Abstract
Outdoor aerosol onderzoek maakt gebruik van algemeen fijn stof bemonsterd filters. Deze procedure kan verschillende karakteristieken van de verzamelde deeltjes wordt parallel uitgevoerd. Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. De winning van hoogmoleculaire organische moleculen, zoals lipopolysacchariden, van bemonsterde filters omvat het schudden van het monster in een pyrogeen-vrij water gebaseerde medium. De volgende analyse is gebaseerd op een enzymatische reactie die kan worden gedetecteerd met een turbidimetrische meting. Door het hoge gehalte aan organische het bemonsterde filters, wordt de extractie van DNA uit de monsters uitgevoerd met een commerciële DNA extractie kit die oorspronkelijk is ontworpen voor bodems en aangepast aan de DNA opbrengst te verbeteren. De detectie en kwantificering van specifieke microbiële soort, volgens een kwantitatieve polymerasekettingreactie Reactibij analyse (Q-PCR) worden beschreven en vergeleken met andere beschikbare werkwijzen.
Introduction
Air bemonstering van filters is een fundamenteel instrument in atmosferische aërosolen onderzoek. 1 in de steekproef opgenomen filters zijn het uitgangspunt voor diverse chemische, fysische en biologische karakteriseringen van de verzamelde ambient deeltjes. 2-11 Het voordeel van deze aanpak is dat verschillende analyses kunnen worden uitgevoerd off-line op hetzelfde monster. Samenstellen van de gegevens uit de verschillende analyses maakt de onderzoeker een goed begrip van de kenmerken van de verzamelde deeltjes en hulpmiddelen te verkrijgen bij het oplossen van complexe vraagstukken in de atmosferische wetenschappen. 12,13 Bijvoorbeeld, zee- en binnenvaart air-monsters genomen tijdens dezelfde termijn kan worden vergeleken met betrekking tot de bemonsterde deeltjes toxiciteit en biologische samenstelling. 14 voor deze studie, lipopolysacchariden (LPS), onderdelen van gram-negatieve bacteriële celwanden, ook bekend als endotoxinen werden uit filters bemonsterd wal en een binnenzee site, en werden geëvalueerd met behulp van delimulus amoebocyt lysaat (LAL) -test. Daarnaast werd een genomische evaluatie van de bacteriële inhoud (totaal bacteriën, gramnegatieve en cyanobacteriën) werd uitgevoerd op hetzelfde monster met de kwantitatieve polymerasekettingreactie (Q-PCR). De LAL-test is gebaseerd op metingen van troebelheid gevormd na de toevoeging van een waterig extract van amebocytes van de degenkrab, Limulus polyphemus, aan een waterige oplossing die de endotoxinen. Hoe hoger de endotoxine concentratie in het monster, des te sneller vertroebeling ontwikkelt. 15 de Q-PCR-analyse is gebaseerd op een fluorescentiesignaal uitgezonden als een specifiek DNA-fragment wordt geamplificeerd. 16 Bij real time monitoring van het signaal gedurende de exponentiële fase van de PCR reactie en kalibreren met een standaard curve, kan de eerste DNA bedrag worden gekwantificeerd. De combinatie van deze twee analyses samen met anderen, zoals elders beschreven, kan 14 een goede schatting van de niveaus van endotoxine en het verschaffenhoeveelheid van de bron bacteriën in de monsters.
Het doel van de hier gepresenteerde methode is een zeer nauwkeurige en betrouwbare analyse van de endotoxine en DNA- gehalte van bio-aerosolen onttrokken filters te verkrijgen. Terwijl werkwijzen voor bemonstering van de fysische en anorganische chemische eigenschappen van aërosolen zijn welbekend en, meer recentelijk, werkwijzen ontwikkeld om de organische stof component onderzoeken, 17 er weinig onderzoek gedaan naar de biologische component van aërosolen. 18 De reden voor de huidige methode is om deze kloof te pakken door die een gedetailleerd overzicht van een robuuste methode voor het extraheren, analyseren, en het identificeren van de biologische fractie van de lucht aerosolen. 14
De methode die hier beschreven wordt verwacht dat wijdverspreide gebruik vinden in biologische indoor en outdoor aerosol onderzoeksprojecten waarbij filter analyse. 20-24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Een gedetailleerde lijst van alle gebruikte materialen en instrumenten die worden gebruikt in dit protocol wordt getoond in de sectie Materials.
1. Air Sampling op Filters
- Bereiding van filters
- Voor hoge volume sampling, gebruik maken van 20,3 x 25,4 cm 2 filters. Kies het specifieke type filter die aansluit bij onderzoeksbehoeften, en de afsnij- size, indien van toepassing. 1 hier gebruik kwarts microfiber filters.
- Pre-bak filters die bestemd zijn voor organische en biologische verbinding bemonstering organische resten te vernietigen. Pre-bake de filters, wikkel ze afzonderlijk in aluminiumfolie en bak ze in een laboratorium-oven bij 450 ° C gedurende ten minste 5 uur.
- Bewaar de gebakken filters bij -20 ° C tot bemonstering.
- Instrument Handling en Air Sampling
- Clean resterende stof van het hoofd van het hoge volume sampler. Veeg de onderdelen met een schone papieren doekjes en laat ze aan de lucht drogen before ze dan weer aan de sampler.
- Ontsmet de filter cassette met ethanol, en werken met handschoenen en een laboratoriumjas te allen tijde.
- Plaats een pre-gebakken filter in het schone filter cassette, en ga verder volgens de hoge volume sampler handleiding.
- Markeer de datum en alle ongewone weersomstandigheden, indien van toepassing (bv regen, stof storm) op de aluminium wrap, en opslaan in een schone plek tot aan de voltooiing van de bemonstering.
- Verzamel de bemonsterde filter en vouw het in de helft, met de bemonsterde kant naar binnen.
- Wikkel het filter in de originele aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C tot analyse.
Let op: Als het tijdsverloop tussen bemonstering en analyse is langer dan 2 maanden, bewaar het monster bij -80 ° C om afbraak van de organische en biologische materiaal te voorkomen.
2. endotoxine Analyse
Let op: Ontsmet het werkoppervlak met 70% ethanol eend werken met pyrogeenvrij buizen, tips en reagentia alleen. Als glaswerk worden gebruikt, is voorverwarmen bij 250 ° C gedurende 30 minuten of 200 ° C gedurende 60 minuten noodzakelijk. 25 Prepare alle reagentia in een klasse II bioveiligheid kast en met handschoenen en een laboratoriumjas allen tijde.
- reagens Voorbereiding
- Volg het protocol van de LAL kit fabrikant om het lysaat kort hydrateren voor gebruik. 26 Tik zachtjes op het flesje te verjagen LAL nog op de fles muren. Til de stopper voorzichtig om het vacuüm te breken. Met behulp van een injectiespuit genaaid, voeg 5 ml pyrogeenvrij water (PFW) aan het flesje alle lysaat inhoud hydrateren en meng zachtjes om schuimvorming te voorkomen.
- Sluit de flacon met plastic paraffine film wanneer niet in gebruik en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal twee dagen. Bewaar overblijvende lysaat bij -20 ° C gedurende maximaal drie maanden.
Opmerking: Dit reagens kan slechts eenmaal worden bevroren. - Hydrateren de controle standaard endotoxine (CSE), waarvan 0,5 μ bevat; g E. coli, in overeenstemming met het protocol van de fabrikant. 27 Bepaal de specifieke hoeveelheid water aan de CSE flacon moet worden toegevoegd op de website van de fabrikant van de 28 door het invoeren van het lotnummer voor de set, waar vermeld op de website. De eindconcentratie van E. coli in de flacon, wordt gemeten in endotoxine-eenheden (EU, waarbij 10 EU = 1 ng). Label dit flesje ed0.
- Sluit de CSE flacon met plastic paraffine film wanneer niet in gebruik en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken.
- Standard Curve en Spiked-filter Voorbereiding
- In een klasse II bioveiligheid kast bereiden 22 pyrogeenvrij 2 ml centrifugebuizen met afnemende hoeveelheden CSE (buizen Ed1-Ed11) of geen CSE (de lege buis met alleen PFW) een gedupliceerde endotoxine verdunningsreeks produceren, zoals getoond in Tabel 1.
- In een biologisch kast met kringloop, gesneden 22 cirkelstukken van schone, voorgebakken filter met een gedesinfecteerd 1,1 2 cm diameter kurkboor.
- Plaats het filter paren in steriele petrischaaltjes.
- Spike 50 ul van elk lid van endotoxine verdunningsreeks Ed2-Ed11 en naar de lege buis op een overeenkomstige paar filters.
- Laat de platen met het verrijkte filters geopend onder de motorkap om te drogen gedurende 30 min.
- Plaats elk filter stuk in een pyrogeenvrij 2 ml buis.
| Buis | Final endotoxine concentratie (EU ml -1) | Standard volume endotoxine (ml) | Pyrogeenvrij water volume (ml) | totale volume (ml) | ed0 | 2500 | stock oplossing * | 5 |
| ED1 | 1000 | 80 (van ed0) | 120 | 200 |
| Ed2 | 100 | 20 (van Ed1) | 180 | 200 |
| ED3 | 50 | 10 (van Ed1) | 190 | 200 |
| eD4 | 25 | 5 (van Ed1) | 195 | 200 |
| ED5 | 12.5 | 2.5 (van Ed1) | 197.5 | 200 |
| ED6 | 6.25 | 1.25 (uit Ed1) | 198,75 | 200 |
| ED7 | 3.125 | 6.25 (uit Ed2) | 193,75 | 200 |
| ED8 | 1,563 | 6,25 (van ED3) | 193,75 | 200 |
| ED9 | 0,781 | 6.25 (uit eD4) | 193,75 | 200 |
| ED10 | 0,391 | 6,25 (van ED5) | 193,75 | 200 |
| Ed11 | 0,195 | 6,25 (van ED6) | 193,75 | 200 |
| Blanco | 0 | 0 | 200 | 200 |
Tabel 1:. Endotoxine standaardcurve endotoxineconcentratie, hoeveelheid gesteld endotoxine en pyrogeenvrij water toegevoegd, en het totale volume verkregen worden voor elke verdunning buis in de ijkcurve.
- Endotoxine Extraction van de Experimentele en Spiked Filters
- In een biologisch kast met kringloop, stuurde de bemonsteringsfilters (uit stap 1.2) in ronde stukken met een gedesinfecteerd 1,12 cm diameter kurkboor en plaats ze samen met de puntige standaard filters (van stap 2,2), in pyrogeenvrij 2 ml buizen (dat wil zeggen, het monster tubes).
- Voeg 1 ml PFW aan de buizen en schud ze gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met een klinisch shaker.
- Centrifugeer de monsterbuizen in een microcentrifuge bij 375 xg gedurende 10 min. 29
- Transfer the supernatant, die de endotoxinen bevat, in een nieuwe pyrogeenvrije 2 ml buis.
- Limulus Amebocyte Lysaat (LAL) test
- Bepaal de concentratie endotoxine in de monsters door het uitvoeren van de LAL-test in een pyrogeen-vrij 96-well microplaat met een vlakke bodem en een deksel.
- Plan de plaat matrix vooraf, zoals getoond in figuur 1. Voeg een standaardcurve direct bereid uit endotoxine standaardoplossingen Ed2-Ed11 (en immers het concentratiebereik van 100-0,195 EU / ml (zie paragraaf 2.2)) zich in hardloopplaat . De standaard curve moet putten 1-10 rijen A en B van de plaat te bezetten. Zet opzij putten 11-12 in deze rijen voor de blanco monsters (het maken van een totaal van vier blanks).
- Schakel microplate lezer en programmeren van een kinetische reactie waarbij incubatie van de microplaat bij 37 ° C en schudden elke 5 min, gevolgd door absorptiemetingen bij 405 nm. Herhaal 18 keer gedurende 1,5 uur.
- Bepaal de efficiency waarmee de endotoxinen worden uit de bemonsteringsfilters (bijv., verkregen uit het verrijkte standaard filters monsters) via splitsing van de berekende endotoxine bedrag door de oorspronkelijke hoeveelheid ingespoten.
- Start de test door het plaatsen van 50 ui van de standaard endotoxine-oplossingen (uit stap 2.4.2), of van de spiked filter extract en zijn blanks (van paragraaf 2.3), of van de experimentele monsters en blanco's (ook uit paragraaf 2.3), volgens de geplande plaat-array (figuur 1) en sluit het deksel.
- Aan elk putje, snel toe te voegen 50 pl LAL-oplossing, en schud de plaat horizontaal, terwijl het wordt geplaatst op de tafel voor het opheffen van hem in de lezer.
- Plaats de plaat in de plaat lezer en start de experimentele run.
Figuur 1:. Endotoxine-array plaat Een exruim van een endotoxine analyse array in een 96-well microplaat.
3. Genomic Analysis
Opmerking: Voor DNA-extractie, ontsmet het werkblad met 70% ethanol en werken met steriele buizen, tips en reagentia alleen. Voor Q-PCR-analyse van DNA, ontsmet het werkblad met oppervlak DNA-ontsmettingsmiddel. Bereid alle reagentia in een klasse II bioveiligheid kast en werken met handschoenen en een laboratoriumjas te allen tijde.
- Bereiding van het DNA Primers en Probes
- Voorafgaand aan DNA extractie, hetzij teneinde een in de handel verkrijgbare set van primers en een probe (als de methode hydrolyse probe wordt toegepast), of het ontwerpen van een nieuwe set primers en een probe middels primer ontwerpen rekentechnieken. 30
- Hydrateren de primers volgens het protocol van de fabrikant met behulp van 10 mM Tris-0,1 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (TE-buffer) of PCR-grade water.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om de eerste PCR-primer st ontbindenock in TE-buffer met lage EDTA (0,1%) als het voorkomt primer afbraak bij bewaring gedurende een langere tijdsduur. Gebruik PCR-grade water voor daaropvolgende verdunningen te EDTA bedragen die PCR-reacties kunnen remmen te verminderen. - Aliquots van 50 pl en 100 pl van de primer en probe in steriele 0,5 ml buizen en bewaar bij -20 ° C tot analyse.
- Standard Cell Concentratie Evaluation Voorafgaand aan DNA Extraction
- In een geschikte grootte centrifugebuis, bereiden een standaard mobiele oplossing van de microbiële species van belang (buis Od0, tabel 2A). Meng de celsuspensie door pipetteren op en neer in de buis 7-10 keer met behulp van een pipet met een kleine boring.
- Als de cellen worden gekleurd (bijvoorbeeld bepaalde schimmelsporen), hebben een kleuring procedure niet uit. Als cel kleuring vereist, verdunnen de celsuspensie in een geschikte kleurstof voor microscopische detectie van de cellen van belang. 31
- Reinig het deksel slip en hemocytometer met ethanol. Bevochtig en bevestig het deksel slip op de hemocytometer.
- Laad ongeveer 8 ul van de celsuspensie in zowel hemocytometer compartimenten door voorzichtig aanraken van de rand van het dekglas met de punt van de pipet en het vullen van de kamer door capillaire werking. Niet over / onder de kamer te vullen.
- Bepaal het aantal cellen door ze te bekijken onder een microscoop bij 400x vergroting (40X objectief en 10x bij oculaire). Negen vierkanten van 1 x 1 mm en 2 aangebracht in een 3 x 3 raster moet worden gezien. Focus de microscoop op een van de vier hoeken vierkanten van het rooster (een hogere vergroting kan worden gebruikt). De 1 x 1 mm 2 vierkante moeten 16 kleinere vierkanten bevatten.
- Tel alle cellen in de vier 1 x 1 mm 2 hoekvelden, en in het middelste vierkant van 3 x 3 raster. Als er te veel of te weinig cellen te tellen, herhaalt u de procedure, hetzij concentreren of verdunnen van de oorspronkelijke celsuspensie zo nodig (15-50 cellen moeten bedekken een uitkiezen 1 mm 2-gebied).
- Bereken de concentratie van de cellen (cellen ml-1) in de standaard celsuspensie Od0 het aantal cellen gemiddeld over de vijf velden geteld als volgt: Celgetal ml -1 = Gemiddelde cellen vierkante -1 Verdunningsfactor 10 4.
- Evaluatie van DNA Extraction Efficiency
- Bereid negen steriele 0,5 ml buizen volgens tabel 2A.
- Verdun de standaard celoplossing (Od0) tot ongeveer 10 7 cellen ml-1 in een totaal volume van 20 pl (OD1) bevatten.
- Voeg 18 ul van steriele nuclease-vrij PCR-grade water (NFW) naar buizen Od2-Od8 en 20 ul naar de lege buis, Od9.
- Overdracht 2 pi van de celoplossing van OD1 in Od2. Pipet voorzichtig te mengen en de overdracht 2 pl van tube Od2 naar OD3. Verder verdunnen van de cellen op dezelfde wijze langs de buizen tot en met koker Od8 te obtain een seriële verdunning van 10 -10 0 7 cellen ml-1.
- In een biologisch kast met kringloop, gesneden 18 cirkelstukken van schone, voorgebakken filter met een gedesinfecteerde 1,12 cm diameter kurkboor. Plaats de filters paarsgewijs in steriele petrischalen.
- Spike 10 gl van verdunningen OD1 tot Od8 en de lege buis Od9 op elk van de gepaarde filters, zodat er een filterpaar overeenkomt met elke standaard celconcentratie.
- Laat de petrischaaltjes geopend onder de motorkap en laat ze drogen gedurende 30 min.
- Plaats elk filter stuk in een steriele schroef-top 2 ml buis en pak het DNA volgens de procedure van punt 3.4.
- DNA-extractie van de Experimentele en Spiked Filters
Opmerking: Voor DNA-extractie van filters, gebruiken commerciële kits zijn ontworpen voor DNA extractie van grond volgens het protocol van de fabrikant met de volgende modificaties.- Voor elke filter monster (OD1-Od8), voor te bereiden een mengsel van zuur gewassen glasparels in een 0,5 ml steriele buis. Gebruik 0,1 g korrels met een diameter van 425-600 urn en 0,3 g korrels met een diameter van ≤106 um.
- In een kast met biologische kringloop, snijd drie ronde stukken uit willekeurig geselecteerde locaties op elk filter monster met behulp van een gedesinfecteerde 1,12 cm diameter kurkboor, en plaats ze in schroef-top 2 ml buizen.
- Voeg de glaskraal mengsel aan de buizen.
- Voeg de cel-lysis buffer met de extractie kit aan elke buis in de biologische kast met de in protocol van de fabrikant bedrag.
- Bereid een emmer ijs en verstoren de cellen mechanisch met behulp van een kraal beater.
- Klop de kralen voor 1 min en vervolgens leg ze op ijs gedurende 1 minuut. Herhaal vijf keer.
- Ga verder met het protocol van de kit leverancier uit de post-lysis stap.
- Na elutie met bijgeleverde elutiebuffer (10 mM Tris bevat bUffer) of NFW, herlaad het geëlueerde monster door de kolom opnieuw om DNA opbrengst te verbeteren.
Opmerking: Als niet geanalyseerd op dezelfde dag als de DNA-extractie, kunnen monsters worden bewaard bij -20 ° C tot analyse.
| A- Bereiding van Standard Cell Verwatering Series | ||||
| Buis | Uiteindelijke celconcentratie (cel -1 ml) | standaardcel volume (ml) | Nuclease gratis water volume (ml) | Totaal volume (ml) |
| Od0 | bepalen met Hemocytometer telkamer | |||
| OD1 | worden geëlueerd om het bereik van 10 7 cellen ml -1 | 20 | ||
| OD2 | 10 -1 OD1 | 2 van OD1 | 18 | 20 |
| OD3 | 10 -2 OD1 | 2 van Od2 | 18 | 20 |
| Od4 | 10 -3 OD1 | 2 van OD3 | 18 | 20 |
| Od5 | 10 -4 OD1 | 2 van Od4 | 18 | 20 |
| Od6 | 10 -5 OD1 | 2 van Od5 | 18 | 20 |
| Od7 | 10 -6 OD1 | 2 van Od6 | 18 | 20 |
| Od8 | 10 -7 OD1 | 2 van Od7 | 18 | 20 |
| Blanco | 0 | 0 | 20 | 20 |
| B- Bereiding van DNA standaardcurve | ||||
| Buis | Uiteindelijke DNA-concentratie (mg ml -1) | Standaard DNA volume (ml) | Nuclease gratis water volume (ml) | Totaal volume (ml) |
| bepalen met NanoDrop | ||||
| DD1 | worden geëlueerd om het bereik van 10 1 mg ml -1 | 20 | ||
| DD2 | 10 -1 DD1 | 2 van DD1 | 18 | 20 |
| DD3 | 10 -2 DD1 | 2 van DD2 | 18 | 20 |
| DD4 | 10 -3 DD1 | 2 van DD3 | 18 | 20 |
| DD5 | 10 -4 DD1 | 2 van DD4 | 18 | 20 |
| DD6 | 10 -5 DD1 | 2 van DD5 | 18 | 20 |
| DD7 | 10 -6 DD1 | 2 van DD6 | 18 | 20 |
| DD8 | 10 -7 DD1 | 2 van DD7 | 18 | 20 |
| Blanco | 0 | 0 | 20 | 20 |
Tabel 2:. DNA Standaard Curve Standaard microorganisme cellen verdunningsreeks (A) gedetailleerd voor de standaard cel volume, NFW volume en het totale volume in elke verdunning buis. DNA standaard curve preparaat (B), gedetailleerd voor de standaard DNA volume, NFW volume, en het totale volume in elke verdunning buis.
- DNA Standard Curve Voorbereiding
- Gebruik een spectrofotometer om de DNA-concentratie van de standaard DNA monster (Dd0) te bepalen bij 260 nm.
- Bereid negen steriele 0,5 ml buisjes om een DNA-standaardcurve bereid, zoals weergegeven in tabel 2B.
- Indien nodig verdunnen standaard DNA-oplossing Dd0 binnen een concentratiebereik van 1-10 ug ml-1 in de eerste buis (DD 1) in een totaal volume van 20 pl.
- Voeg 18 ul van NFW buizen DD2-DD8 en 20 ul naar de lege buis.
- Overdracht 2 pi van de standaard DNA-oplossing van DD1 in DD2. Pipet voorzichtig te mengen en vervolgens over 2 pl van DD2 naar DD3. Verder verdunnen van het DNA op dezelfde wijze langs de buizen een seriële verdunning van 10 0 -10 -7 in tubes DD2-DD8 samen met een lege buis containi bereikenng alleen NFW.
Opmerking: Als niet geanalyseerd op dezelfde dag van extractie, monsters opslag bij -20 ° C tot analyse.
- Schakel de Q-PCR-instrument van te voren op te warmen.
- In een nieuw programma-bestand, plaatst u de details voor de Q-PCR uitgevoerd in de-instrument besturingssoftware zoals beschreven in tabel 3.
Opmerking: De verschillende instrumenten hebben verschillende optimale timing voor elke thermische cyclus stap. Deze ingang is beschreven in de handleiding van het instrument. - Ontsmet het werkoppervlak met oppervlak DNA-ontsmettingsmiddel en werken alleen met steriele buizen, tips, en reagentia.
- Bereid een emmer ijs naast de werkbank. Store Taq-polymerase mix op ijs.
- Bereken het aantal reactieholten dat de plaat wordt ingenomen. Voeg theoretische rekening met extra reacties (5%) en vermenigvuldig het vergrote aantal reacties van het volume per reactie op het totale keuze reactietijd berekenenn volume.
- Bereid de reactie gemengd zwembad, vanaf NFW, primers, probe, en ten slotte het Taq-polymerase mix. Zie bijvoorbeeld het volume berekeningen voor de gemengde pool in Tabel 4.
- Bewaar het reactiemengsel in het donker op ijs tot gebruik.
- Plaats 1 pl standaard DNA, DNA monster of NF W (als negatieve controle) in de putten in de Q-PCR microtiterplaat in drievoud.
- Zorg ervoor dat de plaat is in een plaat houder om te voorkomen dat het aanraken van het werkoppervlak en het schoon te houden.
- Voeg 9 ul van de gemengde pool (tabel 4) in elke reactieholte.
- Bedek de plaat met optische zelfklevende folie en sluit deze goed van alle kanten.
- Spin down de plaat in een centrifuge met plaat bakken gedurende 1 minuut bij 1000 xg voordat u hem in de Q-PCR-apparaat.
- Plaats de plaat in het instrument en activeer het lopende programma.
| Parameter | Details | Comments |
| detectiemethode | Kwantitatieve hydrolyseprobe | |
| Thermische fietsen voorwaarden | ||
| Initiële denaturatie en enzymactivering | 95 ° C gedurende 10 min | |
| Denaturation | 95 ° C gedurende 15 sec | herhaal 45 keer |
| Gloeien en extensie | 60 ° C gedurende 60 sec | |
| Plate-array | ||
| standaardkromme | DD1 - DD8 | 3 herhalingen per verdunning in 1-8 putjes op de top 3 rijen |
| Non-template control (NTC) | Nuclease gratis water (NFW) | 3 herhalingen in de 9 e en aan de top3 rijen. |
| geanalyseerde monsters | DNA geëxtraheerd uit filters | 3 herhalingen per monster bij de overige wells. |
| primer set | per elk putje | |
| monstervolume | 10 ml |
Tabel 3:. Details voor Q-PCR besturingssoftware Details van de analyse parameters in het programma bestand Q-PCR worden ingevoerd.
| Reagens | Volume per reactie (ml) | Aantal reacties | Toelage voor fouten(5%) | Het totale volume mix (ml) |
| Taq-polymerase mix | 5 | 50 | 52.5 | 262.5 |
| F primer (10 mm) | 0.5 | 50 | 52.5 | 26.25 |
| R primer (10 mM) | 0.5 | 50 | 52.5 | 26.25 |
| Nuclease gratis water | 3 | 50 | 52.5 | 157.5 |
| DNA - 1 ml zal rechtstreeks in het doel putten in de 96 plaat worden toegevoegd. | ||||
Tabel 4:. kwantitatieve PCR-Reaction Mix Berekening Volume per reactie, het aantal reacties, toelage voor fouten, en de berekende totale volume in het reactiemengsel per reagens toegevoegd worden gedetailleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het is gebruikelijk om atmosferische aërosolen studie met "off-line" analyses van bemonsterde filters (zie figuur 2). 32 Chemische analyses van de bemonsterde stof omvatten organische (bijvoorbeeld eiwitten, koolwaterstofmoleculen, sacchariden) en anorganische (bijvoorbeeld metalen, zouten) -gehalte . Biologische analyses omvatten levensvatbare en niet-levensvatbare micro-organismen inhoud, soort-identificatie door een DNA aanpak of microscopie, alsook DNA-kwantificering.
Figuur 2: Filer monsteranalyse stroomdiagram Filtreer na luchtmonsters (A) bereiding van het filter voor downstream analyses (B), en analyse van het monster bestanddelen (C)..
e = "1"> Voor het endotoxine extractie, worden filter deelmonsters (1,12 cm 2) geschud in 1 ml PFW gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. De monsters worden daarna gedurende 10 minuten bij 375 x g. Centrifugeren verschillende snelheden kunnen leiden tot verschillende extractie efficiëntie, zoals in figuur 3A.
Een eerste test voor de extractie-efficiëntie moet worden uitgevoerd voor de gekozen specifieke filter en protocol uitgevoerd. In figuur 3B, worden hogere extractie rendementen verkregen van stekelige schoon in vergelijking met gesamplede kwarts filters, en beide rendementen lager zijn dan die bereikt door directe detectie van de standaardoplossing. Zoals elders, kan de aard van de bemonsterde fijn stof op het filter beïnvloeden ook de endotoxine extractie-efficiëntie. 14,33
g3.jpg "/>
Figuur 3: Endotoxine extractierendement Het effect van centrifugeersnelheid (A) en filterbelasting (B) op endotoxine extractierendement.. Fout balken geven de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De reactie voor de detectie van endotoxinen betreft een 1: 1 verhouding van LAL reagens om de endotoxine standaard, het monster geëxtraheerd endotoxinen of de plano's. Het wordt aanbevolen om drie exemplaren te gebruiken voor het monster analyse. Voor standaard curves, duplicaten voldoende. Wanneer de absorptie waarden (bij 405 nm) zijn voltooid, wordt de resulterende optische dichtheid (OD), na exporteren naar een data-analyse spreadsheet voor verdere analyse van de gegevens.
Zoals in het endotoxine extractie, is het belangrijk om een voorlopige analyse van het DNA-extractie-efficiëntie uit onder specifieke experimentele omstandigheden. Dit gebeurt door spiking een bekende hoeveelheid van een standaard organisme celoplossing op een stuk gesneden uit het filter na de DNA-extractie hierboven beschreven protocol. De concentratie van de beoogde micro-organisme uit het bemonsterde aerosols wordt bepaald met Q-PCR. Hier de hydrolyse probe techniek gebruikt, die het voordeel van hoge specificiteit heeft, vanwege de extra probe gebonden aan het matrijs-DNA. 35 De SYBR groen werkwijze kan ook worden toegepast voor dit doel. Kalibratiecurven zijn afgeleid van DNA geëxtraheerd uit de gekozen belangwekkende organismen via de extractiewerkwijze beschreven. Een gemengde pool van de reactie verbindingen, met uitzondering van het DNA-monster, standaard of controle, wordt bereid en bewaard in het donker op ijs totdat ze nodig. Vervolgens wordt een hoeveelheid van de gemengde pool toegevoegd aan elk putje in een 96 microwell optische plaat. Het DNA standaard, monster of controle wordt toegevoegd nadat het reactiemengsel volgens de plaat array. Nadat alle reagentia zijn in de plaat is geplaatst, is het op zeegeleid met een optische kleeffolie en gecentrifugeerd om alle druppeltjes verzamelen op de bodem van de putjes. De plaat is dan in de Q-PCR instrument voor thermische cyclus amplificatie en signaaldetectie ingevoegd. De uitgangsdata uit PCR Ct waarden worden gedefinieerd als het aantal cycli waarbij het geamplificeerde DNA bedrag het drempelniveau bereikt. Behulp van de ijkgrafiek waarden, kan de concentratie van doelwit DNA worden verkregen (zie figuur 4). 36 Het micro-organisme cel concentraties kunnen worden berekend uit de Ct-waarden van de extractie-efficiëntie vergeleken met een hemocytometer telling van de standaard oplossing organisme. 37 
Figuur 4: Kwantitatieve PCR-amplificatiecurve (A) en CALIBRAT.ion curve variërend van 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) uitgevoerd voor representatieve Gram-negatieve bacteriën DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft de extractie en detectiemethoden voor het kwantificeren van zowel endotoxinen en DNA aanwezig in spuitbussen monsters verzameld op filters. De methoden vereisen nauwkeurige routines en kan gemakkelijk worden uitgevoerd zolang de experimentator hecht aan een paar essentiële en belangrijke punten besproken.
Voor het endotoxine detectiestap op dat de lysaatoplossing vrij viskeus is en neigt om belletjes op pipetteren. Het is moeilijk te verwijderen u bellen, en ze een wijziging in de microplaat-lezer waarden. Daarom is het belangrijk om de eerste plaats het monster in de plaat en pas na die op de bellen verdwijnen verder met de toevoeging van het lysaat oplossing. Een nuttige techniek om belvorming in deze stap te voorkomen is om langzaam met de pipet en niet te druk helemaal bij het aftappen het lysaat aan de putjes. Als reactie te starten wanneer de lysaat wordt toegevoegd aan de endotoxin extract, is het noodzakelijk om de meting zo snel mogelijk te starten. Om het lysaat additiestap verkorten, kan een multichannel pipet gebruikt. Merk op dat in sommige kits en protocollen is er een extra pre-incubatiestap van de monsters bij 37 ° C gedurende 10 minuten, nadat het is geplaatst in de micro titter plaat. 29 Pas na deze stap, kan het lysaat worden toegevoegd.
Belangrijk voor milieumonster extractie van endotoxinen is de aanwezigheid van remmers in de monsters (bijvoorbeeld bij hoge verontreiniging luchtmonster). In dit geval, verdunning wordt kritiek en vals verbetering, typisch waargenomen voor niet-verdunde monster te voorkomen. 38
Ook zijn er een aantal punten van belang voor het succes en betrouwbaarheid van de Q-PCR detectie waarborgen. 1) Omdat de omvang van de oplossingen is zeer klein, als ze niet op de bodem van de put worden geplaatst, het watergehalte in het DNA druppel kan worden ingedampt while aanbrengen van de monsters op de plaat. Om dit probleem te voorkomen, plaatst u de DNA-monster op de bodem van de put, koelen van de plaat door het op ijs of een andere koeling platform, en voor te bereiden alles van tevoren om deze stap zo veel mogelijk te versnellen. 2) Bij de voorbereiding van de Q-PCR-mix (Tabel 4), omvatten de buis met aluminiumfolie om fotodegradatie voorkomen. 3) De onderhavige experiment beschrijft de bereiding van een 10 pi reactie. Niettemin in sommige Q-PCR instrumenten, het reactievolume 20 gl en het volume van elk reagens dienovereenkomstig verveelvoudigd. 4) De optimale temperatuurcyclus omstandigheden kunnen veranderen voor verschillende primers en polymerase mixen. 39 Zo moet de annealing temperatuur worden ingesteld op ongeveer de smelttemperatuur van de primers en wordt empirisch bepaald als de temperatuur waarbij amplificatie meest efficiënt optreedt. Daarom is het ook belangrijk om een kalibratiecurve voor elk geanalyseerd Q-PCRplaat, zodat de kwantificering juist. Kalibratiecurven en standaard spiked filters dienen ook als een positieve controle, zodat geen remming optreedt. Om inhibitie te voorkomen, is het raadzaam om de extractie kits ontworpen om remmers van milieu monsters te verwijderen gebruiken. 5) Het aantal thermische cycli in dit experiment is ingesteld op het maximum, 45, om de gevoeligheid te verhogen als de DNA concentraties door de filter extracten waren zeer laag. 6) Zorg ervoor dat de Cycles om Threshold (Cτ) waarden voor alle DNA-monsters zijn binnen het dynamische bereik van de ijkkromme. Ook voor zorgen dat amplificatie van een negatief controlemonster ten minste acht cycli groter is dan die van de DNA-monsters. 7) Als het werken met de SYBR Green reagens, zorg ervoor dat er geen meerdere smelttemperatuur pieken per reactie.
Voor turbidimetrische test, twee endotoxine kwantificering methoden beschikbaar: de kinetische methode en de Eindpunt chromogene methode. In de kinetische aanpak, zoals uitgevoerd in dit protocol, de tijd die nodig is om het monster te bereiken maximale absorptie wordt gemeten. Hier wordt een kortere reactietijd interval geeft een hogere concentratie endotoxine in het monster. In het eindpunt chromogene methode wordt de absorptie van licht gemeten na een gedefinieerde incubatietijd van de endotoxine concentratie vast te stellen. Beide methoden vereisen een standaard calibratie curve voor kwantificering. 40
Hoewel de precisie en nauwkeurigheid van de endotoxine extractie hierboven beschreven is zeer hoog, kan 14 de extractie-efficiëntie worden verbeterd. Het is mogelijk dat een ander type filter of toevoeging van een detergens (bijvoorbeeld polysorbaat 20) aan de extractieprocedure de opbrengst van endotoxine uit het filter kunnen verbeteren. Endotoxine extractie-efficiëntie kan ook worden beïnvloed door verschillende deeltjes bemonsterd parallel aan het filter. 33 Voor onze experimentele opstelling, dedetectiegrens methode wordt geschat op 0,001 EU m -3 zijn. 14
Technieken voor het kwantificeren van het DNA-extract dat als alternatief voor Q-PCR kan dienen omvatten klonering en digitale druppeltje PCR (DD-PCR). De voordelen van Q-PCR via klonering voor soorten identificatie zijn de grotere gevoeligheid en dat vereist een lagere DNA-concentratie voor de eerste amplificatiestap. In tegenstelling tot Q-PCR, de kloneringswerkwijze die is arbeidsintensief en tijdrovend, niet kwantitatief. Een alternatieve methode voor de kwantificering van het DNA extract DD-PCR. 19 Het voordeel van deze techniek is dat het niet een ijkkromme vereist, aangezien de detectie is gebaseerd op één enkel DNA spanning in elke druppel. Voor milieumonsters, geen betrouwbare methode bestaat nu toe voor druppel-detectie van DNA geëxtraheerd uit filters.
De efficiëntie waarmee DNA wordt geëxtraheerd frOM het filter, en de nauwkeurigheid en precisie van de DNA metingen kunnen worden beïnvloed door factoren als filtertype doelwit microorganismen en instrumentatie. 34,41 Daarom moet worden bepaald voor de monsteranalyse. In onze experimentele opstelling, kan de detectielimiet bereiken neer tot 3,5 genoom m -3. 14
Tot slot, de hier beschreven methode is toepasbaar voor de identificatie en kwantificatie van de lucht bemonsterd biologische soorten uit zowel de antropogene en natuurlijke bronnen. Precieze gebruik van de geschikte test maakt het mogelijk waardevolle onderzoeken van complexe milieuvraagstukken te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 - High Volume Air Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series - Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 µm | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 µm | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
- Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
- Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
