Abstract
Une nouvelle méthode pour l'extraction en phase solide (SPE) des échantillons d'eau de l'environnement est proposé. Le prototype développé est rentable et conviviale, et permet d'effectuer des SPE rapide, automatisée et simple. La solution de pré-concentré est compatible avec l'analyse par immuno-essai, avec une faible teneur en solvant organique. Un procédé est décrit pour l'extraction et la pré-concentration de l'hormone naturelle 17β-oestradiol dans les échantillons d'eau de 100. SPE en phase inverse est effectuée avec sorbant octadécyl-silice et l'élution est effectuée avec 200 ul de methanol à 50% v / v. Eluant est dilué par addition de di-eau pour réduire la quantité de methanol. Après avoir préparé manuellement la colonne SPE, la procédure globale est effectuée automatiquement dans 1 h. A la fin du procédé, la concentration en estradiol est mesurée en utilisant un dosage immuno-sorbant lié à une enzyme du commerce (ELISA). Pré-concentration 100 fois et on obtient la teneur en méthanol dans seulement 10% v / v. Recouvrements complets de la moléculesont atteints avec 1 ng / L échantillons enrichis déminéralisée et synthétiques eau de mer.
Introduction
La préparation des échantillons est une étape importante dans tout processus analytique. En particulier, l'élimination des effets de matrice, la diminution des interférences, et l'enrichissement de l'analyte sont nécessaires pour obtenir des résultats précis et d'atteindre de faibles limites de détection. Perturbateurs endocriniens (PE) sont particulièrement préoccupantes en raison de leur action sur les organismes vivants, même si les niveaux actuels à de très faibles dans l'environnement. L'hormone naturelle 17β-estradiol est présent sur la pollution de l'eau de l'UE Watch List et sujettes à être ajouté à la liste des substances prioritaires réglementés en vertu de la directive-cadre européenne sur l'eau. Extraction en phase solide (SPE) est couramment appliquée pour l'analyse des petits polluants dans l'eau, à la fois chimique 1-5 (chromatographie, spectrométrie de masse) et immunologiques 6-9 méthodes de détection. Ce dernier a gagné un intérêt dans le domaine de la surveillance de l'environnement, comme les immunoessais sont disponibles en grande variété de formats, sont spécifiques à la TArget analyte, et d'atteindre de faibles limites de détection. 6, 7, 10, 11 divers liés à une enzyme dosages immuno (ELISA) sont commercialement disponibles et permettent d'analyser plusieurs échantillons à la fois sur une plaque multi-puits. La procédure consiste dans les étapes de réaction successives qui peuvent prendre quelques heures. Le produit final de réaction peut être détecté optiquement pour déterminer la concentration de la molécule cible sur la base d'une courbe d'étalonnage.
SPE procédures classiques comprennent sorbant pré-conditionné, l'extraction de l'échantillon, le lavage, élution et concentration par évaporation de l'éluant. Le solvant utilisé pour la dilution de cet extrait est choisie en fonction de la méthode de détection. Pour les méthodes immunologiques, la quantité d'influences de solvants organiques fortement la sensibilité de la méthode. 12
En plus de la récupération et les performances de pré-concentration, la méthode doit également être simple et rentable. Automatisation de la procedure contribue à réduire les erreurs humaines liées. Dans nos travaux précédents 13 nous avons présenté notre prototype pour SPE automatisée, et de notre méthode a été appliquée à l'analyse de l'hormone naturelle 17β-estradiol dans des échantillons d'eau de mer. Avec la présente vidéo, nous tenons à souligner les avantages techniques de notre méthode par rapport à hors ligne traditionnelle et en ligne SPE, et notamment sa compatibilité avec détection par immuno-réactions. Nous décrivons le protocole appliqué à des échantillons d'eau pour la détection de 17β-estradiol. SPE est réalisée avec octadécyl-silice (C18) et phase de sorbant élution est réalisée avec du methanol dilué.
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Protocol
Remarque: Le protocole suivant décrit la SPE effectué sur 100 ml d'eau échantillon avec C18 sorbant et l'élution avec 50% v / v de methanol. L'échantillon enrichi est dilué pour atteindre 10% v / v de méthanol avant l'analyse avec un immuno-enzymatique (ELISA) kit.
1. Préparation des réactifs
- Préparer les échantillons d'eau
- Avant toute autre étape, filtrer chaque échantillon de 100 ml d'eau avec des filtres de taille de 0,2 um des pores.
- Addition de l'échantillon avec une concentration souhaitée par dilution volume approprié de solution de référence dans un volume d'eau. Par exemple, préparer 100 ml d'échantillon d'eau avec 100 ng / L de E2 par dilution de 3,3 ul de solution de référence E2 à une concentration de 300 ug / L. Diluer cette solution dix fois pour obtenir un échantillon enrichi avec 10 ng / L E2. Diluer celui-ci encore dix fois pour obtenir un échantillon de 100 ml à 1 ng / L E2.
- Placer l'échantillon filtré (non modifiée ou pointes) dans une bouteille en verre avec GFil L45. Utilisation de l'échantillon sur le même jour. Prenez une petite fraction à analyser avec le test ELISA pour estimer la concentration initiale.
- Préparer 300 ul d'éluant par dilution dans du methanol (di) de l'eau désionisée à 50% v / v dans un tube étanche.
2. Préparation de la colonne SPE
- Préparer une 20 mg / ml de suspension les particules de sorbant octadécyl-silice en ajoutant 1600 ul de premiers méthanol puis 400 ul de di-eau à 40 mg d'agent de sorption en phase inverse. Bien refermer le couvercle et agiter avec un vortex.
- Installation de la membrane inférieure dans la colonne
- Sélectionnez une membrane en nylon avec la taille des pores 11 um et le placer sur une double couche de tissu anti-poussière. Avec un poinçon de diamètre 3 mm, couper deux petites pièces dans la membrane.
- Prenez l'une des petites membranes avec un plat de gamme pince de filtre et le placer sur un côté de la colonne.
- Vissez le connecteur à fond plat avec le tube et serrer. La membrane est un groupe now en place et l'adsorbant, peut être ajouté en toute sécurité. Dessiner une flèche sur le corps de la colonne pointant vers l'extrémité où la membrane a été placée.
- Préparation de la colonne de sorbant emballé
- Fixer la colonne sur le support avec la flèche pointant vers le bas. La colonne doit être réglé le plus verticalement possible.
- Fixer un vide de 10 ml seringue à usage unique à l'extrémité du tube de la colonne, à l'aide des connecteurs Luer-Lock.
- Préparer une micro-pipette avec une pointe 20-200 pi, réglez le volume à 100 pi. Ce format d'embout de pipette est adaptée à la taille de la colonne de sorbant à préparer. La procédure serait plus difficile avec de plus grandes pointes de pipettes, tels que ceux utilisés avec des pipettes de 1 ml.
- Agiter la suspension de sorbant avec un vortex, et pipeter rapidement 100 pi dans le centre de la colonne. Tout en injectant, aspirer délicatement toute la solution pipetté cuvette de la membrane en utilisant la seringue avec l'autre main. A ce stl'âge, la solution de remplissage de la seringue doit être claire de particules, et un lit de particules peut éventuellement être observé dans la colonne.
- Répétez ce processus 2 fois plus en agitant la suspension entre toutes les étapes de pipetage pour assurer suspension homogène des particules dans la solution. La colonne résultant contient 6 mg de sorbant.
- Lorsque 300 ul de suspension ont été chargés et séché par aspiration avec la seringue, la seringue maintenir en position et placer la seconde membrane en nylon sur le dessus à l'aide de la pince de l'autre main.
- Visser la deuxième connecteur avec tube et jetez la seringue. La colonne SPE est prêt à l'emploi.
3. Préparation du système
- Serrer la colonne SPE sur le dispositif en utilisant les luer-lock. La flèche doit pointer vers la même direction que celle indiquée sur l'appareil.
- Connectez la bouteille contenant l'échantillon à l'appareil en vissant lefourni bouchon de sécurité GL45 sur elle.
- Chargez 200 pi d'éluant dans le réservoir 'éluant.
- Charge 800 pi de di-eau dans le réservoir »de dilution».
- Placer une bouteille à la sortie de déchets pour recueillir l'eau traitée lors de l'étape d'extraction. Le format n'a pas d'importance, mais le volume doit être suffisamment grand par rapport au volume de l'échantillon.
- Placer une petite fiole à la sortie du capteur avec la capacité du volume minimum de 1,5 ml. Un volume maximal de 1 ml sera trop petite que des bulles se forment à cette sortie lors de la collecte éluant enrichi et le tampon de dilution.
- Vérifiez que le régulateur de pression est en position fermée en tournant manuellement, inversez-horaire jusqu'à nouvel mouvement est pas possible.
4. SPE avec le Prototype
- Allumez le prototype en appuyant sur le bouton situé à l'arrière.
- Préparation de l'interface utilisateur et en sélectionnant le programme
- Ouvrir l'interface utilisateur. Sélectionnerle port de communication de l'ordinateur auquel l'appareil est connecté à partir de la liste, et cliquez sur le bouton 'Suivant'.
- Entrez les valeurs de 580 pour pset et 30 pour dpset. La pompe sera ajustée pour maintenir la pression dans le système sous pression et des réservoirs à 580 ± 30 mbar lors de l'exécution.
- Sélectionnez le mode automatisé.
- Dans le coin en mode automatisé, charger le fichier de programme dans le 'chemin du fichier de configuration "boîte.
- Réglage du régulateur de pression
- Démarrer la pompe.
- Tournez manuellement le régulateur de pression jusqu'à ce que la valeur lue pour preg est inférieure mais proche de 320 mbar.
- Arrêtez la pompe.
- Démarrage de la procédure SPE
- Appuyez sur 'Start' dans le coin en mode automatisé. La pompe se met en marche et de l'extraction, élution et de dilution étapes sera automatiquement suivre un autre. L'ensemble de la procédure pour un échantillon de 100 ml est réalisée en 50 min.
- Vérifiez la valeur de preg. Il doit être dans la gamme de 320 à 350 mbar lors de l'étape d'extraction pour assurer un débit optimal.
- Fermez le petit flacon et stocker à 4-5 ° C dans l'obscurité jusqu'à l'analyse. Effectuer l'analyse dans le 30 heures suivantes afin d'éviter la dégradation de l'analyte.
- Éliminer l'eau traitée.
- Nettoyage du système
Remarque: après chaque procédure d'extraction a besoin le système à être nettoyée pour empêcher la contamination croisée.- Préparer une solution à 10 ml de methanol à 70% v / v dans une bouteille en verre GL 45.
- Débranchez la colonne SPE et branchez le tube avec connecteurs.
- En mode automatique, sélectionnez le fichier «nettoyage» et démarrer avec les mêmes réglages de pression.
5. La détection de la concentration d'estradiol avec ELISA
- Préparer les échantillons d'étalonnage ayant des concentrations comme indiqué dans le protocole fourni avec le kit ELISA qui est utilisé. Préparer un Calibration ensemble avec la même matrice que l'échantillon, et un calibrage avec du méthanol à 10% v / v.
- Verser la quantité nécessaire d'échantillon dans les puits de la plaque, selon les instructions du fabricant. Utiliser des échantillons d'étalonnage, les échantillons non modifiés et enrichis eau qui ont été filtrés mais pas traitées avec SPE, et enrichi des échantillons dans le méthanol à 10% v / v. Utilisez 3 puits par échantillon pour réduire l'erreur associée à l'essai.
- Suivre les indications du protocole qui est fourni avec le kit de réactifs de l'addition, le temps d'incubation, le lavage et la réaction ultérieure avec l'enzyme.
- Lire le signal optique dans chaque puits selon les instructions du fabricant de la trousse avec un instrument de lecture de plaque et recueillir les données.
- Utiliser le logiciel de l'instrument de lecteur de plaque pour être compatibles avec les courbes d'étalonnage et déterminer la concentration de E2 dans l'échantillon initial avec la même matrice, et dans les échantillons enrichis avec du methanol 10% v / v.
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Representative Results
La reproductibilité de la garniture de matière de sorption a été évaluée par séchage et pondérer le sorbant pipeté dans des flacons en verre et le résultat est montré sur la figure 1. La reproductibilité du moment de l'injection a été testé pour 100 ml d'échantillons, comme représenté sur la Figure 2. Concentration initiale et pré- concentré échantillons enrichis ont été déterminées en utilisant un kit ELISA commercial pour 17β-estradiol et sont présentés dans la figure 3.
Le procédé proposé consiste à l'utilisateur pour la préparation de la phase de sorption (Figure 1). Les particules de sorbant sont maintenus entre deux membranes de stabilité mécanique et sont denses par la pression appliquée à la seringue pendant que le pipetage de la suspension dans la colonne. La colonne résultant contient une quantité optimisée de 6 mg de l'agent de sorption choisi erreur avec seulement 6% de cette valeur. Cette étape sert égalementcomme sorbant conditionné, que la suspension est préparée dans des conditions de solvant appropriés.
Après la préparation et l'installation de la colonne SPE sur le système, et de charger les solutions appropriées dans les réservoirs, la procédure de pré-concentration est entièrement automatisé et requiert au total moins de 1 heure pour un échantillon de 100 ml (Figure 2). L'extraction est réalisée à 40 ± 8 min. Seuls les deux paramètres sont influencés encore par l'utilisateur, la préparation de l'adsorbant tassé et le réglage du débit. La première serait être résolu en appliquant les grandes méthodes d'échelle pour la colonne fabrication. La seconde est liée au réglage manuel du régulateur de pression, qui détermine la valeur de la pression utilisée pour entraîner les solutions à travers le système. Cette source d'erreur serait éliminé en mettant en oeuvre un régulateur de pression électronique.
En ce qui concerne les performances, la prfacteur e-concentration obtenue est de 100. Tout d'abord, de pré-concentration 500 fois est effectuée par élution de l'extrait de l'adsorbant avec 50% v / v de methanol. Ensuite, une dilution de 5 fois est effectuée en ajoutant di-eau. Cette dilution permet de réduire la teneur en solvant et conserve la sensibilité de l'analyse immunologique. Lorsque l'on regarde les courbes d'étalonnage de l'ELISA (figure 3A), il est clair que le rapport de methanol dans l'échantillon enrichi ne modifie pas la sensibilité du dosage immunologique. Un résultat représentatif de la pré-concentration est représentée sur la Figure 3. Le procédé a été appliqué à des échantillons di-eau et eau de mer artificielle dopés avec 1 ng / L de 17β-estradiol. Bien que les concentrations des échantillons sont en dessous de la limite de détection, le procédé de pré-concentration apporte avec succès ces échantillons dans l'intervalle de dosage (30 - 30 000 ng / L). Les recouvrements ont été obtenus en comparant la concentration finale avec une concentration théorique à pointes. Recouvrement de 128% ± 22% et 107% ±6% ont été calculés pour di-eau et l'eau de mer artificielle respectivement (figure 3B).
Figure 1. Illustration et reproductibilité de la méthode pour l'emballage de sorbant. Il existe trois étapes: la première fixation de la membrane de nylon avec le premier connecteur, l'injection de la suspension de matière de sorption, et la fermeture de la colonne par l'insertion, la seconde membrane et le connecteur. La colonne résultant contient 6 mg de sorbant avec 6% écart type (n = 6 préparé et colonnes pondérés). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Étape par étapeillustration de la procédure avec une reproductibilité de temps pour l'injection de l'échantillon. Les entrées de solution sont chargés dans les réservoirs ou bouteille. Les deux sorties sont l'échantillon traité (des déchets) et l'échantillon enrichi, ce qui est compatible pour l'analyse par un dosage immunologique avec une faible teneur en solvant. La procédure générale est automatisé et prend un peu moins de 1 h (n = 31 avec l'écart type). L'influence de l'utilisateur sur le débit est mis en évidence avec des caractères bleus. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Résultats de la pré-concentration de E2 et de l'analyse par ELISA. (A) Les courbes d'étalonnage de l'ELISA et les points mesurés pour 1 ng / L dopés di-eau (i) et de l'eau de mer artificielle (ii) après enrichment. (B) Recouvrements obtenus pour 1 ng / L dopés di-eau (i) et de l'eau de mer artificielle (ii) après enrichissement des échantillons (n = 4). Les barres d'erreur sont les écarts-types résultant de la nombre de répétitions et les 3 puits de la plaque ELISA qui ont été utilisées pour déterminer la concentration dans chaque échantillon. Ce chiffre a été modifié à partir de (13). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Un nouveau procédé pour la préparation d'échantillons d'eau suivie d'une analyse immunologique utilisant a été proposé. L'instrument permet d'effectuer extraction en phase solide de manière automatisée et conviviale.
La filtration de l'échantillon d'eau avant son injection dans le système est critique. Toutes les particules encore présentes dans la solution seraient potentiellement provoquer l'obstruction du réseau fluidique et obstruer la colonne SPE. Une autre étape importante est la préparation de la colonne SPE. La quantité de particules dans la colonne est critique pour atteindre les meilleures performances possibles. Une attention particulière doit être prise lors de la préparation de la suspension de particules de sorbant, pour éviter l'agglomération des particules. Ce résultat est obtenu en ajoutant d'abord la fraction de solvant pour l'agent de sorption à sec, puis la fraction di-eau. Puis, au cours de l'étape de conditionnement, il est important de mélanger la suspension et l'aspiration tandis que les 100 pi avec de la pipette. A la fin de la pro SPEprocédure, bien nettoyer le système est critique. Tout d'abord, il évite la contamination croisée lorsque l'on travaille avec des échantillons différents, et d'autre part elle permet d'éviter le risque de contamination biologique de l'instrument lorsqu'il est inutilisé.
Comme indiqué dans l'introduction, l'utilisation de méthodes d'immuno-détection pour l'analyse de petites molécules de polluants dans l'environnement est en pleine expansion. Ces méthodes atteindre limites de détections dans les faibles niveaux ng / L 7, 11 et ont l'avantage d'être très spécifique. Ces méthodes sont utilisées en combinaison avec des méthodes chimiques, la plupart des techniques de spectrométrie de masse liées. 14, 15 Celui-ci ne limitent pas l'utilisation de solvant organique et de bénéficier de systèmes de SPE automatisés qui permettent d'atteindre les facteurs pré-requis de concentration élevés. En comparaison, les dosages immunologiques sont plus sensibles à la composition de tampon de dosage et le manque adapté des techniques de préparation d'échantillons pour faciliter le processus. Notre module est dédié à l'analyse de l'artmolécules de centre commercial par dosage immunologique.
Avec notre procédé automatisé, un enrichissement de 100 fois de l'échantillon est obtenu et qui permet de détecter l'analyte dans la gamme de concentration ELISA. Si ces performances de pré-concentration semblent faibles par rapport à SPE traditionnelle, ils répondent parfaitement aux exigences de l'immuno-détection. En outre, l'instrument a une petite empreinte (25 cm x 15 cm x 10 cm) et à faible coût par rapport aux manuels ou automatisés configurations typiques de SPE. 13 Si nécessaire, le débit pour l'analyse de l'échantillon multiple peut donc être augmentée en utilisant quelques dispositifs en parallèle. Une autre possibilité serait de concevoir un procédé de petits volumes d'échantillon et d'éluant, ce qui réduirait le temps nécessaire pour la procédure. D'autres limitations ont été abordés à travers la description des résultats. Il ya encore deux étapes où l'utilisateur est impliqué, tous deux liés au degré de développement de ce prototype et seraient résolus en faisant un pas de plus vers acommerciaux dispositif. L'emballage de la phase de matière de sorption est réalisée manuellement. La méthode a toutefois été montré pour être facile et reproductible. Nous sommes confiants que les colonnes jetables pourraient être produites si le système a été produit sur une plus grande échelle.
En résumé, nous avons décrit une nouvelle méthode pour effectuer SPE, un dispositif automatisé compact. Nous avons démontré son potentiel pour l'analyse d'échantillons d'eau par dosage immunologique à travers la description d'un procédé d'extraction et de concentration pré-appliqué à la détection de 17β-estradiol par un kit ELISA commercial. La méthode est facile à utiliser et rentable, et pourrait à l'avenir être appliqué en ligne avec les biocapteurs (travaux en cours). Nous prévoyons que notre plate-forme permettra d'effectuer des procédures d'extraction en phase solide similaires sur des matrices d'échantillons plus complexes de haute pertinence pour la surveillance des perturbateurs endocriniens, comme la nourriture ou l'urine. Nous sommes convaincus de notre système prendra en charge l'application des méthodes immuno-détection établis et à venir dansle domaine de l'analyse environnementale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
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