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Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

Außenaerosolforschung verwendet allgemein Partikel auf Filter abgetastet. Dieses Verfahren ermöglicht es, verschiedene Charakterisierungen der gesammelten Partikel in parallel durchgeführt werden. Der Zweck der hier vorgestellten Verfahren ist es, eine hochgenaue und zuverlässige Analyse des Endotoxin und DNA-Gehalt von Bio-Aerosole aus den Filtern extrahiert zu erhalten. Die Gewinnung von hochmolekularen organischen Moleküle, wie Lipopolysacchariden, aus abgetasteten Filter beinhaltet Schütteln der Probe in einer pyrogenfreien Medium auf Wasserbasis. Die nachfolgende Analyse basiert auf einer Enzymreaktion basiert, die unter Verwendung einer turbidimetrischen Messung erfasst werden können. Als Ergebnis des hohen organischen Anteils auf den abgetasteten Filter wird die Extraktion der DNA aus den Proben durchgeführt, eine kommerzielle DNA-Extraktions-Kits verwenden, die ursprünglich für Böden entworfen und modifiziert, um die DNA-Ausbeute verbessern. Der Nachweis und die Quantifizierung von spezifischen mikrobiellen Spezies unter Verwendung quantitative polymerase chain Reactiauf (q-PCR) Analyse mit anderen verfügbaren Methoden beschrieben und verglichen.

Introduction

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Air Probenahme auf Filter ist ein grundlegendes Instrument in atmosphärischen Aerosolen Forschung. 1 Die abgetasteten Filter der Ausgangspunkt für verschiedene chemische, physikalische und biologische Charakterisierungen der gesammelten Umgebungspartikel sind. 11.02 Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin , dass verschiedene Analysen sein kann off-line auf der gleichen Probe durchgeführt. Kompilieren der Daten aus den verschiedenen Analysen der Forscher ermöglicht bei der Lösung komplexer Fragestellungen in den atmosphärischen Wissenschaften ein gutes Verständnis für die Eigenschaften der gesammelten Partikel und Hilfsmittel zu erhalten. 12,13 Zum Beispiel Meeres- und Binnenluftproben , die während der gleichen genommen Zeitraum kann in Bezug auf das abgetastete Partikel Toxizität und biologische Zusammensetzung verglichen. 14 Für diese Studie Lipopolysaccharide (LPS), Komponenten auf gram-negativen Bakterienzellwände, auch als Endotoxine bekannt sind , wurden von den Filtern on-shore abgetastete extrahiert und ein Binnenstelle und wurden unter Verwendung bewertet dieLimulusamöbocytenlysat (LAL-Test). Verwendung der quantitative Polymerase-Kettenreaktion (q-PCR) parallel wird eine genomische Auswertung des Bakteriengehalt (total Bakterien, gramnegative und Cyanobakterien) wurde an derselben Probe durchgeführt. Der LAL - Test basiert auf der Messung der Trübung nach der Zugabe eines wässrigen Extrakts aus Amöbozyten von dem Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus gebildet, zu einer wässrigen Lösung , die Endotoxine enthält. Je höher die Endotoxin - Konzentration in der Probe entwickelt die schneller Trübung. 15 die q-PCR - Analyse auf einem Fluoreszenzsignal basiert , als ein spezifisches DNA - Fragment emittiert wird verstärkt. 16 durch Echtzeit - Überwachung des Signals während der exponentiellen Phase der PCR Reaktion und Kalibrierung mit einer Standardkurve, die anfängliche DNA-Menge quantifiziert werden kann. Die Kombination dieser beiden Analysen zusammen mit anderen, wie anderswo detailliert, 14 eine gute Schätzung des Gehalts an Endotoxin liefern kann und dasMenge der Quell Bakterien in den Proben.

Der Zweck der hier vorgestellten Verfahren ist es, eine hochgenaue und zuverlässige Analyse des Endotoxin und DNA-Gehalt von Bio-Aerosole aus den Filtern extrahiert zu erhalten. Während Verfahren die physikalischen und anorganischen chemischen Eigenschaften von Aerosolen zur Abtastung bekannt sind und in jüngster Zeit sind Verfahren entwickelt worden , dessen organischer Substanz Komponente zu untersuchen, 17 dort hat auf die biologische Komponente von Aerosolen wenig Forschung. 18 Der Grund für die aktuelle Methode ist , diese Lücke zu schließen, indem zum Extrahieren im Detail ein robustes Verfahren präsentiert, die Analyse und die biologische Fraktion in der Luft Aerosole zu identifizieren. 14

Die Methode , die hier detailliert wird erwartet , dass weit verbreitete Verwendung in der biologischen Innen- und Außenaerosolforschungsprojekte mit Filteranalyse zu finden. 20-24

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Protocol

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Hinweis: Eine detaillierte Liste aller Materialien und in diesem Protokoll verwendeten Instrumente ist im Abschnitt Materialien gezeigt.

1. Luftfilterprobenahme

  1. Herstellung von Filter
    1. Für hohe Volumen Probenahme, 20,3 x 25,4 cm 2 Filter verwenden. Wählen Sie die spezifische Art von Filter, der die Forschung Anforderungen am besten entspricht, sowie die Filtergrenzgröße, falls zutreffend. 1 Hier Verwendung Quarz - Mikrofaserfilter.
    2. Pre-Bake-Filter für organische und biologische Verbindung Probenahme soll organische Rückstände zu zerstören. Um Pre-Bake die Filter, wickeln Sie sie einzeln in Aluminiumfolie und dann backen sie in einem Laborofen bei 450 ° C für mindestens 5 Stunden.
    3. Speichern Sie die gebackenen Filter bei -20 ° C bis hin zur Probenahme.
  2. Instrument Handhabung und Air Sampling
    1. Saubere Reststaub aus dem Kopf des hohen Volumens Sampler. Wischen Sie die Teile mit sauberen Papiertüchern und lassen Sie sie an der Luft trocknen before sie auf dem Sampler wieder anschließen.
    2. Desinfizieren Sie die Filterkassette mit Ethanol, und die Arbeit mit Handschuhen und einem Laborkittel zu allen Zeiten.
    3. Legen Sie einen vorgebackenen Filter innerhalb des Reinfilterkassette und verfahren nach dem hohen Volumen Sampler Handbuch.
    4. Markieren Sie das Datum und ungewöhnliche Wetterbedingungen, wenn anwendbar sind (zB regen, Staubsturm) auf der Aluminiumfolie, und speichern Sie es an einem sauberen Ort bis zum Abschluss der Probenahme.
    5. Sammeln Sie die abgetastete Filter und falten Sie es in der Hälfte, mit der abgetasteten Seite nach innen gerichtet.
    6. Wickeln Sie den Filter in der ursprünglichen Aluminiumfolie und bei -20 ° C bis zur Analyse.
      Hinweis: Wenn die Zeitverzögerung zwischen Probenahme und Analyse ist länger als 2 Monate, speichern Sie die Probe bei -80 ° C Abbau des organischen und biologischen Materials zu vermeiden.

2. Endotoxin-Analyse

Hinweis: Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol eind Arbeit mit pyrogenfreiem Rohre, Tipps und Reagenzien nur. Wenn Glas verwendet werden, Vorheizen bei 250 ° C für 30 min oder 200 ° C für 60 min erforderlich ist. 25 alle Reagenzien in einer Klasse II Biosicherheitsschrank vorbereiten und zu allen Zeiten mit Handschuhen und einem Laborkittel zu arbeiten.

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Folgen Sie den LAL - Kit Protokoll des Herstellers das Lysat kurz vor der Verwendung zu rehydrieren. 26 Tippen Sie sanft auf dem Fläschchen LAL zu entfernen verbleibende auf den Flaschenwänden. Heben Sie den Anschlag sanft um das Vakuum zu brechen. Mit einem Nadelvlies-Spritze, 5 ml pyrogenfreiem Wasser (PFW) in das Fläschchen alle Lysat Inhalt zu rehydrieren und sanft Schaumbildung zu vermeiden, mischen.
    2. Verschließen Sie die Fläschchen mit Kunststoff Paraffinfilm, wenn sie nicht in Gebrauch und lagern bei 4 ° C für bis zu zwei Tage. Bewahren Sie alle verbleibenden Lysat bei -20 ° C für bis zu drei Monaten.
      Hinweis: Dieses Reagenz kann nur einmal eingefroren werden.
    3. Rehydrieren die Steuer Standard-Endotoxin (CSE), die 0,5 μ enthält; g E. coli, in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers. 27 die spezifische Wassermenge bestimmen , von der Website des Herstellers 28 durch Eingabe der Chargennummer für das Kit , wo angegeben auf der Website der CSE Fläschchen gegeben werden. Die Endkonzentration von E. coli in der Ampulle wird in Endotoxin - Einheiten gemessen (EU, wo 10 EU = 1 ng). Beschriften Sie diese Fläschchen ed0.
    4. Verschließen Sie die CSE Fläschchen mit Kunststoff Paraffinfilm, wenn sie nicht in Gebrauch und lagern bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
  2. Standardkurve und Spitz-Filter Vorbereitung
    1. In einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II, bereiten 22 pyrogenfreien 2 ml Zentrifugenröhrchen abnehmenden Mengen von CSE enthält (Röhren Ed1-ED11) oder ohne CSE (Blindrohr nur PFW enthält) eine doppelte Endotoxin - Verdünnungsreihe zu erzeugen, wie in der Tabelle dargestellt 1.
    2. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden 22 kreisförmige Stücke von sauberen, vorgebackenen Filter eine desinfizierte 1.1 unter Verwendung von 2 cm Durchmesser Korkbohrer.
    3. Legen Sie die Filterpaare in sterile Petrischalen.
    4. Spike 50 & mgr; l von jedem Mitglied von Endotoxin Verdünnungsreihe Ed2-ED11 und von dem Rohrrohling auf einem entsprechenden Paar von Filtern.
    5. Lassen Sie die Petrischalen, die mit Spikes Filter offen unter der Haube enthält, für 30 Minuten trocknen lassen.
    6. Legen Sie jedes Filterstück in einer pyrogenfreien 2-ml-Tube.
">
Tube Endgültige Endotoxin - Konzentration (EU ml -1) Standard - Endotoxin Volumen (ml) Pyrogenfreiem Wasser Volumen (ml) Gesamtvolumen (ml)
ed0 2500 Stammlösung * 5
Ed1 1000 80 (von ed0) 120 200
Ed2 100 20 (von Ed1) 180 200
Ed3 50 10 (von Ed1) 190 200
eD4 25 5 (von Ed1) 195 200
ED 5 12.5 2.5 (von Ed1) 197,5 200
ED6 6.25 1.25 (von Ed1) 198,75 200
ED7 3,125 6.25 (von Ed2) 193,75 200
ED8 1,563 6.25 (von Ed3) 193,75 200
ED9 0,781 6.25 (von eD4) 193,75 200
ED10 0,391 6.25 (von ED 5) 193,75 200
ED11 0,195 6.25 (von ED6) 193,75 200
Leer 0 0 200 200

Tabelle 1:. Endotoxin - Standardkurve Endotoxin - Konzentration, dem Volumen des Standard - Endotoxin und pyrogenfreiem Wasser zugegeben werden, und das Gesamtvolumen erhalten detaillierte für jedes Verdünnungsröhrchen in der Kalibrierungskurve.

  1. Endotoxin-Extraktion aus der experimentellen und Spiked Filter
    1. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden Sie die Probenfilter (aus Schritt 1.2) in kreisförmige Stücke mit einer desinfizierten 1,12 cm Durchmesser Korkbohrer, und legen Sie sie zusammen mit den Stachelstandardfilter (aus Schritt 2.2), in pyrogenfreiem 2 ml - Röhrchen (dh die Probenröhrchen).
    2. 1 ml PFW zu den Rohren und schüttle sie für 60 min bei Raumtemperatur, unter Verwendung eines Laborschüttler.
    3. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen in einer Mikro bei 375 × g für 10 min. 29
    4. Übertragen the Überstand, der die Endotoxine, in eine neue pyrogenfreien 2-ml-Röhrchen enthält.
  2. Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Test-
    1. Bestimmen Sie die Endotoxin-Konzentration in den Proben, die durch den LAL-Test in einer pyrogenfreien 96-well Mikrotiterplatten mit einem flachen Boden und einem Deckel durchführen.
    2. Planen Sie die Platte Array im Voraus, wie in Abbildung 1 gezeigt. Fügen Sie eine Standardkurve direkt von Endotoxin - Standardlösungen Ed2-ED11 vorbereitet (und damit für den Konzentrationsbereich von 100 bis 0,195 EU / ml (siehe Abschnitt 2.2)) in jeder Laufplatte . Die Standard-Kurve sollte Vertiefungen 1-10 der Zeilen A und B der Platte einnehmen. Stillgelegte Brunnen 11-12 in diesen Reihen für Leerproben (insgesamt vier Leerzeichen).
    3. Schalten Sie den Mikroplattenleser und programmieren es für eine kinetische Reaktion, die Inkubation der Mikrotiterplatten bei 37 ° C und Schütteln alle 5 min, gefolgt von Absorptionsmessungen bei 405 nm. Wiederholen Sie 18-mal für 1,5 Std.
    4. Bestimmen Sie die efficiency , mit dem die Endotoxine aus der Probe extrahiert Filter (dh., die Proben aus dem spiked Standardfiltern erhalten) über Teilung des berechneten Endotoxin Menge von der ursprünglichen Menge versetzt.
    5. Starten Sie den Test, indem 50 ul der Standard-Endotoxin-Lösungen (aus Schritt 2.4.2) oder des Stachel Filter-Extrakt und seine Zuschnitte (aus dem Abschnitt 2.3) oder der experimentellen Proben und deren Zuschnitte (auch aus dem Abschnitt 2.3), gemäß der geplanten Plattenarray (Abbildung 1) und die Abdeckung schließen.
    6. Zu jeder Vertiefung, fügen Sie schnell 50 ul LAL-Lösung und vorsichtig auf die Platte horizontal schütteln, während sie auf den Tisch gelegt wird, bevor es in den Leser zu heben.
    7. Die Platte wird in den Plattenleser und starten Sie den Versuchslauf.

Abbildung 1
Abb . 1: Endotoxin - Arrayplatte Exreichlich einer Endotoxin-Analyse-Array in einer 96-Well-Mikroplatte.

3. Genomic Analysis

Hinweis: Für die DNA-Extraktion, desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und arbeiten mit sterilen Röhrchen, Tipps und Reagenzien nur. Für q-PCR-Analyse von DNA, desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit der Oberfläche DNA-Dekontaminationsmittel. Bereiten Sie alle Reagenzien, die in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank und die Arbeit mit Handschuhen und einem Laborkittel zu allen Zeiten.

  1. Herstellung der DNA-Primer und Sonden
    1. Vor der DNA - Extraktion, entweder um eine im Handel erhältliche Satz von Primern und einer Sonde (wenn die Hydrolyse - Sonden - Verfahren angewendet wird) oder die Gestaltung eines neuen Satzes von Primern und einer Sonde , Primer entwerfen Rechentools. 30
    2. Rehydrieren der Primer gemäß dem Protokoll des Herstellers entweder 10 mM Tris-0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (TE-Puffer) oder PCR-grade mit Wasser.
      Hinweis: Es wird empfohlen, die anfängliche PCR-Primer st aufzulösenock in TE-Puffer mit niedrigem EDTA (0,1%), wie es Primers Abbau verhindert, wenn für eine längere Zeit gehalten. Verwenden PCR-grade Wasser für die anschließende Verdünnungen EDTA Mengen zu reduzieren, die PCR-Reaktionen hemmen könnten.
    3. Bereiten Sie Teilmengen von 50 & mgr; l oder 100 & mgr; l des Primers und der Sonde in sterile 0,5 ml-Röhrchen und bei -20 ° C bis zur Analyse.
  2. Standard-Zellkonzentration Bewertung vor der DNA-Extraktion
    1. In einem geeignet dimensionierten Zentrifugenröhrchen, bereiten eine Standardzelle Lösung der mikrobiellen Spezies von Interesse (Rohr OD0, Tabelle 2A). Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren nach oben und unten in der Röhre 7-10 mal mit einer Pipette mit einer kleinen Bohrung.
    2. Wenn die Zellen (zB bestimmte Pilzsporen) gefärbt sind, keine Färbeverfahren durchführen. Wenn Zellfärbung erforderlich ist, verdünnt die Zellsuspension in einem geeigneten Farbstoff zur mikroskopischen Nachweis der Zellen von Interesse. 31
    3. Reinigen Sie das Deckglas und hemocytometer mit Ethanol. Befeuchten Sie und bringen Sie das Deckglas auf die Zählkammer.
    4. Laden etwa 8 & mgr; l der Zellsuspension in die beiden Kammern durch Hämocytometer sorgfältig den Rand des Deckglases mit der Spitze der Pipette berührt und die Kammer durch Kapillarwirkung füllt. Sie nicht über / unter die Kammer zu füllen.
    5. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, indem sie unter einem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung (40x in Objektiv und 10X in Augen) sehen. Neun Quadrate den Maßen 1 x 1 mm 2 und in einem 3 x 3 Raster angeordnet sind, sollten gesehen werden. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einem der vier Eckquadrate des Gitters (eine höhere Vergrößerung kann verwendet werden). Das 1 x 1 mm 2 Quadrat sollte 16 kleinere Quadrate enthalten.
    6. Zählen Sie alle Zellen in den vier 1 x 1 mm 2 Eckquadrate, sowie in den mittleren Platz der 3 x 3 Raster. Wenn es zu viele oder zu wenige Zellen sind, das Verfahren zu zählen, zu wiederholen, entweder die Konzentration oder die ursprüngliche Zellsuspension als geeignete Verdünnung (15-50 Zellen sollten eine Vereinzelung 1 mm 2 Fläche) überlagern.
    7. Berechnen Sie die Konzentration der Zellen (Zellen ml -1) in der Standard - Zellsuspension OD0 aus der Zelle über die fünf zählter Quadrate gemittelt Zählung wie folgt: Zellenzahl ml -1 = mittlere Zellzahl Quadrat -1 Verdünnungsfaktor 10 4.
  3. Auswertung der DNA-Extraktion Effizienz
    1. Bereiten Sie neun sterile 0,5 ml - Röhrchen gemäß Tabelle 2A.
    2. Verdünnen Sie die Standard - Zell - Lösung (OD0) etwa 10 7 Zellen ml enthalten -1 in einem Gesamtvolumen von 20 & mgr; l (Od1).
    3. In 18 ul sterilem Nuklease-freies PCR-grade Wasser (NFW) Od2-OD8 und 20 & mgr; l auf die leere Röhre, OD9 an Rohren.
    4. Transfer 2 ul der Zelllösung aus Od1 in Od2. Pipette vorsichtig zu mischen und zu übertragen 2 ul von Rohr Od2 zu Od3. Weiter, um die Zellen in der gleichen Art und Weise entlang der Rohre bis zur Verdünnung und einschließlich Rohr OD8 zu obtain eine serielle Verdünnung von 10 7 -10 0 Zellen ml -1.
    5. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden 18 kreisförmige Stücke von sauberen, vorgebackenen Filter, eine desinfizierte 1,12 cm Durchmesser Korkbohrer verwenden. Legen Sie die Filter in Paaren in sterile Petrischalen.
    6. Spike 10 ul von Verdünnungen Od1 zu OD8 und aus dem Rohling Rohr OD9 auf jede der gepaarte-Filter, so dass es ein Filterpaar auf jeder Standardzellenkonzentration entspricht.
    7. Lassen Sie die Petrischalen öffnen unter der Haube und lassen Sie sie für 30 Minuten trocknen lassen.
    8. Legen Sie jedes Filterstück in einem sterilen Schraubdeckel-2-ml-Röhrchen und extrahieren die DNA nach dem Verfahren gemäß Abschnitt 3.4.
  4. DNA-Extraktion aus der experimentellen und Spiked Filter
    Hinweis: Für die DNA-Extraktion aus Filtern, verwenden kommerzielle Kits zur DNA-Extraktion aus dem Boden ausgelegt und nach dem Protokoll des Herstellers mit den folgenden Modifikationen.
    1. Für jede filter Probe (Od1-OD8), eine Mischung aus Säure-gewaschenen Glasperlen in einer 0,5 ml sterilen Röhrchen vorbereiten. Verwenden von 0,1 g Kügelchen mit einem Durchmesser von 425-600 um und 0,3 g Kügelchen mit mit einem Durchmesser von ≤106 um.
    2. In einem biologischen Schrank mit Kreislauf, schneiden drei kreisförmige Stücke aus zufällig ausgewählten Stellen auf jeder Filterprobe eine desinfizierte 1,12 cm Durchmesser Korkbohrer verwenden, und legen Sie sie in Schraubdeckel-2-ml-Röhrchen.
    3. Fügen Sie die Glasperlenmischung an den Rohren.
    4. Fügen Sie die Zell-Lyse-Puffer mit der Extraktions-Kits zu jedem Röhrchen in dem biologischen Schrank zugeführt wird, mit der angegebenen Menge in dem Protokoll des Herstellers.
    5. Bereiten Sie einen Eimer mit Eis und stören die Zellen mechanisch eine Perle Rührbesen verwenden.
    6. Schlagen Sie die Perlen für 1 min und dann auf Eis für 1 min. Versuch wird fünfmal wiederholt.
    7. Fahren Sie mit dem Protokoll des Ausrüster aus der nach der Lyse Schritt.
    8. Nach der Elution mit dem Elutionspuffer geliefert (enthält 10 mM Tris bUffer) oder NFW, laden Sie die eluierte Probe durch die Säule wieder DNA-Ausbeute zu verbessern.
      Anmerkung: Wenn nicht am selben Tag wie die DNA-Extraktion analysiert, können Proben bis zur Analyse bei -20 ° C gelagert werden.
1 "style =" height: 21px; "> Dd0
A- Herstellung von Standardzellenverdünnungsreihe
Tube Endzellkonzentration (Zell ml -1) Standardzellen-Volumen (ml) Nukleasefreiem Wasservolumen (ml) Das Gesamtvolumen (ml)
OD0 bestimmen mit Hemocytometer Zählkammer
Od1 sollte auf den Bereich von 10 7 Zellen ml -1 eluiert werden 20
OD2 10 -1 Od1 2 von Od1 18 20
Od3 10 -2 Od1 2 von Od2 18 20
OD4 10 -3 Od1 2 von Od3 18 20
OD5 10 -4 Od1 2 von OD4 18 20
OD6 10 -5 Od1 2 von OD5 18 20
OD7 10 -6 Od1 2 von OD6 18 20
OD8 10 -7 Od1 2 von OD7 18 20
Leer 0 0 20 20
B- Herstellung von DNA - Standardkurve
Tube DNA - Konzentration (mg ml -1) Standard-DNA-Volumen (ml) Nukleasefreiem Wasservolumen (ml) Das Gesamtvolumen (ml)
bestimmen mit Nanodrop
Dd1 sollte auf den Bereich von 10 1 mg ml -1 eluiert werden 20
Dd2 10 -1 Dd1 2 von Dd1 18 20
Dd3 10 -2 Dd1 2 von Dd2 18 20
Dd4 10 -3 Dd1 2 von Dd3 18 20
DD5 10 -4 Dd1 2 von Dd4 18 20
Dd6 10 -5 Dd1 2 von DD5 18 20
DD7 10 -6 Dd1 2 von Dd6 18 20
DD8 10 -7 Dd1 2 von DD7 18 20
Leer 0 0 20 20

Tabelle 2:. DNA Standardkurve Standard - Mikroorganismus Zellverdünnungsreihe (A) detailliert für die Standardzellvolumen, NFW Volumen und dem Gesamtvolumen in jedem Verdünnungsröhrchen. DNA - Standardkurve Zubereitung (B), detailliert für die Standard - DNA Volumen NFW Volumen und dem Gesamtvolumen in jedem Verdünnungsröhrchen.

  1. DNA-Standardkurve Vorbereitung Extrahieren DNA direkt aus einer Standardprobe des Mikroorganismus von Interesse (Dd0) unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die experimentellen Filter in Schritt 3.4 beschrieben.
  2. Verwenden eines Spektrophotometers die DNA-Konzentration der Standard-DNA-Probe (Dd0) bei 260 nm zu bestimmen.
  3. Bereiten neun sterile 0,5 ml - Röhrchen , aus denen ein DNA - Standardkurve herzustellen, wie in Tabelle 2B gezeigt.
  4. Falls erforderlich, verdünnt die Standard - DNA - Lösung Dd0 innerhalb eines Konzentrationsbereich von 1-10 & mgr; g ml -1 in dem ersten Rohr (Dd1) in einem Gesamtvolumen von 20 ul.
  5. In 18 ul NFW Dd2-DD8 und 20 & mgr; l auf die leere Röhre zu Rohren.
  6. Transfer 2 ul der Standard-DNA-Lösung von Dd1 in Dd2. Pipettieren sanft zu mischen und dann übertragen 2 ul von Dd2 zu Dd3. Weiter die DNA in der gleichen Weise verdünnt wird entlang der Rohre eine serielle Verdünnung von 10 0 -10 -7 in Röhren Dd2-DD8 zusammen mit einem leeren Rohr haltende zu erreichenng nur NFW.
    Anmerkung: Wenn nicht am selben Tag nach der Extraktion analysiert, Proben bei -20 ° C bis zur Analyse.
  • Quantitative PCR-Analyse
    1. Schalten Sie die q-PCR-Instrument im Voraus, um sich aufzuwärmen.
    2. In einer neuen Programmdatei, legen Sie die Details für den q-PCR im Gerät-Betriebssoftware laufen , wie in Tabelle 3 aufgeführt.
      Hinweis: Verschiedene Instrumente haben unterschiedliche optimale Timing für jeden Schritt Wärmezyklus. Dieser Eingang wird in der Instrumentenhandbuch festgelegt.
    3. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche mit der Oberfläche DNA-Dekontaminationsmittel und arbeiten nur mit sterilen Röhrchen, Tipps und Reagenzien.
    4. Bereiten Sie einen Eimer mit Eis neben der Werkbank. Shop Taq-Polymerase-Mix auf Eis.
    5. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Reaktionsgefäße, die in der Platte belegt wird. Machen theoretischen Zulage für zusätzliche Reaktionen (5%) und multiplizieren Sie die vergrößerte Anzahl von Reaktionen durch das Volumen pro Reaktion die Gesamt reactio zu berechnenn Volumen.
    6. Bereiten Sie die Reaktion gemischt Pool, ausgehend von NFW, Primer, Sonde, und schließlich der Taq-Polymerase-Mix. Siehe Beispiel für die Volumenberechnungen für den gemischten Pool in Tabelle 4.
    7. Bewahren Sie die Reaktionsmischung im Dunkeln und auf Eis bis zum Gebrauch.
    8. Platzieren 1 ul Standard-DNA, DNA-Probe oder NFW (als Negativkontrolle) innerhalb der Vertiefungen in der q-PCR Mikrotiterplatten in Triplikaten.
    9. Stellen Sie sicher, dass die Platte in einem Plattenhalter ist es zu verhindern, dass die Arbeitsfläche zu berühren und sie sauber zu halten.
    10. In 9 ul des gemischten Pool (Tabelle 4) in jede Vertiefung Reaktion.
    11. Die Platte mit optischen Klebefolie und verschließen Sie diese sorgfältig von allen Seiten.
    12. Spin down die Platte in einer Zentrifuge mit Platten Eimer für 1 min bei 1000 × g, bevor es in der q-PCR-Gerät platzieren.
    13. Legen Sie die Platte in das Gerät und aktivieren das laufende Programm.
  • Parameter Einzelheiten Bemerkungen
    Nachweisverfahren Quantitative Hydrolyse-Sonde
    Thermische Zyklusbedingungen
    Anfängliche Denaturierung und Enzymaktivierung 95 ° C für 10 min
    Denaturierung 95 ° C für 15 sec wiederholen 45 mal
    Glüh- und Erweiterung 60 ° C für 60 sec
    Plattenarray
    Standardkurve Dd1 - DD8 3 Wiederholungen pro Verdünnung in 1-8 Vertiefungen bei den Top-3 Reihen
    Nicht-Template-Steuerung (NTC) Nuclease freies Wasser (NFW) 3 Wiederholungen in der 9. gut an der Spitze3 Reihen.
    analysierte Proben DNA aus den Filtern extrahiert 3 Wiederholungen pro Probe bei den restlichen Brunnen.
    Primer-Set pro jede Vertiefung
    Probenvolumen 10 ml

    Tabelle 3:. Details zum q-PCR - Betriebssoftware Details der Analyse Parameter in die Datei q-PCR - Programm eingegeben werden.

    Reagens Volumen pro Reaktion (ml) Anzahl der Reaktionen Ermäßigung für Fehler(5%) Das Gesamtvolumen Mix (ml)
    Taq-Polymerase-Mix 5 50 52.5 262,5
    F-Primer (10 mM) 0,5 50 52.5 26,25
    R Primer (10 mM) 0,5 50 52.5 26,25
    Nuclease freies Wasser 3 50 52.5 157,5
    DNA - 1 ml wird direkt in die Ziel Vertiefungen in der 96 Platte hinzugefügt werden.

    Tabelle 4:. Quantitative-PCR - Reaktionsmischung Berechnung Volumen pro Reaktion, die Anzahl der Reaktionen, Zulage für Fehler, und die berechnete Gesamt Volumen werden sollen, hinzugefügt in der Reaktionsmischung pro Reagenz detailliert.

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    Representative Results

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    Es ist üblich , atmosphärischer Aerosole zu studieren "off-line" , analysiert der abgetasteten Filter verwenden (siehe Abbildung 2). 32 Chemische Analysen des abgetasteten Materie umfassen organische (zB Protein, Kohlenwasserstoffmoleküle, Saccharide) und anorganischen (zB Metalle, Salze) Gehalt . Biologische Analysen umfassen lebensfähigen und nicht lebensfähige Mikroorganismen Gehalt, Artbestimmung einer DNA-Ansatz oder Mikroskopie, sowie DNA-basierte Quantifizierung verwenden.

    Figur 2
    Abbildung 2: Filer Probenanalyse Flußdiagramm Filter nach Luftabtastung (A) Herstellung des Filters für Downstream - Analysen (B), und die Analyse der Probenbestandteile (C)..

    e = "1"> Für die Endotoxin - Gewinnung, Filterteilproben (1,12 cm 2) für 60 min bei Raumtemperatur in 1 ml PFW geschüttelt. Die Proben werden dann für 10 min bei 375 x g zentrifugiert. Verschiedene Zentrifugiergeschwindigkeiten können in unterschiedlichen Extraktionseffizienzen führen, wie in 3A dargestellt.

    Ein vorläufiger Test für Extraktionseffizienz sollte für den spezifischen Filter ausgewählt und Protokoll durchgeführt durchgeführt werden. In 3B sind höhere Extraktionswirkungsgrade von Spick sauber erhalten , verglichen mit gesampelten Quarzfilter, und diese beiden Wirkungsgrade sind geringer als die durch direkte Erfassung der Standardlösung erreicht. Wie an anderer Stelle diskutiert, beeinflussen die Art der Umgebungs Aerosolen auf dem Filter abgetastet können auch die Endotoxin - Extraktionseffizienz. 14,33

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    Abbildung 3: Endotoxin Extraktionseffizienz Die Wirkung der Zentrifugationsgeschwindigkeit (A) und die Filterbelastung (B) auf Endotoxin Extraktionseffizienz.. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Die Reaktion zur Endotoxin-Nachweissystemen beinhaltet eine 1: 1-Verhältnis von LAL-Reagenz auf die Endotoxin-Standard, die Probe extrahiert Endotoxinen oder die Rohlinge. Es wird empfohlen, Triplikaten für die Probenanalyse verwendet werden. Doch für Standardkurven, sind Duplikate ausreichend. Wenn die Absorptionsablesungen (bei 405 nm) abgeschlossen sind, wird die sich ergebende optische Dichte (OD) untersucht, nachdem sie in eine Datenanalyse Tabellenkalkulationsprogramm zur weiteren Analyse der Daten zu exportieren.

    Wie in der Endotoxin-Extraktion, ist es wichtig, eine vorläufige Analyse der DNA-Extraktionseffizienz unter den spezifischen experimentellen Bedingungen durchzuführen. Dies wird durch Aufstocken einer bekannten Menge einer Standardorganismus Zelllösung auf ein Stück aus dem Filter ausgeschnitten getan, nach dem DNA-Extraktionsprotokoll oben beschrieben.

    Die Konzentration des Ziel-Mikroorganismus aus den abgetasteten Aerosolen extrahiert q-PCR ermittelt. Hier wird die Hydrolyse Sondentechnik verwendet wird, was den Vorteil einer hohen Spezifität hat, wegen der zusätzlichen Sonde , gebunden an die Templat - DNA. 35 Die SYBR green Verfahren kann auch für diesen Zweck angewendet werden.

    Kalibrierungskurven werden von DNA aus den ausgewählten Organismen von Interesse extrahiert abgeleitet, mit dem Extraktionsverfahren oben beschrieben. Ein gemischter Pool der Reaktionsverbindungen, mit Ausnahme der DNA-Probe, Standard oder die Kontrolle, wird hergestellt und im Dunkeln gehalten und auf Eis, bis sie benötigt. Dann wird ein Aliquot des gemischten Pool in jede Vertiefung in einer 96 Mikrovertiefungs optischen Platte. Die DNA-Standard, Probe oder Kontrolle wird nach dem Reaktionsgemisch hinzugefügt nach dem Plattenarray. Nachdem alle Reagenzien in die Platte eingesetzt worden sind, ist es das MeerLED mit einem optischen Klebefolie und abzentrifugiert alle Tröpfchen von den Vertiefungen am Boden zu sammeln. Die Platte ist als für die Verstärkung und Signalerfassung thermischen Zyklus in die q-PCR-Instrument eingesetzt.

    Die Ausgangsdaten bestehen aus PCR Ct-Werte, die als die Zykluszahl definiert werden, bei dem die amplifizierte DNA Menge den Schwellenwert erreicht hat. Unter Verwendung der Kalibrierungskurve Werte kann die Konzentration der Ziel - DNA erhalten werden (siehe Abbildung 4). 36 der Zelle Mikroorganismus Konzentrationen aus den CT - Werte der Extraktionseffizienz berechnet werden kann , verglichen mit einem Haemocytometerzählung der Standard Organismus Lösung. 37

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Quantitative-PCR - Amplifikation Plot (A) und calibrat.Ionen - Kurve im Bereich zwischen 2 × 10 -4 -2 x 10 2 (B) für repräsentative gramnegative bakterielle DNA durchgeführt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

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    Diese Arbeit beschreibt Extraktion und Nachweismethoden für beide Endotoxinen und DNA, die in Aerosolproben auf Filtern gesammelt zu quantifizieren. Die Methoden erfordern eine genaue Routinen und kann leicht so lange durchgeführt werden, wie der Experimentator auf wenige wesentliche und wichtige Punkte hält sich hier diskutiert.

    Für die Endotoxin-Nachweisschritt zu beachten, dass das Lysat Lösung ziemlich viskos und neigt dazu, Blasen beim Pipettieren zu erzeugen. Es ist schwierig, dich Blasen zu entfernen, und sie führen zu Veränderungen in den Mikrotiterplatten-Leser Werte. Daher ist es wichtig, dass die Probe in der Platte auf den ersten Platz und erst nach sicherzustellen, dass alle Luftblasen verschwunden sind, mit der Zugabe des Lysats Lösung fortzusetzen. Eine hilfreiche Technik Blasenbildung in diesem Schritt zu verhindern, ist langsam mit der Pipette zu arbeiten und es nicht zu drücken, den ganzen Weg, wenn das Lysat in die Vertiefungen fließt. Als Reaktion sofort beginnen, sobald wird das Lysat der endoto hinzugefügt werdenxin extrahieren, es ist wichtig, das Lesen so schnell wie möglich zu starten. Zur Verkürzung kann das Lysat Additionsschritt, eine Mehrkanalpipette verwendet werden. Man beachte , dass in einigen Kits und Protokolle gibt es eine zusätzliche Vorinkubationsschritt der Proben bei 37 ° C für 10 min, nachdem es in der Mikro titter Platte angeordnet ist. 29. Erst nach diesem Schritt kann das Lysat zugegeben werden.

    Ein wichtiger Punkt für die Umweltprobenextraktion von Endotoxinen ist die Gegenwart von Inhibitoren in den Proben (zB in hoher Verschmutzung Luftprobe). In diesem Fall wird Verdünnungs kritisch und kann falsche Verbesserung verhindern, die typischerweise für nicht verdünnten Probe beobachtet. 38

    Ebenso gibt es mehrere Punkte von Bedeutung für den Erfolg und die Zuverlässigkeit des q-PCR-Nachweis zu gewährleisten. 1) Da das Volumen der Lösungen sehr klein ist, wenn sie nicht am Boden der Vertiefung angeordnet sind, kann der Wassergehalt in der DNA Abfall durch Verdampfung verringert werden while Anordnung der Proben auf der Platte. Um dieses Problem zu vermeiden, stellen die DNA-Probe am Boden des Bohrlochs, kühlen die Platte, indem sie es auf Eis oder einem anderen Kühlplattform platzieren und bereiten alles im Voraus diesen Schritt so weit wie möglich zu beschleunigen. 2) Bei der Herstellung der q-PCR - Reaktionsgemisch (Tabelle 4), decken sie die Röhre mit einer Aluminiumfolie zu verhindern Photodegradation. 3) Das vorliegende Experiment beschreibt die Herstellung einer 10 & mgr; l-Reaktion. Dennoch ist in einigen q-PCR Instrumenten ist das Reaktionsvolumen 20 & mgr; l, und dann das Volumen jedes Reagenz entsprechend vervielfacht. 4) Die optimalen thermischen Zyklusbedingungen können für verschiedene Primer und Polymerase - Mixes ändern. 39 Beispielsweise sollte die Glühtemperatur bei etwa der Schmelztemperatur der Primer eingestellt werden, und wird empirisch als die Temperatur bestimmt , bei der Verstärkung am effizientesten auftritt. Aus diesem Grund ist es auch wichtig, um eine Kalibrierungskurve für jeden analysierten q-PCR herzustellen,Platte, um sicherzustellen, dass die Quantifizierung genau ist. Kalibrierungskurven sowie Standard-dotierten Filter dienen auch als eine positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass keine Hemmung auftritt. Um zu vermeiden, Inhibierung, wird empfohlen Extraktions Kits Einsatz Inhibitoren aus Umweltproben zu entfernen. 5) Die Anzahl der Wärmezyklen in diesem Experiment wurde auf die maximale Anzahl eingestellt, 45, um die Empfindlichkeit als die DNA-Konzentrationen von den Filter Extrakte waren sehr gering zu erhöhen. 6) Stellen Sie sicher, dass die Zyklen Threshold (Cτ) Werte für alle DNA-Proben sind innerhalb des dynamischen Bereichs der Eichkurve. Auch sicherstellen, dass jede Verstärkung einer negativen Kontrollprobe zumindest acht Zyklen größer ist als die der DNA-Proben. 7) Wenn mit dem SYBR Green Reagens arbeiten, stellen Sie sicher, dass es keine mehrfachen Schmelztemperaturspitzen pro Reaktion.

    Für turbidimetrischen Test wurden zwei Endotoxin Quantifizierungsmethoden zur Verfügung: die kinetische Methode und die Endpunt chromogenen Verfahren. In der kinetischen Ansatz, wie er in diesem Protokoll durchgeführt wird, die Zeit für die Probe erforderlich zu erreichen maximale Extinktion gemessen wird. Hier wird eine kürzere Reaktionsintervall zeigt eine höhere Endotoxin-Konzentration in der Probe. In dem Endpunkt chromogenen Methode wird der Lichtabsorption nach einer definierten Inkubationszeit gemessen, um die Endotoxin-Konzentration zu bestimmen. Beide Methoden erfordern eine Standard - Kalibrierungskurve für die Quantifizierung. 40

    Obwohl die Präzision und Genauigkeit der oben beschriebenen Endotoxin Extraktion sehr hoch ist, 14 der Extraktionswirkungsgrad verbessert werden könnte. Es ist möglich, dass ein anderer Typ von Filter oder die Zugabe eines Detergens (beispielsweise Polysorbat 20) mit dem Extraktionsverfahren konnte die Ausbeute von Endotoxin aus dem Filter extrahiert verbessern. Endotoxin Extraktionseffizienz kann auch durch verschiedene Partikel in parallel auf dem Filter abgetastet beeinflussbar. 33 Für unseren Versuchsaufbau, derNachweisgrenze der Methode wird geschätzt , 0,001 EU m -3 sein. 14

    Techniken für die DNA-Extrakt quantifizieren, die als Alternative zu den q-PCR umfassen Klonen Ansatz und digitale Tröpfchen PCR (DD-PCR) dienen könnte. Die Vorteile der q-PCR über das Klonen Ansatz für Artbestimmung sind seine höhere Empfindlichkeit und dass es erfordert eine geringere DNA-Konzentration für den ersten Amplifikationsschritt. Darüber hinaus, anders als q-PCR, Klonierung Methode, die arbeitsintensiv und zeitraubend ist, ist nicht quantitativ. Eine alternative Methode zur Quantifizierung der DNA - Extrakt ist DD-PCR. 19 Der Vorteil dieser Technik besteht darin , dass es nicht um eine Kalibrierungskurve erforderlich ist , da die Detektion auf einem einzigen DNA - Stamm in jedem Tröpfchen basiert. Jedoch für Umweltproben gibt es keine zuverlässige Methode bisher für tröpfchen Nachweis von DNA aus den Filtern extrahiert.

    Die Effizienz, mit der DNA fr extrahiert wirdom der Filter, sowie die Genauigkeit und Präzision der DNA Messungen kann durch Faktoren wie Filtertyp, Zielmikroorganismen und Instrumentierungs beeinflussbar. 34,41 Deshalb sollte es definiert vor der Probenanalyse werden. In unserem Versuchsaufbau kann die Nachweisgrenze erreichen bis zu 3,5 Genom m -3. 14

    Zum Schluss das hier beschriebene Verfahren ist anwendbar für die Identifizierung und Quantifizierung von Luft-Proben biologischen Spezies von sowohl anthropogenen und natürlichen Quellen. Präzise Verwendung des geeigneten Assays ermöglicht wertvolle Untersuchungen von komplexen Umweltfragen durchgeführt werden.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

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    References

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    Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt
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    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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