘米)和低成本相比典型手动或自动的SPE设置。13如果需要,对多个样品分析吞吐量因此,可以增加通过使用几个设备在平行下。另一种可能性是,设计了一种用于较小体积的样品和洗脱液的,这将减少所需的过程的时间。一些其他限制是通过结果的描述中讨论。仍然有两个步骤涉及用户在哪里,都链接到该原型的发展程度和将通过使一个步骤进一步朝交流来解决ommercial设备。吸附剂相的填料是手工完成。然而该方法被证明是容易和可重复性。我们相信,一次性列可以生产,如果系统被生产提出了更高的规模。

总之,我们已经描述了一种新的方法,以紧凑的,自动化的设备上执行的SPE。我们已通过商业ELISA试剂盒适用于检测17β雌二醇的提取和预浓缩方法的描述表明其潜在的水样的通过免疫测定分析。该方法是用户友好,成本有效,且可在今后的在线施加与生物传感器(在正在进行的工作)。我们期望平台将使执行上高度相关的更复杂样品基质为内分泌干扰物的监测,如食品或尿类似固相提取程序。我们相信我们的系统将支持在建立和即将到来的免疫检测方法的应用环境分析的领域。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size Merck Millipore GNWP04700 For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size Merck Millipore NY1104700 For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm Medical Budget 39302439
Nucleodur C18 ec  Macherey Nagel 713550.01 50 μm particle diameter
Synthetic sea water Sigma Aldrich SSWS500-500ML
Methanol VWR
17beta-estradiol standard Enzo Life Science 300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit Enzo Life Science ADI-900-008 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L

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References

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环境科学,第107,样品制备,固相萃取,自动化,水质分析,雌激素,免疫
对水样的自动固相萃取小污染物的免疫学分析的简单方法
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Heub, S., Tscharner, N., Kehl, F.,More

Heub, S., Tscharner, N., Kehl, F., Dittrich, P. S., Follonier, S., Barbe, L. A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants. J. Vis. Exp. (107), e53438, doi:10.3791/53438 (2016).

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