Abstract
En ny metode for fastfase-ekstraksjon (SPE) av miljøvannprøver er foreslått. Den utviklet prototype er kostnadseffektiv og brukervennlig, og gjør det mulig å utføre raske, automatisert og enkel SPE. Den pre-konsentrerte oppløsning er kompatibel med analyse ved immunoassay, med et lavt organisk løsningsmiddelinnhold. En fremgangsmåte er beskrevet for ekstraksjon og pre-konsentrasjon av naturlig hormon 17β-østradiol i 100 ml vannprøver. Revers fase SPE er utført med oktadecyl-silika sorbent og eluering utføres med 200 ul metanol 50% volum / volum. Elueringsmiddel fortynnes ved tilsetning av di-vann for å redusere mengden av metanol. Etter fremstilling manuelt SPE-kolonne, er den generelle prosedyren utføres automatisk i løpet av 1 time. Ved slutten av prosessen, blir østradiol-konsentrasjonen måles ved anvendelse av et kommersielt enzymbundet immun-sorbent assay (ELISA). 100 gangers pre-konsentrasjon oppnås, og metanolinnholdet i bare 10% volum / volum. Full inngang på molekyleter oppnådd med 1 ng / L tilsatt avionisert og syntetisk sjøvann prøver.
Introduction
Prøveopparbeidelse er et viktig skritt i enhver analytisk prosess. Spesielt fjerning av matrise effekter, reduksjon av forstyrrelser, og anriking av analytten er nødvendig for å oppnå nøyaktige resultater og oppnå lave påvisningsgrenser. Hormonforstyrrende forbindelser (EDC) er av spesiell bekymring på grunn av deres virkning på levende organismer, selv når stede på svært lave nivåer i miljøet. Det naturlige hormonet 17β-østradiol er til stede på EUs vannforurensning Watch List og utsatt for å bli lagt til listen over prioriterte stoffer som er regulert i henhold til den europeiske vannrammedirektiv. Fastfase-ekstraksjon (SPE) blir vanligvis brukt for analyse av små forurensende stoffer i vann, med både kjemisk 1-5 (kromatografi, massespektrometri) og immunologiske 6-9 deteksjonsmetoder. Sistnevnte fikk interesse innen miljøovervåking, som immunanalyser er tilgjengelige i stort utvalg av formater, er spesifikke for TArget analytt, og når lave påvisningsgrenser. 6, 7, 10, 11 En rekke enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) er kommersielt tilgjengelige, og gjør det mulig å analysere flere prøver på en gang på en multi-brønn plate. Prosedyren består i påfølgende reaksjonstrinn som kan ta noen timer. Sluttproduktet av reaksjonen kan detekteres optisk for å bestemme konsentrasjonen av målmolekylet basert på en kalibreringskurve.
Klassiske SPE prosedyrer inkluderer sorbenten pre-kondisjonering, eksempel ekstraksjon, vasking, eluering og konsentrering ved avdamping av elueringsmiddelet. Løsningsmidlet som anvendes for fortynning av dette ekstraktet er valgt avhengig av påvisningsmetoden. For immunologiske metoder, mengden av organiske løsemidler, sterkt påvirker følsomheten av fremgangsmåten. 12
I tillegg til utvinning og pre-konsentrasjons forestillinger, må fremgangsmåten også være enkel og kostnadseffektivt. Automatisering av procedure bidrar til å redusere menneskerelaterte feil. I vårt tidligere arbeid 13 introduserte vi vår prototype for automatisert SPE, og vår metode ble brukt til analyse av det naturlige hormonet 17β-estradiol i sjøvannsprøver. Med dagens video ønsker vi å fremheve de tekniske fordelene med vår metode i forhold til tradisjonelle off-line og on-line SPE, og sin spesielle kompatibilitet med påvisning av immunreaksjoner. Vi beskriver protokollen anvendt på vannprøver for deteksjon av 17β-østradiol. SPE er utført med oktadecyl-silika (C18) sorbent fase og eluering blir utført med fortynnet metanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Den følgende protokollen beskriver SPE utført på 100 ml vannprøve med C18 sorbent og eluering med 50% volum / volum metanol. Det anrikede prøven blir fortynnet for å nå 10% volum / volum metanol før analyse med en enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) kit.
1. Forberedelse av reagenser
- Forbered vannprøvene
- Før eventuell andre trinn, å filtrere hver 100 ml vannprøve med 0,2 um porestørrelse filter.
- Spike prøven med ønsket konsentrasjon ved fortynning av passende volum av referanseløsning inn i et volum av vann. For eksempel, fremstille 100 ml vannprøve med 100 ng / l E2 ved å fortynne 3,3 ul av E2 referanseløsning ved en konsentrasjon på 300 ug / l. Fortynne denne løsningen ti ganger for å få en prøve tilsatt 10 ng / L E2. Fortynn denne sistnevnte ytterligere ti ganger for å oppnå en prøve på 100 ml med 1 ng / L E2.
- Plasser den filtrerte prøven (umodifisert eller pigg) i en glassflaske med GL45 tråden. Bruk prøven på samme dag. Ta en liten brøkdel som skal analyseres med ELISA for å estimere startkonsentrasjonen.
- Forbered 300 ul elueringsmiddel ved fortynning av metanol i de-ionisert (di-) vann til 50% v / v i et tett rør.
2. Utarbeidelse av SPE kolonne
- Fremstille en 20 mg / ml suspensjon av oktadecyl-silika sorpsjonspartiklene ved tilsetning første 1600 mL metanol og deretter 400 ul av di-vann til 40 mg av revers fase sorbent. Tett lukke lokket og rist med en vortex.
- Installering av bunnmembranen i kolonne
- Velg ett Nylon membran med porestørrelse 11 mikrometer og plassere den på et dobbelt lag med anti-støv vev. Med en 3 mm diameter dor, kuttet to små deler i membranen.
- Grab en av de små membraner med flatskjerm-end filter pinsett og legg den på den ene siden av kolonnen.
- Skru flat-bottom kontakt med røret og stram. Membranen er now på plass og sorbenten kan legges på en sikker måte. Tegn en pil på kroppen peker kolonnen mot slutten av hvor membranen ble plassert.
- Klar pakket sorbent kolonne
- Fest kolonne på holderen slik at pilen peker mot bunnen. Kolonnen må settes så vertikalt som mulig.
- Fest et tomt 10 ml engangssprøyte til enden av røret av kolonnen, ved hjelp av Luer-Lock-kontakter.
- Forbered en mikro-pipette med en 20-200 mL tips, stille volumet til 100 pl. Dette pipettespissen formatet er tilpasset til størrelsen av sorbent-kolonnen som skal fremstilles. Prosedyren ville være vanskeligere med større pipetter for eksempel de som brukes med 1 ml pipetter.
- Omrør sorbenten suspensjonen med en vortex og hurtig Pipetter 100 pl midt på kolonnen. Mens injisering, aspirere forsiktig pipettert over hele løsningen gjennom membranen ved hjelp av sprøyte med den andre hånden. På dette stalder, må oppløsningen fylle sprøyten være klart av partikler og en partikkelseng kan til slutt observeres i kolonnen.
- Gjenta denne fremgangsmåten 2 flere ganger ved omrøring av massesuspensjon mellom alle pipetteringstrinn for å sikre en homogen suspensjon av partiklene i oppløsningen. Den resulterende kolonnen inneholder 6 mg sorbent.
- Når de 300 ul av suspensjonen er lagt inn og tørket ved aspirering med sprøyten, holder sprøyten i stilling og plassere den andre nylon membran på toppen ved hjelp av tang med den andre hånden.
- Skru ned den andre kontakten med tube og kast sprøyten. SPE kolonne er klar til bruk.
3. Klar System
- Stram SPE-kolonnen på enheten ved hjelp av Luer-Lock-kontakter. Pilen må peke i samme retning som den som er vist på enheten.
- Koble flaske som inneholder prøven til enheten ved å skrugitt GL45 sikkerhetshette på den.
- Last 200 ul av elueringsmiddel i 'Elueringsmiddel' reservoaret.
- Last 800 mL av di-vann i "fortynning" reservoaret.
- Plasser en flaske i avløpet for å samle behandlet vann under utvinning trinn. Formatet er ikke viktig, men volumet må være tilstrekkelig stor i forhold til prøvevolumet.
- Plasser en liten ampulle ved sensoren utløp med minst mulig volumkapasitet på 1,5 ml. Et maksimalvolum på 1 ml vil være for liten som bobler vil danne på dette uttaket ved innsamling beriket elueringsmiddel og fortynningsbuffer.
- Kontroller trykkregulatoren er i lukket stilling ved å dreie den manuelt, reverse-klokken til ytterligere bevegelse er ikke mulig.
4. SPE med Prototype
- Slå på prototypen ved å trykke på knappen på baksiden.
- Klargjøring av brukergrensesnittet og velge program
- Åpne brukergrensesnittet. Velgekommunikasjonen porten på datamaskinen som enheten er koblet fra listen, og klikk på knappen "Neste".
- Angi verdiene 580 for PSet og 30 for dpset. Pumpen vil justeres for å opprettholde trykket i det trykksatte system og reservoarer på 580 ± 30 mbar ved løping.
- Velg automatisert modus.
- I automatisert modus hjørnet, legger programfilen i boksen 'konfigurasjonsfil sti ".
- Justering av trykkregulator
- Starte pumpen.
- Slå manuelt trykkregulatoren inntil verdien lese for preg er dårligere, men nær 320 mbar.
- Stoppe pumpen.
- Starte SPE prosedyre
- Trykk Start i automatisert modus hjørne. Pumpen slås på og utvinning, elueringsbetingelser og fortynningstrinn vil automatisk følge hverandre. Hele prosedyren for en 100 ml prøve blir utført i 50 min.
- Kontroller verdien av preg. Det må være i området 320 - 350 mbar under ekstraksjonstrinnet for å sikre en optimal strømningshastighet.
- Lukk liten ampulle og oppbevar ved 4-5 ° C i mørket inntil analyse. Utføre analyser i det følgende 30 timer for å hindre degradering av analytten.
- Kast den behandlet vann.
- Rengjøring av systemet
Merk: Etter hvert ekstraksjonsprosedyren systemet må renses for å unngå krysskontaminering.- Forbered en 10 ml metanol 70% v / v i en GL 45 glassflaske.
- Trekk ut SPE kolonne og koble slangen med kontakter.
- I automatisert modus, velger du "rengjøring" fil og starte den med samme trykk innstillinger.
5. Påvisning av Østradiol Konsentrasjon med ELISA
- Fremstille kalibreringsprøver med konsentrasjoner som angitt i protokollen som følger med ELISA-sett som er brukt. Forbered én Calibrasjon setter med den samme grunnmasse som i prøven, og en kalibrering som er angitt med metanol, 10% volum / volum.
- Tilsett den nødvendige mengden av prøven i brønnene på tallerkenen, i henhold til produsentens instruksjoner. Bruke kalibreringsprøver, umodifisert og tilsatte vannprøver som ble filtrert, men ikke er behandlet med SPE, og anrikede prøver i methanol 10% volum / volum. Bruk 3 brønner per prøve for å redusere den feil som er knyttet til analysen.
- Følg indikasjoner på protokollen som leveres med settet for tilsetningen av reaktantene, inkubasjonstid, vasking og ytterligere reaksjon med enzymet.
- Les det optiske signalet i hver brønn i henhold til settet produsentens instruksjoner med en plateleser instrument og samle data.
- Bruke programvaren til plateavles instrument for å passe kalibreringskurvene og bestemme E2 konsentrasjonen i den opprinnelige prøve med samme matrise, og i de anrikede prøver med metanol 10% volum / volum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduserbarhet av sorbent pakking ble evaluert ved tørking og å vekte pipettert sorbent i glassflasker, og resultatet er vist i figur 1. Reproduserbarhet av injeksjonstidspunktet ble testet i 100 ml prøver, som vist i figur 2. Konsentrasjon i innledende og pre- konsentrert tilsatt prøvene ble bestemt ved anvendelse av et kommersielt ELISA-sett for 17β-østradiol, og er vist i figur 3.
Den foreslåtte fremgangsmåten innebærer at brukeren for fremstilling av absorpsjonsmidlet fase (figur 1). Sorpsjonspartiklene holdes mellom to membraner for mekanisk stabilitet og er tett pakket med trykket påført med sprøyte og under pipettere suspensjonen i kolonnen. Den resulterende kolonne inneholder en optimal mengde på 6 mg av den valgte sorbent med bare 6% feil på denne verdi. Dette trinnet fungerer ogsåsom sorbent kondisjonering, som suspensjonen fremstilles i bevilgede oppløsningsmiddelforhold.
Etter å forberede og installere SPE kolonne på systemet, og lasting av løsninger i egnede reservoarer, er den pre-konsentrasjonen prosedyre fullt automatisert og krever totalt mindre enn 1 time for en 100 ml prøve (figur 2). Ekstraksjon blir utført i 40 ± 8 min. Bare to parametrene er fremdeles påvirket av brukeren, ved fremstillingen av den pakkede sorbent og innstillingen av strømningshastigheten. Den første vil bli løst ved å anvende fremgangsmåter i stor skala for kolonnen fabrikasjon. Den andre er knyttet til den manuelle justering av trykkregulatoren, som bestemmer trykkverdien som brukes til å drive de løsninger gjennom systemet. Denne feilkilden ville bli eliminert ved å implementere en elektronisk trykkregulator.
Angå forestillinger, PRe-konsentrasjonsfaktor er oppnådd 100. Først blir 500-fold pre-konsentrasjonen gjøres ved eluering av ekstrakt fra sorbenten med 50% volum / volum metanol. Deretter ble en 5-ganger fortynning utføres ved å tilsette di-vann. Dette fortynning reduserer løsemiddelinnhold og bevarer immunoassay følsomhet. Når man ser på kurvene i ELISA (figur 3A) kalibrering, er det klart at metanolforholdet i den anrikede prøven ikke påvirker følsomheten av den immunologiske måling. Et representativt resultat av pre-konsentrasjonen er vist i figur 3. Fremgangsmåten ble anvendt på di-vann og kunstig sjøvann prøver tilsatt 1 ng / L av 17β-østradiol. Mens prøvekonsentrasjoner er under deteksjonsgrensen, den pre-konsentrasjonen metoden med hell bringer disse prøver i området av analysen (30 - 30 000 ng / l). Gjenvinningene ble oppnådd ved å sammenlikne den endelige konsentrasjon med teoretisk spiked konsentrasjon. Inngang på 128% ± 22% og 107% ±6% ble beregnet for henholdsvis di-vann og kunstig sjøvann (Figur 3B).
Figur 1. Illustrasjon og reproduserbarhet av fremgangsmåten for sorpsjonsmiddel pakking. Det er tre trinn: som fester den første nylonmembran med den første kontakten, sprøyte sorbenten suspensjonen, og lukking av kolonnen ved å sette inn den andre membran og kontakten. Den resulterende kolonnen inneholder 6 mg av sorbent med 6% standardavvik (n = 6 forberedt og vektet kolonner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. trinn-for-trinnillustrasjon av prosedyren med reproduserbarhet tid for prøveinjeksjon. er Inngangene løsning legges i reservoarer eller flaske. De to utganger er den behandlede prøven (avfall) og den anrikede prøven, som er kompatibel for analyse ved immunoassay med lavt løsningsmiddelinnhold. Den generelle prosedyren er automatisert og tar litt mindre enn en time (n = 31 med standardavvik). Påvirkningen av brukeren på strømningshastigheten er markert med blå bokstaver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Resultater av pre-konsentrasjonen av E2 og analyse ved ELISA. (A) Kalibreringskurver av ELISA og punkter målt i 1 ng / L tilsatt di-vann (i) og kunstig vann (ii) sjøen etter enrichment. (B) Inngang oppnås for 1 ng / L tilsatt di-vann (i) og kunstig sjøvann (ii) prøver etter anrikning (n = 4). Feilstolpene er standardavvik som følge av antallet replikater og 3 brønner på ELISA-plate som ble anvendt for å bestemme konsentrasjonen i hver prøve. Dette tallet har blitt forandret fra (13). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny fremgangsmåte for fremstilling av vannprøver fulgt av analyse ved hjelp av immunologisk analyse ble foreslått. Instrumentet gjør det mulig å utføre fastfaseekstraksjon i en automatisert og brukervennlig måte.
Filtrering av vannprøven før dens injeksjon inn i systemet er kritisk. Eventuelle partikler som fremdeles er tilstede i løsningen ville forårsake tilstopping av fluidic nettverket og hindre SPE-kolonne. Et annet viktig trinn er fremstilling av SPE-kolonne. Mengden av partiklene i kolonnen er avgjørende for å oppnå de beste ytelser mulig. Spesielle hensyn må tas ved utarbeidelse av suspensjon av sorpsjonspartiklene, for å unngå agglomerering av partiklene. Dette oppnås ved å tilsette første fraksjon av løsningsmidlet til den tørre sorbent, og deretter ble di-vannfraksjonen. Deretter, i pakketrinnet, er det viktig å blande suspensjonen godt mens aspire de 100 ul med pipetten. Ved slutten av SPE proprosedyren, skikkelig rengjøring av systemet er kritisk. For det første hindrer det krysskontaminering når det arbeides med forskjellige prøver, og for det andre unngår man risikoen for bio-kontaminering av instrumentet når det ikke er i bruk.
Som omtalt i innledningen, er bruken av immuno-deteksjonsmetoder for analyse av små forurensende molekyler i omgivelsene ekspanderende. Disse fremgangsmåtene når grensene for påvisning i de lave ng / L nivåer 7, 11 og har fordelen av å være svært spesifikk. Slike fremgangsmåter anvendes i kombinasjon med kjemiske metoder, for det meste masse-spektrometri relaterte teknikker. 14, 15. Den sistnevnte ikke begrenser bruken av organisk løsningsmiddel og utbytte av automatiserte SPE systemer som gjør det mulig å nå de nødvendige høye pre-konsentrasjonsfaktorer. Til sammenligning immunoanalyser er mer følsomme for analysebufferen sammensetning og mangel innrettet prøveprepareringsteknikker for å lette prosessen. Vår modulen er dedikert til analyse av small molekyler ved immunoassay.
Ved den automatiserte metode blir en 100-gangers anrikning av prøven oppnådd og tillater å detektere den analytt i ELISA konsentrasjonsområdet. Hvis disse pre-konsentrasjons forestillinger synes lav i forhold til tradisjonelle SPE, de passer perfekt til kravene for immuno-deteksjon. Dessuten har apparatet liten plass (25 cm x 15 cm x 10 cm) og lave kostnader sammenlignet med typiske manuelle eller automatiserte SPE oppsett. 13 Hvis nødvendig kan gjennomstrømningen for multippel analyse av prøver derfor økes ved hjelp av et par anordninger parallelt. En annen mulighet ville være å utforme en fremgangsmåte for mindre volumer av prøve og elueringsmiddel, noe som vil redusere den tiden som er nødvendig for fremgangsmåten. Noen andre begrensninger som ble diskutert igjennom beskrivelse av resultatene. Det er fortsatt to trinn der brukeren er involvert, både knyttet til graden av utvikling av denne prototypen, og vil bli løst ved å gjøre ett skritt videre mot acommercial enhet. Pakking av sorbenten fase gjøres manuelt. Fremgangsmåten ble imidlertid vist seg å være enkel og reproduserbar. Vi er sikre på at engangskolonner kunne produseres hvis systemet ble produsert på en høyere skala.
Oppsummert har vi beskrevet en ny metode for å utføre SPE på en kompakt, automatisert anordning. Vi har vist dens potensial for analyse av vannprøver ved immunoassay gjennom beskrivelsen av en ekstraksjon og pre-konsentrasjon metode anvendt for å detektering av 17β-østradiol ved et kommersielt ELISA-sett. Metoden er brukervennlig og kostnadseffektivt, og kan i fremtiden bli brukt i tråd med biosensorer (arbeid pågår). Vi forventer vår plattform vil gjøre det mulig å utføre lignende fastfaseekstrahering prosedyrer på mer komplekse prøve matriser av høy relevans for overvåking av EDC, som for eksempel mat eller urin. Vi er overbevist om systemet vil støtte bruk av etablerte og kommende immuno-deteksjonsmetoder ifeltet av miljøanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
