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Environment

内毒素和DNA含量的空气采样滤波器分析

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

室外气溶胶的研究通常使用的过滤器采样的颗粒物。此过程使得能够并行执行所收集的颗粒的各种特征。这里提出的方法的目的是获得从过滤器中提取的生物气溶胶的内毒素和DNA含量的高度准确和可靠的分析。高的分子量的有机分子,如脂多糖,从采样滤波器的提取包括摇动在一个无热原的水性介质中的样品。随后的分析是基于可使用浊度测量来检测酶反应。作为上采样滤波器的高有机含量的结果是,使用该最初设计用于土壤和修改,以提高DNA产量市售的DNA提取试剂盒进行DNA的样​​品的提取。的检测和使用定量聚合酶链reacti特定微生物物种的量化上(Q-PCR)分析中描述并与其他可用的方法进行对比。

Introduction

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在过滤器上空气采样是在大气气溶胶研究的基本工具。1所述的取样过滤器可用于各种化学,物理和所收集的环境粒子的生物表征的起点。2-11这种方法的优点是,各种分析可离线对同一样品执行的。编译来自所有不同分析的数据使研究者获得的收集的颗粒和助剂的特性很好地理解在解决在大气科学的复杂问题。12,13例如,在相同的拍摄海洋和内陆空气采样期间可相对于所采样的颗粒的毒性和生物组合物。14本研究进行比较,脂多糖(LPS),对革兰氏阴性细菌细胞壁,也被称为内毒素组分,从过滤器中提取的采样在岸和在内陆部位,并使用该评价鲎变形细胞溶解物(LAL)测试。并行地,细菌含量的基因组的评估(总菌,革兰氏阴性,和蓝藻)是使用定量聚合酶链反应(Q-PCR)对同一样品执行的。在LAL试验是基于形成的加成从鲎, 美洲鲎阿米巴细胞的含水提取物之后,向含有内毒素的水溶液浊度的测量。样品在较高的内毒素浓度,更快浊度开发15的Q-PCR分析是基于发射作为特定的DNA片段被扩增荧光信号16由信号的实时监测在PCR指数期反应和校准用标准曲线,初始的DNA量进行量化。这两种的组合与他人一起分析,如别处详述,14可提供的内毒素和水平的良好估计样品中的源的细菌量。

这里提出的方法的目的是获得从过滤器中提取的生物气溶胶的内毒素和DNA含量的高度准确和可靠的分析。而用于采样气溶胶的物理和无机化学特性的方法是,最近,已开发了探讨其有机质成分众所周知,17一直存在很少研究气溶胶的生物成分上18为当前的理方法是通过在详细介绍,用于提取,分析和确定空气气溶胶的生物分数一个可靠的方法来解决这个间隙14

这里详述的方法可望找到在涉及过滤分析生物的室内和室外的气溶胶研究项目广泛使用。20-24

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Protocol

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注:在材料部分显示的所有材料,并在该协议中使用仪器的详细清单。

1.空气采样过滤器上

  1. 过滤器的研制
    1. 对于高流量采样,使用20.3点¯x25.4厘米2过滤器。选择,具体类型的过滤器是最适合的研究需要,以及在滤波器的截止大小,如果适用。1在此,使用石英微纤维过滤器。
    2. 用于有机和生物化合物采样预烘焙滤波器破坏有机残基。到预先烘烤的过滤器,在铝箔单独包装它们,然后在450℃烘烤他们在实验室炉中至少5小时。
    3. 在-20℃,直到采样存储烘烤滤波器。
  2. 仪器处理和空气取样
    1. 从高流量采样器的头部清洁残留粉尘。擦拭干净的湿巾纸的部件并将它们允许风干befo他们再重新连接到采样器。
    2. 消毒过滤器盒用乙醇和手套和在任何时候都白大褂的工作。
    3. 放置清洁过滤器盒内部的预烘焙滤波器,并根据该高容量采样手册进行。
    4. 标注日期和任何不寻常的天气情况,如果适用( 比如下雨,沙尘暴)的铝套,并在一个干净的地方保存,直到取样完成。
    5. 收集采样滤波器和对折,用采样面朝向内。
    6. 包裹在原铝箔和存储的过滤器在-20℃直至分析。
      注意:如果取样和分析之间的时间间隔是大于2个月​​的时间,存储该样品在-80℃,以避免有机和生物材料的降解。

2.内毒素分析

注意消毒用70%乙醇的工作表面用无热原管,只有技巧和试剂研发工作。如果玻璃器皿的使用,需要预先加热在250℃进行30分钟,或200℃60分钟。25,准备所有试剂在II级生物安全柜并用手套,并在任何时候都白大褂工作。

  1. 试剂准备
    1. 轻轻按照LAL试剂盒生产商的协议,在即将使用前补充水分的裂解液。26轻按小瓶撞出LAL剩余瓶壁上。轻轻抬起挡打破真空。用注射器针刺加5毫升无热原水(PFW)的小瓶再水化所有的溶液内容,轻轻混匀,以避免形成泡沫。
    2. 密封用塑料薄膜石蜡小瓶在不使用时,并储存在4°C至两天。储存在-20℃的任何剩余的溶胞产物长达三个月。
      注意:此试剂可以仅一次冻结。
    3. 补充水分控制标准内毒素(CSE),其中包含0.5μ克E.大肠杆菌 ,按照制造商的方案27确定要通过输入批号为其中网站中指定的试剂盒被添加到CSE小瓶从制造商的网站28的水的特定量。 大肠杆菌的最终浓度大肠杆菌在小瓶中,内毒素单位测量(EU;其中10 EU = 1纳克)。标签此瓶ED0。
    4. 用塑料薄膜石蜡密封小瓶CSE在不使用时,并储存在4°C至4周。
  2. 标准曲线和尖刺过滤准备
    1. 在II级生物安全柜,制备含有CSE(管ED1-Ed11)或无CSE(仅含PFW管坯)的下降量,以产生一复制内毒素稀释系列22无热原-2-毫升离心管中,如表1。
    2. 在循环流动的生物柜,用消毒1.1切割22清洁,预焙过滤器环形件直径2厘米的软木螟。
    3. 将过滤器对进入无菌培养皿中。
    4. 穗从内毒素稀释系列ED2-Ed11的每个成员,并从管坯50微升到一对相应的过滤器。
    5. 离开包含在引擎盖下开放干燥30分钟加标滤波器培养皿。
    6. 放置在一无热原-2毫升管的每个过滤器片。
“>
终浓度内毒素(EU毫升-1) 标准内毒素体积(ml) 无热原水的体积(ml) 总体积(ml)
ED0 2500 原液*
ED1 1000 80(从ED0) 120 200
ED2 100 20(从ED1) 180 200
ED3 50 10(从ED1) 190 200
ED4 25 5(从ED1) 195 200
ED5 12.5 2.5(从ED1) 197.5 200
ED6 6.25 1.25(从ED1) 198.75 200
ED7 3.125 6.25(从ED2) 193.75 200
ED8 1.563 6.25(从ED3) 193.75 200
ED9 0.781 6.25(从ED4) 193.75 200
ED10 0.391 6.25(从ED5) 193.75 200
Ed11 0.195 6.25(从ED6) 193.75 200
空白 0 0 200 200

表1:内毒素标准曲线内毒素浓度,加入的无热原水的标准内毒素和体积,以及所获得的总体积是在校正曲线每种稀释液管详细。

  1. 从实验和尖刺过滤器内毒素提取
    1. 在用循环流动的生物柜,使用消毒1.12厘米直径打孔器,并把它们连同尖刺标准过滤器(来自步骤2.2)切取试样的过滤器(来自步骤1.2)成环形件,在2无热原毫升管( 样品管)。
    2. 加入1ml PFW到管和动摇他们在室温下60分钟,使用实验室摇动器。
    3. 离心样品管在375 XG 10分钟微量。29
    4. 转让日ê上清液,其中包含内毒素,进入一个新的无热原-2毫升管。
  2. 鲎试剂(LAL)测试
    1. 通过在无热原的96孔微具有平坦底部和盖进行鲎试验测定样品中的内毒素浓度。
    2. 规划片阵列提前, 如图1。包括在每一个运行的板直接从内毒素标准溶液ED2-Ed11(因而覆盖100-0.195 EU / ml的(见2.2节)的浓度范围)中制备的标准曲线。标准曲线应该占据井行A的1-10和平板乙。抛开11-12井在这些行的空白样品(即总共四个空格)。
    3. 打开酶标仪和在37℃下,涉及该微板的温育和振荡,每5分钟,接着通过吸收测量在405nm的动力学反应编程。重复18次1.5小时。
    4. 确定efficienCY与该内毒素从样品过滤萃取( ,从加标标准过滤器中获得的样品),通过计算出的内毒素量除以原始量掺入。
    5. 通过将50微升的标准内毒素溶液(来自步骤2.4.2)或加标滤波器提取物及其坯料(从2.3节)开始试验,或试验样品和其空白(也从第2.3节)的,按照计划的板阵列( 图1),盖上盖子。
    6. 每个孔中,迅速加入50微升LAL的解决方案,虽然它被提起到读者面前摆放在桌子上轻轻地水平摇晃板。
    7. 放置在板读数器板并开始实验运行。

图1
图1:内毒素阵列板的前充足的96孔微量的内毒素分析阵列。

3.基因组分析

注意:对于DNA提取,消毒用70%乙醇的工作表面,并用无菌管,只提示和试剂工作。对于DNA的Q-PCR分析,消毒与表面的DNA去污剂的工作表面上。准备所有试剂在II级生物安全柜和手套,在任何时候都白大褂的工作。

  1. 该DNA引物和探针的制备
    1. 之前DNA提取,要么顺序市售的组引物和探针(如果施加的水解探针法),或者设计一组新的引物和使用引物设计的计算工具的探针。30
    2. 根据使用任一的10mM Tris-0.1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)(TE缓冲液)或PCR级水生产商的方案再水合的引物。
      注:建议以溶解初始PCR引物ST玉珠在低乙二胺四乙酸(0.1%),因为它防止引物降解保持较长时间时的TE缓冲液中。使用的PCR级水用于随后的稀释,以减少可能抑制PCR反应的EDTA的量。
    3. 在-20℃下直到分析制备50微升的等分或无菌0.5毫升管100微升引物和探针的和存储。
  2. 标准单元集中评估之前提取DNA
    1. 在一个适当大小的离心管中,制备感兴趣的微生物物种(管OD0, 表2A)的一个标准的细胞溶液。用移液管以小的孔在所述管吹打它向上和向下混合细胞悬浮液的7-10倍。
    2. 如果细胞着色( 某些真菌孢子),不执行染色程序。如果需要细胞染色,稀释细胞悬浮液在针对感兴趣的单元的微观检测的合适染料。31
    3. 清洁盖玻片hemocytom用乙醇ETER。滋润并加盖盖玻片的血球。
    4. 通过仔细触摸用吸管的尖端盖玻片的边缘,通过毛细管作用填充所述腔室装载约8微升的细胞悬液到两个血球腔室。不要过/欠填充腔室。
    5. 通过在放大400倍(40X在目镜物镜和10X),在显微镜下观察它们确定细胞的数量。九个正方形测量1×1 平方毫米和布置成3×3的网格,应看到。着眼于网格的四个角区之一的显微镜(较高的倍率可以使用)。 1×1毫米2平方米应该包含16个小方格。
    6. 算中的四个1×1毫米2角的正方形的所有细胞中,以及在3×3网格的中间正方形。如果有太多或太少的细胞计数,重复该过程,无论是集中或稀释原始细胞悬液适当(1550个细胞应该覆盖挑出一个1mm 2中的区域)。
    7. 计算在从细胞的标准细胞悬液OD0的细胞(细胞毫升-1)的浓度计数在五个计数平方平均如下:细胞计数毫升-1 =平均细胞数平方-1稀释因子10 4。
  3. DNA提取效率评价
    1. 根据表2A准备9无菌0.5毫升管。
    2. 稀释的标准细胞溶液(OD0)含有在20微升(OD1)的总体积为约10 7个细胞毫升-1。
    3. 加入18微升无菌无核酸PCR级水(NFW)到铝管OD2-Od8和20微升空白管,Od9。
    4. 转移2微升从OD1细胞溶液进入OD2的。吸管轻轻地混合和管OD2转移2微升至OD3。继续在沿管子的相同方式稀释所述细胞直至并包括管Od8邻btain的10 7 -10 0细胞ml的系列稀释液-1。
    5. 在循环流动的生物柜,切圆18清洁,预焙滤波器件,使用消毒1.12厘米直径木塞。将过滤器在对进入无菌培养皿中。
    6. 穗从稀释OD1 10微升至Od8并从管坯Od9到每个成对的过滤器,使得存在对应于每个标准细胞浓度一个过滤器对。
    7. 离开培养皿引擎盖下开放,让他们干30分钟。
    8. 放置在无菌的螺杆前2毫升管每个滤波器块,并根据在部分3.4中详述的过程中提取的DNA。
  4. 从实验和尖刺过滤器提取DNA
    注意:对于从过滤器提取DNA,使用根据制造商的进行了以下修改协议设计用于从土壤提取DNA的商业试剂盒。
    1. 对于每一个FIL之三样(OD1-Od8),准备在0.5毫升无菌管酸洗玻璃珠的混合物。使用具有直径为直径为≤106微米425-600微米和0.3克珠0.1克珠。
    2. 在用循环流动的生物柜,使用消毒1.12厘米直径打孔器切从每个过滤器样品随机选择的位置的三个圆形片,并将其放置在螺杆顶端2​​ml管。
    3. 玻璃珠混合物加入到管中。
    4. 与提取试剂盒提供的细胞裂解缓冲液加入到每个管中的生物柜中,具有在制造商的协议所指示的量。
    5. 制备冰桶和机械使用珠打浆机破坏细胞。
    6. 打珠1分钟,然后将它们放置在冰上1分钟。重复五次。
    7. 从裂解后的步骤,试剂盒供应商的协议进行。
    8. 使用附带的洗脱缓冲液洗脱后(含10毫米的Tris buffer)或NFW,通过柱再次重新加载洗脱出来的样本,以提高DNA产量。
      注意:如果在同一天的DNA提取没有分析,样品可以储存在-20℃直至分析。
1“的风格=”高度:21px;“> DD0
标准电池稀释系列的A-准备
最终的细胞浓度(细胞毫升-1) 标准细胞体积(ml) 不含核酸酶的水的体积(ml) 总体积(ml)
OD0 与下摆确定ocytometer计数室
OD1 应该洗脱的10 7个细胞ml的范围内-1 20
OD2 10 -1 OD1 OD1的2 18 20
OD3 10 -2 OD1 OD2的2 18 20
OD4 10 -3 OD1 OD3 2 18 20
OD5 10 -4 OD1 OD4 2 18 20
OD6 10 -5 OD1 OD5的2 18 20
Od7 10-6 OD1 OD6 2 18 20
Od8 10 -7 OD1 Od7 2 18 20
空白 0 0 20 20
DNA标准曲线的制备B-
最后的DNA浓度(毫克毫升-1) 标准DNA体积(ml) 不含核酸酶的水的体积(ml) 总体积(ml)
用的NanoDrop确定
DD1 应该洗脱10 1毫克ml的范围内-1 20
DD2 10 -1 DD1 DD1的2 18 20
DD3 10 -2 DD1 DD2的2 18 20
DD4 10 -3 DD1 DD3 2 18 20
DD5 10 -4 DD1 DD4 2 18 20
DD6 10 -5 DD1 DD5 2 18 20
DD7 10-6 DD1 DD6 2 18 20
DD8 10 -7 DD1 DD7 2 18 20
空白 0 0 20 20

表2:DNA标准曲线的标准微生物细胞稀释系列(A)的详细的标准细胞体积,NFW体积,并且在每个稀释管中的总体积。 DNA的标准曲线制备(B)中,详细的标准DNA量,NFW体积,并且在每个稀释管中的总体积。

  1. DNA标准曲线准备直接从感兴趣使用如步骤3.4实验筛选所述的相同方法的微生物(DD0)的标准试样中提取的DNA。
  2. 使用分光光度计在260nm处确定的标准DNA样品(DD0)的DNA的浓度。
  3. 制备9无菌0.5毫升管从中制备的DNA的标准曲线,示于表2B中
  4. 如果需要的话,在20微升的总体积稀释的标准DNA溶液DD0到1-10微克毫升-1在第一管(DD1)的浓度范围内。
  5. 加入18微升NFW对铝管DD2-DD8和20微升空白管。
  6. 转移2微升从DD1标准DNA溶液进入DD2的。吸管轻轻拌匀,然后从DD2转移2微升到DD3。继续以相同的方式稀释的DNA沿管,以与管坯containi达到10 0 -10系列稀释-7管DD2-DD8一起NG只NFW。
    注意:如果不在-20℃直至分析对提取的同一天进行了分析,存储样本。
  • 定量PCR分析
    1. 交换机上的Q-PCR仪提前预热。
    2. 在一个新的程序文件,插入用于Q-PCR的仪器操作软件运行的细节如表3详述。
      注:不同的仪器对每个热循环步骤的不同最佳时机。此输入仪器手册中规定。
    3. 用消毒表面的DNA去污剂的工作表面,只用无菌管,技巧和试剂工作。
    4. 准备冰桶的工作台旁。冰商店的Taq聚合酶组合。
    5. 计算将在该板所占据反应孔的总数。使额外反应理论津贴(5%)和由每个反应的体积乘以反应的扩大数目来计算总reactioN音量。
    6. 准备反应混合池,从NFW,引物,探针,最后的Taq DNA聚合酶结构开始。对于体积计算为表4中的混合池参见实施例。
    7. 储存在黑暗反应混合物中,并在冰上直到使用。
    8. 放置1微升标准DNA,样品DNA或NFW(作为阴性对照)的孔内,在一式三份的Q-PCR微板。
    9. 确保该板是在板保持器,以防止它从接触工作表面,并保持它的清洁。
    10. 添加9微升混合池( 表4)到每个反应孔。
    11. 覆盖光学胶膜板与来自四面八方的封紧袋口。
    12. 将其放置在Q-PCR设备之前降速板的离心分离机板桶1分钟在1000 XG。
    13. 放置板装入仪器并激活运行的程序。
  • 参数 详细信息 注释
    检测方法定量水解探针
    热循环条件
    初始变性和酶激活 95℃,10分钟
    变性 95℃,15秒重复45次
    退火和延伸 60℃60秒
    平板阵列
    标准曲线 DD1 - DD8 每稀释在1-8井3次重复在顶部3的行
    非模板控制(NTC) 无核酸酶的水(NFW) 在9 3重复以及在顶部3行。
    分析样品从DNA提取过滤器每个样品重复3次在剩余的孔中。
    引物每孔
    样本量 10毫升

    表3:用于Q-PCR操作软件详细分析参数的详细信息以输入到Q-PCR程序文件。

    试剂 每个反应体积(ml) 反应数 津贴错误(5%) 总体积混合物(毫升)
    Taq酶混合 50 52.5 262.5
    F引物(10毫摩尔) 0.5 50 52.5 26.25
    R引物(10毫摩尔) 0.5 50 52.5 26.25
    核酸自由水 3 50 52.5 157.5
    DNA的 - 1毫升将直接加入到在96板中的目标孔中。

    表4:定量PCR反应混合物计算每个反应体积,反应的人数,津贴错误,总体积计算要添加到每个试剂的反应混合物是详细。

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    Representative Results

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    它是常见使用“离线”采样滤波器的分析来研究大气气溶胶(参见图2)。取样物质包括有机( 例如蛋白质,烃类分子,糖类)和无机( 例如金属,盐)含量的32化学分析。生物分析包括存活和非存活的微生物含量,使用DNA的方法或显微镜物种鉴定,以及基于DNA的定量。

    图2
    图2: 文件管理器试样分析 流程图空气采样(A)的后过滤,制备的过滤器下游分析(B)和样品组分(C)的分析

    E =“1”>对于内毒素的提取,滤波子样本(1.12 平方厘米)的1ml PFW摇动,在室温下60分钟。然后将样品离心在375×g下10分钟。不同离心速度可导致不同的萃取效率,如在图3A中表示。

    对提取效率的初步试验应进行选择的特定的过滤器和协议进行。在图3B中 ,较高的萃取效率从与采样石英滤波器相比扣球干净获得,并且这两个效率都比通过直接检测标准溶液的实现低。如其他地方所讨论的,在过滤器上采样的环境气溶胶的性质也可以影响内毒素提取效率。14,33

    g3.jpg“/>
    3: 内毒素提取效率离心速度(A)和过滤器的负载(B)的内毒素提取效率的影响误差线表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。

    用于内毒素检测的反应包括一个1:LAL试剂的到内毒素标准,样本提取内毒素,或坯件1的比例。它建议使用一式三份试样分析。然而,对于标准曲线,重复就足够了。当的吸收读数(在405nm处)完成后,将所得的光密度(OD)是出口它到用于数据的进一步分析的数据分析的电子表格程序后进行分析。

    如内毒素提取,它的具体的实验条件下进行的DNA的提取效率的初步分析是很重要的。这是通过掺加标准生物体细胞溶液已知量上从过滤器切下一块,按照以上描述的DNA提取协议完成。

    从采样的气溶胶提取靶微生物的浓度是用Q-PCR确定的。这里水解探针技术被使用,其具有因为结合于模板DNA的额外探针的高特异性的优势,35的SYBR绿方法也可以适用于该目的。

    校准曲线从从感兴趣的选择的生物体中提取DNA来源,使用上述的提取方法。反应的化合物的混合池,不包括DNA样品,标准或对照,制备和保持在黑暗中,并在冰上直至需要。然后,将混合池的等分试样在96微孔光学板加入到每个孔中。该DNA标准样品,或控制是根据片阵列的反应混合物后加入。之后所有的试剂已经被插入到板,它是海导致用光学粘接膜并旋转以收集所有的液滴在孔的底部。该板比插入的q PCR仪进行热循环扩增和信号检测。

    输出数据由PCR的Ct值,其被定义为在该扩增的DNA量到达阈值电平的周期数目。使用校准曲线值,能够得到目标DNA的浓度(参见4)。36的微生物的细胞浓度可以从与标准生物体溶液的血球计数相比,提取效率的Ct值来计算。37

    图4
    4: 定量PCR扩增曲线 (A)和校准离子曲线范围为代表的革兰阴性细菌的DNA进行2-4之间×10 -2×10 2(B)。 请点击此处查看该图的放大版本。

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    Discussion

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    这部作品描述了收集器的气溶胶样品中既定量的内毒素和DNA提取存在和检测方法。该方法要求精确的例程和只要实验者附着在这里讨论了一些基本的和重要的点可以容易地进行。

    用于内毒素检测步骤,请注意,裂解物溶液是相当粘稠,趋于在移液以产生气泡。它是难以除去你气泡,并且它们导致在微孔板阅读器值的变化。因此,要首先放置在样品中的板和仅确保所有的气泡消失后,继续加入裂解物溶液是很重要的。一个有用的技术,以防止在这一步骤中气泡的形成是用吸管慢慢地工作,而不是排水裂解液入井时按它所有的方式。作为反应立即开始,一旦裂解物被添加到endoto辛提取物,有必要尽早开始读取。为了缩短溶解产物添加步骤,可以使用多道移液器。注意,在一些试剂盒和协议有样品在37℃下进行10分钟的额外预孵育步骤中,它被放置在微偷笑板后29仅此步骤之后,可以加入裂解物。

    对于内毒素的环境样品提取的重要的一点是在样品中的抑制剂的存在下( 例如高污染空气样品中)。在这种情况下,稀释变得至关重要,并能防止假增强,通常为未稀释的样品观察到的。38

    同样,也有重要的几个点,以确保所述Q-PCR检测的成功和可靠性。 1)作为溶液的体积是非常小的,如果它们不放置在井的底部,在该DNA滴的水含量可以通过蒸发控制而减少Ë安排在板样品。为了防止此问题,将DNA样品在井的底部,通过将它放置在冰上或其它冷却平台冷却该板,并准备提前一切加快该步骤尽可能。 2)当制备Q-PCR反应混合物( 表4),用铝箔覆盖的管,以防止光降解。 3)在本实验中描述了一个10微升反应的准备。然而,在某些Q-PCR的仪器,将反应体积为20微升,然后各试剂的体积相应地相乘。 4)最佳的热循环条件可以为不同的引物和聚合酶混合物改变。39例如,退火温度应在约引物的熔化温度被设置,并且根据经验确定为在该扩增最有效地发生的温度。由于这个原因,同样重要的是,以制备校准曲线为每个分析Q-PCR板,以确保该量化是准确的。校正曲线以及标准掺入滤波器也用作阳性对照,以确保没有抑制发生。为了避免抑制,建议使用设计用于从环境样品中移除抑制剂提取试剂盒。 5)在本实验中的热循环数设定为最大数,45中,为了提高灵敏度作为来自滤波器提取的DNA的浓度是非常低的。 6)确保循环至阈值(对于所有DNA样品Cτ)值在标准曲线的动态范围内。还确保阴性对照样品的任何扩增比DNA样品大至少八个周期。 7)如果用的SYBR Green试剂工作,确保有每个反应没有多重熔化温度峰值。

    对于浊度测试中,两款内毒素定量方法:动力学方法和endpoi新台币显色法。在动力学的方法,因为在这个协议进行的,该样品所需要的时间,以达到最大吸收进行测量。这里,更短的反应时间间隔指示样品中更高的内毒素浓度。在端点发色的方法,光吸收所定义的孵育时间,以确定内毒素浓度后测定的。这两种方法都需要定量的标准曲线。40

    虽然上述的内毒素提取的精度和准确度是非常高的,14中的提取效率可以改善。这可能是不同类型的过滤器或额外的洗涤剂(如聚山梨醇酯20),以在萃取步骤可以提高从滤波器提取的内毒素的产量。内毒素提取效率还可以通过在并行采样过滤器上的不同的颗粒的影响。33对于我们的实验装置,该方法的检测限估计为0.001欧米-3 14

    用于量化的DNA提取物,可以作为替代Q-PCR技术包括克隆方法和数字液滴的PCR(DD-PCR)。 Q-PCR的以上物种鉴定的克隆方法的优点是它的更大的敏感性,而且它要求初始扩增步骤低级DNA浓度。此外,与Q-PCR,克隆方法,该方法是劳动密集且耗时的,是不是定量的。为将DNA提取物的定量的另一种方法为DD-PCR 19这个技术的优点在于,它不要求一个校准曲线,该检测是基于在每个液滴单一DNA菌株。然而,对于环境样品,没有可靠的方法迄今用于从过滤器中提取的DNA的液滴检测存在。

    与DNA被提取fr处的效率嗡滤波器,以及该DNA的测量的准确度和精确度,可以由诸如过滤器类型,靶标微生物,和仪表。34,41因此应在试样分析之前定义的影响。在我们的实验装置,检测限可以达到降低到3.5基因组米-3 14

    最后,此处所描述的方法适用于从两个人为和自然来源空气采样生物物种的鉴定和定量。精确使用适当的测定使得进行复杂的环境问题有价值的调查。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

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    References

    1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
    2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. (2015).
    3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
    4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
    5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. (2014).
    6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
    7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
    8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
    9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. John Wiley & Sons. (2011).
    10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. John Wiley & Sons. (2007).
    11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
    12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
    13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
    14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
    15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
    16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
    17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
    18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
    19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
    20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
    21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. (2015).
    22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
    23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
    24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
    25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. Euromed. 12.1-12.15 (2003).
    26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
    27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
    28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
    29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
    30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
    31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
    32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
    33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
    34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
    35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
    36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
    37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
    38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
    39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. Caister Academic Press. (2011).
    40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
    41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
    内毒素和DNA含量的空气采样滤波器分析
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    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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