Abstract
Çevre su numunelerinin katı faz ekstraksiyonu (SPE) için yeni bir yöntem önerilmiştir. Geliştirilen prototip maliyet-etkin ve kullanıcı dostu ve hızlı otomatik ve basit SPE gerçekleştirmenizi sağlar. Önceden konsantre edilmiş çözelti, düşük bir organik çözücü içeriğine sahip immunodeney ile analiz ile uyumludur. Bir yöntem olup 100 mL su örneklerinde doğal hormon 17β-estradiol ekstraksiyonu ve konsantrasyonu için önceden tarif edilmiştir. Ters faz SPE oktadesil- silis sorbent ile gerçekleştirilir ve elüsyon metanol 50% v / v, 200 ul ile yapılır. Elüent metanol miktarı azaltmak için, di-su eklenerek seyreltilmiştir. El SPE sütunu hazırladıktan sonra, genel işlem 1 saat içinde otomatik olarak gerçekleştirilir. İşlemin sonunda, östradiol konsantrasyonu, ticari bir enzim-bağlantılı bağışıklık-sorbent deneyi (ELISA) kullanılarak ölçülmüştür. 100-kat ön konsantrasyonu elde edilir ve yalnızca 10% v / v metanol içeriği. Molekülün tam geri kazanım1 ng ile elde edilir / L-de iyonize ve sentetik deniz suyu örnekleri çivili.
Introduction
Numune hazırlama herhangi bir analitik sürecinde önemli bir adımdır. Özel olarak, matriks etkileri, etkileşimleri azalmasını ve analit zenginleştirilmesi kaldırılması kesin sonuçlar elde edilir ve algılama düşük sınırları ulaşmak için gereklidir. Endokrin bozucu bileşikler (EDCs) nedeniyle canlı organizmalar üzerindeki etkisine özellikle kaygı olduğunda bile çevrede bulunan çok düşük seviyeleri. Doğal hormon 17β-östradiol Avrupa Su Çerçeve Direktifi kapsamında düzenlenen öncelikli maddeler listesine eklenecek AB su kirliliği İzleme Listesi mevcut ve eğilimli. Katı faz ekstraksiyonu (SPE), genel olarak, her iki kimyasal 1-5 (kromatografısi, kütle spektrometrisi) ile immünolojik 6-9 tespit yöntemleri ile, su içinde, küçük kirletici analizi için tatbik edilir. İkincisi immünoanalizler, formatlarda çok çeşitli mevcuttur ta özgü olarak, çevresel izleme alanındaki ilgisini kazanmıştıranalit rYer ve algılama düşük sınırlara ulaşır. 6, 7, 10, 11 Çeşitli enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ticari olarak temin edilebilir ve çok oyuklu bir plaka üzerinde aynı anda birden fazla numune analiz için olanak sağlar. İşlem birkaç saat sürebilir ardışık reaksiyon adımlarla oluşur. Reaksiyonun Nihai ürün kalibrasyon eğrisine göre hedef molekülün konsantrasyonunu belirlemek için, optik olarak tespit edilebilir.
Klasik SPE prosedürler eluent buharlaştırma ile sorbent ön kurutma, örnek ekstraksiyon, yıkama, elüsyon ve konsantrasyonu içerir. Bu ekstrenin seyreltme için kullanılan çözücü, algılama yöntemine bağlı olarak seçilir. Immünolojik yöntemler için, güçlü organik çözücü etkilere yöntemin duyarlılığı miktarı. 12
Kurtarma ve ön konsantrasyonu performansları ek olarak, yöntem, aynı zamanda, basit olabilir ve maliyet etkin gerekmektedir. Prosedüründe otomasyonue insan ile ilgili hataları azaltmaya yardımcı olur. Daha önceki çalışmalarında 13 biz otomatik SPE için prototip tanıttı ve bizim yöntem deniz suyu örneklerinde doğal hormon 17β-östradiol analizi uygulanmıştır. Mevcut videoda biz SPE ve bağışıklık reaksiyonları ile algılama ile kendi özel uyumluluk geleneksel off-line ve on-line karşılaştırıldığında bizim yöntemin teknik avantajları vurgulamak istiyorum. Bu 17β-estradiyol tespiti için su numuneye uygulanan protokol açıklar. SPE oktadesil-silis (C18) sorbent faz ve elüsyon seyreltilmiş metanol ile yerine getirilmiştir gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıdaki protokol SPE% 50 h / h metanol ile C18 sorbent ve elüsyon ile 100 ml su numunesi üzerinde gerçekleştirilmiştir açıklanmaktadır. Zenginleştirilmiş örneği (ELISA) kiti linked immunosorbent bir enzim ile analizden önce,% 10 hac / hac metanol ulaşmak için seyreltilmiştir.
1. Reaktifleri hazırlanması
- Su örnekleri hazırlayın
- Önceki herhangi bir başka aşamasına, 0.2 um gözenek boyutlu filtreler ile, her 100 ml su örneği filtre.
- Bir su hacmi içine bir referans çözeltisi uygun hacimde seyreltilerek istenen konsantrasyona sahip örnek başak. Örneğin, 300 mg / L'lik bir konsantrasyonda E2 referans çözeltisinin 3,3 ul seyreltilmesiyle E2 100 ng / L su numunesi 100 ml hazırlanır. Bir örnek 10 ng / L E2 ile çivili almak için bu çözüme on kez sulandırmak. 1 ng / L E2 ile 100 ml 'lik bir numune elde etmek için bu ikinci bir on kat seyreltilir.
- G, bir cam şişe içinde (modifiye edilmemiş veya kirpi), süzüldü örnek yerleştirinL45 konu. Aynı gün numune kullanılır. Küçük bir bölümünü alın başlangıçtaki konsantrasyon tahmin etmek ELISA ile analiz edilecek.
- Sıkı bir tüp içinde 50% v / v deiyonize (di) su içinde metanol ile elüsyon seyreltilerek 300 ul hazırlayın.
SPE Column 2. Hazırlık
- İlk metanol 1600 ul ve ardından ters fazlı sorbent 40 mg di-su 400 ul ekleyerek oktadesil- silis sorbent partikülleri bir 20 mg / ml süspansiyon hazırlayın. Sıkıca kapağını kapatın ve bir girdap ile çalkalayın.
- Sütununda taban zarı takılması
- Gözenek büyüklüğü 11 mikron ile tek Naylon membran seçin ve anti-toz dokusunun çift kat üzerine yerleştirin. 3 mm çaplı zımba ile, zarın iki küçük parça kesin.
- Düz uç filtre forseps küçük membran tut ve kolonun bir tarafına yerleştirin.
- Tüp düz taban konnektörü Vida ve sıkın. Membran nakış ve yerinde güvenli bir şekilde sorbent eklenebilir. Membran yerleştirildi nerede sonlarına doğru sütun işaret gövdesi üzerinde bir ok çizin.
- Paketlenmiş sorbent sütun hazırlanması
- Dibe doğru okun tutucuya sütun sabitleyin. Sütun dikey olarak mümkün olduğu ayarlanmalıdır.
- Luer-Lock bağlayıcıları kullanarak sütun borusunun ucuna boş 10 ml tek kullanımlık şırınga takın.
- Bir 20-200 ul ucu ile bir mikro-pipet hazırlayın 100 ul seviyesini ayarlamak. Bu pipet ucu biçimi hazırlanacak emici sütunun büyüklüğüne uyarlanır. Prosedür böyle 1 ml pipetler ile kullanılan olanlar gibi büyük pipet uçları ile daha zor olacaktır.
- Bir girdap ile sorbent süspansiyon ajite ve hızla sütun üzerinde merkezde 100 ul pipetlemeyin. Enjekte ederken, aspire nazikçe tüm Pipetlenen çözüm Öte yandan şırıngayı kullanarak zarı yalak. Bu st atyaş, şırınga doldurma çözeltisi parçacıkların açık olmalıdır ve parçacık yatağı sonunda sütununda görülmektedir.
- Çözeltide parçacıkların homojen süspansiyon sağlamak için bütün pipetleme adımları arasındaki stok süspansiyon çalkalayarak bu işlemi 2 kez daha tekrarlayın. Ortaya çıkan kolon sorbent 6 mg içerir.
- Süspansiyon 300 ul yüklendi ve şırınga ile aspire kurutuldu edildiğinde, pozisyonda şırınga tutmak ve diğer elle forseps kullanılarak üstüne ikinci naylon membran yerleştirin.
- Tüp ile ikinci konektörü aşağı Vida ve şırınga atmayın. SPE sütunu kullanıma hazırdır.
3. Hazırlama Sistemi
- Luer-Lock konnektörleri kullanarak cihaz üzerinde SPE sütunu sıkın. Ok cihaz üzerinde gösterilen biri olarak aynı yöne işaret olmalıdır.
- Vidalama cihaza örneğini içeren şişeyi bağlayınBunun üzerine GL45 emniyet kapağını sağladı.
- 'Yıkama sıvısı' rezervuar içinde eluent 200 ul yükleyin.
- Yük 'Sulandırma' rezervuar di-su 800 ul.
- Ekstraksiyon aşamasında işlenmiş suyu toplamak için atık çıkışında bir şişe yerleştirin. Biçimi önemli değildir, ancak birim numune hacmi ile ilgili olarak yeterince büyük olması gerekir.
- 1,5 ml minimum hacim kapasiteli algılayıcı çıkışın küçük bir şişe yerleştirin. Zenginleştirilmiş yıkama sıvısı ve seyreltme tamponu toplarken baloncuklar bu çıkışında oluşturacak şekilde 1 ml maksimum hacmi çok küçük olacaktır.
- Basınç regülatörü elle döndürerek kapalı konumda olduğunu kontrol edin, ters saat yönünde daha fazla hareket etmesi mümkün değildir kadar.
Prototip 4. SPE
- Arkasındaki düğmeye basarak prototip açın.
- Kullanıcı arayüzü hazırlama ve programı seçerek
- Kullanıcı arabirimini açın. SeçinBilgisayarın iletişim portu hangi cihaz listeden bağlı ve düğme 'İleri' tıklayın olduğu.
- Değerleri pset 580 ve dpset 30 girin. Pompa çalışırken 580 ± 30 mbar'da basınçlı sistem ve rezervuarlarda basıncı korumak için ayarlayacaktır.
- Otomatik modu seçin.
- Otomatik mod köşesinde, kutu 'yapılandırma dosyası yolu' program dosyası yüklenemedi.
- Basınç regülatörü ayarlanması
- Pompayı başlatın.
- Süleyman Demirel için okunan değer aşağı ama 320 mbar yakın kadar elle basınç regülatörü çevirin.
- Pompayı durdurun.
- SPE işlemi başlatılıyor
- Otomatik mod köşesinde Basın 'başlangıç'. Pompa açılacaktır ve çıkarma, ayrıştırma ve seyreltme adımlar otomatik olarak birbirini takip edecektir. 100 ml'lik bir örnek için bütün işlem 50 dakika içinde gerçekleştirilir.
- Süleyman Demirel değerini doğrulayın. Uygun bir akış oranını sağlanması için ekstraksiyon aşaması esnasında 350 mbar - Bu aralık 320 olmalıdır.
- Analize kadar karanlıkta 4-5 ° C'de küçük şişe ve mağaza kapatın. Analitin bozulmasını önlemek için aşağıdaki 30 saat içinde analiz gerçekleştirin.
- İşlenmiş su imha ediniz.
- Sisteminin temizlenmesi
Not: Sistem gereken her ekstraksiyon işlemi çapraz bulaşmayı önlemek için temizlenmesi sonra.- GL 45 bir cam şişeye, metanol 70% v / v, 10 ml çözelti hazırlayın.
- SPE sütunu çekin ve konnektörleri ile tüp takın.
- Otomatik modda, 'temizlik' dosyasını seçin ve aynı basınç ayarları ile başlatın.
ELISA ile Estradiol Konsantrasyon 5. Algılama
- Kullanılan ELISA kit ile birlikte verilen protokol içerisinde belirtilen konsantrasyonlarda kalibrasyon numuneleri hazırlayın. Tek Calibra hazırlayınmetanol,% 10 v / v ayarlanır, aynı örnek olarak matris ve bir kalibrasyon ile ayarlanır tion.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, levha üzerindeki kuyu numunenin gerekli miktarda koyun. Kalibrasyon numuneleri, filtre edildi, ancak metanol 10% v örnekleri SPE ile işlenir ve zenginleştirilmiş değil, değişikliğe uğratılmamış ve kirpi su numuneleri kullanarak / h. Tahlil ile ilişkili hatayı azaltmak için numune başına 3 kuyu kullanın.
- Enzim ile reaktiflerin eklenmesi için kit, inkübasyon süresi, yıkama ve başka reaksiyon ile sağlanan protokol endikasyonları izleyin.
- Bir plaka okuyucusu aletle kit üreticisinin talimatlarına göre her kuyuda optik sinyalin okuma ve verileri toplar.
- Metanol,% 10 v zenginleştirilmiş örnekleri kalibrasyon eğrileri uygun aynı matrisin ile ilk numunedeki E2 konsantrasyonunu belirlemek, ve plaka okuyucusu aletin yazılımını kullanarak / h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sorbent ambalaj tekrarlanabilirliği kurutma ile değerlendirildi ve cam viyaller içinde pipetlendi sorbentin ağırlık ve ilk ve pre Şekil 2. Konsantrasyon gösterildiği gibi sonuç, 100 mi örnekler için test edildi enjeksiyonu sırasında Şekil 1. Tekrarlanabilirliği de gösterilmiştir edildi Konsantre örnekleri 17β-estradiol için ticari bir ELISA kiti kullanılarak tespit edilmiş ve Şekil 3'te gösterilmektedir çivili.
Önerilen yöntem sorbent fazının hazırlanması (Şekil 1) kullanıcı içerir. Sorbent partikülleri mekanik stabilite için iki membranların arasında düzenlenen ve yoğun sütunda süspansiyon pipetleme sırasında şırınga ile uygulanan basınç ile paketlenir. Elde edilen sütun bu değer sadece% 6 hata ile seçilen sorbent 6 mg, optimize edilmiş bir miktarını ihtiva etmektedir. Bu adım, hareketSorbent conditioning, süspansiyon tahsis çözücü ortamda hazırlanan gibi.
Hazırlanması ve sistemde SPE sütunu yükleme ve uygun rezervuar çözüm yükledikten sonra, ön-yoğunlaştırma işlemi tamamen otomatiktir ve 100 ml'lik bir numunesi (Şekil 2) toplam en az 1 hr gerektirir. Ekstraksiyon 40 ± 8 dakika içinde gerçekleştirilir. Sadece iki parametrede de kullanıcı, paketlenmiş sorbentin hazırlanması ve akış hızı ayarı etkilenmektedir. İlk sütun imalatı için büyük ölçekli yöntemleri uygulanarak çözülebilir olacaktır. Ikinci sistem vasıtasıyla çözüm tahrik etmek için kullanılan basınç değerini belirler basınç regülatörü, elle ayarlanması ile ilgilidir. Hatanın Bu kaynak bir elektronik basınç regülatörü uygulayarak elenmesine neden olacaktır.
Performansları ile ilgili olarak, prelde e-konsantrasyon faktörü 100. İlk olarak, 500 kat, önceden konsantrasyonu% 50 h / h metanol ile sorbentten özü elüsyon yapılır olmasıdır. Daha sonra 5-kat seyreltme di-su eklenerek gerçekleştirilir. Bu seyreltme solvent içeriğini azaltır ve immunoassay hassasiyetini muhafaza eder. ELISA (Şekil 3A) kalibrasyon eğrileri bakıldığında, bu zenginleştirilmiş numunede metanol oranı immunoassay duyarlılığını etkilemez açıktır. Önceden konsantre temsili bir sonuç, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Yöntem 1 ng / 17β-estradiyol L çivili di su ve yapay deniz suyu örneklere uygulandı. (- 30.000 ng / L 30) örnek konsantrasyonları ispat edebilme sınırının altında iken, ön-konsantrasyon yöntemi başarılı bir şekilde deney aralığında şu örnekleri getirir. Geri kazanımlar, teorik kirpi konsantrasyonuna sahip nihai konsantrasyon karşılaştırılması ile elde edilmiştir. % 22 ve% 107 ± ±% 128 geri kazanımları6 sırasıyla% di-su ve yapay deniz suyu (Şekil 3B) için hesaplanmıştır.
Şekil 1. İllüstrasyon ve sorbent paketleme yöntemi tekrarlanabilirlik. İlk konnektörü ile ilk Naylon membran güvence sorbent süspansiyon enjekte ve ikinci zar ve konektörü takarak sütun kapanış: üç adım vardır. Ortaya çıkan kolon% 6 standart sapma (n = hazırlanmış 6 ve ağırlıklı sütunlar) ile sorbent 6 mg içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Adım-adımNumune enjeksiyon için zaman tekrarlanabilirlik ile prosedürün illüstrasyon. solüsyon girişler rezervuar veya şişe yüklenir. Iki çıkış, düşük solvent içerikli immunoassay ile analiz için uyumlu işlenmiş numune (atık) ve zenginleştirilmiş örnek vardır. Genel prosedür otomatik ve biraz daha az 1 saat (n = 31 standart sapma ile) sürer. Akış hızına kullanıcının etkisi mavi karakterler ile vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil ELISA ile E2'nin önceden konsantre ve analiz 3. Sonuçlar. 1 ng / L için ölçülen ELISA ve nokta (A) kalibrasyon eğrileri ENR sonra di-su (i) ve yapay deniz suyu (ii) çiviliichment. (B) tahsili 1 ng için elde edilen / L di-su (i) ve yapay deniz suyu çivili (ii) örnekleri zenginleştirmeden sonra (n = 4). Hata çubukları çoğaltır sayısı ve her numunedeki konsantrasyonunu belirlemek için kullanıldı ELISA levhası üzerine 3 çukurlardan oluşan, standart sapmaları göstermektedir. Bu rakam (13) modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immünolojik test kullanılarak analiz ve ardından su örneklerinin hazırlanması için yeni bir yöntem önerilmiştir. Enstrüman otomatik ve kullanıcı dostu bir şekilde katı faz ekstraksiyon gerçekleştirmenizi sağlar.
Sistem üflenmeden önce su numunesi filtrasyon kritiktir. Çözelti içinde hala mevcut herhangi bir parçacık potansiyel olarak akışkan ağ tıkar ve SPE sütunu engelleyebilir. Diğer önemli bir adım SPE kolonundan hazırlanmasıdır. Sütununda parçacıkların miktarı mümkün olan en iyi performansı elde etmek için kritiktir. Partiküllerin aglomerasyonunun önlemek için, emici parçacıkların bir süspansiyonunun hazırlanması sırasında özel bir dikkat gösterilmelidir. Bu, di-su oranının, kuru sorbent ilk solvent fraksiyonu eklenmesi ve daha sonra elde edilir. Daha sonra, paketleme basamağı sırasında, pipet ile 100 ul emme sırasında iyi bir süspansiyonu karıştırmak için önemlidir. SPE pro sonundamıknatıslarından çıkan düzgün temizleme sistemi çok önemlidir. Farklı örnekler ile çalışırken Birincisi, çapraz bulaşmayı önler ve kullanılmadığı zaman ikincisi enstrümanın biyo-kontaminasyon riskini önler.
Giriş bölümünde tartışıldığı gibi, çevredeki küçük kirletici moleküller analizi için immüno-algılama yöntemlerinin kullanımı artmaktadır. Bu yöntemler, düşük ng / L seviyelerinde 7, 11 tespitlerde sınırlarını ulaşmak ve çok özel olmanın avantajı var. Bu tür yöntemler, kimyasal yöntemler, daha çok Kitle spektrometresi ile ilgili teknikler ile kombinasyon halinde kullanılırlar. 14, 15 ikinci gerekli yüksek ön yoğunlaşma faktörlerinin ulaşan etkinleştir otomatik SPE sistemleri organik bir çözücü ve fayda kullanımını kısıtlamak değildir. Buna karşılık, immüno-deney tamponu bileşime daha duyarlıdır ve işlemi kolaylaştırmak için örnek hazırlama teknikleri adapte yoksundur. Bizim modülü s analizine adanmıştırimmunoassay merkezi molekülleri.
Bizim otomatik yöntemle, örnek 100-kat zenginleştirme elde edilir ve izin ELISA konsantrasyon aralığında analiti tespit etmek. Bu ön-konsantrasyon performansları, geleneksel SPE kıyasla düşük görünüyor, onlar mükemmel bağışıklık tespiti için gereksinimlerini karşılamak. Ayrıca, enstrüman tipik manuel veya otomatik SPE kurulumları ile karşılaştırıldığında küçük bir ayak izi (25 cm x 15 cm x 10 cm) ve düşük maliyeti vardır. 13 Gerekirse, çoklu numune analizi için verim nedenle birkaç cihazlar kullanılarak artırılabilir paralel. Diğer bir olasılık, işlem için gerekli olan zamanı azaltacaktır örnek ve eluent küçük hacimlerde için bir yöntem tasarım olacaktır. Diğer bazı sınırlamalar sonuçları açıklaması ile tartışıldı. Kullanıcı katılır iki adım, her ikisi de bu prototip geliştirilmesi derecesine bağlı ve ac yolunda bir adım daha ileri yaparak çözüleceği hala vardırürünleri ticari bir cihaz. Sorbent aşamasının ambalaj elle yapılır. Yöntem, bununla birlikte kolay ve tekrarlanabilir olması için gösterilmiştir. Bu sistem, bir üst bir ölçekte üretildiği takdirde tek sütun üretilmiş olabilir inanıyoruz.
Özetle, biz kompakt, otomatik cihaz üzerinde ÖAV'yi gerçekleştirmek için yeni bir yöntem tarif var. Bu, ticari bir ELISA kiti ile 17β-estradiyol tespiti uygulanan bir ekstraksiyon ve ön konsantrasyonu yönteminin açıklaması yoluyla immünolojik su örneklerinin analizi için potansiyel göstermiştir. Yöntem kullanıcı dostu ve düşük maliyetli olduğunu ve gelecekte biyosensörlerde (work in progress) ile in-line uygulanabilir. Bizim platformu gıda veya idrar gibi EDCs izlenmesi için yüksek alaka daha karmaşık örnek matrisler, benzer katı faz ekstraksiyon işlemleri gerçekleştirmek için sağlayacaktır bekliyoruz. Bizim sistem kurulmuş ve gelecek bağışıklık algılama yöntemlerinin uygulanmasını destekleyecek iknaçevresel analizler alanı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
