Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53447
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 2, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

Introduction

הנדסת רקמות לב התקדמה מאוד בעשור האחרון, עם מספר קבוצות פרסום תוצאות של רקמות מתפקדות במלואה, מכים עשו משני cardiomyocytes murine 1-6, ולאחרונה, גזע האנושי תא נגזרות myocytes לב 7-12. בתחום ההנדסה ברקמת הלב הוא מונע על ידי שתי מטרות עיקריות ובעצם עצמאי: 1) לפתח שתלי אקסוגניים כי ניתן להשתיל לתוך אי לבבות לשיפור תפקוד 4-6; ו -2) לפתח מודלים חוץ גופייה לחקר פיזיולוגיה ומחלות, או ככלי הקרנה לפיתוחים רפואיים 2,7.

תלת ממדי (3-D) תרבית תאי נחשב חיונית לפיתוח כלי איתור הדור הבא, כמו מטריקס 3-D משקף microenvironment לב טבעי יותר מאשר תרבית תאים בשכבה 2-D מסורתית; אכן כמה היבטים של ביולוגיה של תא שונים באופן מהותי בתרבויות 2-D לעומת 3-D 13,14 9 או קולגן 7,8,10) נשלט לחלוטין, רכב תא קלט מוגדר פחות טוב, עם התערובת כולה של תאים מתוך בידול לב מכוון של כל אחד תאי גזע עובריים (ESC 7,9) או תאי גזע מושרים (iPSC 10,12) להתווסף הרקמות. בהתאם לקו תאים ספציפיים ואת היעילות של פרוטוקול בידול בשימוש, אחוז cardiomyocytes וכתוצאה מכך יכול לנוע בין פחות מ -25% ליותר מ -90%, את הפנוטיפ cardiomyocyte מסוים (כלומר, ventricular-, atrial-, או קוצב דמוי) יכול גם להשתנות, אפילו שבריר הלא cardiomyocyte יכול להיות מאוד הטרוגנית 15,16 ולשנות את מידת הבשלות של מ 'לב הבדילyocytes 17.

עבודות הנדסיות ברקמת לב אחרונות ניסו לנהל את אוכלוסיית תאי הקלט, עם או משטח תא קו 8 או תאי גזע עוברי אנושי כתב לב סמני 18 בשימוש כדי לבודד את מרכיב myocyte לב של הבידול. בעוד שבתחילה רקמה מורכבת myocytes לב רק היה נראה האידיאל, זה למעשה לא המקרה; hECTs מורכבת רק מיוציטים מלב מצליחה לדחוס לתוך רקמות פונקציונליות, עם כמה קבוצות מציאת יחס 3: 1 של myocytes לב: פיברובלסטים הפקת כוח העווית הגבוה ביותר 8. באמצעות שיטות בחירת תאים שונות, כולל משטח סמנים למיון תא חי, אפשר ליצור hECTs עם אוכלוסיות תאים מוגדרות. בעוד סמנים של תאי סטרומה הלא לב היו זמינים במשך זמן מה, כגון סמן פיברובלסטים המשוערת CD90 19,20, סמני משטח של myocytes לב כבר יותר קשיםלזהות. SIRPα היה בין סמני משטח הלב הראשונים המזוהים לצורך מיוציטים מלב אנושי 18 ו הוכח להיות בררן במיוחד עבור שושלת הלב. לאחרונה, מצאנו כי פעמיים מיון SIRPα + ו- CD90 - תאים מניב כמעט cardiomyocytes טהור, עם CD90 + האוכלוסייה מפגין פנוטיפ פיברובלסטים דמויי (Josowitz, תצפיות לא פורסם). בהתבסס על ממצאים שנאספו אלה, בזאת אנו מתארים יצירת hECTs באמצעות 3: שילוב 1 של SIRPα + / CD90 - cardiomyocytes ו CD90 + פיברובלסטים.

היכולת להנדס ברקמת לב אנושית מוגדרת לחלוטין חיונית לא רק ליצירת כלי מיון חזקים, אלא גם לפיתוח מערכות מודל לחקור cell- המתעורר וטיפולי לב מבוסס גנים. בפרט, טיפולים בתאים רבים לאי ספיקת לב, ניצול סוגי תאים כולל תאי גזע mesenchymal (MSC) 21 22 ותאי mononuclear מח עצם 23-25, נבדקו במחקרים קליניים. בעוד רבים של התוצאות הראשוניות כבר מבטיחים 21,23,25, היתרון הראשוני לעתים קרובות פוחת לאורך זמן 26-29. מגמה דומה דווחה ברקמות לב מהונדסות בעכברים, אשר מציגות יתרון פונקציונלי משמעותי בשל תוספת MSC, אבל ההטבה לא שספגה במהלך לתרבות לטווח ארוך 1. בבסיס הביצועים תת אופטימלית הוא הידע המוגבל שלנו של המנגנונים השולטים טיפולים בתאים. הבנה עמוקה יותר של איך טיפולי תאים להשפיע לטובה שלהם, כמו גם תוצאות שליליות אפשריות של אינטראקציות myocyte-nonmyocyte, שתאפשר הפיתוח של טיפולים השתפרו מניב קליני הטבות משמעותיות וקבועות, עם תופעות לוואי מינימאליות, עבור חולים עם אי ספיקת לב.

כאן אנו מתארים את השימוש hECTs מוגדרת interrogאכול מנגנוני טיפול מבוסס תאים. רכב רקמות הנשלט חיוני לזהות גורמים ספציפיים להשפיע על ביצועי cardiomyocyte. ישירות השלים hECTs עם סוג התא הטיפולי של עניין (למשל, MSCs), יכול לחשוף את ההשפעה על ביצועי myocyte לב, כפי שהראנו חולדה ECTs 1.

הפרוטוקול רב השלבים הבאים מתחיל התמיינות תאי גזע לב הופנה, ואחריו ייצור של bioreactor הרב-הרקמה, וכלה בתיאור בניית רקמות אנליזה פונקציונלית. הניסויים שלנו מבוצעים באמצעות שורת NIH-אושרה H7 תאי גזע עובריים אנושיים (hESC). עם זאת, הפרוטוקולים הבאים גם נבדקו באמצעות קו hESC נוספים ושלושה תאי גזע מושרים (hiPSC) קווים עם תוצאות דומות. מצאנו כי יעילות בידול cardiomyocyte והצלחה ייצור hECT יכול להיות קו התא תלוי, במיוחד FOקווי r hiPSC נגזר מטופלים בודדים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, שתי מנות 6-גם הם מצופים עם סך של 1.68 מיליון hESCs (140,000 תאים לכל היטב), בתשואה של כ -2.5 מיליון מיוציטים לאחר ההבחנה במשך 20 ימים ומיון, מספיק כדי להפוך שש רקמות מוגדרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: בצע את כל המניפולציות התא בתנאים aseptic באמצעות ארון בטיחות ביולוגית HEPA מסונן בכיתה השנייה לעקר את כל הפתרונות על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. בצע בניית רקמות בדיקה תפקודית באחת באותם תנאים מזוהמים או ברדס זרימה למינרית.

1. מתזמן של H7 hESCs כהכנה בידול לב

  1. (יום 1) הכנת מרתף מטריקס ממברנה
    1. להפשיר 150 aliquot μl של מטריקס קרום במרתף מוסמך hESC על קרח בן לילה על 4 מעלות צלזיוס.
  2. (יום 0-4) ציפוי של hESCs על צלחות מצופות
    1. לדלל את מטריקס מופשר לתוך 12 מ"ל של קר כקרח DMEM / F12 ומערבבים היטב.
    2. העברת 1 מ"ל של הפתרון DMEM / F12-מטריקס לבאר כל צלחת מטופל בתרבית רקמה 6 באר. כל aliquot של מעיל פחית מטריקס שני 6 צלחות היטב.
    3. דגירת הצלחות המצופות בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 לפחות.
      הערה:הניסיון, מצופית שלנו מנות חתומות עם פרפין ניתן לאחסן פתרון מטריקס ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים לפני השימוש.
    4. בערך בשעה 75 מפגש%, לנתק את H7 hESCs מצלחת 10 ס"מ באמצעות 6 מ"ל של מגיב דיסוציאציה אנזימטית. לאחר 5 דקות, בעדינות לגרד את התאים מפני שטח התרבות באמצעות מגרד תא פנוי ולהעביר את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי.
    5. הסר 0.5 מ"ל של הפתרון דיסוציאציה עם התאים מהצינור 15 מ"ל ולהעביר צינור מ"ל חדש סטרילי 15 (עוזב 5.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה נוספת לנתק את hESCs) לריבוי קו תאי גזע.
    6. גלולה 0.5 מ"ל של תאים ב XG 300 במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant בעדינות resuspend ב 8 מ"ל של התקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים המכיל 1% סטרפטומיצין פניצילין ואז מעבירים לצלחת בתרבית רקמה חדשה, מצופים, 10 ס"מ ולשמור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לשמור על קו תאי גזע.
      הערה: שמור תקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים על קרח במהלך שינויי תקשורת.
    7. בינתיים, להוסיף 5.5 μl של 10 מ"מ ROCK מעכב Y-27632 לפתרון 5.5 מ"ל של דיסוציאציה הנותרים וממשיכים דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות אחר. לערבב בעדינות את התאים עם pipet 5 מ"ל סרולוגיות. המשך כדי לדגור עד ההשעיה תא בודד מושגת, אז גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. Resuspend התאים 5 מ"ל של התקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים ולבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
    9. זרע היטב בכל צלחת 6-גם בצפיפות של 140,000 תאים לכל טוב. זרעי שתי צלחות 6-גם ליצור בסך הכל שש רקמות מוגדרות. זרוק כל תאים הנותרים לאחר הציפוי.
    10. מלאו הבאר עד 1 מ"ל עם התקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, להסיר את המדיה ומוסיף 2 מיליליטר של תקשורת תא גזע פלוריפוטנטיים הטריה היטב כל (איור 1 א
    11. בדוק את המפגש של צלחות בכל יום ולהתחיל את הבידול פעם התאים להגיע לכ 75 מפגש% (איור 1 ב - D).

2. (יום 4-24) דיפרנציאציה של בתאי גזע עובריים אנושיים כדי cardiomyocytes 30,31

  1. (יום 4-7, בידול יום 0-3) mesoderm אינדוקציה
    1. הכן RPMI התקשורת בידול אני (טבלה 1) על ידי שילוב 500 מ"ל RPMI 1640 עם 10 תוספת מ"ל B27 (ללא אינסולין) ו 5 מ"ל של פתרון המניות סטרפטומיצין פניצילין (10,000 פניצילין IU / ml; 10,000 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין). Aliquot, על הקרח, אל צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב 4 ° C..
    2. (יום 4, בידול יום 0) כן תקשורת אינדוקצית mesoderm על ידי הוספת 2.4 μl של CHIR99021 מעכב GSK3 מולקולה הקטן (מניית 10 מ"מימ, 6 מיקרומטר ריכוז סופי) עד 12 מיליליטר של תקשורת בידול RPMI I. הסר מדיה תא גזע פלוריפוטנטיים מכל טוב אnd להחליף עם 2 מ"ל של התקשורת אינדוקציה mesoderm לכל טוב. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור.
      הערה: מוות של תאים משמעותי מתרחש בדרך כלל בתוספת CHIR99021 (איור 1E). בשכבה תתאושש, אבל זה חשוב לשטוף את התאים המתים משם עם שטיפת DMEM / F12.
    3. (יום 5, בידול יום 1) כן תקשורת אינדוקצית mesoderm טריה כמתוארים לעיל. הסר את המדיה הישנה מבאר כל ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של DMEM / F12 לכל טוב. הוסף 2 מ"ל של התקשורת אינדוקציה mesoderm טרי היטב כל אחד.
      הערה: שטיפה כל יום מהיום 0-10 מגדיל מאוד תשואה וטוהר של myocytes לב.
    4. (יום 6, בידול יום 2) הסר את המדיה אינדוקציה הלב ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב. החזר את השטיפה עם 2 מיליליטר תקשורת בידול RPMI לי (לא מולקולות קטנות הוסיפו אבל עדיין עם B27 (ללא אינסולין) תוספת) ולחזור אל האינקובטור.
  2. (יום 7-13, בידול Day 3-10) לב mesoderm אינדוקציה
    1. (יום 7, יום 3 בידול) כן תקשורת אינדוקצית mesoderm לב על ידי הוספת 6 μl של המולקולה הקטנה Wnt מעכב IWR-1 (10 מ"מ מניות, 5 מיקרומטר סופיים) עד 12 מיליליטר של I. תקשורת בידול RPMI
    2. הסר את המדיה מכל טוב, לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב ולהחליף עם 2 מ"ל של התקשורת אינדוקציה mesoderm לב לכל טוב.
    3. (יום 8, בידול יום 4) כן 12 מיליליטר נוסף של תקשורת אינדוקצית mesoderm לב כפי שתואר לעיל. הסר את המדיה הוסיף היום לפני, לשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב ולהחליף עם 2 מ"ל של התקשורת בידול mesoderm לב טרי לכל טוב ולחזור אל האינקובטור.
    4. (יום 9-10, בידול יום 5-6) ביום שני ימים, להסיר את המדיה אינדוקציה mesoderm הלב ולשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של DMEM / F12.
    5. הוסף 2 מ"ל של התקשורת בידול טרי RPMI אני (ללא תוספת מולקולות קטנות אבל עדיין עם B27 (ללא אינסולין) תוספת)זה טוב ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור.
  3. (יום 11-24, בידול יום 7-20) הס הנגזרת לב Myocyte ארגון / הבשלה
    1. הכן התקשורת בידול RPMI השנייה (טבלה 1) על ידי שילוב 500 מ"ל RPMI 1640 עם 10 מ"ל B27 תוספת (עם אינסולין) ו 5 מ"ל של פתרון המניות פניצילין, סטרפטומיצין. Aliquot, על הקרח, אל צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב 4 ° C..
    2. (יום 11, בידול יום 7) הסר מדיה בידול RPMI (ללא אינסולין) מבאר כל ולשטוף עם 1 מ"ל DMEM / F12. חלף עם 2 מיליליטר של תקשורת בידול RPMI החדשה השני (עם אינסולין) זה טוב ולחזור אל האינקובטור.
      הערה: מכות ספונטניות יש לשים לב ראשון בין ימים 7 ו 10. אם מכות לא נצפו במהלך הזמן הזה, זה בדרך כלל מצביע על יעילות בידול עניה. הפרוטוקול יכול להיות נמשך עד יום 15 במאמץ להתבונן מכות, אבל אם לא מכות הוא ציין ביום 15 עדיף stאמנות הבחנה חדשה.
    3. (יום 12-24, בידול יום 8-20) כל יום, להסיר את המדיה הבידול הישנה ולהחליף עם 2 מיליליטר של תקשורת בידול RPMI הטריה השני לכל טוב להתיר התבגרות תא וארגון בשכבת המכות (איור 1F, וידאו איור 1 ).
      הערה: בהתאם מוות של תאים שיורית, זה עשוי להיות נחוץ כדי לשטוף עם 1 מ"ל של DMEM / F12 דרך יום בידול 10.

3. (יום 24, יום בידול 20) בידוד של הלב myocytes תאים פיברובלסטים דמויי

  1. לנתק תאים מן חד שכבתי
    1. הסר מדיה בידול ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS.
    2. לנתק את monolayers עם 1 מ"ל של הפתרון דיסוציאציה האנזימטית (0.04% טריפסין / 0.03% EDTA) זה טוב.
    3. הזז הצלחת לתוך החממה במשך 10 דקות. בינתיים, להוסיף 12 μl של מעכבי ROCK עד 6 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין.
    4. Gently להוסיף 1 מ"ל של הפתרון נטרול טריפסין המכיל מעכב ROCK היטב כל הצלחת לנטרל את פתרון טריפסין.
    5. שימוש pipet העברת סטרילי, לערבב בעדינות כל טוב כדי להתפרק צבירי תאים.
    6. להעביר את כל 12 מ"ל מהצלחת 6-היטב לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל.
      הערה: מאז שתי 6-גם צלחות משמשות בפרוטוקול זה, שני צינורות 15 מיליליטר יהיה צורך.
    7. העברת 3 מ"ל של PBS היטב אחד של הצלחת, ולאחר מכן ברצף להעביר אותו 3 מ"ל היטב כל הבאים לאסוף את כל התאים שיורית על צלחת. מעבירים את 3 מ"ל הנותרים מהגמר היטב לתוך הצינור אותו 15 מ"ל צנטריפוגות המכיל את התאים.
    8. גלולה ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  2. כן תאים למיון תא חי על ידי FACS
    1. הכן את החיץ מכתים ידי הוספת 5 מ"ל של שור עוברית סרום 45 מ"ל של PBS על הקרח עם 50 μl של מעכבי ROCK.
    2. הסר את supernatant מן pel התאלתת (ב 3.1.8) ו resuspend ב 1.2 מ"ל של חיץ מכתים.
    3. העבר 200 μl של השעיה לתא צינור צנטריפוגות חדשות, מראש צונן, 50 מ"ל על הקרח. זו תהיה מלאה מכתימה השלילית.
    4. מעבירים את ההשעיה 1 מ"ל של תא הנותרים לצינור צנטריפוגות חדשות, מראש צונן, 50 מ"ל על הקרח ולהוסיף 2 μl SIRPα-PE / Cy7 (דילול 1: 500) ו -4 μl של CD90-FITC (1: 250 דילול) . בעדינות מערבבים את ההשעיה תא עם pipet העברת ולחזור הקרח.
    5. דגירה היא את שליטת מדגם השלילי, על שייקר נדנדה, על קרח, ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
    6. הכן צינורות אוסף מדגם ידי הוספת 3 מ"ל של RPMI התקשורת (עם אינסולין) לשני צינורות 15 מ"ל צנטריפוגות. הוסף 3 μl של ROCK מעכב צינור אחד ולאחסן על הקרח.
    7. גלולה התאים מוכתם ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשטוף פעמיים עם 10 מ"ל לפחות של PBS קר כקרח לכל שטיפה.
    8. הוסף 1 μl של DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) ל 5 מ"ל של חיץ מכתים. בעדינותresuspend גלולה המדגם עם 1-3 מ"ל של חיץ מכתים המכיל DAPI באמצעות העברת pipet.
    9. הוסף 500 μl של חיץ מכתים (ללא DAPI הוסיף) לשליטה השלילית.
    10. בעדינות לסנן הן את השליטה מדגם שלילי דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להסיר גושים של תאים ולהעביר קלקר צינורות FACS על הקרח. מיד להביא דוגמאות על סדרן תא.
    11. בדומה הוקם חי מיון תא שיטות 18, להשתמש בשלט השלילי להגדיר את השערים, בחר עבור תאי חיים (DAPI שלילי) ולאסוף הן + FITC (כלומר, CD90 + פיברובלסטים) ו- PE / Cy7 + (כלומר, SIRPα + cardiomyocytes ) אוכלוסיות 20 psi (איור 2 עצמאי).
      הערה: לאחר קביעת השערים, הביקורת השלילית ניתן לתקן PFA 4% כדי לקבוע את היעילות בידול על ידי מכתים עבור-T טרופונין לבבי.
      הערה: יש חוקרים ויעדיפואלוטיפ ולא שליטה בלא כתם כדי להגדיר את השערים כדי לפצות מחייב נוגדנים שאינם ספציפיים. אחד מינוס שנקרא הקרינה (FMO) שליטה היא אפשרות נוספת. בשל פיזור bimodal הברור של FITC, DAPI אותות PE-Cy7, אנו מגודרים מן האוכלוסייה החיובית, שמרני מכוונים רחוק לתוך השער החיובי, אשר אולי לא כולל כמה תוצאות חיוביות נכונה אבל עוזר למזער את תוצאות חיוביות שגויות.
  3. Cell Reaggregation כהכנה הנדסת רקמות
    1. לאחר מעין תא, גלולה שני צינורות איסוף resuspend ב 1 מ"ל של DMEM המכיל 10% סרום ילודים שור, 1% סטרפטומיצין פניצילין 0.2% Amphotericin B ( "מדיה NBS").
    2. ולשלב מחדש את תאי SIRPα + ו- CD90 + ב ליחס 3: 1 ו צלחת התאים בשילוב בתרבות הלא רקמה שטופלו צלחת פטרי בצפיפות של 2 מיליון תאים לכל 60 ס"מ 2 (10 צלחת ס"מ). הוסף 10 מ"ל של התקשורת NBS ו -101; l של ROCK מעכב Y-27632.
    3. מניח השעית תא בתרבית רקמת החממה עבור 48 שעות כדי לאפשר תא reaggregation בצבירים קטנים.

4. הנדסת רקמות אדם לב

  1. לפברק את Bioreactor Multi-רקמה
    הערה: כדי להשלים את האיורים באיור 3A, קבצי CAD עם שרטוטים עיצוב bioreactor מפורט יימסרו לכל מבקש מן המחברים.
    1. מכונת עובש אמן PDMS באמצעות קידוח שישה במרווחים חורים שווה של 0.5 מ"מ קוטר לתוך קוביות 9 x 33 x 3.25 מ"מ של polytetrafluoroethylene.
    2. שימוש endmill, מכונת מסגרת מ פוליסולפון בשטח של 25 x 35 x 11 מ"מ 3. מטרת המסגרת היא להחזיק את ההודעות PDMS (בנוי השחקנים עשו לעיל) ובהלימה בארות baseplate.
    3. באמצעות בנפרד 1 מ"מ endmill, מכונת 6 בארות (6 x 1 x 1 מ"מ 3), 4 מ"מ לתוך חתיכת 3 20 x 40 x 5 מ"מ של פולי השחוריםtetrafluoroethylene כדי ליצור את baseplate.
    4. מערבב את בסיס אלסטומרי סוכן ריפוי עבור polydimethylsiloxane (PDMS) בתוך 10: 1 w / פרופורציות ולהוסיף את תבנית polytetrafluoroethylene המותאם אישית (שלב 4.1.1) כדי ליצור שתי שורות של שישה פוסט כוח-חישה, דגירת הלילה ותחת ואקום ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר ריפוי, להסיר את PDMS בעדינות מהתבנית מאסטר ובזהירות לסמן את צמרות כל הודעה בטוש שחור קבע עבור ניגודיות משופרת ומעקב סטיה פוסט בזמן אמת אוטומטי.
      הערה: Polytetrafluorethylene די רך ועלול להינזק בקלות. היזהר בעת ניקוי עובש אמן לפני PDMS הליהוק על מנת להבטיח אריכות ימים של מערכת וגיאומטריה פוסט PDMS עקבית. חוט 0.5 מ"מ ניתן להשתמש כדי לנקות את החורים עבור ההודעות לאחר כל שימוש, אך היזהר שלא לגרד את החלק הפנימי של החורים.
      הערה: חלופה אחת היא דגה את PDMS תחת ואקום במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר, ואז לתת את התרופה תערובת בלחץ הסביבה.זה עלול להוביל בועות גז שיורית פחות להיקוות PDMS במהלך תהליך הריפוי.
    5. לעקר את כל הרכיבים בתוך אדי חיטוי.
      הערה: עובש אמן PDMS (שלב 4.1.1) ומסגרת פוליסולפון (שלב 4.1.2) הם גם לשימוש חוזר. את הודעות PDMS נוצרו מתוך היצוק (שלב 4.1.4) הן גם לשימוש חוזר אבל רק למשך כ -10 שימושים. עם זאת, יותר הודעות PDMS ניתן ליצור לפי הצורך באמצעות עובש אמן.
  2. איסוף תאי Reaggregated לב
    1. הסרת תאים reaggregated מן החממה ולהעביר את כל 10 מ"ל של התקשורת reaggregation לצינור צנטריפוגות 50 מ"ל.
    2. יש לשטוף את הצלחת עם 3 מיליליטר של PBS ולהעביר את לשטוף את הצינור אותו 50 מיליליטר צנטריפוגות המכיל תקשורת reaggregation.
    3. הוסף 3 מ"ל של 0.04% טריפסין / 0.03% EDTA כדי בצלחת 10 ס"מ ולחזור בחממה במשך 5 דקות.
    4. לאחר 5 דקות, לבדוק את הצלחת עם מיקרוסקופ המתחם הפוך ב 10X הגדלה כדי להבטיח dissocia תא מלאtion מצלחת. אם כמה אשכולות שיורית עדיין מחוברים, בעדינות להתסיס את הצלחת לנתק את הגושים. אם האשכולות נשארים צמודים, לחזור בחממה במשך 2-3 דקות אחרות. אין דגירה יותר מעשר דקות או מוות של תאים משמעותיים עלולים להתרחש.
    5. לאחר כל התאים מנותקים, להוסיף 3 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין. בעדינות מערבבים את פתרון נטרול עם הפתרון טריפסין תאים ולהעביר את הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל את התקשורת reaggregation ולשטוף פעם עם PBS.
    6. יש לשטוף את צלחת כולו עם 5 מ"ל של PBS ולהעביר אל הצינור אותו 50 מ"ל המכיל את התאים.
    7. גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת NBS, ואז להעביר צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    9. גלולה ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר להסיר את supernatant. תאי הלב (תאי CD90 + סטרומה SIRPα + myocytes) מוכן כעת לבניית רקמות.
  3. (אופציונלי) איסוף תאים משלימה עניין
    הערה: בנוסף לרקמות המוגדרות המכילות רק SIRPα + cardiomyocytes ו CD90 + תאי פיברובלסטים דמויים, אפשר להוסיף תאים נוספים של עניין לחקור את השפיע על תפקוד רקמות. לדוגמא MSCs העכברוש הוכח כדי לשפר את התפקוד של רקמות לב מהונדסת עכברוש 1. הצעד האופציונלי הבא מתאר את האוסף של תאים משלימים למערכת המוגדרת.
    1. אסוף את סוג התא המשלים של עניין (למשל, בתאי גזע mesenchymal) באמצעות EDTA 0.25% טריפסין / 0.1%.
    2. גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן resuspend ב 5 מ"ל של תרבית תאים התקשורת המתאימה לסוג של עניין התא. לדוגמא, עבור MSCs, השתמש DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברי, 1% סטרפטומיצין פניצילין 0.2% amphotericin-B לתרבות גאמות.
    3. בצעו ספירת תאים באמצעות hemocytometer, אז גלולה התאים שוב ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את supernatant, resuspend ב 1 מ"ל של התקשורת בתרבות התא והעברת צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    5. גלולה התאים XG ב 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הסר את supernatant. תאי המשלים מוכנים כעת לבניית רקמות.
      הערה: אם התאים המשלימים מתווספים בריכוז של 10% במספר הכולל התא בתוך הרקמה, אז עבור הרקמות המוגדרות, זה ידרוש 50,000 תאים משלימים לכל רקמה כמו כל רקמה מכילה 500,000 תאי לב (שני תאי סטרומה CD90 + ו SIRPα + מיוציטים).
  4. צור את רקמות לב Engineered האנושות
    הערה: אחסן את כל הפתרונות על הקרח התאים בטמפרטורת החדר. כל הכרכים המפורטים להלן לכל רקמה. בדרך כלל, כשש רקמות ניתן לבנות שני 6-גם plאטס של בידול לב.
    1. לדלל 60.0 μl של המניה קולגן 5 מ"ג / מ"ל ​​ל 3.125 מ"ג / מ"ל ​​עם 1.5 μl של 1 M NaOH, 9.6 μl של 10x PBS ו 24.9 μl של מים ללא יונים ultrapure סטרילית.
      צעד קריטי: הימנע כניסתה של בועות אוויר לכל פתרון במהלך ההכנה כבועות אוויר תשבשנה היווצרות רקמה נאה.
    2. להוסיף 12.0 μl של שני MEM 10x ו -0.2 N HEPES pH 9 לתערובת קולגן לדלל ליצור תמהיל קולגן. הוסף הן פתרונות למטה בצד של הצינור צנטריפוגה 15 מ"ל כדי למנוע את כניסתה של בועות אוויר לתערובת קולגן.
    3. מוסיפים את מטריקס קרום במרתף לריכוז סופי של 0.9 מ"ג / מ"ל ​​לתערובת קולגן ולאחסן על הקרח כדי ליצור תמהיל רקמות הסופי. הריכוז הסופי של קולגן צריך להיות 2 מ"ג / מ"ל.
    4. להוסיף 500,000 של תאי reaggregated לתערובת רקמות (myocyte + ריכוז פיברובלסטים הוא 20 מיליון / מ"ל) ולמלא לנפח סופי של 25 μl לכלרקמה עם התקשורת או NBS ללא תא או 50,000 תאים של סוג תא משלים של עניין (למשל, hMSCs) ומערבבים היטב כדי ליצור ההשעיה תא אפילו.
      הערה: מספר תאים בתוספת ישתנה מן ליישומים שונים. הנה 10% תוספת משמשת.
    5. עם טיפול, pipet 25 μl של השעיה התא לתוך כל אחד מששת בארות baseplate bioreactor, ללא החדרת בועות אוויר לתוך הבאר.
    6. לדחוף שתי שורות של חיישני כוח PDMS על משני צדי מסגרת פוליסולפון, ויצר 6 זוגות של הודעות מנוגדות, ואז להפוך את המסגרת על גבי baseplate כך זוג אחד מהפוסטים נכנס לכל היטב המכיל את השעית התא.
      הערה: מסגרת פוליסולפון כולל כרטיסיות כדי לסייע ביישור של PDMS.
    7. בזהירות במקום bioreactor, baseplate למטה, לתוך צלחת 60 מ"מ, אז במקום צלחת בלי העטיפה שלו הפנימי של צלחת 10 ס"מ, מניחים את המכסה 10 ס"מ על גבי, ולהעביר את הרכבה bioreactor כולואל האינקובטור בתרבית רקמה, מחכה שעתיים עד שהרקמה להגליד.
    8. לאחר 2 שעות, להסיר את bioreactor מן החממה ולהוסיף 14 מ"ל של התקשורת NBS אל מכלול שלם, מספיק כדי לכסות את baseplate. חזור אל האינקובטור, ולשנות מחצית התקשורת מדי יום.
    9. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, להסיר בזהירות את baseplate ידי הזזת כל צד בעדינות של baseplate את המסגרת כמה מילימטרים בכל פעם, לשנות את התקשורת, ולאחר מכן להחזיר את bioreactor, רקמות פונות כלפי מטה, אל התקשורת.
    10. המשך שינוי מחצית התקשורת בתרבות NBS מדי יום.
      הערה: התכווצויות ספונטניות של הרקמה ניתן להבחין מוקדם ככל 3 ימים לאחר בניית רקמות, יצירת כוחות עווית למדידה מוקדם ככל יום 5 עד 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להשיג myocytes לב, גרסה מעט שונה של שיטות בידול Boheler וליאן משמשת 30,31. זה הכרחי כי הבידול מתחיל במהלך יומן פאזיים של צמיחת תאים, אלא גם כי אוכלוסיית המוצא היא ומחוברות מספיק כדי לקבל מספר שמיש של תאים לאחר המיון (כ 75% הם אופטימליים). בדרך כלל, עבור H7 hESCs, ציפוי בצפיפות של 140,000 hESCs לכל טוב של צלחת 6-היטב חיוני 8 התקשורת ו 5% CO 2 באינקובטור שמרו על 37 מעלות צלזיוס מניב תרבויות ומחוברות במידה מספקת לאחר 4 ימים כדי להתחיל את הבידול, כפי שמודגם באיור 1 א - ד. מאז אינסולין מעכב מפרט הלב במהלך תהליך ההתמיינות 32, תקשורת חופשית אינסולין (אני התקשורת בידול, טבלה 1) משמש עבור בידול 10 הימים הראשונים. לאחר התמיינות היא יזם באמצעות היישום של CHIR99021 GSK3 המעכב,מוות של תאים משמעותי יתרחש (איור 1E). כתוצאה מכך זה הכרחי כדי לשנות את התקשורת בכל יום. ביום 2 של בידול, התאים יוסרו CHIR99021 ונחו תקשורת בידול אני (ללא הוסיף מולקולות קטנות) למשך 24 שעות. לאחר 24 שאר hr בתקשורת בידול, התאים שטופלו IWR-1 במשך 48 שעות, לאחר מכן הם מתחילים עצמיים לארגן לאשכול (איור 1F) כי הכה מוקדם ככל שבעה ימים מיום תחילת הבידול. מאז מפרט לב התרחש לאחר היישום של IWR-1, התקשורת משתנית מדיה המכילה אינסולין (מדיה בידול שני, טבלת 1). על ידי 18 ימים של בידול, במושבות של תאים להכות חברו ומנותקת חלקית מתא השטח, ויצרו להכות וחסונה "קורים" לאורך כל המנה (וידאו איור 1).

ביום 20, בשכבת המכות הוא ניתק בעדינות viשיטות אנזימטיות להשיג תאים בודדים עבור התא הקשורים פלורסנט חי מיון (FACS). בשיטת הבידול שתוארה לעיל, אנו שמרנים למסוק כ -65% מכלל האוכלוסייה כפי SIRPα + ו -10% כמו CD90 + (איור 2). באופן כללי 1-2 מיליון SIRPα + תאים מתקבלים לכל צלחת 6 באר.

לאחר reaggregation במשך 48 שעות בתוך יחס 3: 1 של SIRPα +: CD90 + תאים, המצרפים התא המוגדרים מעורבבים עם הידרוג'ל מבוסס קולגן pipetted לתוך בארות צרות baseplate של bioreactor הרב-הרקמה. בדרך כלל, לפני הסרת מצלחת, אשכולות קטנים של 5-10 תאים יראו להכות על פני השטח של המנה. Bioreactor הרקמות המוגדרות מורכב משלושה מרכיבים: עובש אמן להטיל את הודעות PDMS; מסגרת להחזיק שני מתלים PDMS מכלל הודעות; וכן baseplate שחור polytetrafluorethylene המכיל שש בארות תמהיל רקמה (איור3A יור). תהליך בניית רקמה כולה מתבצע על קרח בתנאים ספטית. לאחר הוספת תערובות תא-מטריצה ​​נוזל אל בארות baseplate, את ההודעות PDMS מחוברים למסגרת פוליסולפון, ואת הפוכה אז כך את ההודעות להתיישר עם בארות baseplate (איור 3 ב). לאחר 48 שעות של דגירה, הרקמות צריכות להיות דחוסות מספיק כי baseplate ניתן להסיר. את כן הבסיס מנותק בקלות על-ידי לחילוץ המערכת כולה מהתקשורת בעדינות הסרת כל מדיה עודפת בין PDMS ו baseplate. אם כל התקשורת לא הוסר, מתח הפנים של הנוזל הנותר יכול למשוך את רקמות את ההודעות. ברגע התקשורת מוסר, בעדינות לדחוף את baseplate לאחור על הודעות PDMS כדי לעזור לשחרר את הרקמה מן baseplate. ואז בהדרגה לדחוף את baseplate את ידי הזזת בעדינות צד אחד עד כמה מילימטרים, אז בצד השני את אותה כמות. חזור על תהליך זה עד baseplate מוסר, עם כל 6 hECTs מצורפים לפוסטים-סוף PDMS שלהם (איור 4 א). הסרת baseplate צריכה לקחת לא יותר מדקה אחת. החזר את המערכת לתוך תקשורת תרבית תאים, הפוכה, כך שכל הרקמות מכוסות על ידי תקשורת תרבית תאים.

כ יום אחד לאחר הסרת baseplate, התכווצויות מקומיות חלשות צריכות להיות נצפות hECTs המוגדר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר 7 ימים, הרקמות הבשילו נדחס (איור 4 ב-ג) עם סרקומר מזדהות (4D איור). הרקמות בעליל להסיט את ההודעות PDMS עם ממוצע של 5-15 μN בכוח (איור 4E). עווית מדידות כוח עבור רקמות לב המהונדסות המוגדרות ניתן למדוד על ידי מעקב בזמן אמת של סטיית הקצה פוסט עם תוכנת רכישת נתוני מצלמה במהירות גבוהה מותאמים אישית, ומיישום הסטייה לפרסם קרן כיפוף התאוריה לאחר הקביעהמודול יאנג של הודעות סיליקון באמצעות מתמר כוח, כפי שמוסבר ביתר פירוט בעבר. 1,7 שמירה על סטריליות במהלך רכישת נתונים מבטיחה את היכולת למדוד שינויים בתפקוד רקמות לאורך זמן. שמרנו רקמות תפקודיות במשך כמה שבועות, כפי שמוסבר ביתר פירוט במקום אחר 1. הממצאים הראשוניים שלנו מצביעים על שיפור משמעותי בכוח התכווצות hECT כאשר רקמות הם השלימו עם 10% בתאי גזע mesenchymal אדם בשני 1 רץ ו -2 תדרי צעדה רצה (איור 4F).

איור 1
איור 1: נציג תמונות של H7 hESCs במהלך התרחבות תהליך התמיינות לב. השלב הרחב צריך להימשך 4 ימים, עם צמיחה של מושבות הרחבה מ -24 (א), 48 (ב), 72 (ג strong>) ו -96 שעות (D). לאחר 96 שעות של צמיחה הבידול הוא התחיל, וכתוצאה מכך מוות של תאים משמעותי במהלך 48 שעות הראשונות של הטיפול CHIR99021 (E). לאחר ימים של טיפול IWR-1, ארגון מחדש מתרחש (F) כדי ליצור אשכולות של תאים לנצח כבר ביום 7. ארגון בהמשך לתוך "אינטרנט" להכות וחסונה מתרחש מהיום 7 עד היום 20, כאשר monolayers הם ניתקו עבור יצירת רקמות לב מהונדסת.

וידאו איור 1:. בשכבת לב נציג לאחר 17 ימים של בידול . אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון הזה פועם ספונטני בתוך בשכבה בדרך כלל נצפה לראשונה בין היום 7 ויום 10, ועל ידי 17 ימים של בידול בשכבה יצרה קורי מקושר " "כי הכה וחסונה.

בתוך-page = "1" FO: keep-עם-next.within-page = "תמיד">
שֵׁם הֶרכֵּב בידול ימים בשימוש
בידול מדיה לי RPMI 1640
תוסף B27 (מינוס אינסולין)
פניצילין, סטרפטומיצין 		D0-D1 (עם CHIR99021)
D2
D3-D5 (עם IWR-1)
D5-D7
בידול מדיה II RPMI 1640
תוסף B27 (עם אינסולין)
פניצילין, סטרפטומיצין 		D7-D20

טבלה 1: רכב Medias הבידול.

איור 2
איור 2: סוג תא נציג חיing תוצאות שתי דגימות נערכו:. פקד בלא כתם פקד מוכתם באמצעות 1: 500 דילול של נוגדן SIRPα-PE / Cy7 ו 1: 250 דילול של נוגדן CD90-FITC. לאחר מכתים, התאים מוינו ב 20 psi במיון חיץ המורכב של PBS, 10% בסרום שור בילוד, 10 מיקרומטר ROCK מעכב Y-27632, ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI. שניהם אוכלוסיות התאים היו מגודרות הפרופילים קדימה וצד פיזור להוציא פסולת (A, קו כחול) ואז תאים בודדים נבחרו על ידי השוואת הרוחב הפולס וגובה (דופק ניתוח רוחב) הוא הפיזור קדימה (B, קו כחול) ערוצי פיזור בצד (C, קו כחול). לאחר מכן, תאי חיים נבחרו על ידי gating DAPI - האוכלוסייה (D, קו כחול). אוכלוסיות התאים הסופיות לאיסוף נקבעו על ידי בחינת רמות ביטוי FITC ו- PE-Cy7 של אוכלוסיות חיות. השליטה בלא הכתם (E, שמאל) שמשהלהקים את השער המתאים כדי לבחור עבור + FITC (CD90) ו SIRPα-PE / Cy7 + (cardiomyocyte) אוכלוסייה נוכחית במדגם המוכתם (E, מימין). FITC ו SIRPα-PE / Cy7 + poplations נאספו 15 נפרד מ"ל צינורות צנטריפוגות.

איור 3
איור 3:. סכמטי של bioreactor רב רקמות בתהליך הנדסת רקמות הלב בנייה של bioreactor רב רקמה דורש שלושה מרכיבים (א): 1) תבנית אב polytetrafluoroethylene 9 x 33 x 5 מ"מ 3, עם 6 חורים במרווחים שווים 0.5 מ"מ קוטר; 2) 25 x 35 x 11 מ"מ 3 מסגרת פוליסולפון להחזיק את הודעות PDMS במהלך בניית רקמות ותרבות; ו -3) 20 x 40 x 5 מ"מ 3 baseplate polytetrafluorethylene שחור עם 6 בארות של 6 x 1 x 1 מ"מ 3 מימדים, ספאCED מזה 4 מ"מ לאורכו. כדי ליצור רקמות לב אנושיות מהונדסות (B), את הודעות PDMS מיוצרות על ידי PDMS ליתוגרפיה רכה באמצעות עובש אמן polytetrafluorethylene, שתיים מהם נלחצים אז על הכרטיסיות של מסגרת פוליסולפון לגבש 6 זוגות של הודעות שלוחת חישת כוח. פתרון הרקמה pipetted לתוך בארות baseplate polytetrafluorethylene השחורה. המסגרת ואת ההודעות נשמרות הפוכה ואז ומיושר על baseplate polytetrafluorethylene כך זוג אחד מהפוסטים נכנס לכל היטב המכיל תמהיל רקמות. אחרי 48 שעות, את כן הבסיס יוסר הרקמות המוגדרות מתורבתות על ההודעות, נותרים הפוכות במדיה NBS.

איור 4
איור 4:. נציג תמונות ומדידות פונקציונליות של רקמות לב מהונדסת אדם מוגדר bioreact רב-הרקמהמערכת או מחזיקה שש רקמות במקבילות (A, ראשי חץ). רקמות מוגדרות עצמיות התאסף בתוך שבעה ימים ממועד יצירת רקמות (מבט מלמעלה, B ו- מבט מצד אלכסוני, C). (D). החלק של hECT מוגדר מוכתם עבור-T טרופונין לבבי (cTnT). (ה) מעקב עווית נציג תערוכות כוח הגלם לאורך זמן במהלך 1 צעדה הרץ על ידי גירוי של שדות חשמליים. (F) עווית התחקות במהלך גירוי רץ 1 (0-2 שניות) ו -2 הרץ (2-4 שניות) צעדה, עם חץ סימון שינוי התדר, הן hECTs המוגדרת unsupplemented (קו מוצק) ורקמות בתוספת 10% hMSCs (קו מקווקו).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בניית רקמות לב מהונדסת אנושיות תחמו (hECT) יכולה לספק מודל יותר עקבי ואמין של תפקוד myocyte לב אנושי. האנושות, כל הרכיבים הסלולר תאיים במערכת ידועים וניתן לטפל לפי צורך, ובכך להסיר את ההשפעה של בלבול סוגי תאים ידועים אחרים הנובעים תהליך ההתמיינות. כדי לאזן צמיחת תאים מהירה תשואה גבוהה, עדיף כי הבידול מתחיל ב 75% מפגש של hESCs, אידיאלי ארבעה ימים לאחר הציפוי. בנוסף, השימוש של ROCK מעכב Y-27632 הן בזמן ניתוק התא reaggregation לאחר מיון משפר כדאיות התא מאוד. הנוכחות של מכות ספונטניות של מיוציטים במהלך תהליך הבידול היא אינדיקטור חשוב של היעילות והבריאות של הבידול. אם מכות ספונטניות לא הוא ציין זה עשוי להצביע על יעילות בידול עניה, או עקב ריאגנטים יעילים או פסדשל pluripotency של תאי גזע.

במהלך בניית רקמות, את הודעות PDMS חייבות ליישר כמו שצריכים עם ערוצי baseplate ליצור רקמות בנויות היטב כי נמשכו זמן רב מספיק למדידת תפקוד התכווצות. כדי לשפר את קלות יישור המכשיר, ולחזק היווצרות רקמה סביב הפרסומים שבהם הם רגישים שבירה, אפשר להוסיף רוחב נוסף (כ בקוטר פוסט אחד בכל צד של הפוסט) עד קצה הערוצים, כפי שמודגם על ידי "עצם הכלב" ערוצי -shaped באיור 3 א. ללא יישור מכשיר נכון הרקמה תהיה גם לנתק מן העמדות זמן קצר לאחר התרבות, או תישאר הבאר כאשר baseplate מוסר. אם רקמה בנויה היטב נפל במהלך הסרת baseplate, אפשר לצרף את הרקמה בעדינות את ההודעות באמצעות מלקחיים בסדר תחת מיקרוסקופ לנתח, למרות שזה קל לפגוע hECTs העדין אם טיפול הולם אינו נלקח. </ P>

חוסנה החברתי עיקרי של המערכת המוגדרת תארה הוא היכולת לחקור את התרומה של מנגנוני אינטראקציה עם תאי תאים ישירים טיפולים בתאי לב המבוסס על שליטה ספציפית של רכב תא. ההזרקה של תאים בבעלי חיים אינה מדויקת ובכפוף כדאיות נמוכה ושימור 33. בנוסף, ההשפעה של התאים מוזרקים על רקמת המטרה היא מסובכת בשל אינטראקציות עם מערכות פיזיולוגיות אחרות, כגון מערכת החיסון. ככזה, להבנת התרומה של אינטראקציות תאי תאים ישירות טיפולים בתאי לב הוא מאתגר להתייחס אורגניזמים מודל. לכן, יתרון השיטה המתוארת הוא כי תאי תאי אינטראקציות מנותחות בסביבה תלת ממדי biomimetic, שמירה על היבטים מרכזיים של נישת הלב, ובנוכחות של סוגי תאים המסוימים של עניין - כלומר, myocytes הלב פיברובלסטים. השירות של שימוש במערכת מוגדר hECT הוא demonstrated עם התוספת של 10% hMSCs נגזר מח אדם 34,35 והשתמש בניסויים קליניים לתערובת התא במהלך יצירת רקמות. רקמות אלה תוגברו עם hMSCs הציגו בכוח התכווצות גדול יותר ברקמות האנושיות המוגדרות unsupplemented (איור 4F). מכיוון שהסביבה והרכב הרקמות כבר נשלטו, השיפור של תפקוד רקמות עם תוספת MSC משקף שפעה טבועה hMSCs על תפקוד cardiomyocyte. עוד כוח למערכת הוא שמאז הרקמות הם קטנות יותר מאשר השתמשו בעבר, שימוש תא 1,7 הוא יעיל יותר, שיקול חשוב בעת שימוש differentiations בבימויו של תאי גזע פלוריפוטנטיים כמקור התא.

מעבר ללימוד מנגנוני טיפול בתא, מערכת hECT המוגדרת תאפשר בחינת הבסיס הסלולר של אינטראקציות תאי תאי לב וכלי דם. הפרעות של הביולוגיה של תאי לפני רקמות constמְהוּמָה, למשל עם shRNAs, ותאפשר החקירה של המנגנונים המולקולריים השולטים תאים תאים אינטראקציות ותא-מטריקס. יתרון נוסף למערכת הנדסת רקמות הוא ההיווצרות של במיופיברילים מיושר מסוגלים התכווצויות פונקציונליות. לפיכך, שימוש במערכת hECT המוגדר, את הדינמיקה של היווצרות myofibril, פיתוח cardiomyocyte וארגון ארכיטקטורת הרקמה יכולה כל להיחקר באמצעות שינוי של מרכיבי מטריקס חוץ התאי או המניפולציה מולקולרית של התאים. הטבע האנושי ו 3-D של מערכת hECT גם מגדיל את translatability של הממצאים.

בעוד המערכת המתוארת מציעה שיטה חזקה בהבנת שאלות בסיסיות בביולוגיה לב וכלי דם, זה לא בלי מגבלות. ראשית, רקמות מהונדסות תערוכה פנוטיפ בשלה, עולה בקנה אחד עם נתוני כוח עווית שפורסם ממדגמים שריר הלב היילוד 7. בעודבגרות פנוטיפי יכול להיות גורם בלבול בהערכת מנגנוני אינטראקציה עם התא, יש ראיות כי cardiomyocytes חולה לחזור תוכנית הגן עוברית 7,36-38. אם ממצאים ממערכת hECT להוכיח להיות רלוונטי בהקשר של ללב כושל, זה עשוי להיות יתרון לבדיקת טיפולי לב. הפרוטוקול גם משתמש מטריצת קרום במרתף מוסמך hESC במהלך בניית רקמות. הרכב של מטריקס זה יכול להשתנות ממגרש למגרש, ובעוד חלופות מטריקס במרתף מוגדר זמינות להם טרם תטופלנה במסגרת של hECTs.

מגבלות נוספות כוללות העדר מערכת כלי דם ללא תופעות אינטראקצית מערכות ברמה. בהתחשב בגודל של הרקמות, דרישות מטבוליות מתקיימים על ידי דיפוזיה לבד ולכן אין מערכת כלי הדם היא הייתה צריכה להבטיח כדאיות התא. עם זאת, איתות תא האנדותל יכולה להיות גורם חשוב טיפולי תאים ספציפיים. אם זה המקרה, מספר מסוים של אנדותאי thelial פשוט ניתן להוסיף לתערובת התא המוגדרת במהלך בניית רקמות. בעוד אינטראקציות מערכות ברמה חשובות על הבנה מלאה של מנגנוני תא, מערכת הרקמות המהונדסת מציעה גישה רדוקציוני לפשט את הבעיה על מנת לתת מענה המנגנון שיטתי. מורכב אפשר להוסיף למערכת רקמות המוגדרת לפי צורך באמצעות ההקדמה של השפעות מערכות קשורות, כגון לויקוציטים לשלב תגובה חיסונית, או על ידי הוספת סוגי רקמות שכנות לחקור איתות אוטוקריני.

ככלי חקירה, המערכת ברקמת לב מהונדסת האנושית תחמה מציעה את היתרונות של תאים אנושיים ספציפי מינים, סביבת ותרבות 3-D biomimetic עם מורכבות ביולוגיות בשליטה, ניטור פשוט אורך של פונקצית התכווצות, וכן רכב הסלולר מטריצה ​​מוגדר. כיוונים עתידיים במערכת hECT כוללים מניפולציה של סוג תא הטיפולי של שנינות ענייןh siRNA או shRNA לפני המבוא ברקמה כדי לחקור פרטים מולקולריים ספציפיים של אינטראקציה בין תאים. בנוסף, במקום להשתמש hESCs כדי ליצור תאי הלב, ניתן להשתמש בתאי גזע מושרים (iPSCs) מחול עם מוטציה תורשתית במאמץ מודל גילויי מחלת לב הקשורות ברקמות המהונדסות. לכן, השיטה שלנו של יצירת רקמות לב מהונדס אדם עם אוכלוסיות תאים מוגדרות מבטיחה לפתוח אפיקים חדשים ללימוד טיפולים בתאי לב כדי לעזור להאיץ את הפיתוח של טיפולים חדשניים עבור חולים עם מחלת לב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (1F30HL118923-01A1) כדי TJC, HHSN268201000045C חוזה NIH / NHLBI PEN כדי KDC, המועצה מענק מחקר של הונג קונג TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) כדי Bdg, האמריקני איגוד הלב (12PRE12060254) כדי RJ, ומחקר גרנט מועצת HKSAR (TBRS, T13-706 / 11) כדי RL מימון נוסף שהועמדה TJC ידי NIH DRB 5T32GM008553-18 וכתוצאה התמחות על הדרכה NIDCR-הבינתחומי מערכות התפתחותית פגמי ביולוגית לידת T32HD075735. המחברים גם מבקשים להודות בתודה ארתור Autz ב"מרכז זאן של המכללה העירונית של ניו יורק על הסיוע עם עיבוד bioreactor ו ממדוח Eldaly לקבלת סיוע טכני. כמו כן, אנו מודים לד"ר קנת Boheler לקבלת ייעוץ על בידול הלב, וד"ר יהושע הייר למתן אדם בתאי גזע mesenchymal בנדיבות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Tags

Bioengineering גיליון 109 טיפול בתאים הנדסת רקמות תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם נגזר myocytes לב תאי גזע mesenchymal תאי סטרומה mesenchymal Bioengineering microenvironment הסלולר לב וכלי דם SIRPA CD90
בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb,… More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter