Abstract
En ny metod för fastfasextraktion (SPE) av miljö vattenprover föreslås. Den utvecklade prototypen är kostnadseffektiv och användarvänlig, och gör det möjligt att utföra en snabb, automatiserad och enkel SPE. För-koncentrerade lösningen är kompatibel med analys genom immunanalys, med en låg organisk halt lösningsmedel. Ett förfarande beskrivs för utvinning och pre-koncentration av naturligt hormon 17β-östradiol i 100 ml vattenprov. Omvänd fas SPE utförs med oktadecyl-kiseldioxid sorbenten och eluering sker med 200 pl metanol 50% volym / volym. Elueringsmedel utspädes genom tillsats av di-vatten för att sänka mängden metanol. Efter framställning manuellt SPE kolonn, är den totala proceduren utföras automatiskt inom en timme. Vid slutet av processen, är östradiol koncentrationen mäts genom användning av en kommersiell enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). 100-faldig för-koncentration uppnås och halten metanol i endast 10% volym / volym. Full återvinningar av molekylenuppnås med en ng / L spiked avjoniserat och syntetiska havs vattenprov.
Introduction
Provberedning är ett viktigt steg i en analysprocessen. I synnerhet avlägsnande av matriseffekter, minskning av störningar, och anrikning av analyt är nödvändiga för att få exakta resultat och nå låg detektionsgräns. Hormonstörande ämnen (EDC) är av särskilt intresse på grund av deras verkan på levande organismer även när närvarande vid mycket låga halter i miljön. Det naturliga hormonet 17β-estradiol finns på EU: s vattenföroreningar bevakningslistan och benägna att läggas till i förteckningen över prioriterade ämnen som regleras inom ramen för Europeiska ramdirektivet för vatten. Fast fas extraktion (SPE) är allmänt tillämpas för analys av små föroreningar i vatten, med både kemiska 1-5 (kromatografi, masspektrometri) och immunologiska 6-9 detektionsmetoder. Den senare fick intresset inom miljöövervakning, eftersom immun finns i stor variation av format, är specifika för target analyt, och nå låg detektionsgräns. 6, 7, 10, 11 Olika enzymlänkade immunosorbentanalyser (ELISA) är kommersiellt tillgängliga och möjliggöra att analysera flera prov samtidigt på en platta med flera brunnar. Förfarandet består i successiva reaktionssteg som kan ta några timmar. Den slutliga produkten av reaktionen kan detekteras optiskt för att bestämma koncentrationen av målmolekylen baserat på en kalibreringskurva.
Klassiska SPE förfaranden inkluderar sorbent pre-conditioning, prov extraktion, tvättning, eluering och koncentrering genom indunstning av elueringsmedlet. Det lösningsmedel som används för spädning av detta extrakt väljs beroende på detektionsmetoden. För immunologiska metoder, mängden av organiska lösningsmedel påverkar starkt känsligheten hos metoden. 12
Förutom återvinning och pre-koncentrations föreställningar, behöver metoden även att vara enkel och kostnadseffektiv. Automatisering av den procedure bidrar till att minska de mänskliga relaterade fel. I vårt tidigare arbete 13 introducerade vi vår prototyp för automatiserad SPE, och vår metod tillämpades på analysen av det naturliga hormonet 17β-östradiol i havsvattenprover. Med den nuvarande video vill vi lyfta fram de tekniska fördelarna med vår metod jämfört med traditionella off-line och on-line SPE och dess särskilda kompatibilitet med detektering av immunreaktioner. Vi beskriver protokollet tillämpas på vattenprover för detektering av 17β-östradiol. SPE sker med oktadecyl-kiseldioxid (C18) sorbent fas och eluering utförs med utspädd metanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Följande protokoll beskriver SPE utförs på 100 ml vattenprov med C18-sorbenten och eluering med 50% volym / volym metanol. Den anrikade provet späds för att nå 10% volym / volym metanol innan analys med en enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) -kit.
1. Förbereda Reagens
- Förbered vattenproverna
- Innan någon annan åtgärd, filtrera varje prov 100 ml vatten med 0,2 um porstorlek filter.
- Spike provet med önskad koncentration genom utspädning lämplig volym referenslösning i en volym av vatten. Exempelvis bereda 100 ml vattenprov med 100 ng / L av E2 genom att späda 3,3 | il E2-referenslösning vid en koncentration av 300 | ig / l. Späd denna lösning tio gånger för att få ett prov spetsat med 10 ng / L E2. Späd denna senare ytterligare tio gånger för att erhålla ett prov på 100 ml med 1 ng / L E2.
- Placera det filtrerade provet (omodifierad eller spetsade) i en glasflaska med GL45 tråden. Använd provet på samma dag. Ta en liten fraktion som skall analyseras med ELISA för att uppskatta initial koncentration.
- Bered 300 pl elueringsmedel genom utspädning metanol i avjoniserat (di) vatten till 50% volym / volym i en tät rör.
2. Beredning av SPE Column
- Förbered en 20 mg / ml suspension av oktadecyl-kiseldioxid sorbentpartiklar genom att lägga till första 1.600 il metanol och därefter 400 il di-vatten till 40 mg av omvänd fas sorbent. Tätt stänga locket och skaka med en virvel.
- Installera bottenmembranet i kolumn
- Välj en Nylon-membran med porstorlek 11 pm och placera den på ett dubbelt lager av anti-damm vävnad. Med en stans 3 mm i diameter, skärs två små delar i membranet.
- Ta en av de små membran med en platt-end filter pincett och placera den på en sida av kolonnen.
- Skruva fast flatbottnad kontakt med röret och dra åt. Membranet är now på plats och sorbenten kan tillsättas säkert. Rita en pil på kroppen av kolonnen pekar mot slutet där membranet placerades.
- Förbereda den packade sorbent kolumnen
- Säkra kolonnen på hållaren med pilen pekar mot botten. Kolonnen måste ställas in så lodrätt som möjligt.
- Fäst en tom 10 ml engångsspruta till änden av röret av kolonnen, genom att använda Luer-Lock-anslutningar.
- Förbered en mikro-pipett med en 20-200 pl spets, ställa in volymen till 100 pl. Denna pipettspetsen formatet är anpassat till storleken på sorbenten kolonnen som skall framställas. Förfarandet skulle vara svårare med större pipettspetsar såsom de som används med 1 ml pipetter.
- Skaka sorbenten suspensionen med en virvel, och snabbt pipettera 100 l i mitten på kolonnen. Medan du injicerar, aspirera varsamt alla pipetterade lösningen igenom membranet genom att använda sprutan med den andra handen. Vid denna stålder, måste lösningen ha fyllt sprutan vara fria från partiklar, och en partikelbädd kan slutligen observeras i kolonnen.
- Upprepa denna process ytterligare 2 gånger genom omröring av mäldsuspensionen mellan alla pipetteringssteg för att säkerställa homogen suspension av partiklarna i lösningen. Den resulterande kolumnen innehåller 6 mg sorbent.
- När 300 ul av suspensionen har laddats och torkades genom att aspirera med sprutan, håller sprutan på plats och placera den andra nylonmembran på toppen med hjälp av pincetten med den andra handen.
- Skruva ner den andra kontakten med slang och kassera sprutan. SPE-kolonn är klar för användning.
3. Förbereda systemet
- Dra åt SPE kolumnen på enheten med hjälp av Luer-Lock kontakter. Pilen måste vara pekar i samma riktning som den som visas på enheten.
- Anslut flaskan innehållande provet till anordningen genom att skruvaförutsatt GL45 säkerhets locket på den.
- Ladda 200 il eluent i "Eluent" reservoar.
- Belastning 800 il di-vatten i "Utspädning" reservoar.
- Placera en flaska vid avloppet för att samla upp behandlat vatten under extraktionssteget. Formatet är inte viktigt men volymen behöver vara tillräckligt stora med avseende på provvolymen.
- Placera en liten flaska på sensor uttag med den minsta volymkapacitet på 1,5 ml. En maximal volym av 1 ml blir för små som bubblor bildas i uttaget när du samlar anrikat elueringsmedel och spädningsbuffert.
- Kontrollera tryckregulatorn är i stängt läge genom att vrida den manuellt, omvänd medurs tills vidare rörelse är inte möjligt.
4. SPE med Prototype
- Slå på prototypen genom att trycka på knappen på baksidan.
- Framställning användargränssnittet och val av program
- Öppna användargränssnittet. Väljkommunikationsporten på den dator som enheten är ansluten i listan och klicka på knappen 'Nästa'.
- Ange värdena 580 för pset och 30 för dpset. Pumpen kommer att justera för att upprätthålla trycket i det trycksatta systemet och reservoarer vid 580 ± 30 mbar när man kör.
- Välj den automatiserade läge.
- I den automatiserade läge hörn, ladda programfilen i rutan "konfigurations sökvägen".
- Justering av tryckregulatorn
- Starta pumpen.
- Vrid manuellt tryckregulatorn tills det värde som avlästs för preg är sämre men nära till 320 mbar.
- Stoppa pumpen.
- Starta SPE förfarandet
- Tryck "start" i automatiska läget hörnet. Pumpen växlar på och utvinning, eluerings och utspädningssteg kommer automatiskt att följa varandra. Hela förfarandet för en 100 ml prov utförs i 50 minuter.
- Kontrollera värdet på preg. Det måste ligga i intervallet 320-350 mbar under extraktionssteget för att säkerställa ett optimalt flöde.
- Stäng den lilla flaskan och lagra vid 4-5 ° C i mörker tills analys. Genomföra analys i följande 30 timmar för att förhindra nedbrytning av analyten.
- Förfoga över det behandlade vattnet.
- Rengöring av systemet
Obs: Efter varje extraktionsprocedur systemet måste rengöras för att förhindra korskontaminering.- Bered en 10 ml lösning av metanol 70% v / v i en GL 45 glasflaska.
- Koppla SPE kolumnen och plugga slangen med kontakter.
- I den automatiserade läge väljer du "rensa" filen och starta den med samma inställningar tryck.
5. Upptäckt av östradiol koncentration med ELISA
- Förbered kalibrerings prover med halter som anges i protokollet som medföljer ELISA-kit som används. Förbered en calibration in med samma matris som provet, och en kalibrering set med metanol 10% v / v.
- Dispensera den nödvändiga mängden prov i brunnarna på plattan, enligt tillverkarens instruktioner. Använd kalibreringsprover, omodifierade och spetsade vattenprover som filtrerades och som inte bearbetats med SPE, och berikade prover metanol 10% v / v. Använd 3 brunnar per prov för att reducera felet i samband med analysen.
- Följ anvisningarna i protokollet som är försedd med satsen för tillsättning av reaktanter, inkubationstid, tvättning och ytterligare reaktion med enzymet.
- Läs den optiska signalen i varje brunn beroende på satsen Tillverkarens instruktioner för en plattläsare instrument och samla in data.
- Använda programvaran av plattläsaren instrumentet för att passa kalibreringskurvorna och bestämma E2-koncentrationen i det initiala provet med samma matris, och i de anrikade prover med metanol 10% volym / volym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbarhet sorbent förpackning utvärderades genom torkning och väga pipetterad sorbenten i glasflaskor och resultatet visas i figur 1. Reproducerbarhet av tiden för injektionen testades för 100 ml prov, som visas i Figur 2. Koncentration i grund- och pre- koncentrerad spikade prover bestämdes genom användning av ett kommersiellt ELISA-kit för 17β-östradiol och visas i figur 3.
Det föreslagna förfarandet innebär att användaren för framställning av sorbent fasen (Figur 1). De sorberande partiklarna hålls mellan två membran för mekanisk stabilitet och är tätt packade med det tryck som appliceras med sprutan medan pipettering av suspensionen i kolonnen. Den erhållna kolumnen innehåller en optimerad mängd av 6 mg av den valda sorbenten med endast 6% fel från detta värde. Detta steg fungerar ocksåsom sorbent luftkonditionering, eftersom suspension framställs i anslagna lösningsmedelsbetingelser.
Efter framställning och installation av SPE-kolonn på systemet, och laddar lösningarna i de lämpliga behållarna, är förfarandet för för-koncentrationen helt automatiserad och kräver totalt mindre än 1 h under en 100 ml prov (fig 2). Extraktion utförs i 40 ± 8 minuter. Endast två parametrar påverkas fortfarande av användaren, utarbetandet av den packade sorbenten och fastställandet av flödeshastigheten. Den första skulle lösas genom att tillämpa storskaliga metoder för kolumn tillverkning. Den andra är relaterad till manuell justering av tryckregulatorn, som bestämmer tryckvärdet användes för att driva de lösningar genom systemet. Denna felkälla skulle elimineras genom att implementera en elektronisk tryckregulator.
När det gäller prestanda, pre-koncentrationsfaktor som uppnås är 100. För det första, är 500-faldig för-koncentration görs genom att eluera extraktet från sorbenten med 50% volym / volym metanol. Så 5-gånger utspädning genomföres genom tillsats av di-vatten. Denna utspädning minskar lösningsmedelsinnehållet och bevarar immunkänslighet. När man tittar på de kalibreringskurvor i ELISA (figur 3A), är det tydligt att metanolen förhållandet i den anrikade provet inte påverkar känsligheten hos immunoanalysen. Ett representativt resultat av pre-koncentrationen visas i fig 3. Metoden tillämpades på di-vatten och artificiellt havsvatten prover spetsade med 1 ng / L av 17β-östradiol. Medan provkoncentrationerna ligger under detektionsgränsen, före koncentrationen metoden ger framgångsrikt dessa prover i intervallet av analysen (30 - 30.000 ng / L). Utbytena erhölls genom att jämföra den slutliga koncentrationen med teoretisk spiked koncentration. Återvinningarna på 128% ± 22% och 107% ±6% beräknades för di-vatten och artificiellt havsvatten respektive (Figur 3B).
Figur 1. Illustration och reproducerbarhet av metoden för sorbent packning. Det finns tre steg: fäster första nylonmembran med den första kontakten, injicera sorbenten fjädring, och stänga kolonnen genom att sätta det andra membranet och kontakten. Den resulterande kolumnen innehåller 6 mg sorbent med 6% standardavvikelse (n = 6 förberedda och vägda kolumner). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Steg-för-stegillustration av förfarandet med reproducerbarhet av tiden för provinjektion. Lösnings ingångar läggs i behållare eller flaska. De två utgångarna är det behandlade provet (avfall) och den anrikade provet, som är kompatibel för analys genom immunanalys med låg lösningsmedelshalt. Den totala proceduren är automatiserad och tar något mindre än 1 h (n = 31 med standardavvikelsen). Inverkan av användaren på flödeshastigheten är markerad med blå tecken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Resultat av pre-koncentrationen av E2 och analys med ELISA. (A) Kalibreringskurvor i ELISA och poäng som uppmäts för 1 ng / L spiked di-vatten (i) och artificiellt havsvatten (ii) Efter Enrichment. (B) återgång erhölls för en ng / L spiked di-vatten (i) och artificiellt havsvatten (ii) prov efter berikning (n = 4). Felstaplarna är standardavvikelser härrör från antalet replikat och de 3 brunnarna på ELISA-plattan som användes för att bestämma koncentrationen i varje prov. Denna siffra har modifierats (13). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny metod för framställning av vattenprover, följt av analys med användning av immunanalys föreslogs. Instrumentet gör det möjligt att utföra fastfasextraktion i ett automatiserat och användarvänligt sätt.
Filtreringen av provvattnet före injicering i systemet är kritisk. Alla partiklar finns kvar i den lösningen skulle eventuellt orsaka igensättning av fluidic nätverk och hindra SPE kolumnen. Ett annat viktigt steg är att förbereda SPE kolumnen. Mängden partiklar i kolonnen är avgörande för att uppnå bästa prestanda möjligt. Särskild försiktighet måste iakttas vid framställning av suspension av sorbentpartiklar, för att undvika agglomerering av partiklarna. Detta uppnås genom att tillsätta först lösningsmedelsfraktionen till den torra sorbenten och sedan di-vattenfraktionen. Sedan, under packningssteget, är det viktigt att blanda suspensionen väl medan aspire de 100 il med pipetten. Vid slutet av SPE proförfarandet, korrekt rengöring av systemet är kritisk. För det första hindrar det korskontaminering när man arbetar med olika prover, och för det andra den undviker risken för biologisk kontaminering av instrumentet när det inte används.
Som diskuterats i inledningen, är användningen av metoder immundetektions för analys av små förorenande molekyler i miljön växer. Dessa metoder når gränserna för detekteringar i de låga ng / L nivåer 7, 11 och har fördelen av att vara mycket specifika. Sådana metoder används i kombination med kemiska metoder, främst masspektrometri relaterade tekniker. 14, 15 senare inte begränsa användningen av organiska lösningsmedel och dra nytta av automatiserade SPE system som gör det möjligt att nå de höga pre-koncentrationsfaktorer krävs. I jämförelse, immun är mer känsliga för analysbuffertsammansättning och saknar anpassat provberedning tekniker för att underlätta processen. Vår modul är avsedd för analys av sköpcentret molekyler genom immunanalys.
Med vår automatiserade metod används ett 100-faldig anrikning av provet uppnås och tillstånd för att detektera analyten i koncentrationsområdet ELISA. Om dessa pre-koncentrations föreställningar verkar låga jämfört med traditionell SPE, de passar perfekt kraven för immundetektering. Dessutom har instrumentet ett litet fotavtryck (25 cm x 15 cm x 10 cm) och låg kostnad jämfört med typiska manuella eller automatiska SPE inställningar. 13 Om det behövs kan genomströmningen för provanalys multipel därför ökas med hjälp av ett par enheter parallellt. En annan möjlighet skulle vara att utforma ett förfarande för mindre volymer av prov och elueringsmedel, vilket skulle minska den tid som krävs för förfarandet. Några andra begränsningar diskuterades genom beskrivning av resultaten. Det finns fortfarande två steg där användaren är involverad, båda kopplade till graden av utvecklingen av denna prototyp och skulle lösas genom att göra ett steg vidare mot acommercial enhet. Packningen av sorbenten fasen sker manuellt. Metoden dock visat sig vara enkel och reproducerbar. Vi är övertygade om att engångskolonner skulle kunna produceras om systemet framställdes på en högre skala.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en ny metod för att utföra SPE på en kompakt, automatiserad anordning. Vi har visat dess potential för analys av vattenprover genom immun genom beskrivningen av en extraktion och för-koncentrationsmetod som tillämpas på detektering av 17β-östradiol genom ett kommersiellt ELISA-kit. Metoden är användarvänliga och kostnadseffektiva, och kan i framtiden användas i linje med biosensorer (arbete pågår). Vi förväntar oss att vår plattform gör det möjligt att utföra liknande fastfasextraktion förfaranden på mer komplexa provmatriser av hög relevans för övervakning av EDC, såsom mat eller urin. Vi är övertygade om vårt system kommer att stödja tillämpningen av etablerade och kommande metoder immundetektions iinom miljöanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
