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Endotoxins और डीएनए सामग्री के लिए एयर फिल्टर नमूना विश्लेषण

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

आउटडोर एयरोसोल अनुसंधान आमतौर पर बात कण फिल्टर पर जांचा उपयोग करता है। इस प्रक्रिया में सक्षम बनाता एकत्र कणों के विभिन्न अभिलक्षण समानांतर में प्रदर्शन किया जाएगा। यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य जैव एयरोसौल्ज़ फिल्टर से निकाले के endotoxin और डीएनए सामग्री की एक बेहद सटीक और विश्वसनीय विश्लेषण प्राप्त करने के लिए है। ऐसे lipopolysaccharides के रूप में उच्च आणविक भार कार्बनिक अणुओं, नमूना फिल्टर से, की निकासी एक pyrogen मुक्त पानी आधारित माध्यम में नमूना मिलाते शामिल है। बाद के विश्लेषण के एक enzymatic प्रतिक्रिया है कि एक turbidimetric माप का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है पर आधारित है। नमूना फिल्टर पर उच्च कार्बनिक सामग्री का एक परिणाम के रूप में, नमूनों से डीएनए की निकासी के लिए एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट है कि मूल रूप से मिट्टी के लिए बनाया गया है और डीएनए उपज में सुधार करने के लिए संशोधित किया गया था का उपयोग किया जाता है। का पता लगाने और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन reacti का उपयोग कर विशिष्ट माइक्रोबियल प्रजातियों की मात्रा का ठहरावपर क्यू (पीसीआर) विश्लेषण वर्णित और अन्य उपलब्ध तरीकों के साथ तुलना कर रहे हैं।

Introduction

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फिल्टर पर एयर नमूना वायुमंडलीय एयरोसौल्ज़ अनुसंधान के क्षेत्र में एक बुनियादी उपकरण है। 1 नमूना फिल्टर विभिन्न रासायनिक, भौतिक और जैविक एकत्र परिवेश के कणों की अभिलक्षण के लिए प्रारंभिक बिंदु है। 2-11 इस दृष्टिकोण का लाभ विभिन्न विश्लेषण किया जा सकता है एक ही नमूना पर बंद लाइन प्रदर्शन किया। शोधकर्ता सक्षम बनाता है सभी अलग विश्लेषण से डेटा संकलन वायुमंडलीय विज्ञान में जटिल सवालों को हल करने में एकत्र कणों और एड्स की विशेषताओं में से एक अच्छी समझ प्राप्त करने के लिए। 12,13 उदाहरण के लिए, समुद्री और अंतर्देशीय एयर नमूने ही के दौरान लिया अवधि जांचा कण विषाक्तता और जैविक संरचना। इस अध्ययन के लिए 14 के लिए सम्मान के साथ तुलना की जा सकती है, lipopolysaccharides (एलपीएस), ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया कोशिका-दीवारों, भी रूप में जाना जाता endotoxins पर घटकों, पर किनारे पर जांचा और फिल्टर से निकाले गए थे एक अंतर्देशीय साइट है, और का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया थाLimulus amebocyte lysate (लाल) की परीक्षा। समानांतर में, बैक्टीरियल सामग्री की एक जीनोमिक मूल्यांकन (कुल बैक्टीरिया, नकारात्मक चना, और cyanobacteria) मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर क्यू) का उपयोग कर एक ही नमूना पर प्रदर्शन किया गया था। LAL परीक्षा में गंदगी की माप, घोड़े की नाल केकड़े, Limulus Polyphemus से amebocytes का एक जलीय निकालने के अलावा के बाद का गठन endotoxins युक्त एक जलीय समाधान के लिए पर आधारित है। उच्च नमूने में endotoxin एकाग्रता, तेजी से मैलापन विकसित करता है। 15 क्यू पीसीआर विश्लेषण एक प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में एक विशिष्ट डीएनए टुकड़ा परिलक्षित होता है उत्सर्जित पर आधारित है। 16 संकेत के वास्तविक समय की निगरानी के द्वारा पीसीआर का तेजी के चरण के दौरान प्रतिक्रिया और एक मानक की अवस्था के साथ औजार, प्रारंभिक डीएनए राशि मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इन दोनों का संयोजन अन्य लोगों के साथ एक साथ विश्लेषण करती है, के रूप में कहीं और विस्तृत, 14 और endotoxin के स्तर का एक अच्छा अनुमान प्रदान कर सकते हैंनमूने में बैक्टीरिया के स्रोत की राशि।

यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य जैव एयरोसौल्ज़ फिल्टर से निकाले के endotoxin और डीएनए सामग्री की एक बेहद सटीक और विश्वसनीय विश्लेषण प्राप्त करने के लिए है। जबकि एयरोसौल्ज़ के शारीरिक और अकार्बनिक रसायन विशेषताओं नमूना लेने के लिए तरीकों अच्छी तरह से जाना जाता है और हाल ही में, अपने तरीकों कार्बनिक पदार्थ घटक जांच करने के लिए विकसित किया गया है, वहाँ 17 एयरोसौल्ज़ के जैविक घटक पर अल्प अनुसंधान किया गया है। वर्तमान में 18 के लिए तर्क विधि विस्तार से निकालने का विश्लेषण, और हवाई एयरोसौल्ज़ के जैविक अंश की पहचान करने के लिए एक मजबूत विधि पेश करके इस अंतर को संबोधित करने के लिए है। 14

विधि यहाँ विस्तृत 20-24 जैविक इनडोर और आउटडोर एयरोसोल अनुसंधान फिल्टर विश्लेषण से संबंधित परियोजनाओं में व्यापक प्रसार उपयोग मिल जाने की उम्मीद है।

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Protocol

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नोट: सभी सामग्री और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल उपकरणों की एक विस्तृत सूची सामग्री अनुभाग में दिखाया गया है।

1. फिल्टर पर एयर सैम्पलिंग

  1. फिल्टर की तैयारी
    1. उच्च मात्रा नमूना लेने के लिए, 20.3 x 25.4 सेमी 2 फिल्टर का उपयोग करें। यहाँ फिल्टर के विशिष्ट प्रकार का सबसे अच्छा फिट बैठता है कि अनुसंधान की जरूरत है, साथ ही फिल्टर कट ऑफ आकार, यदि लागू चुनें। 1, उपयोग क्वार्ट्ज microfiber फिल्टर।
    2. पूर्व सेंकना जैविक और जैविक यौगिक नमूना लेने के लिए इरादा फिल्टर जैविक अवशेषों को नष्ट करने के लिए। पूर्व सेंकना करने के लिए फिल्टर, उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट और व्यक्तिगत रूप से तो कम से कम 5 घंटे के लिए 450 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रयोगशाला भट्ठी में उन्हें सेंकना।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस तक नमूने पर पकाया फिल्टर स्टोर।
  2. साधन हैंडलिंग और एयर सैम्पलिंग
    1. उच्च मात्रा पारखी के सिर से स्वच्छ अवशिष्ट धूल। साफ कागज पोंछे के साथ कुछ हिस्सों को साफ कर लें और उन्हें हवा शुष्क befo करने की अनुमतिउन्हें नमूना करने के लिए पुन: कनेक्ट पुन।
    2. इथेनॉल के साथ फिल्टर कैसेट कीटाणुरहित, और दस्ताने और हर समय एक प्रयोगशाला कोट के साथ काम करते हैं।
    3. स्वच्छ फिल्टर कैसेट के अंदर एक पूर्व बेक्ड फिल्टर प्लेस, और उच्च मात्रा पारखी पुस्तिका के अनुसार आगे बढ़ें।
    4. , तारीख और किसी भी असामान्य मौसम की स्थिति फोटो अगर लागू (जैसे बारिश, धूल तूफान) एल्यूमिनियम की चादर पर, और एक साफ जगह में इसे बचाने के नमूने के पूरा होने तक।
    5. नमूना फिल्टर लीजिए और आधे में गुना, नमूना पक्ष आवक सामना करना पड़ रहा है।
    6. -20 डिग्री सेल्सियस तक विश्लेषण पर मूल एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान में फिल्टर लपेटें।
      नोट: नमूना और विश्लेषण के बीच समय अंतराल में 2 महीने से अधिक समय है, -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर जैविक और जैविक सामग्री की गिरावट से बचने के लिए।

2. endotoxin विश्लेषण

नोट: 70% इथेनॉल के साथ एक काम की सतह कीटाणुरहितpyrogen मुक्त ट्यूब, सुझाव और अभिकर्मकों के साथ ही विकास कार्य। कांच के बने पदार्थ का उपयोग किया जाता है, तो 30 मिनट के लिए 250 डिग्री सेल्सियस, या 60 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व हीटिंग की आवश्यकता है। 25 एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी अभिकर्मकों को तैयार है और दस्ताने और हर समय एक प्रयोगशाला कोट के साथ काम करते हैं।

  1. अभिकर्मक तैयार
    1. शीशी पर धीरे उपयोग करने से पहले lysate rehydrate करने के लिए शीघ्र ही LAL किट निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें। 26 ठोकर LAL बोतल दीवारों पर शेष जगह देना। डाट धीरे से उठा वैक्यूम तोड़ने के लिए। एक needled सिरिंज का प्रयोग, सभी lysate सामग्री rehydrate और धीरे मिश्रण फोम गठन से बचने के लिए शीशी pyrogen मुफ्त पानी (PFW) के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ शीशी सील जब अप करने के लिए दो दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करें और स्टोर में नहीं है। अप करने के लिए तीन महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी शेष lysate स्टोर।
      नोट: यह अभिकर्मक केवल एक बार जमे हुए किया जा सकता है।
    3. नियंत्रण मानक endotoxin (सीएसई) है, जो 0.5 μ शामिल rehydrate; जी ई कोलाई, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार। 27 पानी की विशेष राशि किट जहां वेबसाइट पर निर्दिष्ट के लिए बहुत संख्या में प्रवेश करने से निर्माता की वेबसाइट से 28 शीशी सीएसई के लिए जोड़ा जा करने के लिए निर्धारित करते हैं। के अंतिम एकाग्रता कोलाई शीशी में, endotoxin इकाइयों में मापा जाता है (ईयू, जहां 10 यूरोपीय संघ = 1 एनजी)। इस शीशी Ed0 लेबल।
    4. प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ सीएसई शीशी सील जब से 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करें और स्टोर में नहीं है।
  2. मानक वक्र और नुकीला फिल्टर तैयारी
    1. एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में, 22 pyrogen मुक्त 2 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज सीएसई (ट्यूबों ED1-Ed11) या कोई सीएसई (खाली ट्यूब केवल PFW युक्त) के घटते मात्रा युक्त एक दोहराया endotoxin कमजोर पड़ने श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए ट्यूबों तैयार के रूप में तालिका में दिखाया गया है 1।
    2. परिपत्र के प्रवाह के साथ एक जैविक कैबिनेट में, एक कीटाणुरहित 1.1 का उपयोग कर साफ, पूर्व बेक्ड फिल्टर के 22 टुकड़े काट परिपत्र 2 सेमी व्यास काग छिद्रक।
    3. बाँझ पेट्री डिश में फिल्टर जोड़े रखें।
    4. फिल्टर का एक इसी जोड़ी पर endotoxin कमजोर पड़ने श्रृंखला ED2-Ed11 के प्रत्येक सदस्य से और खाली ट्यूब से 50 μl स्पाइक।
    5. हुड के तहत खुले 30 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए नुकीला फिल्टर युक्त पेट्री डिश छोड़ दें।
    6. एक pyrogen मुक्त 2 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक फिल्टर टुकड़ा रखें।
">
ट्यूब अंतिम endotoxin एकाग्रता (ईयू मिलीलीटर -1) स्टैंडर्ड endotoxin मात्रा (एमएल) Pyrogen मुफ्त पानी की मात्रा (एमएल) कुल मात्रा (एमएल)
Ed0 2500 शेयर समाधान* 5
ED1 1,000 80 (Ed0 से) 120 200
ED2 100 20 (ED1 से) 180 200
Ed3 50 10 (ED1 से) 190 200
Ed4 25 5 (ED1 से) 195 200
Ed5 12.5 2.5 (ED1 से) १९७.५ 200
Ed6 6.25 1.25 (ED1 से) १९८.७५ 200
Ed7 3.125 6.25 (ED2 से) १९३.७५ 200
Ed8 १.५६३ 6.25 (Ed3 से) १९३.७५ 200
Ed9 .781 6.25 (Ed4 से) १९३.७५ 200
Ed10 0.391 6.25 (Ed5 से) १९३.७५ 200
Ed11 0.195 6.25 (Ed6 से) १९३.७५ 200
रिक्त 0 0 200 200

तालिका 1:। Endotoxin मानक वक्र endotoxin एकाग्रता, मानक endotoxin की और pyrogen मुक्त पानी की मात्रा जोड़ा जाना है, और कुल मात्रा प्राप्त अंशांकन वक्र में प्रत्येक कमजोर पड़ने ट्यूब के लिए विस्तृत रहे हैं।

  1. प्रायोगिक और नुकीला फिल्टर से endotoxin निष्कर्षण
    1. परिपत्र के प्रवाह के साथ एक जैविक कैबिनेट में, नुकीला मानक फिल्टर (2.2 चरण से) के साथ मिलकर एक कीटाणुरहित 1.12 सेमी व्यास काग बोरर का उपयोग कर, और उन्हें जगह है, कटौती नमूना फिल्टर परिपत्र टुकड़ों में (1.2 चरण से), pyrogen मुक्त 2 में मिलीलीटर ट्यूब (यानी, नमूना ट्यूब)।
    2. ट्यूबों के लिए 1 मिलीलीटर PFW जोड़ें और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए उन्हें हिला, एक प्रयोगशाला प्रकार के बरतन का उपयोग कर।
    3. 10 मिनट के लिए 375 XG पर एक microcentrifuge में नमूना ट्यूबों अपकेंद्रित्र। 29
    4. स्थानांतरण वेंई सतह पर तैरनेवाला, जो एक नए pyrogen मुक्त 2 मिलीलीटर ट्यूब में, endotoxins शामिल हैं।
  2. Limulus Amebocyte Lysate (लाल) टेस्ट
    1. एक फ्लैट नीचे और एक ढक्कन के साथ एक pyrogen मुक्त 96 अच्छी तरह से microplate में Lal परीक्षण के प्रदर्शन से नमूनों में endotoxin एकाग्रता का निर्धारण।
    2. पहले से योजना प्लेट सरणी, के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है। हर थाली में चल endotoxin मानक समाधान ED2-Ed11 (और इस प्रकार 100-.195 यूरोपीय संघ / एमएल (2.2 अनुभाग देखें) की एकाग्रता रेंज को कवर) से सीधे तैयार एक मानक वक्र शामिल करें । मानक वक्र कुओं पंक्तियाँ एक के 1-10 और थाली के बी पर कब्जा करना चाहिए। (चार कारतूस की कुल बना) खाली नमूने के लिए इन पंक्तियों में कुओं 11-12 अलग निर्धारित करें।
    3. microplate रीडर पर मुड़ें और एक काइनेटिक 37 डिग्री सेल्सियस पर microplate के ऊष्मायन से जुड़े और हर 5 मिनट, 405 एनएम पर अवशोषण माप के द्वारा पीछा मिलाते प्रतिक्रिया के लिए यह कार्यक्रम। 1.5 घंटे के लिए 18 बार दोहराएँ।
    4. दक्षता का निर्धारण करते हैंसीवाई जिसके साथ endotoxins नमूना फिल्टर से निकाले जाते हैं (अर्थात्।, नमूने नुकीला मानक फिल्टर से प्राप्त) मूल राशि से गणना की endotoxin राशि के विभाजन के माध्यम से नुकीला।
    5. (कदम 2.4.2 से), या नुकीला फिल्टर निकालने और इसके कारतूस (धारा 2.3 से) के मानक endotoxin समाधान के 50 μl रखकर परख शुरू करें, या प्रयोगात्मक नमूने और इसके कारतूस (भी से खंड 2.3) की, योजना बनाई प्लेट सरणी (चित्रा 1) के अनुसार और कवर बंद के रूप में।
    6. प्रत्येक के लिए ठीक है, जल्दी से लाल समाधान के 50 μl जोड़ें, और धीरे क्षैतिज थाली हिला जबकि यह इसके रीडर में उठाने से पहले मेज पर रखा गया है।
    7. प्लेट रीडर में थाली प्लेस और प्रयोगात्मक रन शुरू करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। Endotoxin सरणी प्लेट एक पूर्वएक 96 अच्छी तरह से microplate में एक endotoxin विश्लेषण सरणी की पर्याप्त।

3. जीनोमिक विश्लेषण

नोट: डीएनए निष्कर्षण के लिए, 70% इथेनॉल के साथ काम की सतह कीटाणुरहित और बाँझ ट्यूब, सुझाव और अभिकर्मकों के साथ ही काम करते हैं। डीएनए के क्यू पीसीआर विश्लेषण के लिए, सतह डीएनए decontaminant के साथ काम की सतह कीटाणुरहित। एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी अभिकर्मकों को तैयार है और दस्ताने और हर समय एक प्रयोगशाला कोट के साथ काम करते हैं।

  1. डीएनए प्राइमरों और जांच की तैयारी
    1. डीएनए निष्कर्षण, या तो आदेश प्राइमरों के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेट और एक जांच (यदि हाइड्रोलिसिस जांच विधि लागू किया जाता है), या प्राइमरों का एक नया सेट और एक जांच प्राइमर कम्प्यूटेशनल उपकरण डिजाइनिंग डिजाइन का उपयोग करने से पहले। 30
    2. या तो 10 मिमी Tris-0.1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (ते बफर) या पीसीआर ग्रेड पानी का उपयोग निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार प्राइमरों rehydrate।
      नोट: यह प्रारंभिक पीसीआर प्राइमर सेंट भंग करने की सिफारिश की हैकम EDTA (0.1%), जब अब समय के लिए रखा के रूप में यह प्राइमर गिरावट के साथ रोकता है ते बफर में Ock। बाद में dilutions के लिए पीसीआर ग्रेड पानी का प्रयोग करें EDTA मात्रा में है कि पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकता है कम करने के लिए।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस तक विश्लेषण पर 50 μl की aliquots या बाँझ 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्राइमर और जांच के 100 μl और दुकान तैयार करें।
  2. स्टैंडर्ड सेल एकाग्रता मूल्यांकन डीएनए निष्कर्षण से पहले
    1. एक उपयुक्त आकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में, ब्याज की माइक्रोबियल प्रजातियों (ट्यूब Od0, टेबल 2 ए) के एक मानक सेल समाधान तैयार है। एक छोटे से बोर के साथ एक पिपेट का उपयोग ट्यूब में pipetting ऊपर और नीचे सेल निलंबन मिक्स 7-10 बार।
    2. कोशिकाओं रंग के होते हैं (जैसे कुछ कवक spores), एक धुंधला प्रक्रिया प्रदर्शन नहीं करते। सेल धुंधला आवश्यक है, ब्याज की कोशिकाओं के सूक्ष्म पता लगाने के लिए एक उपयुक्त डाई में सेल निलंबन पतला। 31
    3. साफ कवर पर्ची और hemocytomइथेनॉल के साथ eter। गीला और hemocytometer को कवर पर्ची प्रत्यय।
    4. ध्यान से पिपेट की नोक के साथ कवर पर्ची के किनारे छू और केशिका क्रिया द्वारा चैम्बर भरने से दोनों hemocytometer कक्षों में सेल निलंबन के बारे में 8 μl लोड। ऊपर / नीचे चैम्बर भरने मत करो।
    5. 400X बढ़ाई (वस्तुनिष्ठ और नेत्र में 10X 40X में) पर एक खुर्दबीन के नीचे उन्हें देखने के द्वारा कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं। नौ चौकों मापने के लिए 1 एक्स 1 मिमी 2 और 3 एक्स 3 ग्रिड में व्यवस्थित देखा जाना चाहिए। ग्रिड के चार वर्गों में से एक कोने पर फोकस माइक्रोस्कोप (एक उच्च बढ़ाई इस्तेमाल किया जा सकता है)। 1 एक्स 1 मिमी 2 वर्ग 16 ​​छोटे वर्गों को शामिल करना चाहिए।
    6. चार 1 एक्स 1 मिमी 2 चौकों कोने में सभी कक्षों, साथ ही में 3 एक्स 3 ग्रिड के बीच वर्ग गणना। गिनती करने के लिए बहुत अधिक या बहुत कुछ कोशिकाओं देखते हैं, तो प्रक्रिया को दोहराने, या तो ध्यान दे या उचित रूप में मूल सेल निलंबन गिराए (15-50 कोशिकाओं को अकेला छोड़ कर एक 1 मिमी 2 क्षेत्र उपरिशायी चाहिए)।
    7. सेल से मानक सेल निलंबन Od0 में कोशिकाओं (कोशिकाओं मिलीलीटर -1) की एकाग्रता की गणना पांच चौकों की गिनती भर में औसतन इस प्रकार के रूप में गिनती: सेल गिनती मिलीलीटर -1 = औसत सेल गिनती वर्ग -1 कमजोर पड़ने कारक 10 4।
  3. डीएनए निष्कर्षण दक्षता का मूल्यांकन
    1. टेबल 2A के अनुसार नौ बाँझ 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार।
    2. पतला मानक सेल समाधान (Od0) 20 μl (Od1) की कुल मात्रा में लगभग 10 7 कोशिकाओं मिलीलीटर -1 को नियंत्रित करने के लिए।
    3. बाँझ nuclease मुक्त पीसीआर ग्रेड पानी (NFW) के 18 μl Od2-Od8 और खाली ट्यूब, Od9 के लिए 20 μl ट्यूबों के लिए जोड़ें।
    4. स्थानांतरण Od2 में Od1 से सेल के समाधान के 2 μl। पिपेट धीरे मिश्रण और OD3 करने के लिए ट्यूब Od2 से 2 μl हस्तांतरण करने के लिए। जारी कोशिकाओं के लिए अप करने के लिए ट्यूब के साथ एक ही तरीके से गिराए और ट्यूब सहित Od8 ओ10 7 0 -10 कोशिकाओं मिलीलीटर की एक धारावाहिक कमजोर पड़ने btain -1।
    5. परिपत्र के प्रवाह के साथ एक जैविक कैबिनेट में, एक कीटाणुरहित 1.12 सेमी व्यास काग बोरर का उपयोग कर साफ, पूर्व बेक्ड फिल्टर का 18 परिपत्र टुकड़े काट। बाँझ पेट्री डिश में जोड़े में फिल्टर रखें।
    6. बनती फिल्टर में से प्रत्येक पर Od8 करने और खाली ट्यूब Od9 से dilutions Od1 से 10 μl कील, एक फिल्टर जोड़ी एक मानक सेल एकाग्रता के लिए इसी तरह के है कि वहाँ।
    7. पेट्री डिश हुड के नीचे खुला छोड़ दें और उन्हें 30 मिनट के लिए सूखी।
    8. एक बाँझ पेंच शीर्ष 2 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक फिल्टर टुकड़ा प्लेस और प्रक्रिया धारा 3.4 में विस्तृत के अनुसार डीएनए निकाल सकते हैं।
  4. प्रायोगिक और नुकीला फिल्टर से डीएनए निष्कर्षण
    नोट: फिल्टर से डीएनए निष्कर्षण के लिए, वाणिज्यिक निम्नलिखित संशोधनों के साथ निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार मिट्टी से डीएनए निष्कर्षण के लिए डिजाइन किट का उपयोग करें।
    1. प्रत्येक fil के लिएआतंकवाद नमूना (Od1-Od8), एक 0.5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में एसिड धोया कांच के मोती का एक मिश्रण तैयार करते हैं। 0.1 ग्राम ≤106 माइक्रोन की एक व्यास वाले 425-600 माइक्रोन और 0.3 ग्राम मोतियों की एक व्यास वाले मोती का प्रयोग करें।
    2. परिपत्र के प्रवाह के साथ एक जैविक कैबिनेट में, एक कीटाणुरहित 1.12 सेमी व्यास काग बोरर का उपयोग कर प्रत्येक फिल्टर नमूना पर बेतरतीब ढंग से चयनित स्थानों से तीन गोल टुकड़े काट, और उन्हें पेंच शीर्ष 2 मिलीलीटर ट्यूब में जगह है।
    3. ट्यूबों के लिए ग्लास मनका मिश्रण जोड़ें।
    4. सेल lysis बफर निकासी किट के साथ आपूर्ति की राशि निर्माता प्रोटोकॉल में संकेत के साथ, जैविक कैबिनेट में प्रत्येक ट्यूब में जोड़े।
    5. बर्फ की एक बाल्टी को तैयार है और यंत्रवत् एक मनका डिब्बा का उपयोग कोशिकाओं को बाधित।
    6. 1 मिनट के लिए मोती मारो और फिर 1 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें जगह है। पाँच बार दोहराएँ।
    7. पोस्ट-सेल कदम से किट आपूर्तिकर्ता के प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
    8. आपूर्ति की क्षालन बफर के साथ क्षालन के बाद (शामिल 10 मिमी Tris खuffer) या NFW, डीएनए उपज में सुधार करने के लिए फिर से कॉलम के माध्यम से eluted नमूना पुनः लोड।
      नोट: यदि डीएनए निष्कर्षण के रूप में एक ही दिन में विश्लेषण नहीं, नमूने -20 डिग्री सेल्सियस तक विश्लेषण पर संग्रहित किया जा सकता है।
1 "शैली =" ऊंचाई: 21px; "> Dd0
मानक सेल कमजोर पड़ने श्रृंखला की तैयारी A-
ट्यूब अंतिम सेल एकाग्रता (सेल मिलीलीटर -1) स्टैंडर्ड सेल की मात्रा (एमएल) Nuclease मुफ्त पानी की मात्रा (एमएल) कुल मात्रा (एमएल)
Od0 हेम के साथ निर्धारितगिनती चैम्बर ocytometer
Od1 10 7 कोशिकाओं मिलीलीटर की श्रृंखला के लिए eluted किया जाना चाहिए -1 20
Od2 10 -1 Od1 Od1 के 2 18 20
OD3 10 -2 Od1 Od2 के 2 18 20
od4 10 -3 Od1 OD3 के 2 18 20
Od5 10 -4 Od1 Od4 के 2 18 20
Od6 10 -5 Od1 Od5 के 2 18 20
Od7 10 -6 Od1 Od6 के 2 18 20
Od8 10 -7 Od1 Od7 के 2 18 20
रिक्त 0 0 20 20
डीएनए मानक वक्र के बी तैयारी
ट्यूब अंतिम डीएनए एकाग्रता (मिलीग्राम मिलीलीटर -1) मानक डीएनए की मात्रा (एमएल) Nuclease मुफ्त पानी की मात्रा (एमएल) कुल मात्रा (एमएल)
NanoDrop के साथ निर्धारित
डीडी 1 10 1 मिलीग्राम मिलीलीटर की श्रृंखला के लिए eluted किया जाना चाहिए -1 20
DD2 10 -1 डीडी 1 डीडी 1 के 2 18 20
DD3 10 -2 डीडी 1 DD2 के 2 18 20
Dd4 10 -3 डीडी 1 DD3 के 2 18 20
Dd5 10 -4 डीडी 1 Dd4 के 2 18 20
DD6 10 -5 डीडी 1 Dd5 के 2 18 20
DD7 10 -6 डीडी 1 DD6 के 2 18 20
DD8 10 -7 डीडी 1 DD7 के 2 18 20
रिक्त 0 0 20 20

तालिका 2:। डीएनए मानक वक्र स्टैंडर्ड सूक्ष्मजीव सेल कमजोर पड़ने श्रृंखला (ए) मानक सेल की मात्रा, NFW मात्रा, और प्रत्येक कमजोर पड़ने ट्यूब में कुल मात्रा के लिए विस्तृत। डीएनए मानक वक्र तैयारी (बी), मानक डीएनए मात्रा NFW मात्रा, और प्रत्येक कमजोर पड़ने ट्यूब में कुल मात्रा के लिए विस्तृत।

  1. डीएनए मानक वक्र तैयारी ब्याज की सूक्ष्मजीव (Dd0) एक ही प्रक्रिया 3.4 कदम में प्रयोगात्मक फिल्टर के लिए वर्णित के रूप में उपयोग करने का एक नमूना मानक से सीधे डीएनए निकालें।
  2. 260 एनएम पर मानक डीएनए नमूना (Dd0) के डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें।
  3. नौ बाँझ 0.5 मिलीलीटर ट्यूबों जिसमें से एक डीएनए मानक वक्र तैयार करने के लिए, के रूप में तालिका 2 बी में दिखाया तैयार करें।
  4. यदि आवश्यक हो, 20 μl की कुल मात्रा में 1-10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 पहली ट्यूब (डीडी 1) में की एकाग्रता सीमा के भीतर करने के लिए मानक डीएनए समाधान Dd0 पतला।
  5. NFW के 18 μl dd2-DD8 और खाली ट्यूब के लिए 20 μl ट्यूबों के लिए जोड़ें।
  6. स्थानांतरण dd2 में डीडी 1 से मानक डीएनए समाधान के 2 μl। Pipet धीरे मिश्रण करने के लिए और फिर DD3 को dd2 से 2 μl हस्तांतरण। एक ही तरीके से डीएनए गिराए जारी साथ ट्यूब एक खाली ट्यूब containi के साथ मिलकर की 10 0 -10 एक धारावाहिक कमजोर पड़ने -7 ट्यूबों में dd2-DD8 प्राप्त करने के लिएएनजी केवल NFW।
    नोट: यदि -20 डिग्री सेल्सियस तक विश्लेषण पर निकासी के एक ही दिन पर विश्लेषण नहीं, स्टोर नमूने हैं।
  • मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण
    1. अग्रिम में क्यू पीसीआर साधन पर स्विच गर्म करने के लिए।
    2. एक नया प्रोग्राम फाइल में, क्यू पीसीआर साधन ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर में चलाने के लिए विवरण के रूप में 3 टेबल में विस्तृत डालें।
      नोट: विभिन्न उपकरणों के प्रत्येक थर्मल चक्र कदम के लिए अलग इष्टतम समय है। इस इनपुट के साधन के मैनुअल में निर्दिष्ट किया जाता है।
    3. सतह डीएनए decontaminant के साथ काम की सतह कीटाणुरहित और केवल बाँझ ट्यूब, टिप्स, और अभिकर्मकों के साथ काम करते हैं।
    4. काम बेंच के बगल में बर्फ की एक बाल्टी तैयार करें। बर्फ पर स्टोर Taq-पोलीमर्स मिश्रण।
    5. प्रतिक्रिया कुओं कि थाली में कब्जा हो जाएगा की कुल संख्या की गणना। अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं के लिए सैद्धांतिक भत्ता (5%) और कुल reactio गणना करने के लिए प्रतिक्रिया प्रति मात्रा से प्रतिक्रियाओं की संख्या गुणा बढ़ेn मात्रा।
    6. NFW, प्राइमरों, जांच, और अंत में Taq पोलीमरेज़ मिश्रण से शुरू, पूल प्रतिक्रिया मिश्रित तैयार करें। तालिका 4 में मिश्रित पूल के लिए मात्रा की गणना के लिए उदाहरण देखें।
    7. अंधेरे में प्रतिक्रिया मिश्रण और बर्फ पर उपयोग करें जब तक स्टोर।
    8. triplicates में क्यू पीसीआर microplate में कुओं के अंदर मानक डीएनए, डीएनए नमूना, या NFW (एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) की 1 μl रखें।
    9. सुनिश्चित करें कि प्लेट यह काम की सतह को छूने से रोकने के लिए और इसे साफ रखने के लिए एक प्लेट धारक में है।
    10. अच्छी तरह से प्रत्येक प्रतिक्रिया में मिश्रित पूल (तालिका 4) के 9 μl जोड़ें।
    11. ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली कवर और सभी पक्षों से कस कर इसे सील।
    12. नीचे की थाली एक अपकेंद्रित्र में थाली बाल्टी के साथ 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर क्यू पीसीआर डिवाइस में रखने से पहले स्पिन।
    13. साधन में थाली प्लेस और चल रहे कार्यक्रम को सक्रिय करें।
  • पैरामीटर विवरण टिप्पणियाँ
    पता लगाने की विधि मात्रात्मक हाइड्रोलिसिस जांच
    थर्मल साइकिल चालन की स्थिति
    प्रारंभिक विकृतीकरण और एंजाइम सक्रियण 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस
    विकृतीकरण 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस 45 बार दोहराने
    एनीलिंग और विस्तार 60 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस
    प्लेट सरणी
    मानक वक्र डीडी 1 - DD8 शीर्ष 3 पंक्तियों में 1-8 कुओं में कमजोर पड़ने के प्रति 3 दोहराता
    गैर-टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) Nuclease मुफ्त पानी (NFW) 9 में 3 दोहराता वें अच्छी तरह से शीर्ष3 पंक्तियों।
    विश्लेषण के नमूने डीएनए फिल्टर से निकाला शेष कुओं पर नमूना प्रति 3 दोहराता है।
    प्राइमर सेट प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति
    नमूना मात्रा 10 मिलीलीटर

    तालिका 3:। क्यू पीसीआर ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के लिए विवरण विश्लेषण मापदंडों का विवरण क्यू पीसीआर प्रोग्राम फाइल में दर्ज किया है।

    अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम (एमएल) प्रतिक्रियाओं की संख्या त्रुटि के लिए भत्ता(5%) कुल मात्रा का मिश्रण (एमएल)
    Taq पोलीमरेज़ मिश्रण 5 50 52.5 262.5
    एफ प्राइमर (10 मिमी) 0.5 50 52.5 26.25
    आर प्राइमर (10 मिमी) 0.5 50 52.5 26.25
    Nuclease मुफ्त पानी 3 50 52.5 157.5
    डीएनए - 1 मिलीलीटर 96 थाली में लक्ष्य कुओं में सीधे जोड़ दिया जाएगा।

    टेबल 4:। मात्रात्मक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण गणना प्रतिक्रिया प्रति वॉल्यूम, प्रतिक्रियाओं की संख्या, भत्ता त्रुटि के लिए, और कुल गणना की मात्रा अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जा करने के लिए विस्तृत रहे हैं।

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    Representative Results

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    यह "बंद लाइन" जांचा फिल्टर का विश्लेषण का उपयोग कर वायुमंडलीय एयरोसौल्ज़ अध्ययन करने के लिए आम बात है (देखें चित्र 2) 32 रासायनिक बात जैविक (जैसे प्रोटीन, हाइड्रोकार्बन के अणु, saccharides) और अकार्बनिक (जैसे धातु, लवण) शामिल सामग्री जांचा का विश्लेषण करती है। । जैविक विश्लेषण व्यवहार्य और अलाभकारी सूक्ष्मजीव सामग्री, प्रजातियों की पहचान एक डीएनए दृष्टिकोण या माइक्रोस्कोपी का उपयोग, साथ ही डीएनए आधारित मात्रा का ठहराव शामिल हैं।

    चित्र 2
    चित्रा 2: फाइलर नमूना विश्लेषण के प्रवाह चार्ट एयर नमूने (ए) के बाद फिल्टर, नीचे की ओर विश्लेषण (बी), और नमूना घटकों (सी) के विश्लेषण के लिए फिल्टर की तैयारी।।

    ई = "1"> endotoxin निकासी के लिए, फिल्टर उप नमूने (1.12 सेमी 2) कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर PFW में हिल रहे हैं। नमूने तो पर 375 x जी 10 मिनट के लिए centrifuged हैं। विभिन्न centrifugation गति, विभिन्न निकासी क्षमता में परिणाम कर सकते हैं के रूप में चित्रा 3 ए में संकेत दिया।

    निकासी दक्षता के लिए एक प्रारंभिक परीक्षा विशिष्ट फिल्टर चुना और प्रोटोकॉल प्रदर्शन के लिए आयोजित किया जाना चाहिए। चित्रा 3 बी में, उच्च निकासी क्षमता जांचा क्वार्ट्ज फिल्टर के साथ तुलना में साफ spiking से प्राप्त कर रहे हैं, और इन क्षमता के दोनों मानक समाधान के प्रत्यक्ष पता लगाने के माध्यम से हासिल की तुलना में कम कर रहे हैं। के रूप में कहीं चर्चा की, फिल्टर पर जांचा परिवेश एयरोसौल्ज़ की प्रकृति भी endotoxin निकासी क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। 14,33

    g3.jpg "/>
    चित्रा 3: endotoxin निकासी दक्षता endotoxin निकासी दक्षता पर centrifugation गति (ए) और फिल्टर लोड (बी) का असर।। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    endotoxin मानक, नमूना निकाले endotoxins, या रिक्त स्थान के लिए लाल अभिकर्मक की: 1 के अनुपात endotoxin का पता लगाने के लिए एक प्रतिक्रिया 1 शामिल है। यह नमूना विश्लेषण के लिए triplicates का उपयोग करने की सिफारिश की है। हालांकि, मानक घटता के लिए, डुप्लिकेट पर्याप्त हैं। अवशोषण रीडिंग (405 एनएम) पूरा कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) यह डेटा के आगे के विश्लेषण के लिए एक डेटा विश्लेषण स्प्रेडशीट कार्यक्रम में निर्यात करने के बाद विश्लेषण किया है।

    endotoxin निकासी के रूप में, यह विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों के तहत डीएनए निष्कर्षण दक्षता का एक प्रारंभिक विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक टुकड़ा फिल्टर से कटौती पर एक मानक जीव सेल के समाधान के लिए एक ज्ञात राशि spiking, डीएनए निष्कर्षण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए किया जाता है।

    लक्ष्य सूक्ष्मजीव जांचा एयरोसौल्ज़ से निकाला की एकाग्रता क्यू पीसीआर का उपयोग निर्धारित होता है। यहाँ हाइड्रोलिसिस जांच तकनीक का इस्तेमाल किया जाता है, जो टेम्पलेट डीएनए जांच के लिए बाध्य अतिरिक्त की वजह से, उच्च विशिष्टता का लाभ दिया है। 35 SYBR हरी विधि भी इस उद्देश्य के लिए लागू किया जा सकता है।

    कैलिब्रेशन घटता ब्याज के चुने हुए जीवों से निकाले डीएनए से निकाली गई है, निकासी ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर। प्रतिक्रिया यौगिकों के एक मिश्रित पूल, डीएनए नमूने, मानक, या नियंत्रण को छोड़कर, तैयार है और अंधेरे में और बर्फ पर रखा जब तक आवश्यक है। फिर, मिश्रित पूल के एक विभाज्य एक 96 microwell ऑप्टिकल थाली में अच्छी तरह से प्रत्येक में जोड़ा जाता है। डीएनए मानक, नमूना, या नियंत्रण प्लेट सरणी के अनुसार प्रतिक्रिया मिश्रण के बाद कहा है। बाद सभी अभिकर्मकों थाली में डाला गया है, यह समुद्र हैएक ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के साथ नेतृत्व किया और कुओं के तल पर सभी बूंदों को इकट्ठा करने के लिए नीचे घूमती है। प्लेट थर्मल चक्र प्रवर्धन और संकेत का पता लगाने के लिए Q-पीसीआर साधन में डाला की तुलना में है।

    उत्पादन के आंकड़ों पीसीआर सीटी मूल्यों, जो चक्र संख्या, जिस पर परिलक्षित डीएनए राशि दहलीज स्तर तक पहुँच के रूप में परिभाषित कर रहे हैं से मिलकर बनता है। अंशांकन वक्र मूल्यों का प्रयोग, लक्ष्य डीएनए की एकाग्रता प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 4 देखें)। 36 सूक्ष्मजीव के सेल सांद्रता निकासी दक्षता मानक जीव समाधान की एक hemocytometer गिनती के साथ तुलना की सीटी मूल्यों से गणना की जा सकती है। 37

    चित्रा 4
    चित्रा 4: मात्रात्मक पीसीआर प्रवर्धन साजिश (ए) और calibrat।आयन लेकर 2 -4 के बीच x 10 x 10 -2 2 (बी) के प्रतिनिधि ग्राम नकारात्मक जीवाणु के डीएनए के लिए प्रदर्शन वक्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

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    इस काम फिल्टर पर एकत्र एयरोसोल नमूनों में दोनों endotoxins और डीएनए वर्तमान बढ़ाता के लिए निष्कर्षण और तरीकों का पता लगाने का वर्णन है। तरीकों सटीक दिनचर्या की आवश्यकता होती है और जब तक experimentalist यहाँ पर चर्चा के लिए कुछ जरूरी और महत्वपूर्ण बिंदुओं का पालन करता है के रूप में आसानी से किया जा सकता है।

    endotoxin पता लगाने के कदम के लिए, ध्यान दें कि lysate समाधान काफी चिपचिपा है और pipetting पर बुलबुले का उत्पादन करने के लिए जाता है। यह तुमको बुलबुले को दूर करने के लिए मुश्किल है, और वे microplate पाठक मूल्यों में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व। इसलिए, यह पहली थाली में और केवल यह सुनिश्चित करना कि सभी बुलबुले गायब हो गया के बाद नमूना जगह है, lysate समाधान के अलावा के साथ जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इस चरण में बुलबुला बनने से रोकने के लिए एक उपयोगी तकनीक विंदुक के साथ धीरे-धीरे काम करने के लिए, और जब कुओं में lysate draining यह सभी तरह प्रेस करने के लिए नहीं है। एक प्रतिक्रिया के रूप में तुरंत शुरू कर एक बार lysate endoto को जोड़ा जा रहा हैजिन निकालने, यह जितनी जल्दी हो सके पढ़ने शुरू करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा lysate कदम को छोटा करने के लिए, एक मल्टीचैनल पिपेट इस्तेमाल किया जा सकता है। नोट एक अतिरिक्त पूर्व ऊष्मायन 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने के कदम यह है कि वहाँ कुछ किट और प्रोटोकॉल में, के बाद यह सूक्ष्म मुंह दबाकर हंसना थाली में रखा गया है। 29 केवल इस कदम के बाद, lysate जोड़ा जा सकता है।

    Endotoxins के पर्यावरण नमूना निकासी के लिए एक महत्वपूर्ण बात नमूनों में अवरोधकों की उपस्थिति (उच्च प्रदूषण हवा के नमूने में जैसे) है। इस मामले में, कमजोर पड़ने महत्वपूर्ण हो जाता है, और झूठे वृद्धि, आम तौर पर गैर-पतला नमूना के लिए मनाया रोका जा सकता है। 38

    इसी तरह, वहाँ महत्व के कई बिंदुओं सफलता और क्यू पीसीआर का पता लगाने की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं। 1) समाधान की मात्रा बहुत छोटा है, के रूप में यदि वे अच्छी तरह से नीचे नहीं रखा जाता है, डीएनए बूंद में पानी की सामग्री वाष्पीकरण whil द्वारा कम किया जा सकताई प्लेट पर नमूनों की व्यवस्था। इस समस्या को रोकने के लिए, अच्छी तरह से नीचे डीएनए नमूने जगह है, बर्फ या ठंडा एक और मंच पर रखकर प्लेट शांत, और जितना संभव हो उतना इस कदम एश के लिए अग्रिम में सब कुछ तैयार करते हैं। 2) जब क्यू पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (तालिका 4) की तैयारी, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब फोटो-क्षरण को रोकने के लिए कवर। 3) वर्तमान प्रयोग एक 10 μl प्रतिक्रिया की तैयारी का वर्णन है। फिर भी, कुछ क्यू पीसीआर उपकरणों में, प्रतिक्रिया मात्रा 20 μl है और फिर प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा के हिसाब से गुणा किया जाता है। 4) इष्टतम थर्मल चक्र की स्थिति अलग प्राइमरों और पोलीमर्स घोला जा सकता है के लिए बदल सकते हैं। उदाहरण के लिए 39, annealing तापमान प्राइमरों के पिघलने के तापमान के आसपास पर सेट किया जाना चाहिए, और जिस पर तापमान प्रवर्धन सबसे अधिक कुशलता से होता है के रूप में अनुभव से निर्धारित किया जाता है। इस कारण से यह भी एक विश्लेषण किया क्यू पीसीआर के लिए एक अंशांकन वक्र तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण हैथाली, यह सुनिश्चित करें कि मात्रा का ठहराव सटीक है। कैलिब्रेशन घटता के रूप में अच्छी तरह से मानक-नुकीला फिल्टर एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी सेवा करते हैं, यह सुनिश्चित करें कि कोई निषेध होता है। निषेध से बचने के लिए, यह निकासी पर्यावरण के नमूनों से अवरोधकों को हटाने के लिए डिज़ाइन किया गया किट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। 5) इस प्रयोग में थर्मल चक्रों की संख्या अधिकतम संख्या 45 के लिए स्थापित किया गया था, आदेश फिल्टर अर्क से डीएनए सांद्रता के रूप में संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए बहुत कम थे। 6) सुनिश्चित करें कि सीमा चक्र (Cτ) सभी डीएनए के नमूने लिए मूल्यों अंशांकन वक्र के गतिशील रेंज के भीतर हैं। यह भी सुनिश्चित करना है कि एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना के किसी भी प्रवर्धन कम से कम आठ चक्र डीएनए नमूनों की तुलना में अधिक है। 7) SYBR ग्रीन अभिकर्मक के साथ काम कर रहे हैं, तो यकीन है कि कोई प्रतिक्रिया प्रति कई पिघलने के तापमान चोटियों देखते हैं कि सुनिश्चित करें।

    turbidimetric परीक्षण के लिए, दो endotoxin मात्रा का ठहराव तरीके उपलब्ध हैं: काइनेटिक विधि और endpoichromogenic विधि NT। गतिज दृष्टिकोण में, इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के रूप में, समय नमूने के लिए आवश्यक तक पहुँचने के लिए अधिक से अधिक absorbance मापा जाता है। इधर, एक छोटा नमूना प्रतिक्रिया अंतराल में एक उच्च एकाग्रता endotoxin इंगित करता है। समापन बिंदु chromogenic विधि में, प्रकाश अवशोषण एक परिभाषित ऊष्मायन समय endotoxin एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद मापा जाता है। दोनों तरीकों मात्रा का ठहराव के लिए एक मानक अंशांकन वक्र की आवश्यकता होती है। 40

    हालांकि सटीक और endotoxin निकासी के ऊपर वर्णित की सटीकता बहुत अधिक है, 14 निकासी दक्षता में सुधार किया जा सकता है। यह संभव है कि निष्कर्षण प्रक्रिया करने के लिए फिल्टर का एक अलग प्रकार या एक साबुन के अलावा (जैसे Polysorbate 20) के रूप में फिल्टर से निकाला endotoxin की उपज में सुधार हो सकता है। Endotoxin निकासी दक्षता भी फिल्टर पर समानांतर में जांचा अलग कणों से प्रभावित किया जा सकता है। 33 हमारे प्रयोगात्मक सेटअप के लिए,पता लगाने की विधि की सीमा 14 मीटर -3 0,001 यूरोपीय संघ के होने का अनुमान है।

    डीएनए निकालने कि क्यू पीसीआर के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकता बढ़ाता के लिए तकनीक क्लोनिंग दृष्टिकोण और डिजिटल छोटी बूंद पीसीआर (डीडी पीसीआर) शामिल हैं। प्रजातियों की पहचान के लिए क्लोनिंग दृष्टिकोण पर क्यू पीसीआर का लाभ अपने अधिक से अधिक संवेदनशीलता रहे हैं और यह प्रारंभिक प्रवर्धन कदम के लिए एक कम डीएनए एकाग्रता की आवश्यकता है। इसके अलावा, क्यू पीसीआर, क्लोनिंग विधि है, जो श्रम प्रधान और समय लेने वाली है के विपरीत, मात्रात्मक नहीं है। डीएनए निकालने की मात्रा का ठहराव के लिए एक वैकल्पिक तरीका डीडी पीसीआर है। 19 इस तकनीक का लाभ यह है कि यह एक अंशांकन वक्र के रूप में पता लगाने के लिए प्रत्येक छोटी बूंद में एक डीएनए तनाव पर आधारित है की आवश्यकता नहीं है, है। हालांकि, पर्यावरण के नमूनों के लिए, कोई विश्वसनीय विधि अब तक फिल्टर से निकाले डीएनए की छोटी बूंद-पता लगाने के लिए मौजूद है।

    दक्षता डीएनए के साथ जो मंगलवार निकाला जाता हैओम फिल्टर, साथ ही सटीकता और डीएनए माप की परिशुद्धता, इस तरह के फिल्टर प्रकार, लक्ष्य सूक्ष्मजीवों, और इंस्ट्रूमेंटेशन। 34,41 जैसे कारकों इसलिए यह नमूना विश्लेषण करने से पहले परिभाषित किया जाना चाहिए से प्रभावित किया जा सकता है। हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में, पता लगाने की सीमा 3.5 मीटर जीनोम -3 के लिए नीचे पहुँच सकते हैं। 14

    समाप्त करने के लिए, विधि यहाँ वर्णित पहचान और दोनों मानवीय और प्राकृतिक स्रोतों से हवा नमूना जैविक प्रजातियों की मात्रा का ठहराव के लिए लागू है। उचित परख के सटीक उपयोग सक्षम बनाता है जटिल पर्यावरण सवालों के मूल्यवान अन्वेषण का कार्य किया जाना है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Endotoxins और डीएनए सामग्री के लिए एयर फिल्टर नमूना विश्लेषण
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    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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