Abstract
Um novo método de extracção em fase sólida (SPE) de amostras de água do ambiente é proposto. O protótipo desenvolvido é amigável custo-eficiente e usuário, e permite realizar SPE rápido, automatizado e simples. A solução de pré-concentrado é compatível com a análise por imunoensaio, com um conteúdo de solvente orgânico de baixo. É descrito um método para a extracção e concentração da pré-hormona natural 17β-estradiol em 100 ml de amostras de água. SPE de fase reversa é efectuada com octadecil-sílica adsorvente e a eluição é feita com 200 ul de metanol a 50% v / v. Eluente é diluída por adição de di-água para baixar a quantidade de metanol. Depois de preparar manualmente a coluna SPE, o procedimento geral é realizada automaticamente dentro de 1 hora. No final do processo, a concentração de estradiol é medido usando um ensaio imuno-sorvente comercial ligado a enzima (ELISA). 100 vezes pré-concentração é conseguida e o teor de metanol em apenas 10% v / v. Recuperações de pleno direito da moléculasão alcançados com 1 ng / L amostras adicionadas desionizada e água do mar sintética.
Introduction
A preparação da amostra é uma etapa importante em qualquer processo analítico. Em particular, a remoção dos efeitos de matriz, diminuição das interferências, e enriquecimento da substância a analisar são necessárias para obter resultados precisos e atingem baixos limites de detecção. Compostos de desregulação endócrina (EDC) são particularmente preocupantes devido à sua ação sobre os organismos vivos, mesmo quando presentes em níveis muito baixos no meio ambiente. O hormônio natural 17β-estradiol está presente na poluição da água UE Watch List e propenso a ser adicionado à lista de substâncias prioritárias regulamentados pela Directiva-Quadro da Água da UE. Extracção em fase sólida (SPE), é geralmente utilizado para a análise de pequenas poluentes na água, com tanto química 1-5 (cromatografia, espectrometria de massa) e métodos de detecção imunológicos 6-9. Este último ganhou interesse no campo da monitorização ambiental, como imunoensaios estão disponíveis em grande variedade de formatos, são específicas para a TArPegue analito, e atingir baixos limites de detecção. 6, 7, 10, 11 Vários ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA) estão comercialmente disponíveis e permitem analisar várias amostras ao mesmo tempo sobre uma placa multi-poços. O procedimento consiste em passos de reacção sucessivos que podem levar algumas horas. O produto final da reacção pode ser detectado opticamente para determinar a concentração da molécula alvo com base em uma curva de calibração.
SPE procedimentos clássicos incluem sorvente pré-condicionado, extracção da amostra, a lavagem, a eluição, e concentração por evaporação do eluente. O solvente utilizado para a diluição deste extracto é escolhido dependendo do método de detecção. 12 Para os métodos imunológicos, a quantidade de solvente orgânico influências fortemente a sensibilidade do método.
Para além da recuperação e os desempenhos de pré-concentração, o método também tem de ser simples e de custo eficiente. Automação do Procedure ajuda a reduzir erros humanos-relacionados. No nosso trabalho anterior 13 que introduzida a protótipo para SPE automatizado, e o nosso método foi aplicado para a análise da hormona natural 17β-estradiol nas amostras de água do mar. Com o presente vídeo, gostaríamos de destacar as vantagens técnicas do nosso método em comparação com off-line tradicional e on-line SPE, e em particular a sua compatibilidade com detecção por imuno-reacções. Nós descrevemos o protocolo aplicado a amostras de água para a detecção de 17β-estradiol. SPE é realizada com octadecil-silica (C18) de fase sorvente e a eluição é realizada com metanol diluído.
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Protocol
Nota: O protocolo seguinte descreve a SPE realizada em amostra de 100 ml de água com sorvente C18 e eluição com 50% v / v de metanol. A amostra é diluída enriquecido para chegar a 10% v / v de metanol, antes da análise com um ensaio de imunoabsorção enzimática kit (ELISA).
1. Preparar os reagentes
- Prepare as amostras de água
- Antes de qualquer outra etapa, filtrar cada amostra de 100 ml de água com filtros de tamanho de poro de 0,2 um.
- Pico a amostra com a concentração desejada por diluição volume apropriado da solução de referência para um volume de água. Por exemplo, preparar 100 mL de amostra de água com 100 ng / L de E2 através da diluição de 3,3 ml de solução de referência E2 a uma concentração de 300 ug / L. Diluir esta solução dez vezes para obter uma amostra enriquecida com 10 ng / L E2. Dilui-se esta última mais de dez vezes para se obter uma amostra de 100 ml com 1 ng / L E2.
- Colocar a amostra filtrada (não modificada ou perfurantes) em um frasco de vidro com GLinha L45. Utilizar a amostra no mesmo dia. Pegue uma pequena fração de ser analisadas com o ELISA para estimar concentração inicial.
- Preparar 300 ul de eluente por diluição em metanol (di) água desionizada a 50% v / v em um tubo apertado.
2. Preparação da coluna de SPE
- Preparar uma solução 20 mg / ml, suspensão de partículas de octadecil-sílica absorventes, adicionando primeiros 1.600 ul de metanol e em seguida 400 ul de di-água a 40 mg de adsorvente de fase inversa. Feche bem a tampa e agitar com um vortex.
- Instalação da membrana inferior na coluna
- Selecione uma membrana de nylon com tamanho de poros de 11 mm e coloque-a sobre uma dupla camada de tecido anti-poeira. Com um furador de diâmetro de 3 mm, cortar duas peças pequenas na membrana.
- Pegar numa das pequenas membranas com uma extremidade plana fórceps de filtro e colocá-lo sobre um lado da coluna.
- Parafuso do conector de fundo plano com o tubo e aperte. A membrana é now no lugar e o adsorvente pode ser adicionado de forma segura. Desenhar uma seta no corpo da coluna de apontamento para o fim em que a membrana foi colocada.
- Preparação da coluna de sorvente embalado
- Fixe a coluna no suporte com a seta apontada para o fundo. A coluna deve ser definido como na vertical quanto possível.
- Anexar um vazio 10 ml seringa descartável para a extremidade do tubo da coluna, utilizando os conectores Luer-Lock.
- Prepare uma micro-pipeta com uma ponta de 20-200 �, ajustar o volume para 100 l. Este formato de ponta de pipeta é adaptada ao tamanho da coluna de adsorvente a ser preparado. O procedimento seria mais difícil com pontas de pipeta maiores, como os usados com pipetas de 1 ml.
- Agita-se a suspensão sorvente com um vortex, e pipeta-se rapidamente 100 pi no centro sobre a coluna. Embora a injecção, aspirar suavemente pipetado toda a solução através da membrana usando a seringa com a outra mão. Neste sta idade, a solução de encher a seringa tem de estar livre de partículas, e um leito de partículas pode, eventualmente, ser observada na coluna.
- Repetir este processo mais 2 vezes por agitação da suspensão de pasta entre todos os passos de pipetagem para garantir a suspensão homogénea das partículas em solução. A coluna resultante contém 6 mg de sorvente.
- Quando os 300 ul de suspensão ter sido carregado e secou-se por aspiração com a seringa, manter a seringa na posição e colocar a segunda membrana de nylon sobre a parte superior, utilizando a pinça com a outra mão.
- Aperte o segundo conector com tubo e descarte da seringa. A coluna de SPE está pronto para uso.
3. Preparação do Sistema
- Aperte a coluna SPE no dispositivo usando os conectores Luer-Lock. A seta aponta para deve ser na mesma direcção que a mostrada no dispositivo.
- Ligue o frasco contendo a amostra para o dispositivo por enroscamento afornecida tampa de segurança GL45 nele.
- De carga de 200 mL de eluente no reservatório "Eluente '.
- Carga de 800 ul de di-água no reservatório "diluição".
- Coloque uma garrafa na saída de resíduos para recolher a água processada durante a etapa de extração. O formato não é importante, mas o volume tem de ser suficientemente grande no que diz respeito ao volume da amostra.
- Coloque um pequeno frasco na saída do sensor com a capacidade mínima volume de 1,5 ml. Um volume máximo de 1 ml será muito pequeno como bolhas se formarão neste saída ao coletar eluente enriquecido e tampão de diluição.
- Verifique se o regulador de pressão está na posição fechada, rodando-a manualmente, inverter-horário até novo movimento não é possível.
4. SPE com o Prototype
- Ligue o protótipo pressionando o botão na parte de trás.
- Preparando a interface do usuário e selecionar o programa
- Abra a interface do usuário. Selecionara porta de comunicação do computador ao qual o dispositivo está conectado a partir da lista e clique no botão "Next".
- Digite os valores para 580 pset e 30 para dpset. A bomba irá ajustar para manter a pressão no sistema pressurizado e reservatórios em 580 ± 30 mbar quando em execução.
- Selecione o modo automatizado.
- No canto modo automatizado, carregar o arquivo de programa no "caminho do arquivo de configuração 'caixa.
- Ajustar o regulador de pressão
- Comece a bomba.
- Gire manualmente o regulador de pressão até que o valor lido para preg é inferior mas próximo de 320 mbar.
- Parar a bomba.
- Iniciar o procedimento de SPE
- Prima 'start' no canto automatizado modo. A bomba irá ligar e as etapas de extração, eluição e diluição seguirá automaticamente o outro. Todo o procedimento para uma amostra de 100 mL é realizada em 50 min.
- Verifique se o valor de preg. Ele deve estar na gama de 320 - 350 mbar durante a fase de extracção para assegurar uma taxa de fluxo óptima.
- Feche o pequeno frasco e armazenar a 4-5 ° C no escuro até à análise. Realizar a análise em 30 horas a seguir para evitar a degradação da substância a analisar.
- Elimine a água processada.
- Limpeza do sistema
Nota: Após cada procedimento de extração do sistema precisa ser limpo para evitar a contaminação cruzada.- Prepara-se uma solução de 10 ml de metanol a 70% v / v em um frasco de vidro de 45 GL.
- Desligue a coluna SPE e ligue o tubo com conectores.
- No modo automático, selecione o arquivo 'limpeza' e iniciá-lo com as configurações mesma pressão.
5. Detecção de Concentração de Estradiol com ELISA
- Preparar as amostras de calibração com concentrações, tal como indicado no protocolo fornecido com o kit de ELISA que é utilizado. Prepare uma calibração definido com a mesma matriz, como a amostra, e um conjunto de calibragem com metanol a 10% v / v.
- Retirar a quantidade necessária de amostra nos poços na placa, de acordo com as instruções do fabricante. Use amostras de calibração, as amostras de água não modificados e perfurantes que foram filtrados, mas não processados com a SPE, e amostras enriquecidas em metanol a 10% v / v. Use 3 poços por amostra para reduzir o erro associado com o ensaio.
- Seguir as indicações do protocolo que é fornecido com o kit para a adição de reagentes, tempo de incubação, lavagem e posterior reacção com a enzima.
- Ler o sinal óptico em cada poço de acordo com as instruções do fabricante do kit com um instrumento leitor de placas e recolher os dados.
- Utilizar o software do instrumento leitor de placas para se ajustar às curvas de calibração e determinar a concentração de E2 na amostra inicial com mesma matriz, e nas amostras enriquecidas com metanol a 10% v / v.
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Representative Results
A reprodutibilidade da embalagem sorvente foi avaliada por secagem e pesagem do sorvente pipetado em frascos de vidro e o resultado é mostrado na Figura 1. A reprodutibilidade do tempo de injecção foi testado para as amostras de 100 ml, como mostrado na Figura 2. A concentração in inicial e pré- concentrado cravado amostras foram determinadas usando um kit comercial de ELISA para 17β-estradiol e são mostrados na Figura 3.
O procedimento proposto envolve o utilizador para a preparação da fase de sorvente (Figura 1). As partículas sorventes são mantidos entre duas membranas para estabilidade mecânica e são densamente pela pressão aplicada com a seringa enquanto pipetando a suspensão na coluna. A coluna resultante contém uma quantidade optimizada de 6 mg do adsorvente escolhido com apenas 6% erro nesta valor. Este passo também agecomo sorvente condicionado, como a suspensão é preparada em condições de solventes adequados.
Depois de preparar e de instalar a coluna de SPE no sistema, e carregar as soluções nos reservatórios adequados, o processo de pré-concentração é totalmente automatizado e requer, no total, menos de 1 hora para uma amostra de 100 ml (Figura 2). A extracção é realizada em 40 ± 8 min. Apenas dois parâmetros são ainda influenciado pelo utilizador, a preparação do sorvente embalado e o ajuste do caudal. A primeira seria resolvido mediante a aplicação de métodos para a fabricação em grande escala da coluna. A segunda é relativa à regulação manual do regulador de pressão, que determina o valor da pressão utilizada para accionar as soluções através do sistema. Esta fonte de erro seria eliminada através da implementação de um regulador de pressão eletrônico.
Em relação a performances, o prFactor E-concentração é conseguida 100. Em primeiro lugar, 500 vezes pré-concentração é feita por eluição do extracto a partir do adsorvente com 50% v / v de metanol. Em seguida, uma diluição de 5 vezes é realizada através da adição de di-água. Esta diluição reduz o conteúdo de solvente e preserva a sensibilidade imunoensaio. Ao olhar para as curvas de calibração de ELISA (Figura 3A), é evidente que a relação de metanol na amostra enriquecida não afecta a sensibilidade do imunoensaio. Um resultado representativo de pré-concentração é mostrado na Figura 3. O método foi aplicado a amostras de di-água e água do mar artificial fortificada com 1 ng / L de 17β-estradiol. Enquanto as concentrações das amostras estão abaixo do limite de detecção, o método de pré-concentração traz com sucesso dessas amostras no intervalo do ensaio (30 - 30.000 ng / L). As recuperações foram obtidas comparando a concentração final com uma concentração teórica cravado. As recuperações de 128% ± 22% e 107% ±6% foram calculados para o di-água e água do mar artificial, respectivamente (Figura 3B).
Figura 1. Ilustração e reprodutibilidade do método para a embalagem absorvente. Há três etapas: a primeira membrana de fixação de nylon com o primeiro conector, que injetam a suspensão absorvente, e fechar a coluna, inserindo a segunda membrana e conector. A coluna resultante contém 6 mg de adsorvente com desvio padrão de 6% (n = 6 colunas preparadas e ponderadas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Passo-a-passoilustração do procedimento com reprodutibilidade do tempo para a injecção da amostra. As entradas de solução são carregados nos reservatórios ou garrafa. As duas saídas são a amostra processada (resíduos) e a amostra enriquecida, o qual é compatível para análise por imunoensaio com baixo teor de solvente. O procedimento geral é automatizado e leva ligeiramente menos do que 1 hora (n = 31 com desvio padrão). A influência do usuário sobre o caudal é realçado com personagens azuis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os resultados do pré-concentração de E2 e análise por ELISA. (A) curvas de calibração de ELISA e os pontos medidos de 1 ng / L cravado di-água (i) e água do mar artificial (ii) depois de enrichment. (B) As recuperações obtidas para 1 ng / L cravado di-água (i) e água do mar artificial (ii) após enriquecimento amostras (n = 4). As barras de erro são desvios padrão resultantes a partir do número de repetições e 3 poços na placa de ELISA que foram usadas para determinar a concentração de cada amostra. Esta figura foi modificada a partir de (13). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Foi proposto um novo método para a preparação de amostras de água seguida por análise utilizando imunoensaio. O instrumento permite realizar extração em fase sólida de forma automatizada e fácil de usar.
A filtração da amostra de água antes da sua injecção no sistema é crítico. Quaisquer partículas ainda presentes na solução seria, potencialmente, causar o entupimento da rede de fluidos e obstruir a coluna de SPE. Outro passo importante é a preparação da coluna de SPE. A quantidade de partículas na coluna é crítica para conseguir os melhores resultados possíveis. Um cuidado especial deve ser tomado quando da preparação da suspensão de partículas absorventes, para evitar a aglomeração das partículas. Isto é conseguido através da adição de a primeira fracção de solvente para o absorvente seco, e, em seguida, a fracção de di-água. Então, durante o passo de embalagem, o que é importante para misturar bem a suspensão enquanto aspirar os 100 ul com a pipeta. No final da SPE prócesso, limpar adequadamente o sistema é crítico. Em primeiro lugar, evita a contaminação cruzada quando se trabalha com amostras diferentes, e em segundo lugar, evita o risco de bio-contaminação do instrumento quando ele não é usado.
Como discutido na introdução, a utilização de métodos de detecção de imuno para análise de moléculas pequenas de poluentes no meio ambiente está a expandir. Esses métodos de atingir os limites de detecções nos baixos níveis ng / L 7, 11 e tem a vantagem de ser muito específica. Tais métodos são utilizados em combinação com métodos químicos, a maioria técnicas relacionadas com espectrometria de massa. 14, 15 Estes últimos não restringir a utilização de um solvente orgânico e beneficiar de sistemas de SPE automatizados que permitem alcançar os factores de concentração pré-elevadas exigidas. Em comparação, os imunoensaios são mais sensível à composição do tampão de ensaio e falta adaptado técnicas de preparação da amostra a fim de facilitar o processo. Nosso módulo é dedicado à análise de smoléculas de shopping por imunoensaio.
Com o nosso método automatizado, um enriquecimento de 100 vezes da amostra é conseguido e permite detectar a substância a analisar na gama de concentração de ELISA. Se essas performances pré-concentração parecer baixo em comparação com SPE tradicional, eles combinam perfeitamente com os requisitos para a detecção de imuno. Além disso, o instrumento tem uma base pequena (25 cm x 15 cm x 10 cm) e de baixo custo em comparação com configurações típicas SPE manuais ou automatizados. 13 Se necessário, a taxa de transferência para a análise de amostras múltiplas pode, portanto, ser aumentada pela utilização de alguns dispositivos em paralelo. Outra possibilidade seria a de criar um método para pequenos volumes de amostra e eluente, o que reduz o tempo necessário para o procedimento. Algumas outras limitações foram discutidos por meio da descrição dos resultados. Há ainda duas etapas onde o usuário está envolvido, ambos ligados ao grau de desenvolvimento deste protótipo e seriam resolvidos fazendo mais um passo rumo acommercial dispositivo. A embalagem da fase sorvente é feito manualmente. O método foi, no entanto mostrou-se fácil e reprodutível. Estamos confiantes de que as colunas descartáveis poderia ser produzido se o sistema foram produzidos em uma escala maior.
Em resumo, descrevemos um novo método para executar SPE num dispositivo compacto e automatizado. Nós demonstramos o seu potencial para a análise de amostras de água por imunoensaio por meio da descrição de um método de extracção e concentração pré-aplicado à detecção de 17β-estradiol por um kit de ELISA comercial. O método é de fácil utilização e de baixo custo, e poderia no futuro ser aplicada em linha com biossensores (work in progress). Esperamos que a nossa plataforma permitirá a realização de procedimentos de extração em fase sólida semelhantes em matrizes de amostras mais complexas de alta relevância para o controlo dos desreguladores endócrinos, como a alimentação ou na urina. Estamos convencidos de nosso sistema apoiará a aplicação de métodos de detecção imuno-estabelecidos e futuros emo campo de análise ambiental.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
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