Abstract
Открытый исследования аэрозоля обычно использует твердые частицы сэмпл на фильтрах. Эта процедура позволяет различным характеризации собранных частиц, которые будут выполняться параллельно. Цель метода, изложенного здесь, чтобы получить очень точную и надежную анализ содержания эндотоксина и ДНК биоаэрозолей, экстрагированных из фильтров. Экстрагирование с высокой молекулярной массой органических молекул, такие как липополисахариды, из дискретизированных фильтров включает встряхивании образца в среде свободной от пирогенов на водной основе. Последующий анализ основан на ферментативной реакции, которые могут быть обнаружены с помощью турбодиметрического измерения. В результате высокого содержания органических веществ на дискретизированных фильтров, извлечение ДНК из образцов осуществляется с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК, которая была первоначально разработана для почв и модифицируется с целью улучшения выхода ДНК. Обнаружение и количественное определение конкретных видов микроорганизмов с помощью количественной полимеразной цепи Reactiна (Q-PCR) анализа, и по сравнению с другими существующими методами.
Introduction
Отбор проб воздуха на фильтрах является основным инструментом в атмосферных исследований аэрозолей. 1 Отобранная фильтры являются отправной точкой для различных химических, физических и биологических характеристик собранных частиц окружающей среды. 2-11 Преимущество такого подхода состоит в том, что различные анализы могут быть осуществляется в автономном режиме на том же образце. Компиляция данных из всех различных анализов позволяет исследователю получить хорошее представление о характеристиках собранных частиц и помогает в решении сложных вопросов в области атмосферных наук. 12,13 Так , например, морских и внутренних воздушных проб , взятых в течение того же период можно сравнить с относительно отобранного токсичности частиц и биологического состава. 14 для данного исследования, липополисахариды (LPS), компоненты на грамотрицательных бактериальных клеточных стенок, также известные как эндотоксины, были извлечены из фильтров пробы на суше и на внутренним местом, и были оценены с помощьюЛаймулус амебоцит лизат (LAL) тест. Параллельно с этим, геномная оценка содержания бактерий (общее количество бактерий, грамотрицательных и цианобактерии) проводили на том же образце с использованием количественной полимеразной цепной реакции (Q-PCR). Тест LAL основан на измерении мутности , образующихся после добавления водного экстракта amebocytes из подковы краба, Limulus Полифема, к водному раствору , содержащему эндотоксинов. Чем выше концентрация эндотоксина в образце, тем быстрее мутность развивается. 15 Анализ Q-ПЦР на основе сигнала флуоресценции , испускаемой в качестве специфического фрагмента ДНК усиливается. 16 с помощью реального времени наблюдения сигнала во время экспоненциальной фазы ПЦР реакции и калибровочный со стандартной кривой, исходное количество ДНК может быть определена количественно. Сочетание этих двух анализов вместе с другими, как подробно описано в другом месте, 14 может обеспечить хорошую оценку уровней эндотоксина иКоличество источника бактерий в образцах.
Цель метода, изложенного здесь, чтобы получить очень точную и надежную анализ содержания эндотоксина и ДНК биоаэрозолей, экстрагированных из фильтров. В то время как методы отбора проб физические и неорганические химические характеристики аэрозолей хорошо известны и, совсем недавно, методы были разработаны , чтобы исследовать ее органического компонента вещества, 17 наблюдается скудное исследование на биологическую составляющую аэрозолей. 18 Обоснование тока способ устранить этот пробел, представляя в деталях надежный метод для извлечения, анализа и определения биологической фракции в воздухе аэрозолей. 14
Метод подробно здесь , как ожидается , найдут применение широко распространенный в биологических внутренних и наружных научно - исследовательских проектов , связанных с аэрозольных фильтров анализа. 20-24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Подробный перечень всех материалов и инструментов, используемых в данном протоколе приведен в разделе Материалы.
1. Отбор проб воздуха на фильтрах
- Подготовка фильтров
- Для получения высокой выборки объема, используйте 20,3 х 25,4 см 2 фильтров. Выберите конкретный тип фильтра , который наилучшим образом соответствует потребности в научных исследованиях, а также размер фильтра отсечки, если это применимо. 1 Здесь микроволокна фильтры используют кварцевые.
- Предварительно выпекать фильтры, предназначенные для органических и биологических проб соединения для разрушения органических остатков. Чтобы предварительно испечь фильтров, завернуть их по отдельности в алюминиевую фольгу, а затем выпекать их в лабораторной печи при температуре 450 ° С в течение по меньшей мере 5 ч.
- Храните испеченные фильтры при температуре от -20 ° С до отбора проб.
- Погрузочно-разгрузочные работы и инструмент отбора проб воздуха
- Чистая остаточная пыль с головы высокой пробоотборником. Протрите детали с чистыми бумажные салфетки и дать им возможность воздушно-сухой Befoповторное повторное подключение их к сэмплер.
- Лечить фильтр кассеты с этанолом, и работать в перчатках и пальто лаборатории во все времена.
- Поместите предварительно обожженных фильтр внутри чистого фильтра кассеты, и действовать в соответствии с сэмплера инструкции большого объема.
- Отметьте дату и любые необычные погодные условия, если это применимо (например , дождь, пыльная буря) на алюминиевой пленкой, а не сохранить его в чистом месте до завершения выборки.
- Собрать отобранной фильтр и сложите его пополам, с дискретизированный стороной, обращенной внутрь.
- Заверните фильтр в оригинальной алюминиевой фольги и хранить при температуре -20 ° C до анализа.
Примечание: Если промежуток времени между отбором и анализом проб больше, чем 2-х месяцев, хранить образцы при -80 ° С, чтобы избежать деградации органического и биологического материала.
2. Анализ эндотоксина
Примечание: дезинфицируют поверхность работы с 70% этаноломd работа с апирогенном трубы, советы и реагентов только. Если изделия из стекла используются, предварительного нагрева при температуре 250 ° С в течение 30 мин, или 200 ° С в течение 60 мин требуется. 25 Подготовьте все реагенты в шкафу класса II биологической безопасности и работать в перчатках и пальто лаборатории во все времена.
- Подготовка реагентов
- Следуйте протоколу комплекта производителя LAL регидрировать лизат непосредственно перед употреблением. 26 Нажмите мягко на флаконе , чтобы сместить LAL оставшиеся на стенках бутылки. Поднимите пробку осторожно, чтобы сломать вакуум. С помощью шприца иглами, добавьте 5 мл пирогенов воды (PFW) во флакон регидрировать все содержимое лизата и аккуратно перемешать, чтобы избежать образования пены.
- Уплотнение флакона с пластиковой парафиновой пленки, когда он не используется и хранить при температуре 4 ° С в течение до двух дней. Храните оставшуюся лизат при -20 ° С в течение до трех месяцев.
Примечание: Этот реагент может быть заморожено только один раз. - Увлажняет контрольный стандарт эндотоксина (CSE), который содержит 0,5 мкм; г Е. палочка, в соответствии с протоколом производителя. 27 Определите определенное количество воды , которое нужно добавить во флакон с сайта CSE 28 производителя, введя номер лота для набора , где указанный на сайте. Конечная концентрация E. палочки во флаконе, измеряется в единицах эндотоксина (ЕС, где 10 EU = 1 нг). Добавьте описание этого флакона ed0.
- Уплотнение флакона CSE с пластиковым парафиновой пленки, когда он не используется и хранить при температуре 4 ° С в течение до 4 недель.
- Стандартная кривая и подготовка Шипастое-фильтр
- В кабинете биологической безопасности класс II, подготовить 22 пирогенов 2 мл центрифужные пробирки , содержащие снижающие количество CSE (трубки Ed1-ED11) или нет CSE (заготовка трубка , содержащая только Pfw) для получения дублируется эндотоксина разбавления серии, как показано в таблице 1.
- В кабинете биологической с круговым потоком, вырезать 22 круглых кусков чистой, предварительно обожженной фильтр с использованием вылеченный 1.1 2 см пробка диаметром буром.
- Поместите фильтр пары в стерильные чашки Петри.
- Спайк 50 мкл из каждого члена эндотоксина разведения серии Ed2-ED11 и из заготовки тюбика на соответствующую пару фильтров.
- Оставьте чашки Петри, содержащие фильтры шипами открытые под капотом высохнуть в течение 30 мин.
- Поместите каждый фильтр образной вставки в свободной от пирогенов 2 мл пробирку.
| трубка | Конечная концентрация эндотоксина (EU мл -1) | Стандартный объем эндотоксина (мл) | Пирогена объем воды (мл) | Общий объем (мл) | ed0 | 2500 | основной раствор* | 5 |
| Ed1 | 1000 | 80 (от ed0) | 120 | 200 |
| Ed2 | 100 | 20 (от Ed1) | 180 | 200 |
| Ed3 | 50 | 10 (от Ed1) | 190 | 200 |
| ED4 | 25 | 5 (от Ed1) | 195 | 200 |
| eD5 | 12,5 | 2.5 (от Ed1) | 197,5 | 200 |
| ED6 | 6,25 | 1,25 (от Ed1) | 198.75 | 200 |
| ED7 | 3.125 | 6,25 (от Ed2) | 193.75 | 200 |
| ED8 | 1,563 | 6,25 (от ed3) | 193.75 | 200 |
| ED9 | 0.781 | 6,25 (от ED4) | 193.75 | 200 |
| ED10 | 0.391 | 6,25 (от eD5) | 193.75 | 200 |
| ED11 | 0,195 | 6,25 (от ED6) | 193.75 | 200 |
| пустой | 0 | 0 | 200 | 200 |
Таблица 1:. Эндотоксина Стандартная кривая концентрации эндотоксина, объем стандартной эндотоксинов и пирогенов добавляемой воды, а общий объем полученного детализированы для каждого разведения трубки в калибровочной кривой.
- Эндотоксина Извлечение из экспериментальной и Шипастое Фильтры
- В кабинете биологической с круговым потоком, срезанные фильтры для отбора проб (из шага 1.2) в круглых деталей с использованием вылечен 1,12 см пробка диаметром мотылька, и поместить их вместе с зубчатыми стандартных фильтров (из шага 2.2), в апирогенной 2 мл пробирки (т.е. образца трубы).
- Добавляют 1 мл Pfw в пробирки и встряхнуть их в течение 60 мин при комнатной температуре, используя лабораторный шейкер.
- Центрифуга пробирки с образцами в микроцентрифуге при 375 х г в течение 10 мин. 29
- Передача йе супернатант, который содержит эндотоксинов, в новый пирогенов 2 мл пробирку.
- Limulus амебоцит лизата (LAL) Тест
- Определить концентрацию эндотоксина в образцах, выполнив тест LAL в апирогенной 96-луночный микропланшет с плоским дном и крышкой.
- Запланируйте блок плиты заранее, как показано на рисунке 1. Включите стандартную кривую , полученную непосредственно от стандартных решений эндотоксина Ed2-ED11 (и , таким образом , охватывающих диапазон концентраций 100-0.195 ЕС / мл (смотри раздел 2.2)) в каждой запущенной пластине , Стандартная кривая должна занимать колодцы 1-10 рядов А и B пластины. Отложите скважин 11-12 в этих строках для пустых образцов (что в общей сложности четырех заготовок).
- Включите планшет-ридере и запрограммировать его для кинетической реакции, включающей инкубацию в микропланшет при температуре 37 ° С и встряхивая каждые 5 мин, с последующим измерением абсорбции при 405 нм. Повторите 18 раз в течение 1,5 ч.
- Определить efficienТиЦ , с которой эндотоксины извлекаются из образцов фильтров (то есть., полученные от обогащенных стандартных фильтров образцов) через разделение рассчитанного количества эндотоксина по первоначальной суммы с шипами.
- Начало анализа путем размещения 50 мкл стандартных растворов эндотоксина (от стадии 2.4.2), или зубчатым экстракта фильтра и его заготовок (из раздела 2.3), или из экспериментальных образцов и его заготовок (также из раздела 2.3), в соответствии с запланированной пластины массива (рисунок 1) и закройте крышку.
- В каждую лунку, быстро добавить 50 мкл раствора LAL, и осторожно встряхните планшет в горизонтальном направлении в то время как он помещается на стол перед подъемом его в считывающее устройство.
- Поместите пластину в ридере и запустить экспериментальный прогон.
Рисунок 1:. Эндотоксина пластины массива Эксвполне достаточный из массива анализа эндотоксина в 96-луночный микропланшет.
3. геномный анализ
Примечание: Для экстракции ДНК, дезинфицируют поверхность работы с 70% этанола и работать с стерильные пробирки, наконечники и реагенты только. Для Q-ПЦР анализа ДНК, дезинфицируют поверхность работы с поверхностью ДНК-дезинфицирующего средства. Подготовьте все реагенты в шкафу биологической безопасности II класса и работать в перчатках и пальто лаборатории во все времена.
- Получение ДНК праймеры и зонды
- До экстракции ДНК, либо заказать коммерчески доступный набор праймеров и зонд (если метод гидролиза зонда применяется), или создать новый набор праймеров и зонда с использованием праймера проектирования вычислительных средств. 30
- Регидратировать праймеров в соответствии с протоколом производителя с использованием либо 10 мМ Трис-0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (ТЕ буфер) или ПЦР класса воды.
Примечание: Рекомендуется, чтобы растворить первоначальный ПЦР-праймер-йOck в буфере ТЕ с низким ЭДТА (0,1%), так как он предотвращает деградацию праймера при хранении в течение более длительного времени. Используйте ПЦР-класса воды для последующих разведений, чтобы уменьшить количество ЭДТА, которые могут ингибировать реакцию ПЦР. - Подготовка аликвоты 50 мкл или 100 мкл праймера и зонда в стерильные 0,5 мл пробирки и хранят при -20 ° C до анализа.
- Стандартный Cell Концентрация Оценка До ДНК экстракции
- В подходящего размера центрифужную пробирку, готовят стандартный раствор клеток из видов микроорганизмов , представляющих интерес (труба Od0, Таблица 2А). Смешайте клеточной суспензии с помощью пипетки вверх и вниз в трубку 7-10 раз с помощью пипетки с небольшим отверстием.
- Если клетки окрашены (например , некоторые грибковые споры), не выполняют процедуры окрашивания. Если требуется окрашивание клеток, разбавленные суспензии клеток в подходящем красителя для микроскопического обнаружения интересующих клеток. 31
- Очистите крышку скольжения и hemocytomЭтер с этанолом. Смочить и прикрепить крышку скольжения на гемоцитометра.
- Загружаем около 8 мкл клеточной суспензии в обеих камерах гемоцитометра, осторожно касаясь края покровным кончиком пипетки и заполнения камеры под действием капиллярных сил. Не над / под заполнить камеру.
- Определить количество клеток, рассматривая их под микроскопом при увеличении 400X (40X в цель и 10X в окуляр). Девять квадратов измерения 1 х 1 мм 2 и расположены в сетке 3 х 3 следует рассматривать. Фокус микроскопа на одной из четырех угловых квадратах сетки (с большим увеличением можно использовать). 1 х 1 мм 2 квадрат должен содержать 16 меньших квадратов.
- Граф все ячейки в угловых квадратов четыре 1 х 1 мм 2, а также в средней площади сетки 3 х 3. Если есть слишком много или слишком мало клеток, чтобы их сосчитать, повторите процедуру, либо концентрирования или разбавления исходной суспензии клеток в зависимости от обстоятельств (15-50 ячеек должны накладывать исключительности область 1 мм 2).
- Вычислить концентрацию клеток (клеток мл -1) в стандартной клеточной суспензии Od0 из клетки рассчитывать в среднем через пять подсчитанных квадратов следующим образом : Количество ячеек Количество мл -1 = средняя ячейка квадрат -1 коэффициент разбавления 10 4.
- Оценка эффективности ДНК Extraction
- Подготовьте девять стерильные 0,5 мл пробирки согласно таблице 2А.
- Разбавляют стандартный раствор клеток (Od0) содержит около 10 7 кл мл -1 в общем объеме 20 мкл (OD1).
- Добавьте 18 мкл стерильной нуклеазы без ПЦР-класса воды (NFW) в пробирки OD2-Od8 и 20 мкл в пустую пробирку, Od9.
- Передача 2 мкл раствора клеток из OD1 в OD2. Пипетка осторожно перемешать и передать 2 мкл из пробирки OD2 в Od3. Продолжить разбавляя клетки таким же образом, вдоль трубок до и включая трубки Od8 -оbtain последовательного разбавления 10 7 -10 0 кл мл -1.
- В кабинете биологической с круговым потоком, вырезать 18 круглых кусков чистой, предварительно обожженной фильтр, используя вылеченный 1,12 см пробка диаметром мотылька. Поместите фильтры в пар в стерильные чашки Петри.
- Шип по 10 мкл из разведений OD1 в Od8 и из заготовки трубчатой Od9 на каждую из спаренных фильтров, таким образом, что имеется один фильтр пара, соответствующая каждой стандартной концентрации клеток.
- Оставьте чашки Петри открытые под капотом и дайте им высохнуть в течение 30 мин.
- Поместите каждый фильтр кусок в стерильном завинчивающейся крышкой 2 мл пробирку и извлечь ДНК в соответствии с процедурой, описанной в разделе 3.4.
- ДНК Извлечение из экспериментальной и Шипастое Фильтры
Примечание: Для выделения ДНК из фильтров, использовать коммерческие наборы, предназначенные для экстракции ДНК из почвы в соответствии с протоколом производителя со следующими изменениями.- Для каждого филTer образца (OD1-Od8), готовят смесь кислых промытую стеклянных шариков в 0,5 мл стерильной пробирке. С помощью 0,1 г шариков, имеющих диаметр 425-600 мкм и 0,3 г шариков, имеющих диаметр ≤106 мкм.
- В кабинете биологической с круговым потоком, вырезать три круглые куски из произвольно выбранных местах на каждом образце фильтра с использованием вылеченный 1,12 см диаметр пробки мотылька, и поместите их в завинчивающейся крышкой 2 мл пробирки.
- Добавьте стакан шарик смеси в пробирки.
- Добавьте буфер клеточного лизиса, поставляемый с использованием набора для экстракции в каждую пробирку, в кабинете биологической, с количеством, указанным в протоколе изготовителя.
- Приготовьте ведро льда и разрушения клеток механическим способом с помощью бусинки колотушки.
- Удар бусинки в течение 1 мин, а затем поместить их на льду в течение 1 мин. Повторите пять раз.
- Продолжить с протоколом комплекта поставщика от стадии после лизиса.
- После элюирования с помощью прилагаемого буфера для элюции (содержит 10 мМ Трис бuffer) или NFW, загрузите элюированный образец через колонку еще раз, чтобы улучшить выход ДНК.
Примечание: Если не анализировались в тот же день, что и экстракции ДНК, образцы можно хранить при -20 ° С до анализа.
| A- Приготовление стандартной серии Cell Разбавление | ||||
| трубка | Конечная концентрация клеток (клеток мл -1) | Стандартный объем ячейки (мл) | Nuclease свободный объем воды (мл) | Общий объем (мл) |
| Od0 | определить, с Подолаocytometer счетнокамерное | |||
| OD1 | следует элюирование в диапазоне от 10 7 кл мл -1 | 20 | ||
| OD2 | 10 -1 OD1 | 2 OD1 | 18 | 20 |
| Od3 | 10 -2 OD1 | 2 OD2 | 18 | 20 |
| OD4 | 10 -3 OD1 | 2 Od3 | 18 | 20 |
| Od5 | 10 -4 OD1 | 2 OD4 | 18 | 20 |
| Od6 | 10 -5 OD1 | 2 Od5 | 18 | 20 |
| OD7 | 10 -6 OD1 | 2 Od6 | 18 | 20 |
| Od8 | 10 -7 OD1 | 2 OD7 | 18 | 20 |
| пустой | 0 | 0 | 20 | 20 |
| B- Получение ДНК стандартной кривой | ||||
| трубка | Конечная концентрация ДНК (мг мл -1) | Стандартный объем ДНК (мл) | Nuclease свободный объем воды (мл) | Общий объем (мл) |
| определить с NanoDrop | ||||
| DD1 | следует элюирование в диапазоне от 10 : 1 мг мл -1 | 20 | ||
| Dd2 | 10 -1 DD1 | 2 DD1 | 18 | 20 |
| DD3 | 10 -2 DD1 | 2 DD2 | 18 | 20 |
| DD4 | 10 -3 DD1 | 2 DD3 | 18 | 20 |
| DD5 | 10 -4 DD1 | 2 DD4 | 18 | 20 |
| DD6 | 10 -5 DD1 | 2 DD5 | 18 | 20 |
| DD7 | 10 -6 DD1 | 2 DD6 | 18 | 20 |
| DD8 | 10 -7 DD1 | 2 DD7 | 18 | 20 |
| пустой | 0 | 0 | 20 | 20 |
Таблица 2:. ДНК Стандартная кривая Стандартный микроорганизм клеток серии разведений (А) подробное для стандартного объема клеток, объем NFW, и общий объем в каждой разведений трубке. ДНК стандартный препарат кривой (В), подробное для стандартного объема ДНК, объем NFW, и общий объем в каждой разведений трубке.
- ДНК Стандартная кривая Получение
- С помощью спектрофотометра для определения концентрации ДНК стандартного образца ДНК (Dd0) при длине волны 260 нм.
- Подготовьте девять стерильные 0,5 мл пробирки , из которых для получения стандартной кривой ДНК, как показано в таблице 2B.
- При необходимости разбавить стандартного раствора ДНК Dd0 в пределах диапазона концентраций 1-10 мкг мл -1 в первой трубке (DD1) в общем объеме 20 мкл.
- Добавьте 18 мкл NFW в пробирки DD2-DD8 и 20 мкл в пустую пробирку.
- Передача 2 мкл стандартного раствора ДНК из DD1 в DD2. Пипеткой осторожно перемешать, а затем передать 2 мкл от DD2 к DD3. Продолжить разбавляя ДНК таким же образом , вдоль трубы , чтобы достигнуть последовательного разбавления 10 0 -10 -7 в трубах Dd2-DD8 вместе с пустой containi трубкинг только NFW.
Примечание: Если не анализировались в тот же день экстракции, образцы хранят при температуре -20 ° С до анализа.
- Включите инструмент Q-PCR заранее, чтобы разогреть.
- В новом программном файле, вставьте детали для д-PCR запуска в приборостроении эксплуатации программного обеспечения , как указано в таблице 3.
Примечание: Различные инструменты имеют различные оптимальные сроки для каждого этапа термического цикла. Этот вход указан в руководстве прибора. - Лечить рабочую поверхность с поверхностью ДНК-дезинфицирующего и работать только с стерильные пробирки, советы и реагентов.
- Приготовьте ведро льда рядом с верстака. Магазин Taq-полимераза смесь на льду.
- Подсчитайте общее количество реакционных скважин, которые будут заняты в пластине. Сделать теоретическое пособие для дополнительных реакций (5%) и умножить увеличенное число реакций по объему на реакцию для расчета общего reactioп объем.
- Готовят реакционную смешанный бассейн, начиная с NFW, грунтовок, зондом и, наконец, полимеразной смеси Taq. Смотрите пример для расчета объема для смешанного пула в таблице 4.
- Хранить в реакционную смесь в темноте и на льду до использования.
- Поместите 1 мкл стандартной ДНК, ДНК образца или NFW (в качестве негативного контроля) внутри лунок в микропланшете Q-PCR в трех повторах.
- Убедитесь в том, что пластина находится в держателе, чтобы предотвратить его от прикосновения к рабочей поверхности и держать его в чистоте.
- Добавить 9 мкл смешанного пула (таблица 4) , в каждую реакционную лунку.
- Закройте планшет с оптической клейкой пленкой и плотно заклейте его со всех сторон.
- Спин вниз пластины в центрифуге с ведрами пластины в течение 1 мин при 1000 XG перед установкой его в устройство Q-PCR.
- Поместите пластину в прибор и активировать работающую программу.
| параметр | Детали | Комментарии |
| метод обнаружения | Количественный гидролиз зонда | |
| Термические условия велоспорта | ||
| Первичная денатурация и активация фермента | 95 ° С в течение 10 мин | |
| денатурация | 95 ° С в течение 15 сек | повторить 45 раз |
| Отжиг и расширение | 60 ° С в течение 60 сек | |
| массив Plate | ||
| Стандартная кривая | DD1 - DD8 | 3 повторений в разведении в 1-8 лунок на 3 верхних строк |
| Контроль нешаблонном (NTC) | Нуклеазы свободной воды (NFW) | 3 повтора в 9 - м а в верхней3 ряда. |
| проанализированных образцов | ДНК, выделенную из фильтров | 3 повтора на пробу в оставшиеся лунки. |
| набор праймеров | в каждую лунку | |
| объем образца | 10 мл |
Таблица 3:. Детали для операционной программного обеспечения Q-PCR Подробная информация о параметрах анализа , который необходимо ввести в файл программы Q-PCR.
| реактив | Объем в реакции (мл) | Количество реакций | Учет ошибок(5%) | Общий объем смеси (мл) |
| Taq полимераза смесь | 5 | 50 | 52,5 | 262,5 |
| F праймер (10 мМ) | 0,5 | 50 | 52,5 | 26.25 |
| R праймер (10 мМ) | 0,5 | 50 | 52,5 | 26.25 |
| Нуклеазы свободной воды | 3 | 50 | 52,5 | 157,5 |
| ДНК - 1 мл будет добавлен непосредственно в целевые лунки в 96-пластины. | ||||
Таблица 4:. Количественный ПЦР-реакционной смеси Расчет объема в реакции, количество реакций, учет ошибок и общего расчетного объема чтобы быть добавлены в реакционную смесь на реагент детализированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обычно для изучения атмосферных аэрозолей с использованием "офф-лайн" анализ выбранных фильтров (рисунок 2). 32 Химический анализ отобранного вещества включают органические (например , белок, молекулы углеводородов, сахариды) и неорганические (например , металлы, соли) содержание , Биологические анализы включают жизнеспособные и нежизнеспособные содержание микроорганизмов, идентификации видов с использованием подхода ДНК или микроскопии, а также на основе ДНК квантификации.
На рисунке 2: файлера диаграмма потока пробы фильтров анализа после проб воздуха (А), подготовка фильтра для последующих анализов (В), и анализа компонентов образца (C)..
е = "1"> Для извлечения эндотоксина, фильтр подвыборки (1,12 см 2) встряхивают в 1 мл Pfw в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем образцы центрифугировали в течение 10 мин при 375 х г. Различные скорости центрифугирования может привести к различной эффективностью экстракции, как показано на рисунке 3А.
Предварительный тест на эффективность экстракции следует проводить для конкретного фильтра, выбранного и протокола выполняется. На фигуре 3В, более высокую эффективность экстракции получают из чистой пики по сравнению с дискретизированных кварцевых фильтров, и оба эти КПД ниже , чем достигаемое с помощью прямого обнаружения стандартного раствора. Как уже обсуждалось в других местах, характер окружающей среды аэрозолей , отобранных на фильтре также может влиять на эффективность экстракции эндотоксин. 14,33
g3.jpg "/>
Рисунок 3: эндотоксин эффективность экстракции Влияние скорости центрифугирования (А) и фильтра нагрузки (В) на эффективность экстракции эндотоксин.. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Реакция для обнаружения эндотоксинов включает в соотношении 1: 1 реагента LAL к стандарту эндотоксина, образец экстрагируют эндотоксинов или пропуски. Рекомендуется использовать трехкратном повторе для анализа проб. Тем не менее, для стандартных кривых, дубликатами достаточны. Когда показания поглощения (при 405 нм) завершены, в результате чего оптическая плотность (ОП) анализируется после экспорта в программу электронных таблиц данных анализа для дальнейшего анализа данных.
Как и в извлечении эндотоксина, важно провести предварительный анализ эффективности экстракции ДНК в специфических условиях эксперимента. Это делается с помощью пики известного количества стандартного раствора организмом клеток на кусок вырезать из фильтра, в соответствии с протоколом экстракции ДНК, описанной выше. Концентрация целевого микроорганизма, извлеченной из дискретизированных аэрозолей определяется с использованием Q-PCR. Здесь используется метод зонда гидролиза, который имеет преимущество высокой специфичности, из-за дополнительного зонда , связанного с ДНК - матрицей. 35 Зеленый метод SYBR также может быть применен для этой цели. Калибровочные кривые получены из ДНК, выделенной из выбранных организмов, представляющих интерес, с использованием метода экстракции, описанного выше. Смешанный пул соединений реакции, за исключением образца ДНК, стандарт, или контроль, готовят и хранят в темноте и на льду, пока не требуется. Затем аликвоту смешанного пула добавляется в каждую лунку в оптической пластине 96 микропланештным. Стандартная ДНК, образец, или элемент управления добавляется после того, как реакционной смеси в соответствии с блока плиты. После того, как все реагенты были вставлены в пластину, это мореВели с оптическим клейкой пленкой и центрифугировали, чтобы собрать все капли в нижней части лунки. Пластина, чем вставляется в прибор Q-PCR для амплификации термического цикла и обнаружения сигнала. Выходные данные состоят из значений PCR-Ct, которые определяются как число циклов, при котором усиливается количество ДНК достигает порогового уровня. Использование значений по калибровочной кривой, концентрация ДНК - мишени может быть получена (смотри рисунок 4). 36 концентрации клеток микроорганизма могут быть вычислены из значений Ct по эффективности экстракции по сравнению с количеством гемоцитометра стандартного раствора организма. 37 
Рисунок 4: Количественная-ПЦР - амплификации участка (А) и Калибр.ионная кривая в диапазоне от 2 × 10 -4 -2 · 10 2 (В) выполняется для представителей грамотрицательной бактериальной ДНК. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа описывает экстракции и обнаружения методов количественной оценки как эндотоксины и ДНК, присутствующей в аэрозольных пробах, собранных на фильтрах. Эти методы требуют точных процедур и могут быть выполнены легко, пока экспериментатор придерживается несколько существенных и важных моментов, обсуждаемых здесь.
Для стадии обнаружения эндотоксинов, обратите внимание, что решение лизат достаточно вязким и имеет тенденцию производить пузырьков при пипеткой. Трудно удалить тебя пузыри, и они приводят к изменениям значений микропланшет-ридер. Поэтому, важно, чтобы сначала поместить образец в пластине, и только после того, как обеспечить, чтобы все пузырьки исчезли, продолжают с добавлением раствора лизата. Полезный метод для предотвращения образования пузырей на этой стадии медленно работать с пипеткой, а не давить на весь путь при сливе лизата в лунки. В качестве реакции начинают сразу же, как только лизат добавляется к endotoэкстракт Xin, очень важно, чтобы начать чтение как можно скорее. Чтобы сократить шаг лизат Кроме того, многоканальную пипетку можно использовать. Обратите внимание , что в некоторых наборах и протоколах имеется дополнительная предварительная инкубация шаг образцов при температуре 37 ° С в течение 10 мин, после того, как он помещен в микро Titter пластине. 29 Только после этого шага, лизат может быть добавлен.
Важным моментом для извлечения проб окружающей среды эндотоксинов является наличие ингибиторов в образцах (например , в образце высокого загрязнения воздуха). В этом случае, разведение становится критическим, и может предотвратить ложное улучшение, как правило , наблюдаемое для неразбавленной пробы. 38
Кроме того, есть несколько моментов, имеющих важное значение для обеспечения успеха и надежности обнаружения Q-PCR. 1) По мере того как объем растворов очень мало, если они не расположены в нижней части скважины, содержание воды в капле ДНК может быть уменьшен путем испарения whilе размещения образцов на пластине. Чтобы избежать этой проблемы, поместите образец ДНК в нижней части скважины, охладить пластины, поместив ее на лед или другой охлаждающей платформе, и все подготовить заранее, чтобы ускорить этот шаг как можно больше. 2) При приготовлении реакционной смеси Q-PCR (таблица 4), охватывают трубу с алюминиевой фольгой , чтобы предотвратить фото-деградации. 3) В настоящем эксперименте описано получение 10 мкл реакционной смеси. Тем не менее, в некоторых инструментов Q-ПЦР, реакционный объем 20 мкл, а затем объем каждого реагента умножается соответственно. 4) Оптимальные условия термического цикла , может изменяться для различных праймеров и полимеразы смесей. 39 Например, температура отжига должна быть установлена на уровне около температуры плавления праймеров, и определяется эмпирически как температура , при которой усиление происходит наиболее эффективно. По этой причине важно также, чтобы подготовить калибровочную кривую для каждого анализируемого д-ПЦРпластины, чтобы гарантировать, что количественное определение является точным. Калибровочные кривые, а также стандартные-фильтры служат шипами также в качестве положительного контроля, чтобы гарантировать, что никакого ингибирования не происходит. Для того, чтобы избежать ингибирования, рекомендуется использовать наборы экстракции, предназначенные для удаления ингибиторов из проб окружающей среды. 5) Количество термических циклов в этом эксперименте было установлено равным максимальному числу, 45, с целью повышения чувствительности, так как концентрации ДНК из экстрактов фильтров были очень низкими. 6) Убедитесь, что циклы порогу (Сх) значения для всех образцов ДНК находятся в пределах динамического диапазона калибровочной кривой. Кроме того, чтобы любое усиление отрицательного контрольного образца, по меньшей мере, восемь циклов больше, чем у образцов ДНК. 7) При работе с реагентом SYBR Green, убедитесь, что нет множественные пики температуры плавления в реакции.
Для турбидиметрическим теста, два метода эндотоксина квантификации доступны: метод кинетического и Конечн ая точкант хромогенный метод. В кинетическом подходе, как выполнено в данном протоколе, время, требуемое для образца, чтобы достичь максимальной измеряется оптическая плотность. При этом более короткий интервал реакции указывает на более высокую концентрацию эндотоксина в образце. В конечной точке хромогенного метода, поглощение света измеряется по истечении определенного времени инкубации, чтобы определить концентрацию эндотоксина. Оба метода требуют стандартной калибровочной кривой , для количественного определения . 40
Хотя точность и точность извлечения эндотоксина , описанной выше , является очень высокой, 14 эффективность экстракции может быть улучшена. Вполне возможно, что другой тип фильтра или добавление моющего средства (например, полисорбат 20) в процессе экстракции может повысить выход эндотоксина, извлеченной из фильтра. Эффективность экстракции эндотоксина также может быть под влиянием различных частиц дискретизированных параллельно на фильтре. 33 Для нашей экспериментальной установки,предел метода обнаружения оценивается в 0,001 ЕС м -3. 14
Методики для количественного определения экстракта ДНК, которые могли бы служить в качестве альтернативы д-PCR включают клонирование подход и цифровой капельку ПЦР (ДД-PCR). Преимущества д-PCR над клонировании подхода для идентификации видов являются его большей чувствительностью и что оно требует более низкой концентрации ДНК для начальной стадии амплификации. Кроме того, в отличие от д-ПЦР, метод клонирования, который является трудоемким и занимает много времени, не является количественным. Альтернативный метод количественного экстракта ДНК ДД-ПЦР. 19 Преимущество этого метода состоит в том , что он не требует построения калибровочной кривой, так как обнаружение основано на одном штамме ДНК в каждой капельке. Тем не менее, для проб окружающей среды, нет надежного метода не существует до сих пор для капельной-обнаружения ДНК, извлеченной из фильтров.
Эффективность, с которой ДНК экстрагируют фром фильтр, а также точность и точность измерений ДНК, может быть под влиянием таких факторов, как тип фильтра, целевых микроорганизмов и измерительных приборов. 34,41 Поэтому она должна быть определена до анализа проб. В нашей экспериментальной установки, предел обнаружения может достигать до 3,5 м -3 генома. 14
В заключение, описанный здесь метод применим для идентификации и количественной оценки воздушно-пробы биологических видов из антропогенных и природных источников. Точное использование соответствующего анализа позволяет ценные исследования сложных экологических вопросов, которые будут осуществляться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 - High Volume Air Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series - Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 µm | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 µm | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
- Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
- Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
