Abstract
Een nieuwe methode voor vastefase-extractie (SPE) milieu watermonsters voorgesteld. De ontwikkelde prototype is kostenefficiënt en gebruiksvriendelijk, en maakt het mogelijk om een snelle, geautomatiseerde en eenvoudige SPE voeren. De pre-geconcentreerde oplossing is geschikt voor analyse door immunoassay, met een laag gehalte organisch oplosmiddel. Een werkwijze wordt beschreven voor de extractie en pre-percentage natuurlijke hormoon 17β-oestradiol in 100 ml watermonsters. Omgekeerde fase SPE wordt uitgevoerd met octadecyl-silicagel sorptiemiddel en elutie uitgevoerd met 200 pl methanol 50% v / v. Eluent wordt verdund door toevoeging van di-water om de hoeveelheid methanol te verlagen. Na bereiding handmatig SPE kolom, wordt de totale procedure automatisch uitgevoerd binnen 1 uur. Aan het eind van het proces wordt oestradiol concentratie gemeten met behulp van een commercieel enzym-gekoppelde immuun-sorbent assay (ELISA). 100-voudig pre-concentratie wordt bereikt en het gehalte aan methanol in slechts 10% v / v. Vol terugvorderingen van het molecuulworden bereikt met 1 ng / l spiked gedeïoniseerd en synthetische zeewater monsters.
Introduction
Monstervoorbereiding is een belangrijke stap in een analytisch proces. Vooral het verwijderen van matrixeffecten, vermindering van storingen en de verrijking van het analyt nodig om nauwkeurige resultaten te bereiken en lage detectiegrenzen. Hormoonverstorende stoffen (EDC's) zijn van bijzonder belang vanwege hun actie op de levende organismen, zelfs wanneer aanwezig op zeer lage niveaus in het milieu. Het natuurlijke hormoon 17β-estradiol is aanwezig op de EU watervervuiling watch list en gevoelig te worden toegevoegd aan de lijst van prioritaire stoffen die vallen onder de Europese Kaderrichtlijn Water. Vaste fase-extractie (SPE) is gewoonlijk voor de analyse van kleine verontreinigingen in het water, zowel chemisch 1-5 (chromatografie, massaspectrometrie) en immunologische 6-9 detectiemethoden. De laatste kreeg belang op het gebied van toezicht op het milieu, zoals immunoassays zijn verkrijgbaar in grote verscheidenheid van formaten, zijn specifiek voor de tarGebruik analyt, en bereiken lage aantoonbaarheidsgrenzen. 6, 7, 10, 11 Diverse enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) zijn commercieel verkrijgbaar en in staat om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren op een multi-well plaat. De procedure bestaat uit achtereenvolgende reactiestappen die enkele uren kan duren. Het uiteindelijke reactieproduct kan optisch worden gedetecteerd om de concentratie van het doelwitmolecuul op basis van een ijkcurve te bepalen.
Klassieke SPE procedures omvatten sorbens pre-conditioning, monstername, wassen, elutie en indampen van het eluens. Het oplosmiddel gebruikt voor het verdunnen van het extract wordt gekozen afhankelijk van de detectiemethode. Voor immunologische werkwijzen, de hoeveelheid organisch oplosmiddel beïnvloedt sterk de gevoeligheid van de werkwijze. 12
Naast het herstel en de pre-concentratie uitvoeringen, de werkwijze moet ook eenvoudig en kostenefficiënt. Automatisering van de procedure helpt tot-mens-gerelateerde fouten te verminderen. In onze vorige werk 13 we ons prototype voor geautomatiseerde SPE geïntroduceerd, en onze methode werd toegepast op de analyse van het natuurlijke hormoon 17β-estradiol in zee watermonsters. Met de huidige video willen we de technische voordelen van onze methode vergeleken met de traditionele off-line en on-line SPE, en de bijzondere compatibiliteit met detectie door immuno-reacties te markeren. We beschrijven het protocol toegepast watermonsters voor de detectie van 17β-oestradiol. SPE wordt uitgevoerd met octadecyl-silicagel (C18) sorbent fase en elutie wordt uitgevoerd met verdunde methanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het volgende protocol beschrijft de SPE uitgevoerd op 100 ml water monster met C18 sorptiemiddel en elutie met 50% v / v methanol. De verrijkte monster wordt verdund tot 10% v / v methanol bereiken voordat de analyse van een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit.
1. Voorbereiding van de reagentia
- Bereid de watermonsters
- Voorafgaand aan een andere stap, filteren elke 100 ml water monster met 0,2 um poriegrootte filters.
- Spike het monster met gewenste concentratie door verdunning geschikt volume referentieoplossing in een volume water. Zo bereiden 100 ml water monster met 100 ng / l E2 door het verdunnen van 3,3 pl E2 referentieoplossing in een concentratie van 300 ug / L. Verdun deze oplossing tien keer om een monster verrijkt met 10 ng / L E2. Verdun deze laatste nog tien keer een monster van 100 ml met 1 ng / L E2 verkrijgen.
- Plaats het gefiltreerde monster (ongemodificeerde of spiked) in een glazen fles met GL45 draad. Gebruik het monster op dezelfde dag. Neem een kleine fractie wordt geanalyseerd met ELISA beginconcentratie schatten.
- Bereid 300 ul eluens door verdunning methanol in gedeïoniseerd (di-) water tot 50% v / v in een strakke buis.
2. Voorbereiding van de SPE Column
- Bereid een 20 mg / ml suspensie van octadecyl-silicagel sorbensdeeltjes door toevoeging eerst 1600 pl methanol en vervolgens 400 gl di-water om 40 mg van omgekeerde fase sorbens. Goed sluit het deksel en schud met een vortex.
- Het installeren van de onderste membraan in kolom
- Selecteer een Nylon membraan met poriegrootte 11 micrometer en plaats het op een dubbele laag van anti-stof weefsel. Met een 3 mm diameter pons gesneden twee houtbewerking van het membraan.
- Pak een van de kleine membranen met een flatscreen-end filter pincet en plaats het op de ene kant van de kolom.
- Schroef de vlakke bodem connector met de buis en draai. Het membraan is now op zijn plaats en het sorbens kan veilig worden toegevoegd. Teken een pijl op het lichaam van de kolom wijst naar het einde, waar het membraan geplaatst.
- De voorbereiding van de gepakte sorptiemiddel kolom
- Bevestig de kolom aan de houder met de pijl naar beneden. De kolom moet zo verticaal mogelijk worden ingesteld.
- Bevestig een lege 10 ml wegwerpspuit aan het einde van de buis van de kolom via de Luer-Lock aansluitingen.
- Bereid een micro-pipet met een 20-200 ul tip, zet het volume tot 100 ul. Deze pipetpunt formaat wordt aangepast aan de grootte van de kolom sorbens te bereiden. De procedure zou moeilijker met grotere pipettips zoals die gebruikt bij 1 ml pipetten zijn.
- Schud het sorberende suspensie met een vortex en snel pipet 100 ul in het midden van de kolom. Tijdens het injecteren, aspireren voorzichtig alle gepipetteerde oplossing doorheen het membraan met behulp van de injectiespuit met de andere hand. Op dit stleeftijd, moet de oplossing vullen van de spuit vrij van deeltjes en een deeltjesgrootte bed kan eventueel worden waargenomen in de kolom.
- Herhaal dit proces 2 keer door roeren van de voorraadsuspensie tussen alle pipetteerstappen homogene suspensie van de deeltjes in de oplossing te waarborgen. De verkregen kolom bevat 6 mg sorptiemiddel.
- Wanneer de 300 ul suspensie zijn geladen en gedroogd door opzuigen met de injectiespuit, houdt de spuit in positie en plaats het tweede Nylon membraan aan de bovenzijde met behulp van de tang met de andere hand.
- Schroef de tweede aansluiting met buis en gooi de spuit. De kolom SPE is klaar voor gebruik.
3. Voorbereiding van het systeem
- Draai de kolom SPE op het apparaat met behulp van de Luer-Lock-aansluitingen. De pijl moet wijzen in dezelfde richting als die op de inrichting.
- Sluit de fles met het monster op de inrichting van de schroevenmits GL45 veiligheid cap op.
- Laad 200 gl eluent in de 'Eluent' reservoir.
- Belasting 800 pi van di-water in het 'verwateren' reservoir.
- Plaats een fles op de afvoer naar het verwerkte water op te vangen tijdens de extractie stap. Het formaat is niet belangrijk, maar de hoeveelheid dient voldoende groot met betrekking tot het monstervolume zijn.
- Plaats een klein flesje op de sensor uitgang met het minimale volume van 1,5 ml. Een maximaal volume van 1 ml zal te klein zijn als belletjes zal vormen in deze outlet bij het verzamelen van verrijkt eluent en verdunning buffer.
- Controleer de drukregelaar in gesloten stand handmatig draaien, reverse-rechts tot verdere verplaatsing niet mogelijk.
4. SPE met de Prototype
- Schakel de prototype door op de knop op de achterkant.
- De voorbereiding van de user interface en het selecteren van het programma
- Open de gebruikersinterface. Selectde communicatie-poort van de computer waarop het apparaat is aangesloten uit de lijst, en klik op de knop 'Volgende'.
- Voer de waarden 580 voor PSET en 30 voor dpset. De pomp wordt aangepast om de druk in het druksysteem en reservoirs te handhaven op 580 ± 30 mbar uitgevoerd.
- Selecteer de automatische modus.
- In de automatische modus hoek, laadt het programma bestand in het vak 'configuratiebestand pad'.
- Het aanpassen van de drukregelaar
- Start de pomp.
- Draai handmatig de drukregelaar totdat de waarde lezen preg inferieur is, maar dicht bij 320 mbar.
- Stop de pomp.
- Starten van de SPE procedure
- Druk op 'start' in de automatische modus hoek. De pomp zal inschakelen en de winning, elutie en verdunning stappen zullen automatisch volgen elkaar. De gehele procedure een 100 ml monster wordt uitgevoerd in 50 minuten.
- Controleer de waarde van preg. Het moet in de range 320 zijn - 350 mbar bij de winning stap om een optimale debiet te garanderen.
- Sluit het kleine flesje en bewaar bij 4-5 ° C in het donker tot analyse. Voer analyse in de volgende 30 uur tot degradatie te voorkomen.
- Ontdoen van het verwerkte water.
- Het reinigen van het systeem
Let op: Na elke extractieprocedure het systeem moet worden gereinigd om kruisbesmetting te voorkomen.- Bereid een 10 ml oplossing van methanol 70% v / v in een glazen fles GL 45.
- Stekker uit de kolom SPE en steek de buis met connectoren.
- In de automatische modus selecteert u de 'schoonmaak' bestand en start het met dezelfde druk instellingen.
5. Detectie van estradiol Concentratie met ELISA
- Bereid de kalibratie monsters bij concentraties zoals aangegeven in het protocol die bij de ELISA kit die wordt gebruikt. Bereid een calibratie set met dezelfde matrix als het monster, en een calibratie set met methanol 10% v / v.
- Doseer de benodigde hoeveelheid monster in de putjes op de plaat, volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik ijkmonsters, ongewijzigde en spiked watermonsters die werden gefilterd, maar niet in methanol 10% v verwerkt met SPE, en verrijkt samples / v. Gebruik 3 putjes per monster aan de foutenbronnen bij de assay te verminderen.
- Volg de aanwijzingen van het protocol dat wordt geleverd bij de kit voor de toevoeging van reagentia, incubatietijd, wassen en verdere reactie met het enzym.
- Lees het optische signaal in elke put volgens instructies van de fabrikant kit met een plaatlezer instrument en het verzamelen van de gegevens.
- Met de software van de plaatlezer instrument om de kalibratiekromme te passen en bepaal de E2 concentratie in het oorspronkelijke monster met dezelfde matrix, en in het verrijkte monsters met methanol 10% v / v.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduceerbaarheid sorptiemiddel verpakking werd geëvalueerd door het drogen en het wegen van de gepipetteerde sorbens in glazen flesjes en het resultaat wordt getoond in figuur 1. Reproduceerbaarheid van het tijdstip van de injectie werd getest 100 ml monsters, zie figuur 2. Concentratie initiële en pre- spiked geconcentreerde monsters werden bepaald met een commerciële ELISA kit voor 17β-oestradiol en worden getoond in figuur 3.
De voorgestelde procedure de gebruiker voor de bereiding van het sorptiemiddel fase (figuur 1). De sorberende deeltjes worden vastgehouden tussen twee membranen voor mechanische stabiliteit en zijn dicht uitgeleverd aangebracht met de spuit terwijl pipetteren de suspensie in de kolom druk. De verkregen kolom bevat een geoptimaliseerde hoeveelheid van 6 mg van het gekozen sorbens met slechts 6% fout op deze waarde. Deze stap treedt ookals sorptiemiddel conditionering, de schorsing is opgesteld toegeëigend oplosmiddel omstandigheden.
Na bereiding en installeren van de SPE kolom van het systeem en het laden van de oplossingen in de geschikte reservoirs, wordt de pre-concentratieprocedure volledig geautomatiseerd en vergt in totaal minder dan 1 uur voor een 100 ml monster (figuur 2). Extractie wordt uitgevoerd bij 40 ± 8 min. Slechts twee parameters nog beïnvloed door de gebruiker, de voorbereiding van de verpakte sorptiemiddel en de instelling van de stroomsnelheid. De eerste worden opgelost door de toepassing grootschalige werkwijzen voor het vervaardigen kolom. De tweede heeft betrekking op de handmatige instelling van de drukregelaar, waarbij de drukwaarde gebruikt om de oplossingen te drijven via het systeem bepaalt. Deze bron van fouten zouden worden geëlimineerd door het implementeren van een elektronische drukregelaar.
Ten aanzien van de prestaties, de pre-concentratiefactor bereikt is 100. Eerst wordt 500-voudig preconcentratie gedaan door elueren het uittreksel uit het sorbens met 50% v / v methanol. Dan 5 maal verdunning wordt uitgevoerd door toevoeging van di-water. Deze verdunning vermindert het gehalte aan oplosmiddelen en behoudt de immunoassay gevoeligheid. Wanneer we de kalibratiecurves van ELISA (figuur 3A), is het duidelijk dat de verhouding methanol in het verrijkte monster beïnvloedt de gevoeligheid van de immunoassay. Een representatief resultaat van pre-concentratie wordt weergegeven in figuur 3. De werkwijze werd op di-water en kunstmatig zeewater monsters verrijkt met 1 ng / l 17β-oestradiol. Terwijl de monsterconcentraties beneden de detectielimiet, de pre-Concentratiewerkwijze succes brengt die monsters in het bereik van de assay (30 - 30.000 ng / l). De terugwinning werden verkregen door vergelijking van de theoretische eindconcentratie spiked concentratie. Terugvorderingen van 128% ± 22% en 107% ±6% werd berekend voor di-water en kunstmatige zeewater respectievelijk (Figuur 3B).
Figuur 1. Illustratie en reproduceerbaarheid van de werkwijze voor het verpakken sorptiemiddel. Er zijn drie stappen: bevestigen van het eerste nylon membraan met de eerste connector, injecteren van het sorptiemiddel suspensie en sluiten van de kolom door het inbrengen van het tweede membraan en connector. De resulterende kolom bevat 6 mg sorbent met 6% standaarddeviatie (n = 6 voorbereid en gewogen kolommen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Stap-voor-stapillustratie van de procedure met de reproduceerbaarheid van de tijd voor het injecteren van een monster. De oplossing ingangen zijn in de reservoirs of fles geladen. De twee uitgangen zijn de verwerkte monster (afval) en de verrijkte monster, die compatibel is voor analyse door immunoassay met een laag gehalte aan oplosmiddelen is. De algemene procedure is geautomatiseerd en duurt iets minder dan 1 uur (n = 31 met standaarddeviatie). De invloed van de gebruiker op het debiet is gemarkeerd met blauwe letters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Resultaten van de pre-concentratie van E2 en analyse door ELISA. (A) IJkkrommen van de ELISA en de punten gemeten 1 ng / L spiked di-water (i) en kunstmatig zeewater (ii) na Enrichment. (B) Terugvorderingen verkregen 1 ng / L spiked di-water (i) en kunstmatig zeewater (ii) monsters na verrijking (n = 4). De foutenstaven zijn standaardafwijkingen voortvloeien uit het aantal herhalingen en de 3 putjes van de ELISA plaat die werden gebruikt om de concentratie in elk monster te bepalen. Dit cijfer is aangepast (13). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een nieuwe werkwijze voor de bereiding van watermonsters gevolgd door analyse met behulp immunoassay voorgesteld. Het instrument maakt het mogelijk om de vaste fase extractie uit te voeren op een geautomatiseerde en gebruiksvriendelijke manier.
De filtratie van het watermonster vóór de injectie in het systeem kritisch. Eventuele deeltjes nog in de oplossing mogelijk verstopping van de vloeibare netwerk veroorzaken en belemmeren de kolom SPE. Een andere belangrijke stap is de bereiding van de kolom SPE. De hoeveelheid deeltjes in de kolom is kritisch voor de best mogelijke prestaties te bereiken. Speciale zorg moet worden genomen bij de voorbereiding van de opschorting van sorbensdeeltjes, om agglomeratie van de deeltjes te voorkomen. Dit wordt bereikt door eerst de oplosmiddelfractie het droge sorbens, en vervolgens het di-waterfractie. Daarna tijdens het verpakken stap is het belangrijk om de suspensie te mengen goed, terwijl het afzuigen 100 ul met de pipet. Aan het einde van de SPE proprocedure, goed schoonmaken van het systeem is van cruciaal belang. Allereerst voorkomt kruisbesmetting bij het werken met verschillende monsters, en ten tweede voorkomt het risico van biocontaminatie van het instrument wanneer deze niet wordt gebruikt.
Zoals in de inleiding is het gebruik van immuno-detectiemethoden voor de analyse van kleine verontreinigende moleculen in de omgeving uitbreiden. Deze methoden bereiken grenzen van detecties in het lage ng / L niveau 7, 11 en hebben het voordeel dat ze zeer specifiek. Dergelijke werkwijzen worden in combinatie met chemische werkwijzen, voornamelijk massaspectrometrie gerelateerde technieken. 14, 15 De laatstgenoemde hebben het gebruik van organische oplosmiddelen en profiteren van SPE geautomatiseerde systemen die het mogelijk maken het bereiken van de vereiste hoge pre-concentratie factoren beperken. In vergelijking, immunoassays zijn gevoeliger voor de assay buffer samenstelling en gebrek aangepast staalvoorbereidingstechnieken om het proces te vergemakkelijken. De module is gewijd aan de analyse van de small moleculen door immunoassay.
Met onze geautomatiseerde werkwijze wordt een 100-voudige verrijking van het monster gerealiseerd en maakt het mogelijk de analyt in de ELISA concentratiebereik detecteren. Als die pre-concentratie optredens lijken laag in vergelijking met de traditionele SPE, ze perfect aansluiten bij de eisen voor immuno-detectie. Bovendien, het instrument heeft een kleine footprint (25 cm x 15 cm x 10 cm) en lage-kosten in vergelijking met de typische handmatige of geautomatiseerde SPE setups. 13 Indien nodig, kan de doorvoer voor meerdere monsteranalyse daarom worden verhoogd met behulp van een paar apparaten parallel. Een andere mogelijkheid zou zijn om een werkwijze te ontwerpen voor kleinere hoeveelheden monster en elutiemiddel, waarbij de tijd die de procedure zou verminderen. Enkele andere beperkingen werden besproken door de beschrijving van de resultaten. Er zijn nog twee stappen waarbij de gebruiker betrokken, zowel in verband met de mate van ontwikkeling ervan en worden opgelost door een stap verder naar acommercial apparaat. De verpakking van het sorptiemiddel fase handmatig. De methode werd echter aangetoond gemakkelijk en reproduceerbaar. We zijn ervan overtuigd dat wegwerp kolommen zou kunnen worden geproduceerd als het systeem werden geproduceerd op een hogere schaal.
Samengevat hebben we een nieuwe methode SPE voeren op een compacte, geautomatiseerde inrichting beschreven. We hebben het potentieel voor de analyse van watermonsters door immunoassay aangetoond door de beschrijving van een extractie en pre-Concentratiewerkwijze door een commerciële ELISA-kit toegepast voor detectie van 17β-oestradiol. De methode is gebruiksvriendelijk en kosteneffectief en kan in de toekomst worden toegepast in lijn met biosensoren (werk in uitvoering). We verwachten ons platform in staat zal stellen om soortgelijke vaste fase extractie procedures op meer complexe monstermatrices van groot belang voor de monitoring van EDC's, zoals voedsel of urine uit te voeren. We zijn ervan overtuigd dat ons systeem zal de toepassing van gevestigde en opkomende immuno-detectiemethoden in ondersteuningop het gebied van milieu-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
