Abstract
Açık aerosol araştırmaları yaygın filtreler örneklenmiş partiküler madde kullanır. Bu prosedür, toplanan partiküllerin değişik karakterizasyonları paralel yapılmasını sağlar. Burada sunulan yöntemin amacı, filtreler çıkarılır, biyo-aerosolleri endotoksin ve DNA içeriği son derece doğru ve güvenilir bir analiz sağlamaktır. örnek filtrelerden Lipopolisakkaridler gibi yüksek moleküler ağırlıklı organik moleküllerin, ekstraksiyonu pirojensiz su bazlı ortam içinde örnek çalkalama içerir. Daha sonra yapılan analiz bir türbidimetrik ölçümü kullanılarak tespit edilebilir bir enzimatik reaksiyona dayanır. örneklenmiş filtreler üzerindeki yüksek organik içeriğin bir sonucu olarak, örneklerden DNA ekstraksiyon ilk topraklar için tasarlanmış ve DNA verimi artırmak için modifiye edilmiş bir ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Algılama ve kantitatif polimeraz zincir Reacti kullanarak belirli mikrobiyal türlerin miktar(Q-PCR) analizi tarif diğer yöntemlerden karşılaştırılmıştır.
Introduction
Filtrelerin hava örnekleme atmosferik aerosoller araştırma temel araçtır. 1 örneklenmiş filtreler çeşitli kimyasal, fiziksel ve toplanan çevre parçacıkların biyolojik karakterizasyonları için başlangıç noktasıdır. 2-11 Bu yaklaşımın avantajı çeşitli analizler olabilmesidir aynı numune üzerinde off-line gerçekleştirilir. Araştırmacı tüm farklı analizler verileri etkinleştirir derlenmesi atmosfer bilimleri karmaşık sorunların çözümünde toplanan parçacıkların ve yardımların özelliklerinin iyi bir anlayış elde etmek için. 12,13 Örneğin, deniz ve iç hava örnekleri aynı sırasında alınan süresi Bu çalışma için örnek partikül toksisite ve biyolojik kompozisyon. 14 ile ilgili olarak karşılaştırılabilir, lipopolisakarit (LPS), aynı zamanda endotoksinlerin şekilde bilinmektedir gram-negatif bakteri hücre duvarları, bileşenler, kıyı-ve örneklendiği filtrelerden ekstre edildi bir iç site ve kullanılarak değerlendirildilimulus amebocyte lizat (LAL) testi. Buna paralel olarak, bakteriyel içeriğin bir genomik değerlendirme (toplam bakteri, gram negatif ve siyanobakteri kantitatif) polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) kullanılarak aynı numune üzerinde gerçekleştirilmiştir. LAL Test endotoksin içeren bir sulu çözeltiye, at nalı yengeç, Limulus Polyphemus'un gelen amebocytes sulu ekstraktının ilave edildikten sonra oluşan bulanıklık ölçümlerine dayanır. Örnek yüksek endotoksin konsantrasyonu hızlı türbidite geliştirir. 15 Q-PCR analizi, belirli bir DNA fragmanı amplifiye olarak yayılan bir floresan sinyali dayanır. 16 sinyal gerçek zamanlı izleme PCR üslü fazda standart bir eğri ile reaksiyonu ve kalibre, ilk DNA miktar olarak tespit edilebilir. Bu ikisinin kombinasyonu başka bir yerde ayrıntılı olarak, 14 endotoksin ve düzeyleri iyi bir tahmin sağlayabilir, diğerleriyle birlikte analizleriörneklerinde, kaynak bakteri miktarı.
Burada sunulan yöntemin amacı, filtreler çıkarılır, biyo-aerosolleri endotoksin ve DNA içeriği son derece doğru ve güvenilir bir analiz sağlamaktır. Aerosol fiziksel ve inorganik kimyasal özellikleri örnekleme yöntemleri ve daha yakın zamanda, yöntemler organik madde bileşeni araştırmak için geliştirilmiştir iyi bilinen iken, 17 aerosollerin biyolojik bileşeni yetersiz araştırma olmuştur. 18 akımı gerekçesi yöntem ayrıntılı olarak, ayıklanması analiz ve havadaki aerosoller biyolojik kısmını tanımlamak için sağlam bir yöntem sunarak bu boşluğu doldurmak için. 14
Burada açıklanan yöntem filtre analizini içeren biyolojik kapalı ve açık aerosol araştırma projelerinde yaygın kullanım alanı bulur bekleniyor. 20-24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Tüm malzemeler ve bu protokolde kullanılan araçların ayrıntılı bir listesi Malzemeler bölümünde gösterilir.
Filtreler 1. Hava Örnekleme
- Filtreler hazırlanması
- Yüksek hacimli numune alma, 20.3 x 25.4 cm 2 filtreleri kullanın. En iyi araştırma ihtiyaçlarına uygun filtre belirli tip yanı sıra filtre kesme boyutunu, varsa seçin. 1 Burada, kullanım kuvars mikrofiber filtreleri.
- organik ve biyolojik bileşik, örnekleme için önceden-Bake filtreler organik kısmı yok etmek. -Öncesi fırında filtreler, alüminyum folyo ile tek tek kaydırmak ve daha sonra, en az 5 saat boyunca 450 ° C'de bir laboratuar fırınında pişirin için.
- örnekleme kadar -20 ° C 'de fırında filtreleri saklayın.
- Enstrüman Taşıma ve Hava Örnekleme
- yüksek hacimli numune kafasından temiz kalan toz. temiz bir kağıt mendil ile silin parçaları ve hava-kuru befo için onlara izinörnekleyici tekrar takmadan yeniden.
- etanol ile filtre kasetini dezenfekte edin ve eldiven ve her zaman bir laboratuvar önlüğü ile çalışır.
- temiz filtre kaseti içinde bir ön-pişmiş filtreyi yerleştirin ve yüksek hacimli örnekleyici kılavuzuna göre hareket edin.
- Ve alüminyum şal uygulanabilir (örneğin yağmur, toz fırtınası), örnekleme tamamlanmasına kadar temiz bir yerde saklayın eğer, tarih ve herhangi bir olağandışı hava koşulları işaretleyin.
- örneklenmiş filtreyi toplayın ve örneklenmiş tarafı içe bakacak şekilde ikiye katlayın.
- analize kadar -20 ° C 'de, özgün alüminyum folyo ve deposunda filtre sarın.
Not: numune alma ve analiz arasındaki zaman gecikmesi, daha 2 aydan uzun ise, organik ve biyolojik maddenin bozulmasını önlemek için -80 ° C'de örnek saklayın.
2. Endotoksin Analizi
Not:% 70 etanol An ile çalışma yüzeyi dezenfekteSadece pirojensiz tüpler, ipuçları ve reaktif d çalışır. Bardak kullanıldığında, 30 dakika boyunca 250 ° C ya da 60 dakika boyunca 200 ° C'de önceden ısıtılması gereklidir. 25, bir sınıf II biyo-güvenlik kabini tüm reaktifler hazırlamak ve eldiven ve her durumda bir laboratuar kaplama ile çalışır.
- reaktif Hazırlama
- Kullanmadan önce kısa bir süre lizat rehydrate LAL kiti üreticisinin protokolünü izleyin. 26 dokunun yavaşça flakon üzerindeki şişe duvarlarında kalan LAL çıkarmak için. vakum kırmak için hafifçe stoper kaldırın. Bir iğneli bir şırınga kullanarak, tüm lizat içeriği rehidrate ve köpük oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırmak için şişeye pirojensiz su (PFW) 5 ml ilave edin.
- Plastik parafın film ile şişenin kapatılması değilken kadar iki gün 4 ° C sıcaklıkta kullanılması ve mağaza. en çok üç ay boyunca -20 ° C 'de kalan lisat saklayın.
Not: Bu reaktif sadece bir kez dondurulabilir. - 0.5 mikron içeren kontrol standart endotoksin (CSE), rehydrateg E. E. coli, üreticinin protokolüne uygun olarak. 27 web sitesinde belirtilen kiti için lot numarasını girerek üreticinin web sitesinden 28 den CSE şişeye ilave edilecek suyun belirli bir miktar belirleyin. E. nihai konsantrasyon (AB; burada 10 AB = 1 ng) E. coli şişede, endotoksinden ölçülür. Bu şişeyi Ed0 etiketleyin.
- plastik parafin film ile CSE şişeyi mühür değilken kadar 4 hafta boyunca 4 ° C'de kullanımı ve mağaza.
- Standart Eğri ve Çivili-filtre Hazırlık
- Tablo l'de gösterildiği gibi, bir sınıf II biyo-güvenlik kabini, bir çoğaltılmış endotoksin seyreltme serisi üretmek CSE (borular Ed1-Ed11) veya CSE (boş tüp sadece PFW ihtiva eden) azalan miktarları ihtiva eden 22 pirojensiz 2 ml santrifüj tüplerine hazırlanması 1.
- dairesel akışı ile biyolojik kabinede, bir dezenfekte 1.1 kullanarak temiz, ön-pişmiş filtre 22 dairesel parçaları kesmek 2 cm çaplı mantar delici.
- Steril petri kutularının içine filtre çiftleri yerleştirin.
- Filtrelerin karşılık gelen çifti üzerine endotoksin seyreltme serisi ED2-Ed11 her üyesinden ve boş tüp 50 ul Spike.
- 30 dakika kurumaya kaputun altında açık çivili filtreleri içeren Petri kapları bırakın.
- pirojensiz 2 ml tüp içinde, her bir filtre parçası yerleştirin.
| Tüp | Nihai endotoksin konsantrasyonu (AB ml -1) | Standart endotoksin hacmi (mi) | Pirojensiz su hacmi (ml) | toplam hacmi (mi) | Ed0 | 2500 | ana çözelti* | 5 |
| Ed1 | 1000 | 80 (Ed0 arasında) | 120 | 200 |
| ED2 | 100 | 20 (ED1 itibaren) | 180 | 200 |
| ED3 | 50 | 10 (ED1 arasında) | 190 | 200 |
| Ed4 | 25 | 5 (ED1 arasında) | 195 | 200 |
| Ed5 | 12.5 | 2.5 (ED1 arasında) | 197.5 | 200 |
| ED6 | 6.25 | 1.25 (ED1 arasında) | 198,75 | 200 |
| ED7 | 3.125 | 6.25 (ED2 arasında) | 193,75 | 200 |
| ed8 | 1,563 | 6.25 (ED3 arasında) | 193,75 | 200 |
| Ed9 | 0.781 | 6.25 (Ed4 arasında) | 193,75 | 200 |
| ED10 | 0.391 | 6.25 (Ed5 arasında) | 193,75 | 200 |
| Ed11 | 0.195 | 6.25 (ED6 arasında) | 193,75 | 200 |
| Boş | 0 | 0 | 200 | 200 |
Tablo 1:. Endotoksin standart eğri endotoksin konsantrasyonu, standart bir endotoksin ve pirojen içermeyen su hacmi ilave edilecek ve elde edilen toplam hacim kalibrasyon eğrisinde Her seyreltme tüpünden için ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Deneysel ve Çivili Filtreler Endotoksin Ekstraksiyon
- akış şemasına sahip biyolojik bir kabin içinde, pirojensiz 2'de, (Kademe 2.2) kirpi standart filtreler ile birlikte, dezenfekte 1.12 cm çapında bir mantar delici kullanılarak ve koyun dairesel parçalar halinde (adım 1.2 arasında) bir numune kesme filtreleri ml'lik tüpler (yani örnek tüpleri).
- tüplere 1 mi PFW ekleyin ve laboratuar çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca her çalkalayın.
- 10 dakika boyunca 375 x g'de bir mikrosantrfuj numune tüpleri santrifüjleyin. 29
- aktarım inciYeni bir pirojensiz 2 ml tüp içine, endotoksin içeren e yüzer.
- Limulus Amebocyte lisatı (LAL) Deney
- Düz dipli ve bir kapakla pirojensiz 96 çukurlu bir mikrolevhadaki LAL deneyi ile örneklerde endotoksin konsantrasyonunu belirler.
- Şekil 1'de gösterildiği gibi., Önceden plaka dizi planlayın her çalışan plakada (100-0,195 EU / ml (bölüm 2.2) konsantrasyonu aralığını kapsayan ve böylece) endotoksin standart çözümleri ED2-Ed11 doğrudan hazırlanmış bir standart eğri ekleyin . Standart eğri kuyuları satırlar A 1-10 ve plaka B işgal etmelidir. Boş numuneler için bu satırlarda kuyuları 11-12 kenara (dört boşlukları toplam yapım).
- mikroplaka okuyucusu açın ve 37 ° C'de mikro-enkübasyonu içeren ve 405 nm 'de absorpsiyon ölçümleri ile takip her 5 dakikada bir, çalkalama kinetik reaksiyon için programlamak. 1.5 saat boyunca 18 kez tekrarlayın.
- Verim belirleyincy hangi endotoksin örnek filtreler elde edilir (yani., çivili standart filtreler alınan numuneler) orijinal miktarın hesaplanan endotoksin miktarı bölünmesi yoluyla çivili.
- Veya çivili filtre özü ve (bölüm 2.3) kendi boşlukları (adım 2.4.2 itibaren) standart endotoksin çözümleri 50 ul koyarak tahlil başlayın, ya da deneysel numuneler ve (aynı zamanda bölüm 2.3 dan itibaren) kendi boşlukları, kapak planlanan plaka dizisi (Şekil 1) başına ve kapatın olarak.
- Her iyi, hızlı bir şekilde LAL solüsyonu 50 ul ekleyin ve okuyucusuna kaldırmadan önce masaya alınırken yavaşça yatay plaka sallayın.
- plaka okuyucu plaka koyun ve deneysel çalışma başlatmak.
Şekil 1:. Endotoksin dizi plakası Bir eski96 çukurlu bir mikrolevhadaki bir endotoksin analizi dizi bol.
3. Genomik Analizler
Not: DNA ekstraksiyonu için,% 70 etanol ile çalışma yüzeyi dezenfekte ve sadece steril tüpler, ipuçları ve reaktifler ile çalışır. DNA'nın q-PCR analizi için, yüzey DNA temizleyici ile çalışma yüzeyi dezenfekte edin. Bir sınıf II biyogüvenlik kabini içinde tüm reaktifler hazırlayın ve eldiven ve her zaman bir laboratuvar önlüğü ile çalışır.
- DNA primerleri ve sondaları hazırlanması
- DNA ekstraksiyonu, ya düzen (hidroliz prob yöntemi uygulandığı takdirde) primerlerin piyasadan temin seti ve bir sonda, ya da astar bir dizi yeni ve astar hesaplama araçlarını tasarlama kullanarak bir prob tasarımı önce. 30
- ya da 10 mM Tris-0.1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (TE tamponu) ya da PCR dereceli su kullanılarak üreticinin protokolüne göre primerler rehidrate.
Not: İlk PCR primeri st çözmek için tavsiye edilirdaha uzun süre saklandığında astar bozulmayı önler düşük EDTA (% 0.1) ile TE tampon maddesi içinde takılıp sıkıştırılmış. PCR reaksiyonları inhibe olabilir EDTA miktarlarını azaltmak için daha sonraki dilüsyonları için PCR-dereceli su kullanın. - analize kadar -20 ° C'de, 50 ul hacimde veya steril 0.5 ml'lik tüplerde primer ve prob 100 ul ve mağaza hazırlayın.
- Standart Hücre Konsantrasyon Değerlendirme DNA Ekstraksiyon önce
- Uygun büyüklükteki bir santrifüj tüpünde, ilgi konusu mikrop türleri (tüp Od0, Tablo 2A) içindeki bir standart hücre solüsyon hazırlanır. Küçük delikli bir pipet kullanılarak tüp içinde pipetleme aşağı 7-10 kez hücre süspansiyonu karıştırın.
- Hücreler (örneğin belirli mantar sporları) renkli ise, bir boyama işlemi yapmazlar. Hücre boyaması gerekli ise, ilgi konusu hücrelerin mikroskobik saptanması için uygun bir boya hücre süspansiyonu seyreltin. 31
- kapak kayma ve hemocytom temizleyinetanol ile eter. Nemlendirin ve hemasitometre kapak kayma yapıştırın.
- dikkatlice pipet ucu ile kapak kayma kenarına dokunup kılcal hareket ile odasını doldurarak hem hemositometre odalarına hücre süspansiyonu yaklaşık 8 ul yükleyin. üzerinde / altında odasını doldurmayın.
- 400X büyütmede (oküler objektif ve 10X olarak 40X) bir mikroskop altında görüntüleyerek hücre sayısını belirler. Dokuz kareler 1 x 1 ölçme mm 2 ve 3 x 3 ızgara düzenlenmiş görülmelidir. ızgara dört köşe meydanlarından birinde mikroskop odaklanın (daha yüksek bir büyütme kullanılabilir). 1 x 1 mm 2 kare 16 küçük kareler içermelidir.
- Dört 1 x 1 ila 2 mm köşe kareler hücreleri, hem de 3 x 3 ızgara orta kare sayısı. saymak için çok fazla veya çok az sayıda hücre varsa, 15- (ya konsantre ya da uygun şekilde orijinal hücre süspansiyonu seyreltilmesi, prosedürü tekrarlayın50 hücre) bir tekleme 1 ila 2 mm alanı kaplamak gerekir.
- Aşağıdaki gibi hücreden standart hücre süspansiyonu Od0 hücrelerin (hücreler ml -1) konsantrasyonunu hesaplayınız beş sayılan kareler arasında ortalama sayısı: Hücre sayımı ml -1 = Ortalama hücre sayısı kare -1 Seyreltme Faktörü 10 4.
- DNA Ekstraksiyon Etkinliğinin Değerlendirilmesi
- Tablo 2A göre dokuz steril 0.5 ml'lik tüpler hazırlayın.
- Standart hücre çözeltisi (Od0), 20 ul (Od1) bir toplam hacim içinde yaklaşık 10 7 hücreleri ml -1 içeren seyreltin.
- OD2-Od8 ve boş tüp, Od9 20 ul tüpler steril nükleaz içermeyen PCR dereceli su (NFW) 18 ul ekleyin.
- Aktarım OD2 içine Od1 hücre çözeltisi 2 ul. Pipet hafifçe karıştırın ve Od3 için tüp OD2 2 ul aktarmak. o kadar Od8 kadar tüplere boyunca aynı şekilde hücreleri seyreltilmesi ve tüp dahil Devam10 7 -10 0 hücreleri ml bir seri seyreltme btain -1.
- dairesel akışı ile biyolojik kabinede, bir dezenfekte 1.12 cm çapında bir mantar delici kullanarak, temiz, ön-pişmiş filtrenin 18 yuvarlak parçalar kesin. steril petri çanaklarına çiftler halinde filtreleri yerleştirin.
- Her bir standart hücre konsantrasyonuna karşılık gelen bir filtre çifti olduğu şekilde, eşleştirilmiş filtrenin her biri üzerine Od8 ve boş bir tüp Od9 dilüsyonlar Od1 10 ul başak.
- kaputun altında açık Petri kapları bırakın ve 30 dakika boyunca kurumaya bırakın.
- steril vida üst 2 ml tüp her filtre parçasını yerleştirin ve bölüm 3.4 detaylı prosedüre göre DNA ayıklayın.
- Deneysel ve Çivili Filtreler DNA Ekstraksiyon
Filtreyi DNA ekstraksiyonu için aşağıdaki değişikliklerle birlikte üreticinin protokolüne uygun olan toprak DNA ekstraksiyonu için tasarlanmış ticari kitler kullanın.- Her fil içinter örneği (Od1-Od8), 0.5 mi steril tüp içinde asitle yıkanmış cam boncuklar bir karışım hazırlanması. ≤106 um bir çapa sahip olan 425-600 um ve 0.3 g boncuk bir çapa sahip 0.1 g boncuk kullanın.
- dairesel akışı ile biyolojik kabinede, bir dezenfekte 1.12 cm çapında bir mantar delici kullanarak her filtre örnek üzerinde rastgele seçilmiş yerlerden üç yuvarlak parçalar kesip, ve vida-üst, 2 ml tüp koyun.
- tüplere cam boncuk karışımı ekleyin.
- üreticinin protokolü belirtilen miktarda biyolojik kabine her tüpe ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen hücre lisis tamponu ekleyin.
- bir kova buz hazırlayın ve mekanik bir boncuk çırpıcı kullanarak hücrelerin bozabilir.
- 1 dakika boyunca boncuk yendi ve daha sonra 1 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Beş kez tekrarlayın.
- post-parçalama adımı kit tedarikçinin protokolü ile devam edin.
- verilen elüsyon tamponu ile elüsyon sonra (10 mM Tris B içerenUffer) ya da NFW DNA verimini artırmak için daha kolonu boyunca örnek yeniden.
Not: DNA ekstraksiyonu ile aynı gün analiz edilmemiştir, numuneler, analiz edilinceye kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
| Standart Hücre Seyreltme Serisi A- Hazırlanması | ||||
| Tüp | Nihai hücre konsantrasyonu (hücre mi-1) | Standart hücre hacmi (mi) | Nükleazlar serbest su hacmi (ml) | Toplam hacim (mi) |
| Od0 | Hem ile belirlemeksayım odası ocytometer | |||
| Od1 | 10 7 hücre ml aralığına elüt olmalıdır -1 | 20 | ||
| OD2 | 10 -1 Od1 | Od1 2 | 18 | 20 |
| Od3 | 10 -2 Od1 | OD2 2 | 18 | 20 |
| od4 | 10 -3 Od1 | Od3 2 | 18 | 20 |
| Od5 | 10 -4 Od1 | Od4 2 | 18 | 20 |
| Od6 | 10 -5 Od1 | Od5 2 | 18 | 20 |
| Od7 | 10 -6 Od1 | Od6 2 | 18 | 20 |
| Od8 | 10 -7 Od1 | Od7 2 | 18 | 20 |
| Boş | 0 | 0 | 20 | 20 |
| DNA Standart Eğrisi B- Hazırlanması | ||||
| Tüp | Nihai DNA konsantrasyonu (mg mi-1) | Standart DNA hacmi (mi) | Nükleazlar serbest su hacmi (ml) | Toplam hacim (mi) |
| NanoDrop ile belirlemek | ||||
| DD1 | 10 1 mg ml aralığına elüt olmalıdır -1 | 20 | ||
| Dd2 | 10 -1 DD1 | DD1 2 | 18 | 20 |
| DD3 | 10 -2 DD1 | DD2 2 | 18 | 20 |
| DD4 | 10 -3 DD1 | DD3 2 | 18 | 20 |
| DD5 | 10 -4 DD1 | DD4 2 | 18 | 20 |
| Dd6 | 10 -5 DD1 | DD5 2 | 18 | 20 |
| DD7 | 10 -6 DD1 | Dd6 2 | 18 | 20 |
| DD8 | 10 -7 DD1 | DD7 2 | 18 | 20 |
| Boş | 0 | 0 | 20 | 20 |
Tablo 2:., DNA, standart eğri, standart hücre hacmi NFW hacmi ve her çözücüden bir tüp içinde toplam hacmi için ayrıntılı bir standart mikroorganizma hücresi seyreltme serisi (A). Standart DNA hacmi NFW hacmi ve her çözücüden bir tüp içinde toplam hacmi için ayrıntılı bir DNA, standart eğri hazırlanması, (B).
- DNA, standart eğri hazırlanması
- 260 nm'de standart DNA numunesi (DD0) DNA konsantrasyonu belirlemek için bir spektrofotometre kullanarak.
- Tablo 2B'de gösterildiği gibi, bir DNA standart eğri hazırlamak için olan, dokuz, steril 0.5 ml tüpler hazırlayın.
- Gerekirse, 20 ul toplam hacim içinde 1-10 ug ml -1 ilk tübün (DD1) 'de bir konsantrasyon aralığı içinde, standart DNA solüsyonu DD0 seyreltin.
- Dd2-DD8 ve boş tüpe 20 ul tüpler için NFW 18 ul ekleyin.
- Aktarım Dd2 içine DD1 standart DNA çözeltisi 2 ul. Pipet hafifçe karıştırın ve sonra DD3 için Dd2 2 ul aktarın. Tüpler boş boru containi ile 10 0 -10 arasında bir seri seyreltme -7 tüplerde Dd2-DD8 elde etmek için birlikte aynı şekilde DNA seyreltilmesi devamng sadece NFW.
Not: analiz edilinceye kadar -20 ° C'de, ekstraksiyon aynı gün deposu örnekleri analiz değilse.
- ısınmak için önceden q-PCR aleti açın.
- Tablo 3'te ayrıntılı olarak yeni bir program dosyasında cihaz çalışan yazılım çalıştırmak Q-PCR için ayrıntıları yerleştirin.
Not: Farklı enstrümanlar her bir termal döngü adım için farklı optimum zamanlama var. Bu giriş cihazın kılavuzunda belirtilir. - Yüzey DNA temizleyici ile çalışma yüzeyi dezenfekte ve sadece steril tüplere, ipuçları ve reaktifler ile çalışır.
- Bir sonraki çalışma tezgah bir kova buz hazırlayın. Buz üzerinde muhafaza edin Taq polimeraz karışımı.
- plaka işgal edilecek reaksiyon toplam kuyu sayısını hesaplayın. İlave reaksiyonlar için teorik yardımı (% 5) yapmak ve toplam reaksiyonunun hesaplamak için reaksiyon başına hacim ile reaksiyonlar büyütülmüş çarpınn hacmi.
- NFW, primerler, prob, ve son olarak da, Taq polimeraz karışımı başlayarak Reaksiyon karıştırılır havuz hazırlayın. Tablo 4'te karışık havuzu için hacim hesaplamalarında örneğe bakın.
- kullanılıncaya kadar reaksiyon karanlıkta karışımı ve buz üzerinde saklayın.
- üçlü olarak Q-PCR mikrotablada kuyu içindeki (negatif kontrol olarak) standart DNA, örnek DNA veya NFW 1 ul koyun.
- plaka çalışma yüzeyi dokunmadan engellemek için ve temiz tutmak için bir plaka sahibi olduğundan emin olun.
- Her bir reaksiyon Karma havuz (Tablo 4) 9 ul ekle.
- Optik yapışkan film ile plaka Kapak ve her taraftan sıkıca kapatın.
- q-PCR cihazında yerleştirmeden önce 1000 xg'de 1 dakika boyunca plaka kova ile bir santrifüj plaka aşağı doğru döndürün.
- aracı haline plaka koyun ve çalışan bir programı etkinleştirin.
| Parametre | ayrıntılar | Yorumlar |
| algılama yöntemi | Kantitatif hidroliz prob | |
| Termal döngü koşulları | ||
| Başlangıç denatürasyonu ve enzim aktivasyon | 10 dakika boyunca 95 ° C | |
| denatürasyonu | 15 saniye için 95 ° C | 45 kez tekrarlayın |
| Tavlama ve uzatma | 60 saniye için 60 ° C | |
| plaka dizisi | ||
| standart eğri | DD1 - DD8 | ilk 3 satır da 1-8 kuyularda seyreltme başına 3 tekrarlar |
| Sigara şablon kontrolü (NTC) | Nükleazlar serbest su (NFW) | 3 9'da tekrarlar inci iyi üst3 satır. |
| analiz örnekleri | DNA filtrelere ekstrakte | Geri kalan kuyular da numune başına 3 tekrar. |
| primer seti | her biri göz başına | |
| örnek hacmi | 10 mi |
Tablo 3:. Q-PCR işletim yazılımı Ayrıntılar analiz parametrelerinin Detayları q-PCR programı dosyası içine girilmelidir.
| reaktif | Reaksiyon başına hacim (ml) | Reaksiyonların sayısını | Hata karşılığı(% 5) | Toplam hacim karışımı (mi) |
| Taq polimeraz karışımı | 5 | 50 | 52.5 | 262.5 |
| F primerinin (10 mM) | 0.5 | 50 | 52.5 | 26.25 |
| R, primer (10 mM) | 0.5 | 50 | 52.5 | 26.25 |
| Nükleazlar ücretsiz su | 3 | 50 | 52.5 | 157.5 |
| DNA, - 1 mi 96 plakasının hedef oyuklara direkt olarak eklenir. | ||||
Tablo 4:. Kantitatif PCR Reaksiyonu Mix Hesaplama reaksiyon başına Cilt, reaksiyonların sayısı, ödenek hata için, ve toplam hesaplanan hacim reaktif başına reaksiyon karışımı içine ilave edilmesi detaylandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu "off-line" örneklenmiş filtreleri analizleri kullanılarak atmosferik aerosoller incelemek için yaygındır (Şekil 2). 32 Kimyasal örneklenmiş madde, organik (örneğin protein, hidrokarbon molekülleri, sakkaritler) ve inorganik (örneğin metaller, tuzlar) dahil içeriği analizleri . Biyolojik analizler uygulanabilir ve cansız mikroorganizma içeriği, bir DNA ya da yaklaşımı mikroskobu kullanarak tür tanımlamak, hem de DNA tabanlı ölçümü içerir.
Şekil 2: Filtre Örnek analizi akış şeması hava örnekleme (A) filtre, alt analizler (B) ve örnek (c) bileşenlerinin analizi için filtrenin hazırlanması..
E = "1"> endotoksin çıkartma, filtre alt örnekleri (1.12 cm2), oda sıcaklığında 60 dakika süreyle 1 ml PFW içinde çalkalanır. Örnekler daha sonra 375 x g'de 10 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur. Şekil 3A'da gösterildiği gibi farklı santrifüj hızı, farklı ekstraksiyon verim neden olabilir.
ekstraksiyon etkinliği için bir ön testi spesifik seçilmiş filtre ve protokol için yapılmalıdır. Şekil 3B'de, daha yüksek bir ekstraksiyon verimi örneklenmiş kuvars filtrelerle karşılaştırıldığında, temiz spike elde edilir ve bu verimlilik hem standart çözeltisinin doğrudan tespiti yoluyla elde edilenden daha düşük olur. Başka yerlerde tartışıldığı gibi, filtre üzerinde örneklenmiş ortam aerosoller niteliği de endotoksin çıkartma verimliliğini etkileyebilir. 14,33
g3.jpg "/>
Şekil 3: Endotoksin ekstraksiyon verimi endotoksin çıkartma verimliliğini santrifüj hızı (A) ve filtre yük (B) etkileri.. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
endotoksin standart numune ekstre endotoksinlerin veya boşlukları LAL reaktifi: 1 oranını endotoksin tespiti için, reaksiyon 1 içerir. Numune analizi için üçlü kullanılması tavsiye edilir. Ancak, standart eğriler için, çoğaltmaları yeterlidir. (405 nm) absorpsiyon okumaları tamamlandığında, elde edilen optik yoğunluk (OD) Verilerin daha fazla analiz için bir veri-analiz elektronik tablo programı içine ihracat sonra analiz edilir.
endotoksin ekstre olduğu gibi, belirli deney koşulları altında, DNA ekstraksiyon randımanının bir ön analiz gerçekleştirmek için önemlidir. Bu, yukarıda tarif edilen DNA ekstraksiyon protokolü takip filtre kesilen bir parça üzerine, standart bir organizma hücre çözeltisinin bilinen miktarda spike yapılır. örnek aerosollerden ekstre hedef mikroorganizmaya konsantrasyonu Q-PCR kullanılarak belirlenir. Burada hidroliz prop tekniği için şablon DNA bağlanmış ek bir prob, yüksek özgüllük avantajı olan, kullanılmıştır. 35 SYBR yeşil bir yöntem de bu amaç için kullanılabilir. Kalibrasyon eğrileri yukarıda tarif edilen çıkarma yöntemi kullanılarak, ilgi konusu seçilmiş organizmalardan edilen DNA elde edilir. DNA örneği, standart ya da kontrol dışı Reaksiyon bileşikler karışık bir havuz, hazırlanabilir ve gerekli olana değin karanlıkta ve buz üzerinde tutulur. Daha sonra, karışık havuzun bir alikosu, 96 mikro optik plakanın üzerindeki çukurların her birine ilave edilir. DNA, standart numune ya da kontrol plakası dizisine göre reaksiyon karışımı sonra eklenir. tüm reaktifler plaka takıldıktan sonra, o denizoptik yapışkan film ile açtı ve kuyu dibinde tüm damlacıklar toplamak için aşağı döndü. plaka termal döngü amplifikasyonu ve sinyal tespiti için q-PCR cihazına yerleştirilir fazladır. çıkış verileri Yükseltilmiş DNA miktarı eşik değeri ulaştığı döngüsü sayısı olarak tanımlanır PCR Ct değerleri, oluşur. Kalibrasyon eğrisi değerleri kullanılarak, hedef DNA konsantrasyonu, (bakınız Şekil 4) elde edilebilir. 36 mikroorganizmaların hücre konsantrasyonları, standart bir organizma çözeltisinin bir hemositometre sayısı ile karşılaştırıldığında ekstraksiyon randımanının Ct değerleri hesaplanabilir. 37 
Şekil 4: Kantitatif PCR amplifikasyonu arsa (A) ve KALİBR.-4 10 x 2 ila -2 x 10 2 (B) temsilcisi gram negatif bakteri DNA için yapılan değişen iyon eğrisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma Filtreler üzerinde toplanan aerosol örneklerinde endotoksin ve DNA hediyesi hem ölçülmesi için çıkarma ve algılama yöntemleri anlatılmaktadır. yöntemler doğru rutinleri gerektiren ve uzun Deneyciler Burada tartışılan birkaç temel ve önemli noktaları yapışır gibi kolayca yapılabilir.
endotoksin algılama adım için, lizat çözüm oldukça viskoz ve pipetleme üzerine kabarcıkları üretmek eğiliminde olduğunu unutmayın. Sana kabarcıklar kaldırmak zordur, ve onlar mikroplaka okuyucu değerlerindeki değişikliklere yol. Nedenle, ilk olarak, plaka ve ancak tüm kabarcıklar ortadan emin olduktan sonra numuneyi lizat çözeltisi ilave devam etmek önemlidir. Bu adımda kabarcık oluşumunu önlemek için yararlı bir tekniktir pipet ile yavaş çalışmaya ve kuyu içine lizat boşaltırken tüm yol basın değildir. Lizat endoto ilave ediliyor kez bir tepki olarak hemen başlarXin o kadar kısa sürede okumaya başlamak esastır, ayıklayın. Lizat ek aşaması, kısaltmak için, çok kanallı bir pipet kullanılabilir. Bu mikro titre plaka yerleştirilir sonra bir kit ve protokollerde, 10 dakika boyunca 37 ° C'de numunelerin ek bir ön inkübasyon aşaması olduğuna dikkat edin. 29 ancak bu işlemden sonra lizat ilave edilebilir.
Endotoksinlerin çevresel numune çıkarılması için önemli bir nokta (yüksek kirlilik hava numunesinde gibi) örneklerinde önleyicilerinin varlığıdır. Bu durumda, seyreltme kritik hale ve yanlış donanım, tipik olarak seyreltilmiş numune için gözlemlenen engelleyebilir. 38
Benzer şekilde, q-PCR algılama başarısını ve güvenilirliğini sağlamak için önemli birkaç nokta vardır. Onlar da altına yerleştirilen değilse çözeltilerin hacminin çok küçük olduğu için 1) DNA damla su içeriği buharlaşma whil azaltılabilire plaka üzerinde örnekleri düzenlenmesi. Bu sorunu önlemek için kuyunun dibinde DNA örneği yerleştirin buz ya da başka bir soğutma platformu üzerine yerleştirerek plaka serin ve mümkün olduğunca bu adımı hızlandırmak için her şeyi önceden hazırlamak. Q-PCR reaksiyon karışımı (Tablo 4) hazırlanırken 2), foto-bozulmayı önlemek için alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır. 3) Bu deney, bir 10 ul reaksiyon hazırlanmasını tarif etmektedir. Bununla birlikte, bazı Q-PCR aletleri, reaksiyon hacmi 20 ul ve daha sonra her tepkin hacmi buna göre çarpılır. 4) uygun ısıl çevrim koşulları farklı primerler ile polimeraz karışımları için değişebilir. Örneğin 39, tavlama sıcaklığı primerler erime ısısında ayarlanmalıdır ve amplifikasyon en verimli meydana geldiği sıcaklık olarak deneysel olarak tespit edilir. Bu nedenle, her bir analiz Q-PCR için bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak için de önemlidirplaka, ölçülmesi doğru olduğundan emin olmak için. Kalibrasyon eğrileri, hem de standart çivili filtreler hiçbir önleme olmadığından emin olmak için, bir pozitif kontrol olarak da hizmet vermektedir. engellenmesini önlemek için, çevresel örneklerden inhibitörleri kaldırmak için tasarlanmış özütleme kitleri kullanılması tavsiye edilir. Bu deneyde, termal döngü 5) sayısı, en fazla sayıda, 45 ayarlanmış filtre ekstrelerinden, DNA konsantrasyonları duyarlılığını arttırmak için çok düşük olmuştur. 6) Eşik döngüleri (bütün DNA örnekleri için Cτ) değerleri kalibrasyon eğrisinin dinamik aralık içinde olduğundan emin olun. Ayrıca negatif kontrol numunesi herhangi bir amplifikasyon DNA örnekleri daha az sekiz döngü daha olduğundan emin olun. SYBR Green reaktif ile çalışıyorsanız 7), reaksiyon başına hiçbir çoklu erime sıcaklığı tepe vardır emin olun.
türbidimetrik test için iki endotoksin ölçümü yöntemleri mevcuttur: kinetik yöntem ve endpoikromojenik yöntem nt. kinetik yaklaşımda, bu protokolde yapılan olarak, örnek için gereken süre maksimum absorbans ölçülür ulaşmak için. Burada, daha kısa bir reaksiyon aralığı örnek bir yüksek endotoksin konsantrasyonu belirtir. Son nokta kromojenik bir yöntemde, ışık emme endotoksin konsantrasyonunu belirlemek için, tanımlanmış bir kuluçka süresinden sonra ölçülür. Her iki yöntem de ölçümü için standart bir kalibrasyon eğrisi gerektirir. 40
Yukarıda tarif edilen endotoksin ekstraksiyon hassasiyet ve doğruluk çok yüksek olmasına rağmen, 14 ekstraksiyon verimi geliştirilebilir. Ekstre edilen prosedüre filtrenin başka bir türü ya da (örneğin polisorbat 20 gibi) bir deterjanın eklenmesi, filtreden ekstre endotoksin verimini geliştirmek mümkündür. Endotoksin çıkarma verimliliği de filtre üzerinde paralel olarak örneklenmiş farklı parçacıklar tarafından etkilenmiş olabilir. Bizim deneysel kurulum için 33,algılama yönteminin sınırı 0.001 AB m -3 olduğu tahmin edilmektedir. 14
Q-PCR için alternatif olarak hizmet verebilir DNA özü miktarının belirlenmesi için teknikler klonlama yaklaşımı ve dijital damlacık PCR (DD-PCR) içerir. tür tanımlaması için klonlama yaklaşımı üzerinde q-PCR avantajları daha hassasiyet vardır ve ilk amplifikasyon aşaması için daha düşük bir DNA konsantrasyonu gerektirir. Buna ek olarak emek yoğun ve zaman alıcı bir Q-PCR, klonlama yöntemi, farklı olarak, kantitatif değildir. DNA özü miktarının tayini için alternatif bir yöntem, DD-PCR'dir. 19, bu tekniğin avantajı tespiti her damlacık bir tek bir DNA suşu dayalı olarak bu, bir kalibrasyon eğrisi gerektirmez olmasıdır. Bununla birlikte, çevresel numuneler için, güvenilir bir yöntem, şimdiye kadar filtreler ekstre DNA damla tespiti için mevcuttur.
DNA fragmanlarının ekstre edildiği verimliliğiom filtre, yanı sıra DNA ölçümlerinin doğruluğu ve kesinliği, Bu nedenle önce numune analiz tanımlanmış olmalıdır tür filtre türü, hedef mikroorganizmaların ve enstrümantasyon. 34,41 gibi faktörlerden etkilenebilir. Bizim deney düzeneği, algılama sınırı 3.5 genom m -3 aşağı ulaşabilir. 14
Sonuç olarak, burada anlatılan yöntem antropojenik ve doğal kaynaklardan hem de hava örneklenmiş biyolojik türlerin tanımlanması ve ölçümü için geçerlidir. Uygun testinin kesin kullanımı karmaşık çevre soruların değerli araştırmalar yapılmalıdır sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 - High Volume Air Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series - Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 µm | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 µm | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
- Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
- Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
