Abstract
la ricerca di aerosol all'aperto comunemente utilizza il particolato di campionamento su filtri. Questa procedura permette diverse caratterizzazioni di particelle raccolte da eseguire in parallelo. Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un'analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. L'estrazione di alto peso molecolare molecole organiche, come lipopolisaccaridi, da filtri campione comporta agitando il campione in un mezzo a base di acqua apirogena. La successiva analisi si basa su una reazione enzimatica che può essere rivelato utilizzando una misurazione turbidimetrico. Come risultato di elevato contenuto organico sui filtri campione, l'estrazione del DNA da campioni viene effettuata usando un kit di estrazione del DNA commerciale che è stato originariamente progettato per suoli e modificato per migliorare la resa DNA. L'individuazione e la quantificazione delle specie microbiche specifici utilizzando riatti a catena della polimerasi quantitativaon (q-PCR) sono descritti e confrontati con altri metodi disponibili.
Introduction
Campionamento dell'aria sui filtri è uno strumento fondamentale nella ricerca aerosol atmosferico. 1 I filtri campionati sono il punto di partenza per varie chimiche, fisiche, e caratterizzazioni biologiche delle particelle ambientali raccolti. 2-11 Il vantaggio di questo approccio è che varie analisi possono essere eseguito off-line sullo stesso campione. Compilare i dati provenienti da tutte le diverse analisi permette al ricercatore di ottenere una buona comprensione delle caratteristiche delle particelle raccolte e aiuti a risolvere questioni complesse nel campo delle scienze atmosferiche. 12,13 Per esempio, marine ed interne aria-campioni prelevati durante la stessa periodo può essere confrontata rispetto alla tossicità particelle campionata e composizione biologica. 14 per questo studio, lipopolisaccaridi (LPS), componenti batteriche pareti cellulari gram-negativi, noto anche come endotossine, sono stati estratti dai filtri campionata on-shore ea un sito interno, e sono stati valutati utilizzando ilLimulus lisato di amebociti (LAL). In parallelo, una valutazione genomica della carica batterica (batteri totali, gram negativi, e cianobatteri) è stata eseguita sullo stesso campione usando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (q-PCR). Il test LAL si basa su misure di torbidità formate in seguito all'aggiunta di un estratto acquoso di amebociti dal limulo, Limulus polyphemus, ad una soluzione acquosa contenente le endotossine. Maggiore è la concentrazione di endotossina nel campione, la torbidità veloce sviluppa. 15 L'analisi q-PCR si basa su un segnale di fluorescenza emessa da uno specifico frammento di DNA amplificato. 16 Con il monitoraggio in tempo reale del segnale durante la fase esponenziale della PCR reazione e calibrazione con una curva standard, l'importo iniziale di DNA possono essere quantificati. La combinazione di queste due analisi insieme ad altri, come descritto altrove, 14 possono fornire una buona stima dei livelli di endotossina equantità di batteri di origine nei campioni.
Lo scopo del metodo qui presentato è quello di ottenere un'analisi molto accurata e affidabile della endotossina e DNA contenuto di bio-aerosol estratte dai filtri. Mentre i metodi per il campionamento delle caratteristiche chimico fisiche ed inorganici aerosol sono ben noti e, più recentemente, sono stati sviluppati metodi per indagare sua componente materia organica, 17 vi è stata la ricerca scarsa sulla componente biologica di aerosol. 18 Il razionale per la corrente il metodo è quello di affrontare questa lacuna presentando in dettaglio un metodo robusto per l'estrazione, l'analisi e l'identificazione la frazione biologica di aerosol nell'aria. 14
Il metodo descritto qui è prevista per trovare impiego diffuso in progetti di ricerca biologica per interni ed esterni di aerosol che coinvolgono l'analisi del filtro. 20-24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Un elenco dettagliato di tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo è mostrato nella sezione Materiali.
1. Aria di campionamento su filtri
- Preparazione di filtri
- Per il campionamento ad alto volume, utilizzare 20,3 x 25,4 centimetri 2 filtri. Scegliere il tipo specifico di filtro che meglio si adatta alle esigenze di ricerca, così come le dimensioni del filtro cut-off, se applicabile. 1 Qui, filtri in microfibra uso di quarzo.
- filtri pre-cuocere per il prelievo del composto organico e biologico per distruggere residui organici. Per pre-cuocere i filtri, avvolgerli singolarmente in foglio di alluminio e poi cuocere in forno laboratorio a 450 ° C per almeno 5 ore.
- Conservare i filtri forno a -20 ° C fino al campionamento.
- Manipolazione strumento e campionamento dell'aria
- Pulire polvere residua dalla testa del campionatore ad alto volume. Pulire le parti con salviette di carta puliti e consentire loro di befo asciugarere ricollegarli al campionatore.
- Disinfettare la cassetta del filtro con etanolo, e lavorare con i guanti e un camice da laboratorio in ogni momento.
- Mettere un filtro pre-cotto all'interno della cassetta filtro pulito, e procedere secondo il manuale campionatore ad alto volume.
- Segnare la data e le eventuali condizioni atmosferiche particolari, se del caso (ad esempio pioggia, polvere tempesta) sulla avvolgere in alluminio, e salvarlo in un luogo pulito fino al completamento del campionamento.
- Raccogliere il filtro campionato e piegarlo a metà, con il lato rivolto verso l'interno campionato.
- Avvolgere il filtro nel sacchetto originale e conservare a -20 ° C fino all'analisi.
Nota: Se l'intervallo di tempo tra il campionamento e analisi è più di 2 mesi, conservare il campione a -80 ° C per evitare la degradazione del materiale organico e biologico.
Analisi 2. Endotossina
Nota: Disinfettare il piano di lavoro con il 70% di etanolo unlavoro d con apirogeni tubi, consigli e reagenti solo. Se si utilizzano oggetti di vetro, è necessario pre-riscaldamento a 250 ° C per 30 minuti, o 200 ° C per 60 min. 25 preparare tutti i reagenti in una classe II armadietto biosicurezza e lavorare con i guanti e un camice da laboratorio in ogni momento.
- Preparazione dei reagenti
- Seguire il protocollo del produttore kit di LAL per reidratare il lisato poco prima dell'uso. 26 Toccare delicatamente il flacone per rimuovere LAL rimanendo sulle pareti della bottiglia. Sollevare delicatamente il tappo per rompere il vuoto. Utilizzando una siringa agugliato, aggiungere 5 ml di acqua priva di pirogeni (PFW) al flaconcino per reidratare tutti i contenuti lisato e mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
- Sigillare la fiala con il film di paraffina plastica quando non in uso e conservare a 4 ° C per un massimo di due giorni. Conservare la lisato rimanendo a -20 ° C per un massimo di tre mesi.
Nota: Questo reagente può essere congelato una sola volta. - Reidratare il controllo di endotossina standard (CSE), che contiene 0,5 μ; g E. coli, in accordo con il protocollo del produttore. 27 determinare la quantità specifica di acqua da aggiungere al flaconcino CSE dal sito del produttore 28 inserendo il numero di lotto per il kit dove specificato sul sito. La concentrazione finale di E. coli nel flaconcino, viene misurata in unità di endotossine (UE, dove 10 EU = 1 ng). Etichettare questo flacone ED0.
- Sigillare la fiala CSE con il film di paraffina plastica quando non in uso e conservare a 4 ° C per un massimo di 4 settimane.
- Curva standard e preparazione spillo-filtro
- In un armadio biosicurezza di classe II, preparare 22 2 ml provette da centrifuga apirogena, contenenti decreasing quantità di CSE (tubi Ed1-ED11) o nessuna CSE (il tubo bianco contenente solo PFW) per produrre una serie di diluizioni di endotossina duplicato, come mostrato nella Tabella 1.
- In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare 22 pezzi circolari di filtro pulito, pre-cotta utilizzando una disinfettata 1.1 2 centimetri di diametro sughero piralide.
- Mettere le coppie di filtro in piastre Petri sterili.
- Spike 50 ml da ciascun membro della serie di diluizioni endotossine Ed2-ED11 e dal tubo vuoto su una corrispondente coppia di filtri.
- Lasciare le piastre Petri contenenti filtri a spillo aperte sotto il cofano asciugare per 30 min.
- Mettere ogni pezzo di filtro in un tubo apirogena 2 ml.
| Tubo | Concentrazione di endotossina finale (UE ml -1) | Volume di endotossine standard (ml) | Pyrogen volume di acqua libera (ml) | volume totale (ml) | eD0 | 2.500 | soluzione madre* | 5 |
| ED1 | 1.000 | 80 (da ED0) | 120 | 200 |
| ED2 | 100 | 20 (da Ed1) | 180 | 200 |
| ED3 | 50 | 10 (da Ed1) | 190 | 200 |
| ED4 | 25 | 5 (da Ed1) | 195 | 200 |
| ED5 | 12.5 | 2,5 (da Ed1) | 197,5 | 200 |
| ED6 | 6.25 | 1.25 (da Ed1) | 198.75 | 200 |
| ED7 | 3.125 | 6.25 (da Ed2) | 193,75 | 200 |
| ED8 | 1.563 | 6.25 (da Ed3) | 193,75 | 200 |
| ED9 | 0,781 | 6.25 (da ED4) | 193,75 | 200 |
| ED10 | 0,391 | 6.25 (da ED5) | 193,75 | 200 |
| ED11 | 0,195 | 6.25 (da ED6) | 193,75 | 200 |
| vuoto | 0 | 0 | 200 | 200 |
Tabella 1:. Endotossina standard Curve concentrazione di endotossina, il volume di endotossina standard e di acqua apirogena da aggiungere, e il volume totale ottenuto è dettagliato per ogni provetta di diluizione nella curva di calibrazione.
- L'endotossina estrazione dalla Sperimentale e Filtri Spiked
- In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare i filtri campione (dal punto 1.2) in pezzi circolari utilizzando un disinfettato 1,12 centimetri di diametro sughero piralide, e metterli, insieme con i filtri standard spillo (dal punto 2.2), in 2 apirogeno tubi ml (ad esempio, i tubi campione).
- Aggiungere 1 ml PFW ai tubi e agitare per 60 min a temperatura ambiente, utilizzando un agitatore di laboratorio.
- Centrifugare le provette per campioni in una microcentrifuga a 375 xg per 10 min. 29
- esimo di trasferimentoe surnatante, che contiene le endotossine, in una nuova provetta apirogena 2 ml.
- Limulus lisato di amebociti (LAL)
- Determinare la concentrazione di endotossina nei campioni eseguendo il test LAL in apirogena micropiastra a 96 pozzetti a fondo piatto e un coperchio.
- Pianificare la matrice piatto in anticipo, come mostrato in Figura 1. Include una curva standard preparata direttamente da soluzioni standard endotossine Ed2-ED11 (e quindi che coprono l'intervallo di concentrazione di 100-0.195 UE / ml (vedi sezione 2.2)) in ogni piatto in esecuzione . La curva standard dovrebbe occupare pozzetti 1-10 di righe A e B della piastra. Annullare pozzi 11-12 in queste righe per campioni bianchi (per un totale di quattro spazi).
- Accendere il lettore di micropiastre e programmare una reazione cinetica coinvolge incubazione della micropiastra a 37 ° C e agitando ogni 5 minuti, seguito da misure di assorbimento a 405 nm. Ripetere 18 volte per 1,5 ore.
- Determinare il efficienzecy con cui le endotossine sono estratti dai filtri campione (cioè., i campioni ottenuti dai filtri standard spillo) tramite divisione dell'importo endotossina calcolato in base al valore originale spillo.
- Avviare il test mettendo 50 ml di soluzioni di endotossina standard (dal punto 2.4.2), o dell'estratto del filtro a spillo e dei suoi spazi (da sezione 2.3), o dei campioni sperimentali e dei suoi spazi (anche da sezione 2.3), come da previsto plate-array (figura 1) e chiudere il coperchio.
- Per ogni bene, aggiungere rapidamente 50 ml di soluzione di LAL, e agitare delicatamente la piastra orizzontale mentre è posta sul tavolo prima di sollevare nel lettore.
- Posizionare la piastra nel lettore di piastre e iniziare la corsa sperimentale.
Figura 1:. Piastra serie Endotossina Un exampia di un array analisi endotossina in una micropiastra a 96 pozzetti.
3. analisi genomica
Nota: per l'estrazione del DNA, disinfettare la superficie di lavoro con il 70% di etanolo e lavorare con provette sterili, consigli e reagenti solo. Per l'analisi q-PCR del DNA, disinfettare la superficie di lavoro con la superficie del DNA-decontaminante. Preparare tutti i reagenti in un armadio biosicurezza di classe II e lavorare con i guanti e un camice da laboratorio in ogni momento.
- Preparazione dei primer DNA e Sonde
- Prima di estrazione del DNA, sia fine un insieme disponibile in commercio di primer e una sonda (se viene applicato il metodo di sondaggio idrolisi), progettare un nuovo set di primer ed una sonda con innesco progettazione di strumenti computazionali. 30
- Reidratare il primer secondo il protocollo del produttore utilizzando 10 mM Tris-0,1 acido mM etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone TE) o acqua PCR-grade.
Nota: Si consiglia di sciogliere il PCR Primer iniziale stock in tampone TE con bassa EDTA (0,1%) in quanto impedisce la degradazione Primer, conservato per tempi più lunghi. Utilizzare acqua PCR-grade per diluizioni successive per ridurre quantità EDTA che potrebbero inibire le reazioni PCR. - Preparare aliquote di 50 ml o 100 ml di primer e sonda in sterili da 0,5 ml tubi e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
- La valutazione delle cellule concentrazione standard Prima di DNA Extraction
- In una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate, preparare una soluzione cella standard delle specie microbiche di interesse (tubo Od0, Ping-2A). Mescolare la sospensione cellulare pipettando su e giù nel tubo 7-10 volte con una pipetta con un piccolo foro.
- Se le cellule sono di colore (ad esempio alcuni spore fungine), non eseguire una procedura di colorazione. Se è richiesta colorazione della cellula, diluire la sospensione cellulare in un colorante adatto rilevazione microscopica delle cellule di interesse. 31
- Pulire il vetrino e hemocytometer con etanolo. Inumidire e apporre la polizza di copertura al emocitometro.
- Caricare circa 8 ml di sospensione cellulare in entrambe le camere emocitometro toccando con cura il bordo del vetrino con la punta della pipetta e riempiendo la camera per capillarità. Non sopra / sotto riempire la camera.
- Determinare il numero di cellule da loro la visualizzazione al microscopio a 400X ingrandimento (40X in oggettiva e 10X in oculare). Nove piazze misura 1 x 1 mm 2 e disposte in una griglia 3 x 3 dovrebbero essere visti. Primo il microscopio su una delle quattro caselle d'angolo della griglia (un ingrandimento maggiore può essere utilizzato). Il 2 mm quadrato 1 x 1 deve contenere 16 quadrati più piccoli.
- Contare le cellule nelle quattro 1 x 1 mm 2 piazze angolari, nonché nel quadrato centrale della griglia 3 x 3. Se ci sono troppi o troppo poche cellule per contare, ripetere la procedura, sia di concentrazione o diluire la sospensione cellulare originale a seconda dei casi (15-50 cellule devono sovrapporre una zona individuando 1 millimetro 2).
- Calcolare la concentrazione delle cellule (cellule ml -1) nella sospensione cellulare standard Od0 dalla cella conteggio media di tutti i cinque quadrati contati come segue: Cell count ml -1 = cella medio conteggio quadrato -1 Fattore di diluizione 10 4.
- Valutazione del DNA Extraction efficienza
- Preparare nove sterili da 0,5 ml tubi in base alla tabella 2A.
- Diluire la soluzione cella standard (Od0) per contenere circa 10 7 cellule ml -1 in un volume totale di 20 microlitri (OD1).
- Aggiungere 18 ml di acqua sterile PCR-grade priva di nucleasi (NFW) ai tubi OD2-OD8 e 20 l per il tubo vuoto, Od9.
- Trasferimento 2 ml di soluzione di cellule da OD1 in OD2. Pipetta delicatamente per mescolare e trasferire 2 ml di tubo di OD2 a OD3. Continuare diluendo le celle nello stesso modo lungo i tubi fino al tubo OD8 di obtain una diluizione seriale di 10 7 -10 0 cellule ml -1.
- In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare 18 pezzi circolari di filtro pulito, pre-cotta, utilizzando una disinfettata 1,12 centimetri di diametro sughero piralide. Mettere i filtri in coppie in piastre Petri sterili.
- Spike 10 microlitri da diluizioni OD1 a OD8 e dal vuoto tubo Od9 su ciascuno dei filtri accoppiati, in modo tale che vi è una coppia di filtri corrispondente a ciascuna concentrazione cellulare standard.
- Lasciare le piastre di Petri aperti sotto il cofano e lasciarli asciugare per 30 minuti.
- Mettere ogni pezzo filtro in un tappo a vite 2 ml provetta sterile ed estrarre il DNA secondo la procedura descritta nella sezione 3.4.
- Estrazione del DNA dal Sperimentale e Filtri Spiked
Nota: per l'estrazione del DNA da filtri, utilizzare kit commerciali progettati per l'estrazione del DNA dal suolo secondo il protocollo del produttore con le seguenti modifiche.- Per ogni filter del campione (OD1-OD8), preparare una miscela di perle di vetro lavata con acido in una provetta sterile 0,5 ml. Utilizzare 0,1 g perline aventi un diametro di 425-600 micron e 0,3 g perline di diametro ≤106 micron.
- In un armadio biologica con flusso circolare, tagliare tre pezzi circolari da luoghi selezionati casualmente per ogni campione filtro con un disinfettata 1,12 centimetri di diametro sughero piralide, e metterli in tappo a vite 2 ml tubi.
- Aggiungere il composto perle di vetro ai tubi.
- Aggiungere la memoria di cella-lisi fornito con il kit di estrazione a ciascun tubo nel mobile biologica, con l'importo indicato nel protocollo del produttore.
- Preparare un secchio di ghiaccio e distruggere le cellule meccanicamente con un battitore tallone.
- Battere le perline per 1 minuto e poi metterli in ghiaccio per 1 min. Ripeti cinque volte.
- Procedere con il protocollo del fornitore corredo dalla fase di post-lisi.
- Dopo l'eluizione con tampone di eluizione in dotazione (contiene 10 mM Tris bUffer) o NFW, ricaricare il campione eluito attraverso la colonna di nuovo per migliorare la resa del DNA.
Nota: Se non analizzato lo stesso giorno come l'estrazione del DNA, i campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'analisi.
| A- Preparazione di standard Serie cellulare diluizione | ||||
| Tubo | Concentrazione cellulare finale (ml -1 cellulare) | il volume delle cellule standard (ml) | volume di acqua priva di nucleasi (ml) | Volume totale (ml) |
| Od0 | determinare con orloocytometer camera di conteggio | |||
| OD1 | dovrebbe essere eluito alla gamma di 10 7 cellule ml -1 | 20 | ||
| OD2 | 10 -1 OD1 | 2 di OD1 | 18 | 20 |
| OD3 | 10 -2 OD1 | 2 di OD2 | 18 | 20 |
| OD4 | 10 -3 OD1 | 2 di OD3 | 18 | 20 |
| OD5 | 10 -4 OD1 | 2 di OD4 | 18 | 20 |
| OD6 | 10 -5 OD1 | 2 di OD5 | 18 | 20 |
| Od7 | 10 -6 OD1 | 2 di OD6 | 18 | 20 |
| OD8 | 10 -7 OD1 | 2 di Od7 | 18 | 20 |
| vuoto | 0 | 0 | 20 | 20 |
| B- Preparazione del DNA Curva Standard | ||||
| Tubo | Concentrazione di DNA finale (mg ml -1) | Volume DNA standard (ml) | volume di acqua priva di nucleasi (ml) | Volume totale (ml) |
| determinare con NanoDrop | ||||
| DD1 | dovrebbe essere eluito alla gamma di 10 mg 1 ml -1 | 20 | ||
| DD2 | 10 -1 DD1 | 2 di DD1 | 18 | 20 |
| DD3 | 10 -2 DD1 | 2 di DD2 | 18 | 20 |
| DD4 | 10 -3 DD1 | 2 di DD3 | 18 | 20 |
| DD5 | 10 -4 DD1 | 2 di DD4 | 18 | 20 |
| DD6 | 10 -5 DD1 | 2 di DD5 | 18 | 20 |
| DD7 | 10 -6 DD1 | 2 di DD6 | 18 | 20 |
| DD8 | 10 -7 DD1 | 2 di DD7 | 18 | 20 |
| vuoto | 0 | 0 | 20 | 20 |
Tabella 2:. DNA standard Curve serie di diluizioni cella microorganismo standard (A) dettagliato del volume standard di cellule, il volume NFW, e il volume totale in ogni provetta di diluizione. DNA preparato standard curva (B), dettagliato del volume standard DNA, il volume NFW, e il volume totale in ogni provetta di diluizione.
- DNA Curva standard Preparazione
- Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la concentrazione di DNA del campione di DNA standard (DD0) a 260 nm.
- Preparare nove sterile 0,5 ml tubi che per preparare una curva standard DNA, come mostrato nella Tabella 2B.
- Se necessario, diluire la soluzione standard di DNA DD0 entro un intervallo di concentrazione di 1-10 mg ml -1 nel primo tubo (DD1) in un volume totale di 20 microlitri.
- Aggiungere 18 ml di NFW ai tubi DD2-DD8 e 20 ml al tubo vuoto.
- Trasferimento 2 ml di soluzione di DNA standard dal dd1 in DD2. Pipettare delicatamente per mescolare e poi trasferire 2 ml da DD2 a DD3. Continuare diluire il DNA nello stesso modo lungo i tubi per ottenere una diluizione seriale di 10 0 -10 -7 in tubi DD2-DD8 insieme ad un tubo vuoto containing solo NFW.
Nota: se non analizzato lo stesso giorno dell'estrazione, conservare i campioni a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
- Accendere lo strumento q-PCR in anticipo per riscaldarsi.
- In un nuovo file di programma, inserire i dettagli per il q-PCR familiare nel software dello strumento operativo come indicato nella tabella 3.
Nota: gli strumenti differenti hanno tempistica ottimale diverso per ogni fase del ciclo termico. Questo ingresso è specificato nel manuale dello strumento. - Disinfettare la superficie di lavoro con la superficie del DNA-decontaminante e funziona solo con provette sterili, consigli e reagenti.
- Preparare un secchio di ghiaccio accanto al banco di lavoro. Conservare mix Taq-polimerasi sul ghiaccio.
- Calcolare il numero totale di pozzetti di reazione che sarà occupato nella piastra. Tenere conto teorica di reazioni supplementari (5%) e moltiplicare il numero di reazioni allargata per il volume per reazione per calcolare il totale reactioil volume n.
- Preparare la piscina reazione mista, a partire dal NFW, primer, sonde, e infine il mix di Taq polimerasi. Vedere l'esempio per i calcoli di volume per la piscina mista nella tabella 4.
- Conservare la miscela di reazione al buio e in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Mettere 1 ml di DNA di serie, campione di DNA, o NFW (come controllo negativo) all'interno dei pozzetti nella micropiastra q-PCR in triplicato.
- Assicurarsi che il piatto è in un portatarga per impedirne il contatto con la superficie di lavoro e per mantenere pulito.
- Aggiungere 9 ml di piscina misto (Tabella 4) in ogni pozzetto di reazione.
- Coprire la piastra con pellicola adesiva ottica e sigillarla ermeticamente da tutti i lati.
- Spin la piastra in una centrifuga con secchi piastra per 1 min a 1000 xg prima di inserirlo nel dispositivo q-PCR.
- Posizionare la piastra nello strumento e attivare il programma in esecuzione.
| Parametro | Dettagli | Commenti |
| metodo di rilevazione | Sonda idrolisi Quantitative | |
| condizioni di cicli termici | ||
| denaturazione iniziale e attivazione di enzimi | 95 ° C per 10 min | |
| Denaturazione | 95 ° C per 15 sec | ripetere 45 volte |
| Ricottura e l'estensione | 60 ° C per 60 sec | |
| serie piastra | ||
| curva standard | DD1 - DD8 | 3 ripetizioni per diluizione in 1-8 pozzi ai primi 3 righe |
| controllo non-template (NTC) | acqua priva di nucleasi (NFW) | 3 ripetizioni in 9 ° e in cima3 file. |
| campioni analizzati | DNA estratto dai filtri | 3 ripetizioni per campione ai pozzetti rimanenti. |
| primer | per ogni bene | |
| volume del campione | 10 ml |
Tabella 3:. Dettagli per il software operativo q-PCR dettagli dei parametri di analisi da inserire nel file di programma q-PCR.
| Reagente | Volume per reazione (ml) | Numero di reazioni | Margini di errore(5%) | Mix Volume totale (ml) |
| mix Taq polimerasi | 5 | 50 | 52,5 | 262.5 |
| F Primer (10 mm) | 0.5 | 50 | 52,5 | 26.25 |
| R Primer (10 mm) | 0.5 | 50 | 52,5 | 26.25 |
| acqua priva di nucleasi | 3 | 50 | 52,5 | 157.5 |
| DNA - 1 ml sarà aggiunto direttamente nei pozzetti di destinazione nella piastra 96. | ||||
Tabella 4:. quantitativa-PCR miscela di reazione calcolo del volume per reazione, il numero di reazioni, margini di errore, e il volume totale calcolato da aggiungere nel mix di reazione per reagente sono dettagliate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
È comune per studiare aerosol atmosferici usando "off-line" analisi di filtri campione (vedere Figura 2). Analisi 32 chimica del contenuto campionato sostanza includere organica (ad esempio proteine, molecole di idrocarburi, saccaridi) ed inorganici (ad esempio metalli, sali) . analisi biologiche includono contenuti vitali e non vitali microorganismo, identificazione delle specie utilizzando un approccio DNA o la microscopia, nonché quantificazione basata sul DNA.
Figura 2: Diagramma di analisi del flusso del campione Filer filtro dopo-aria campionamento (A), la preparazione del filtro per le analisi a valle (B), e l'analisi dei componenti del campione (C)..
e = "1"> Per l'estrazione endotossina, sottocampioni filtri (1,12 cm 2) vengono agitati in 1 ml PFW per 60 min a temperatura ambiente. I campioni vengono quindi centrifugati per 10 min a 375 x g. Diverse velocità di centrifugazione possono determinare differenti efficienze di estrazione, come indicato in Figura 3A.
Un test preliminare per efficienza di estrazione deve essere condotto per il filtro specifico scelto e il protocollo eseguita. Nella Figura 3B, l'efficienza di estrazione più elevati sono ottenuti da chiodare pulita rispetto ai filtri di quarzo campionati, ed entrambi questi rendimenti sono più bassi rispetto a quello ottenuto attraverso il rilevamento diretto della soluzione standard. Come discusso altrove, la natura degli aerosol ambientali campione sul filtro può anche influenzare l'efficienza di estrazione endotossina. 14,33
g3.jpg "/>
Figura 3: endotossina efficienza di estrazione L'effetto della velocità di centrifugazione (A) e del carico del filtro (B) per l'efficienza dell'estrazione endotossina.. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La reazione di rilevamento endotossina comporta un rapporto 1: 1 di LAL reagente standard di endotossina, le endotossine campioni estratti o gli spazi vuoti. Si raccomanda di utilizzare triplicato per l'analisi del campione. Tuttavia, per le curve standard, duplicati sono sufficienti. Quando le letture di assorbimento (a 405 nm) sono stati completati, la densità ottica risultante (OD) viene analizzata dopo l'esportazione in un foglio elettronico di analisi dati per ulteriori analisi dei dati.
Come nell'estrazione endotossina, è importante effettuare un'analisi preliminare della efficienza di estrazione del DNA nelle condizioni sperimentali specifiche. Questo viene fatto spiking una quantità nota di una soluzione cellula all'organismo standard su un pezzo tagliato dal filtro, seguendo il protocollo di estrazione del DNA sopra descritto. La concentrazione del microrganismo bersaglio estratto dai aerosol campione è determinato impiegando q-PCR. Qui la tecnica sonda di idrolisi viene utilizzato, che ha il vantaggio di elevata specificità, a causa della sonda aggiuntiva legato al DNA stampo. 35 Il metodo verde SYBR può essere applicato anche per questo scopo. Le curve di calibrazione sono derivati da DNA estratto dagli organismi scelti d'interesse, utilizzando il metodo di estrazione sopra descritto. Un pool mista dei prodotti di reazione, escluso il campione di DNA, standard o controllo, viene preparata e conservata al buio e in ghiaccio fino all'utilizzo. Poi, una aliquota del pool misto viene aggiunto in ciascun pozzetto in una piastra ottica 96 micropozzetti. Lo standard di DNA, campione o controllo viene aggiunto dopo che la miscela di reazione in base alla matrice piatto. Dopo che tutti i reagenti sono stati inseriti nella piastra, è marecondotto con un film adesivo ottico e centrifugare per raccogliere tutti goccioline al fondo dei pozzetti. La piastra è quello inserito nello strumento q-PCR per l'amplificazione del ciclo termico e rilevamento del segnale. I dati di uscita sono costituiti da valori PCR Ct, che sono definiti come il numero di cicli in cui la quantità di DNA amplificato raggiunge il livello di soglia. Utilizzando i valori della curva di taratura, la concentrazione di DNA bersaglio può essere ottenuta (vedere Figura 4). 36 concentrazione cellulare del microorganismo può essere calcolato dai valori Ct della efficienza di estrazione rispetto a un conteggio emocitometro della soluzione dell'organismo standard. 37 
Figura 4: Quantitative PCR-plot di amplificazione (A) e calibrat.Curva ionico compreso tra 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) condotte per grammo rappresentante del DNA batterico negativo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo lavoro descrive i metodi di estrazione e di rilevazione per quantificare sia endotossine e DNA presente in campioni di aerosol raccolti su filtri. I metodi richiedono routine accurati e possono essere eseguiti facilmente finché sperimentatore aderisce ad alcuni punti essenziali ed importanti discussi qui.
Per la fase di rilevazione endotossine, si noti che la soluzione lisato è molto viscoso e tende a produrre bolle su pipettaggio. E 'difficile da rimuovere te bolle, e si portano a cambiamenti nei valori micropiastra-reader. Pertanto, è importante posizionare prima il campione nella piastra e solo dopo aver verificato che tutte le bolle scomparsi, proseguire con l'aggiunta della soluzione lisato. Una tecnica utile per prevenire la formazione di bolle in questa fase è quello di lavorare lentamente con la pipetta, e non premere tutto il modo durante lo scarico del lisato nei pozzetti. Come reazione inizia non appena il lisato viene aggiunto al endotoxin estratto, è essenziale per iniziare la lettura non appena possibile. Per accorciare il passo lisato Inoltre, una pipetta multicanale può essere utilizzato. Si noti che in alcuni kit e protocolli c'è una fase di pre-incubazione addizionale dei campioni a 37 ° C per 10 minuti, dopo che è disposto nella piastra micro titter. 29 Solo dopo questa fase, il lisato può essere aggiunto.
Un punto importante per l'estrazione campione ambientale di endotossine è la presenza di inibitori nei campioni (ad esempio nel campione d'aria alto inquinamento). In questo caso, la diluizione diventa critica, e può impedire falsa valorizzazione, tipicamente osservato per il campione non diluito. 38
Allo stesso modo, ci sono diversi punti di importanza per assicurare il successo e l'affidabilità del rilevamento q-PCR. 1) Poiché il volume delle soluzioni è molto piccolo, se non sono posizionati sul fondo del pozzo, il contenuto di acqua nella goccia DNA potrebbe essere ridotto mediante evaporazione while disporre i campioni sul piatto. Per evitare questo problema, inserire il campione di DNA sul fondo del pozzo, raffreddare la piastra ponendolo su ghiaccio o un'altra piattaforma raffreddamento, e preparare tutto in anticipo per accelerare questo passaggio il più possibile. 2) Quando si prepara la miscela di reazione q-PCR (Tabella 4), coprire il tubo con un foglio di alluminio per evitare fotodegradazione. 3) Il presente esperimento descrive la preparazione di una reazione 10 microlitri. Tuttavia, in alcuni strumenti q-PCR, il volume di reazione è di 20 microlitri e quindi il volume di ciascun reagente è moltiplicato conseguenza. 4) Le condizioni ottimali di ciclo termico possono cambiare per diversi primer e miscele polimerasi. 39 Ad esempio, la temperatura di ricottura dovrebbe essere fissato a circa la temperatura di fusione dei primers, ed è determinato empiricamente come la temperatura alla quale l'amplificazione si verifica più efficiente. Per questo motivo è anche importante preparare una curva di calibrazione per ciascun analizzato q-PCRpiatto, per assicurare che la quantificazione è accurato. Le curve di calibrazione e filtri standard-spillo anche servire come controllo positivo, per garantire che si verifica alcuna inibizione. Per evitare l'inibizione, si consiglia di utilizzare i kit di aspirazione progettato per rimuovere gli inibitori da campioni ambientali. 5) Il numero di cicli termici in questo esperimento è stato impostato al numero massimo, 45, al fine di aumentare la sensibilità che le concentrazioni di DNA da estratti filtri erano molto bassi. 6) Assicurarsi che i cicli di soglia (valori Cτ) per tutti i campioni di DNA sono all'interno della gamma dinamica della curva di calibrazione. Inoltre garantire che qualsiasi amplificazione di un campione di controllo negativo è almeno otto cicli superiore a quella dei campioni di DNA. 7) Se si lavora con il reagente Verde SYBR, assicurarsi che non ci sono più i picchi di temperatura di fusione per reazione.
Per il test turbidimetrico, due metodi di quantificazione di endotossine sono disponibili: il metodo cinetico e il Punto finalent metodo cromogenico. Nell'approccio cinetica, come eseguito in questo protocollo, il tempo richiesto per il campione raggiunga assorbanza massima è misurata. Qui, un intervallo più breve reazione indica una concentrazione di endotossina più elevata nel campione. Nel metodo cromogenico endpoint, assorbimento della luce viene misurata dopo un tempo di incubazione definita per determinare la concentrazione di endotossina. Entrambi i metodi richiedono una curva di calibrazione standard per la quantificazione. 40
Anche se la precisione e l'accuratezza dell'estrazione endotossina sopra descritta è molto alta, 14 l'efficacia dell'estrazione potrebbe essere migliorata. E 'possibile che un diverso tipo di filtro o l'aggiunta di un detergente (ad esempio polisorbato 20) per la procedura di estrazione potrebbero migliorare la resa di endotossina estratta dal filtro. Efficienza di estrazione endotossine può anche essere influenzato da diversi particelle campionate in parallelo sul filtro. 33 Per il nostro apparato sperimentale, lalimite del metodo di rilevazione è stimato a 0.001 m UE -3. 14
Tecniche per quantificare l'estratto DNA che potrebbe servire come alternativa a q-PCR includono approccio clonazione e gocciolina digitale PCR (DD-PCR). I vantaggi di q-PCR sulla clonazione approccio per l'identificazione delle specie sono la sua maggiore sensibilità e che richiede una concentrazione di DNA inferiore per la fase di amplificazione iniziale. Inoltre, a differenza q-PCR, il metodo di clonazione, che è laboriosa e che richiede tempo, non è quantitativa. Un metodo alternativo per la quantificazione del DNA estratto è DD-PCR. 19 Il vantaggio di questa tecnica è che non richiede una curva di taratura, come il rilevamento si basa su un unico ceppo DNA in ogni goccia. Tuttavia, per i campioni ambientali, metodo affidabile esiste finora per droplet-rilevazione di DNA estratto dai filtri.
L'efficienza con cui il DNA viene estratto from il filtro, nonché l'accuratezza e precisione delle misure di DNA, possono essere influenzate da fattori quali il tipo di filtro, microrganismi target, e strumentazione. 34,41 Pertanto, deve essere definita prima dell'analisi del campione. Nel nostro setup sperimentale, il limite di rilevazione può raggiungere fino a 3,5 m -3 genoma. 14
Per concludere, il metodo qui descritto è applicabile per l'identificazione e la quantificazione delle specie biologiche con aria campionata da entrambe le fonti antropiche e naturali. uso preciso del test appropriata consente indagini preziose di questioni ambientali complesse da intraprendere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 - High Volume Air Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series - Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 µm | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 µm | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
- Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
- Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
