Introduction
心臓組織工学は、より最近になって、両方のマウス心筋1-6と、から作られた完全に機能する、鼓動組織、ヒト幹細胞由来の心筋細胞7-12の結果を公表する複数のグループで、10年間で大きく前進しました。心臓組織工学の分野は、二つの主要な本質的に独立した目標によって駆動される：1）機能4-6を改善することができない心臓に移植することができる外因性の移植片を開発します。及び2）生理学および疾患を研究するためのin vitroモデルの開発、または治療開発の2,7のためのスクリーニングツールとしてします。
三次元（3-D）細胞培養物を、3-Dマトリックスは、従来の2次元単層細胞培養物よりも自然な心臓の微小環境を反映するように、次世代のスクリーニングツールを開発するために必須であると考えられます。実際に細胞生物学のいくつかの側面は、2次元対3次元培養13,14根本的に異なっています9またはコラーゲン7,8,10）を厳密に制御しつつ、従来の操作されたヒト心臓組織のために、入力細胞組成物は、あまりの指向心臓分化の細胞の混合物全体で、定義されますか胚性幹細胞（ESC 7,9）や人工多能性幹細胞（IPSC 10,12）を組織に添加されます。特定の細胞株および使用する分化プロトコルの効率に応じて、心筋の得率（ すなわち 、ventricular-、atrial-、またはペースメーカーのような）、25％未満から90％以上に、特定の心筋細胞表現型の範囲とすることができますまたしても、非心筋細胞画分は15,16非常に不均一であることで差別心臓メートルの成熟度を変更することができ、変化させることができます17を yocytes。
最近の心臓組織工学作業は心臓レポーターヒト胚性幹細胞株8または細胞表面マーカー18は、分化の心筋細胞成分を単離するために使用されるのいずれかで、細胞のインプット集団を制御しようとしています。唯一の心筋細胞で構成最初に組織が理想的であるように思われるが、これは実際にはそうではありません。心筋細胞の1：1の比率：線維芽細胞が最も高い単収縮力8を生成するのみ心筋細胞で構成hECTsは、いくつかのグループは、3を見つけることで、機能的な組織へと圧縮することができません。生細胞の選別のための表面マーカーを含む、様々な細胞の選択方法を用いることにより、定義された細胞集団でhECTsを作成することが可能です。非心臓マーカー間質細胞は、推定上の線維芽細胞マーカーCD90 19,20のように、しばらくの間利用可能であったが、心筋細胞の表面マーカーは、より困難でした特定する。 SIRPαは、人間の心筋細胞18のために同定された最初の心臓表面マーカー間にあったと心臓系統に高度に選択的であることが示されています。最近、我々は、SIRPα+およびCD90のための二重ソートことを発見した-細胞、線維芽細胞様の表現型（Josowitz、未発表の観察）を示すCD90 +集団と、ほぼ純粋な心筋細胞が得られます。心筋細胞およびCD90 +線維芽細胞- SIRPα+ / CD90の1組み合わせ：これらの収集した知見に基づき、本明細書中で我々は3を使用してhECTsを作成する方法を説明します。
完全に定義された人間の心臓組織を設計する能力は、堅牢なスクリーニングツールを作成するためだけでなく、新興の細胞および遺伝子に基づく心臓治療を研究するためのモデルシステムを開発するだけでなく、必要不可欠です。間葉系幹細胞（MSC）を含む細胞タイプを利用心不全、特に、多数の細胞療法、21 22及び骨髄単核細胞を23~25は 、臨床試験で試験されています。最初の結果の多くは21,23,25を約 束してきたが、最初の利点は、多くの場合、時間26-29とともに減少します。同様の傾向が原因MSC補充に重要な機能的利益を表示するマウス操作心臓組織において報告されているが、利点は、長期培養1中持続しません。サブ最適な性能を根底にある細胞治療を支配するメカニズムの限られた知識です。どのように治療用細胞それらの有益な影響だけでなく、筋細胞nonmyocyte相互作用の潜在的な負の影響を及ぼし、心不全の患者のために、最小限の副作用で、臨床的に有意かつ持続的な利益をもたらす改善された治療法の開発を可能にする。より深く理解
ここでは、interrogに定義されたhECTsの使用を記載しています細胞ベースの治療のメカニズムを食べました。制御された組織組成物は、心筋細胞の性能に影響を与える特定の因子を同定することが不可欠です。我々はラットECTS 1で実証したように、直接目的の治療用細胞型（ 例えば 、MSCS）でhECTsを補完する、心筋細胞のパフォーマンスへの影響を明らかにすることができます。
次の多段階プロトコルは、マルチ組織バイオリアクターの製造に続いて、組織構造および機能分析の説明を結論、指向心臓幹細胞の分化から始まります。我々の実験は、NIH-承認H7ヒト胚性幹細胞（hESCの）ラインを使用して実行されます。しかし、次のプロトコルは、追加のhESCラインと同様の結果で三誘導多能性幹細胞（hiPSC）株を用いて試験されました。我々は、HECT製造における心筋細胞分化および成功効率は、特にfoは、細胞株に依存することができることを見出しました個々の患者由来のR hiPSCライン。このプロトコルに従うことにより、2個の6ウェルディッシュは、20日間分化さと十分な6定義された組織を作るために、ソートした後、約250万筋細胞を生み出す168万のhESC（ウェル当たり14万細胞）、の合計でメッキされています。
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Protocol
注：HEPAろ過クラスII生物学的安全キャビネットを使用して、無菌状態のすべてのセルの操作を実行し、0.2μmのフィルターを介してそれらをフィルタリングすることにより、すべてのソリューションを殺菌。同じ無菌状態または層流フードのいずれかで組織の構築と機能のテストを実行します。
心臓分化のための準備でH7のhESCの1播種
- （1日目）基底膜マトリックスの準備
- 4℃で一晩氷上でのhESC資格の基底膜マトリックスの150μlのアリコートを解凍します。
- コーティングしたプレート上のhESCの（日0-4）めっき
- 氷冷DMEM / F12の12ミリリットルに解凍したマトリックスを希釈し、よく混ぜます。
- 転送6ウェルの組織培養処理皿の各ウェルにDMEM / F12マトリックス溶液1ml。マトリックス缶コート2つの6ウェルプレートの各アリコート。
- 少なくとも1時間室温でコーティングしたプレートをインキュベートします。
注：で我々の経験では、パラフィンで密封被覆された皿は、使用前に最大10日間、4℃でマトリックス溶液中に保存することができます。 - 約75％のコンフルエンスで、非酵素的解離試薬の6ミリリットルを使用して、10cmディッシュからH7ヒトES細胞を解離します。 5分後、穏やかに使い捨てセルスクレイパーを用いて培養表面から細胞を掻き取り、滅菌15mL遠心管に細胞懸濁液を移します。
- 幹細胞株の増殖のために（さらにヒトES細胞を解離する解離試薬の5.5ミリリットルを残して）15mlチューブから細胞を用いた解離溶液の0.5ミリリットルを取り外し、新しい滅菌15mlチューブに移します。
- 20℃で5分間、300×gで細胞を0.5mlのペレット。上清を除去し、穏やかに、新しい、コーティングされた、10cmの組織培養皿に移し、幹細胞株を維持するために37℃、5％CO 2を維持する 1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有する多能性幹細胞培地8mlに再懸濁。
注意：メディアの変更中に氷の上で多能性幹細胞のメディアを保管してください。 - 一方、解離溶液の残りの5.5ミリリットルに10mMのROCK阻害剤Y-27632の5.5μlを添加し、別の5〜10分間室温でインキュベートし続けています。静かに5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて細胞を混ぜます。その後、室温で5分間、300×gで細胞をペレット化し、単一細胞懸濁液が得られるまでインキュベートし続けます。
- 多能性幹細胞培地5mlに細胞を再懸濁し、血球計数器を用いて細胞計数を行います。
- ウェルあたり14万細胞の密度で6ウェルディッシュの各ウェルをシード。 6定義された組織の合計を作成するために、2つの6ウェルプレートに播種します。めっき後、残りの細胞を処分。
- 多能性幹細胞培地でよく、1ミリリットル充填し、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 24時間後、培地を除去し、各ウェルに新鮮な多能性幹細胞培地の2ミリリットルを追加します（ 図1A
- 毎日のプレートの合流点をチェックして、細胞が約75％コンフルエンス（ 図1B - D）に達すると分化を始めます。
2.（日4-24）心筋細胞30,31へのヒト胚性幹細胞の分化
- （日4-7、分化日0-3）中胚葉誘導
- 10ミリリットルのB27の（インスリンなし）サプリメントおよびペニシリン-ストレプトマイシン原液（;万/ mlのストレプトマイシン万IU / mlペニシリン）の5ミリリットルと500ミリリットルをRPMI 1640を組み合わせることにより、RPMIの分化培地I（ 表1）を準備します。小分けし、氷上で、50ミリリットルチューブと4℃でストアに。
- （4日目、分化0日）を各ウェルから多能性幹細胞のメディアを取り出してRPMI分化培地Iの12ミリリットルに小分子GSK3阻害剤CHIR99021（10 mMストック、6μM最終濃度）の2.4μLを添加することにより、中胚葉誘導培地を準備しますANDウェル当たり中胚葉誘導培地2mlで交換してください。インキュベーターにプレートを返します。
注意：重要な細胞死は、典型的には、CHIR99021（ 図1E）の添加で発生します。単層は回復しますが、DMEM / F12リンスと死細胞を洗い流すことが重要です。 - 前述したように（5日目、分化1日目）、新鮮な中胚葉誘導培地を準備します。各ウェルから古いメディアを削除し、ウェルあたりDMEM / F12の1ミリリットルで一回すすいでください。各ウェルに新鮮な中胚葉誘導メディアの2ミリリットルを追加します。
注：デイ0-10から毎日リンスすると、大幅に心筋細胞の収率および純度を向上させます。 - （6日目、分化2日目）は、心臓の誘導培地を取り出して、ウェルあたり1ミリリットルDMEM / F12で一回すすいでください。 2ミリリットルのRPMI分化培地でリンスを交換I（ない小分子が、それでもB27（インスリンなし）サプリメントで追加されません）、インキュベーターに戻します。
- （日7-13、分化ダY 3-10）心臓中胚葉誘導
- （7日目、分化3日目）RPMI分化培地Iの12ミリリットルに小分子Wntシグナル阻害剤のIWR-1（最終10mMストック、5μM）の6μLを追加することによって、心臓中胚葉誘導培地を準備
- 各ウェルから培地を除去、ウェル当たり1ミリリットルDMEM / F12で一回洗浄し、ウェル当たりの心臓中胚葉誘導培地2mlで交換してください。
- 上記のように（8日、分化4日目）の心臓中胚葉誘導培地の追加の12ミリリットルを準備します。メディアを取り出し、ウェル当たり1ミリリットルDMEM / F12で一回洗浄し、ウェル当たり新鮮な心臓中胚葉分化培地2mlで交換し、インキュベーターに戻り、前日追加。
- （日9-10、分化日5-6）の両方の日には、心臓中胚葉誘導培地を除去し、DMEM / F12の各ウェルを1ミリリットルをすすぎます。
- 新鮮なRPMI分化メディアの2ミリリットルを追加I（ない小分子が、それでも、インスリンなしB27（）サプリメントで追加されません）各ウェルにプレートをインキュベーターに戻します。
- （日11月24日、分化日7月20日）hES由来心筋細胞組織/成熟
- 10mLのB27の（インスリンで）補足およびペニシリン-ストレプトマイシンストック溶液5ml 500mlでをRPMI 1640組み合わせることによってRPMI分化培地II（ 表1）を準備します。小分けし、氷上で、50ミリリットルチューブと4℃でストアに。
- （11日目、分化7日目）を各ウェルから（インスリンなし）RPMI分化培地を除去し、1mlのDMEM / F12で洗い流してください。各ウェルに（インスリンとの）新しいRPMI分化メディアIIの2ミリリットルと交換し、インキュベーターに戻します。
注：自発拍動は、第7日目と10との間に観察されるべきである叩解この時間の間に観察されていない場合、それは一般的に乏しい分化効率を示しています。プロトコルは鼓動を観察するための努力で15日目まで継続することができますが、何の鼓動は1日15で観察されない場合には、STに最高です芸術の新しい分化。 - （日12月24日、分化日8月20日）毎日、古い分化培地を除去し、鼓動している単層（ 図1F、 ビデオ図1の細胞成熟と組織を可能にするために、ウェルあたりの新鮮なRPMIの分化培地IIの2ミリリットルと交換）。
注：残留細胞死によっては、分化10日目を通してDMEM / F12の1mlでリンスすることが必要であり得ます。
3.（24日目、分化20日目）心筋細胞と線維芽細胞様細胞の単離
- 単層からの細胞を解離
- 分化培地を取り出して、1mlのPBSで一回すすいでください。
- 各ウェルに酵素的解離溶液（0.04％トリプシン/ 0.03％EDTA）の1ミリリットルで単層を解離させます。
- 10分間インキュベーターにプレートを移動します。一方、トリプシン中和液の6ミリリットルにROCK阻害剤の12μlを添加します。
- GentlYは、トリプシン溶液を中和するために、プレートの各ウェルにROCK阻害剤を含有するトリプシン中和溶液1mlを加えます。
- 無菌トランスファーピペットを用いて、穏やかに細胞クラスターを分割するために、各ウェルを混ぜます。
- 15mlの遠心管に6ウェルプレートからのすべての12ミリリットルを転送します。
注：2つの6ウェルプレートは、このプロトコルで使用されているので二つの15 mlチューブが必要となります。 - プレートの1つのウェルに移し、PBSの3ミリリットルをし、その後は順次ディッシュ上の任意の残留細胞を収集するために、後続の各ウェルに同じ3ミリリットルを転送します。よく細胞を含む同じ15ミリリットルの遠心分離管に最終から残りの3ミリリットルを転送します。
- 4℃で5分間、300×gでペレット。
- FACSによりライブセルソーティングのための細胞を調製
- ROCK阻害剤50μlの氷上でPBSの45ミリリットルにウシ胎児血清の5ミリリットルを追加することにより、染色バッファーを準備します。
- セルペルから上清を除去（3.1.8で）聞かせ染色緩衝液の1.2ミリリットルで再懸濁。
- 氷の上に新しい、予冷し、50ml遠心チューブに200μlの細胞懸濁液を転送します。これは、負の染色対照になります。
- 氷の上に新しい、予冷し、50ml遠心チューブに細胞懸濁液の残りの1ミリリットルを転送し、2μlのSIRPα-PE / Cy7の追加（1：500希釈）およびCD90-FITC4μlの（1：250希釈） 。静かに転送ピペットで細胞懸濁液を混合し、氷に戻ります。
- 4℃で1時間、氷上で、ロッカーシェーカー上で、ネガティブコントロールおよびサンプルの両方をインキュベートします。
- 2 15mlの遠心管に（インスリンと）RPMI培地の3ミリリットルを追加することにより、サンプル採取チューブを準備します。各チューブにROCK阻害剤の3μlを添加し、氷上で保存します。
- 4℃で5分間、300×gで染色された細胞をペレット化し、リンス当たりの氷冷PBSの少なくとも10mlで二回リンス。
- 染色緩衝液5mlにDAPI（1μg/ ml）の1μLを加えます。優しく転送ピペットを用いて、DAPI含有染色用緩衝液1-3 mlのサンプルペレットを再懸濁します。
- （何のDAPIを添加しないで）負の制御に染色緩衝液500μlを追加します。
- 静かに細胞の塊を除去し、氷上でFACSチューブをポリスチレン転送するために40μmのセルストレーナーを介して負対照および試料の両方をフィルタリングします。すぐにセルソーターにサンプルをもたらします。
- 方法18のソート確立生細胞と同様に、ゲートを設定し、生細胞（DAPI負）を選択し、FITC +（ すなわち 、CD90 +線維芽細胞）とPE / Cy7の+（ すなわち 、SIRPα+心筋細胞の両方を収集するために、負のコントロールを使用）20 PSI（ 図2）で独立した集団。
注：ゲートを設定した後、ネガティブコントロールは、心臓トロポニンTについての染色によって、分化効率を決定するために、4％PFAで固定することができます。
注：一部の研究者が使用することを好みますアイソタイプ対照ではなく、非染色対照は、非特異的抗体結合を補償するためにゲートを設定します。いわゆる蛍光マイナス1（FMO）コントロールは、別の可能性です。 FITC、DAPIおよびPE-Cy7の信号の明確な二峰性分布のために、我々は控えめに、おそらくいくつかの真陽性を除外しますが、任意の偽陽性を最小限に抑えることができます正のゲートへと遠くを目指し、陽性集団からゲートさ。
- 組織工学のための準備における細胞再凝集
- 細胞ソートした後、10％新生児ウシ血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.2％アンホテリシンB（「NBS培地」）を含有するDMEMを1mlの両方収集チューブ再懸濁ペレット。
- 60 cm 2の（10cmの皿）当たり2百万個の細胞の密度でペトリ皿に処理1の比率と非組織培養中で合わせた細胞をプレート：3SIRPα+及びCD90 +細胞を再結合します。 NBSメディアと10の10ミリリットルを追加します。1; ROCK阻害剤Y-27632のリットル。
- 小クラスターにセル再凝集を可能にするために、48時間組織培養インキュベーター中で細胞懸濁液を置き。
4.ヒト心臓組織工学
- マルチ組織のバイオリアクターを作製
注： 図3Aのイラストを補うために、詳細なバイオリアクター設計回路図とCADファイルには、著者からのリクエストも承ります。- 機械ポリテトラフルオロエチレンの9×33のx 3.25ミリメートルの直方体に直径0.5mmの6等間隔の穴を掘削することにより、PDMSのマスターモールド。
- 25×35×11ミリメートル3を測定ポリスルホンからエンドミル、機械フレームを使用しました。フレームの目的は、ベースプレートのウェルと整列して（上記の製キャストから構築）PDMSのポストを保持することです。
- 1 mmのエンドミルを使用して、マシン6ウェル（6×1×1ミリメートル3）、黒ポリの20×40×5ミリメートル3個に離れて4ミリメートルテトラフルオロエチレンは、ベースプレートを形成します。
- / w比wの1と6の力感知ポストの2行を作成するために、カスタムポリテトラフルオロエチレンモールド（ステップ4.1.1）に追加して、一晩の下でインキュベート：10でエラストマーベースとポリジメチルシロキサン（PDMS）のための硬化剤を混ぜます80℃の真空。硬化後、軽くマスターモールドからPDMSを削除して、慎重に強化されたコントラストと自動リアルタイムポスト偏向追跡のための黒の油性マジックで各ポストのトップをマークします。
注：ポリテトラフルオロエチレンはかなり柔らかく、簡単に破損することができます。従来のシステムと一貫性のあるPDMSポストジオメトリの寿命を保証するために、鋳造PDMSにマスターモールドを洗浄する際は注意してください。 0.5ミリメートルのワイヤは、各使用後にポスト用の穴をきれいにするために使用されるが、穴の内側をこすりないように注意してくださいすることができます。
注：別の脱ガスに室温で数時間真空下でPDMSで、次に周囲圧力で混合物硬化をしてみましょう。これは、硬化プロセス中にPDMSで形成少ない残留気泡をもたらし得ます。 - 蒸気オートクレーブ内のすべてのコンポーネントを滅菌します。
注：PDMSマスターモールド（ステップ4.1.1）およびポリスルホンフレーム（ステップ4.1.2）は、両方の再利用可能です。キャスト（ステップ4.1.4）から作成されたPDMSの記事も、再利用可能なだけで約10の用途のためのものです。必要に応じて、しかし、より多くのPDMSポストは、マスターモールドを使用して作成することができます。
- 再凝集心臓細胞を収集
- インキュベーターから再凝集細胞を除去し、50mlの遠心分離管に再凝集メディアのすべての10ミリリットルを転送します。
- 3mlのPBSでプレートをすすぎ、再凝集のメディアを含む同じ50ml遠心チューブにリンスを移します。
- 10cmディッシュに0.04％トリプシン/ 0.03％のEDTAの3ミリリットルを追加し、5分間インキュベーターに戻します。
- 5分後、完全な細胞dissociaを確保するために10倍の倍率で反転複合顕微鏡でプレートを検査しますディッシュからる。いくらかの残留クラスターがまだ接続されている場合は、ゆっくり塊を分離するためにプレートを攪拌。クラスタが付着したまま場合は、別の2-3分間インキュベーターに戻します。 10分以上インキュベートしていないか、または有意な細胞死が発生することがあります。
- 一旦、全ての細胞が分離され、トリプシン中和液の3ミリリットルを追加します。穏やかに再凝集培地を含有する50mLの遠心管にトリプシン細胞溶液と転送との中和溶液を混合し、PBSで一回リンス。
- 5mlのPBSで全体の皿をすすぎ、細胞を含む同じ50ミリリットルチューブに移します。
- 室温で5分間、300×gで細胞をペレット。
- 上清を除去し、NBSメディアの1ミリリットル中にペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。
- 室温で5分間、300×gでペレット化し、上清を除去します。心臓細胞（CD90 +間質細胞とSIRPα+の MYOCytes）は現在、組織構築のための準備ができています。
- （オプション）利息の補足細胞を採取
注：唯一のSIRPα+心筋細胞およびCD90 +の線維芽細胞様細胞を含む定義された組織に加えて、組織の機能に対するそれらの効果を調べるために、関心の追加のセルを追加することが可能です。例えば、ラットMSCは、ラット工学心臓組織1の機能を増強することが示されています。以下のオプションのステップは、定義されたシステムのための補助的な細胞の収集について説明しています。- 0.25％トリプシン/ 0.1％EDTAを用いて、関心の補足細胞型（ 例えば 、間葉系幹細胞）を収集します。
- 次いで、目的の細胞型の適切な細胞培養培地5mlに再懸濁し、室温で5分間、300×gで細胞をペレット。例えば、MSCのために、DMEM培養20％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.2％のアンホテリシンBとCを補充使用しますells。
- その後、室温で5分間、300×gで再び細胞をペレット化し、血球計数器を用いて細胞計数を行います。
- 、上清を除去し、細胞培養培地の1ミリリットル中に再懸濁し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。
- 室温で5分間、300×gで細胞をペレット。
- 上清を取り除きます。補足細胞は現在、組織構築のための準備ができています。
注：補足細胞は組織中の総細胞数の10％の濃度で添加される場合、各組織500,000心臓細胞（両方のCD90 +間質細胞を含むように、次に定義された組織のために、これは、組織あたり50,000補足細胞を必要としますそして、SIRPα+筋細胞）。
- 人間のエンジニア心臓組織を作成します。
注：室温で氷の上のすべてのソリューションおよび細胞を保管してください。以下に記載されているすべてのボリュームは組織単位です。典型的には、約6の組織を2つの6ウェルPLから構築することができます心臓分化ののATE。- 1 M NaOHを1.5μlのでミリリットル3.125ミリグラム/、10×PBSの9.6μlをし、滅菌超純脱イオン水24.9μlに5 mg / mlでコラーゲン株式の60.0μlの希釈します。
重要なステップ：気泡は、適切な組織の形成を破壊されますように準備中に各溶液への気泡の導入を避けてください。 - コラーゲンミックスを作成するために、希釈コラーゲン混合物に10倍MEMと0.2 N HEPES pHが9両方の12.0μlを添加します。コラーゲンミックスに気泡の導入を避けるために15ミリリットルの遠心分離管の側を下に両方のソリューションを追加します。
- コラーゲン混合ミリリットル0.9ミリグラム/最終濃度基底膜マトリックスを追加し、最終組織のミックスを作成するために氷上で保存します。コラーゲンの最終濃度は2 mg / mlであるべきです。
- 25μlの最終体積あたりに組織ミックスに再凝集細胞の500,000追加（筋細胞+線維芽細胞濃度が2000万/ mlである）と記入無細胞NBSメディアや関心の補足的な細胞型（ 例えば 、hMSCが）の50,000細胞のいずれかを有する組織、さらには細胞懸濁液を形成するために、よく混ぜます。
注：補足した細胞の数は、異なる用途のために変化するであろう。ここで、10％の補充が使用されます。 - 注意して、空気を導入することなく、バイオリアクターベースプレートの6つの各ウエルにピペット細胞懸濁液の25μlを、ウェルに泡。
- 支柱の1対が細胞懸濁液を含む各ウェルに入るようにベースプレートの上にフレームを反転その後、反対側の柱の6対を形成、ポリスルホンフレームの両側にPDMS力センサの2つの行を押してください。
注：ポリスルホンフレームは、PDMSの整列を助けるためのタブが含まれています。 - その後、10cmの皿の内側のカバーを外したままの皿を置いて上に10cmのカバーを置き、全体バイオリアクターアセンブリを移動し、60ミリメートル皿に、ダウンベースプレート、バイオリアクターを慎重に置きます組織培養インキュベーターに、ゲルの組織のための2つの時間を待っています。
- 2時間後、インキュベーターからバイオリアクターを削除して、ベースプレートをカバーするのに十分な、アセンブリ全体にNBSメディアの14ミリリットルを追加します。インキュベーターに戻り、毎日メディアの半分を変更します。
- 四十八時間後に、慎重に、静かに時のフレームから数ミリメートルをベースプレートの各辺を移動させることにより、ベースプレートを削除するメディアを変更し、その後、組織はメディアに、下に向け、バイオリアクターを返します。
- 毎日NBS培地の半分を変え続けます。
注：組織の自発的収縮が早くも5日目として7に測定可能単収縮力を発生させる、早ければ3日間組織構築後に観察することができます。
- 1 M NaOHを1.5μlのでミリリットル3.125ミリグラム/、10×PBSの9.6μlをし、滅菌超純脱イオン水24.9μlに5 mg / mlでコラーゲン株式の60.0μlの希釈します。
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Representative Results
心筋細胞を得るためには、Bohelerとリアン分化方法を少し変更したバージョンは30,31に使用されます。分化は、細胞増殖の対数期の間に開始することなく、出発集団（約75％が最適である）選別後の細胞の使用可能な数を得るために十分にコンフルエントであることが肝要です。典型的に、H7ヒトES細胞のために、37℃で維持不可欠8培地、5％CO 2インキュベーター中で6ウェル皿のウェル当たり14万hESCの密度でプレーティングすると示されているように、分化を開始するために4日後に十分にコンフルエントな培養物が得られます図1Aの- D。インスリンは、分化プロセス32中に心臓の仕様を阻害するので、インスリンを含まない培地（分化培地I、 表1）は、分化の最初の10日間使用されています。分化はGSK3インヒビターCHIR99021のアプリケーションを介して開始されると、有意な細胞死が（ 図1E）を発生します。結果として、毎日のメディアを変更することが不可欠です。分化の2日目に、細胞を、CHIR99021から削除され、24時間（無添加小分子で）分化培地中で私を休ませました。分化培地での24時間の休息の後、細胞は、それらが自己組織化などの初期分化を開始してから7日として、ビートのクラスター（ 図1F）にし始めるた後、48時間IWR-1で処理されています。心臓の仕様はIWR-1の適用後に発生しているので、メディアは、インスリン（分化培地II、 表1）を含む培地に変更します。分化の18日目までに、鼓動細胞のコロニーが接続されており、部分的にディッシュ（ ビデオ図1）を通して強固に破って「ウェブ」を形成する、細胞表面から切り離さ。
20日目に、鼓動している単層を穏やかにVIを解離されますソーティング（FACS）生の蛍光関連するセルのための単一細胞を得るための酵素的方法。上述の分化方法を用いて、保存的CD90 +（ 図2）とSIRPα+などの人口の約65％と10％の収穫します。一般的に100〜200万SIRPα+細胞を6ウェルプレート当たり得られます。
SIRPα+ 1の比：3で48時間再凝集した後にCD90 +細胞を、定義された細胞凝集体は、コラーゲンベースのヒドロゲルと混合され、マルチ組織のバイオリアクターのベースプレートに狭いウェルにピペット。一般的に、皿から除去する前に、5月10日細胞の小さなクラスターは、皿の表面に暴行見られます。定義された組織のバイオリアクターは、3つのコンポーネントで構成されていますPDMSの投稿をキャストするマスターモールド。ポストの2 PDMSラックを保持するためのフレーム。組織ミックス（ 図のための6つのウェルを含むと黒のポリテトラフルオロエチレンベースプレートUREの3A）。全体の組織構築プロセスを氷上および無菌状態で行われます。ベースプレートのウェルへの液体細胞-マトリックス混合物を添加した後、PDMSのポストはポリスルホンフレームに取り付けられており、ポストはベースプレート（ 図3B）のウェルと整列するように配置され、その後反転しています。インキュベーションの48時間後、組織をベースプレートを除去することができることを十分にコンパクト化すべきです。ベースプレートは、最も簡単にメディアからシステム全体を抽出し、静かにPDMSとベースプレートの間から余分なメディアを除去することによって取り外されます。メディアの全てが削除されていない場合、残りの流体の表面張力は、ポストからの組織を引っ張ることができます。メディアが削除されたら、そっとベースプレートから組織を緩める助けるために戻ってPDMSの投稿に対してベースプレートを押してください。その後、徐々に軽く数ミリメートル、もう一方の側まで同じ量を1面を移動させることにより、ベースプレートをオフにプッシュします。 BAまで、このプロセスを繰り返しseplateは、それぞれのPDMSエンドポスト（ 図4A）に接続されたすべての6 hECTsと、削除されます。ベースプレートを削除すると、1分よりも多くを取るべきではありません。すべての組織は、細胞培養培地で覆われているように、反転し、細胞培養培地中にシステムを交換してください。
ベースプレートを除去した後、約1日、弱い局所的な収縮は明視野顕微鏡下で定義されたhECTsで観察可能でなければなりません。 7日後に、組織が 成熟してきた整列サルコメア（ 図4D）で圧縮された（ 図4B-C）。組織は、目に見え力の5-15μN（ 図4E）の平均とPDMSの記事をそらします。定義されて設計された心臓組織は高速度カメラとカスタムデータ集録ソフトウェアでポスト先端のたわみをリアルタイムで追跡することにより測定し、決定した後、ビーム曲げ理論にポストのたわみを適用することができるための力の測定値をけいれん力変換器を使用してシリコン柱のヤング率は、以前に詳細に説明されるように、データ収集中に1,7の保守性不稔は、経時的に組織機能の変化を測定する能力を保証します。他の場所で1より詳細に説明するように私たちは、数週間のための機能的な組織を維持しています。組織は1 Hzから2 Hzのペーシング周波数（ 図4F）の両方で10％ヒト間葉系幹細胞で補充されたときに我々の予備調査結果は、HECTの収縮力の大幅な向上を示しています。
図1：拡張および心臓分化プロセス中のH7ヒトES細胞の代表的な画像 。拡張期は、72（C、48（B）に、24（A）から拡大したコロニーの成長とともに、4日間持続させるべき（D）。成長の96時間後に分化CHIR99021処理（E）の最初の48時間の間に実質的な細胞死をもたらす、開始されます。 IWR-1治療の2日後、再編成が強固に破っ「ウェブ」に早くも日と7さらに組織を破った細胞のクラスターを形成するために、（F）を発生する単層のために解離された場合、20日に7日目から発生操作された心臓組織を作成します。
ビデオ図1：分化の17日後の代表的な心臓の単層 。このビデオを見るにはこちらをクリックしてください単層内の自発的な拍動は通常、最初の7日目と10日目の間で観察され、分化の17日までに単分子層は、相互接続された「ウェブを形成しています「それはロバスト破りました。
| 名 | 組成 | 使用分化日 |
| 分化メディアI | RPMI 1640 B27サプリメント（マイナスインスリン） ペニシリン - ストレプトマイシン | （CHIR99021付き）D0-D1 D2 D3-D5（IWR-1で） D5-D7 |
| 分化メディアII | RPMI 1640 B27サプリメント（インスリンによる） ペニシリン - ストレプトマイシン | D7-D20 |
表1：分化メディアシュの構成。
図2：代表的生細胞ソート。結果をる2つのサンプルを調製した：1を用いて染色していないコントロールやステンドコントロールを：500SIRPα-PE / Cy7の抗体の希釈および1：CD90-FITC抗体の250希釈。染色後、細胞を、PBS、10％新生仔ウシ血清、10μMのROCK阻害剤Y-27632、及びを1μg/ mlのDAPIで構成されるバッファを選別で20 psiで選別しました。両方の細胞集団は、単一細胞を、前方散乱（B、青線）の両方でパルス幅および高さ（パルス幅分析）を比較することによって、選択されたデブリ（A、青線）を除外するために、前方および側方散乱プロファイルでゲートしたと側方散乱チャネル（C、青線）。人口（D、青線） -次に、生細胞をDAPIをゲーティングすることによって選択しました。収集のための最終的な細胞集団は、ライブ集団のFITC及びPE-Cy7の発現レベルを調べることにより決定しました。非染色コントロール（E、左）に使用されましたFITC +（CD90）および染色された試料中に存在するSIRPα-PE / Cy7の+（心筋細胞）集団（E、右）を選択するために適切なゲートを確立します。 FITCとSIRPα-PE / Cy7の+ poplationsは、別の15ミリリットルの遠心分離管に採取しました。
図3：1）ポリテトラフルオロエチレンのマスターモールド9×33×5 mm 3で、6等間隔の穴を持つ： マルチ組織のバイオリアクターと心臓組織工学プロセスのマルチ組織のバイオリアクターの構築の概略は、次の 3つのコンポーネント（A）が必要です直径が0.5ミリメートル; 2）25×35×11ミリメートル3ポリスルホンフレームは、組織の構築と培養中のPDMSの投稿を保持します。 6×1×1ミリメートル3次元、スパの6ウェルを有すると3）20×40×5ミリメートル3黒のポリテトラフルオロエチレンベースプレートその長さに沿って4ミリメートル離れをced。人間工学的心臓組織（B）を作成するには 、PDMSの記事は、その後、力感知カンチレバーポストの6対を形成するために、ポリスルホンフレームのタブ上にプレスされているそのうちの2つは、ポリテトラフルオロエチレンマスターモールドを使用して、PDMSソフトリソグラフィーによって製作されます。組織液は、黒、ポリテトラフルオロエチレンベースプレートでウェルにピペットされます。フレームとポストは、その後反転し、支柱の1ペアが各ウェルの組織ミックスを含む入るように、ポリテトラフルオロエチレンベースプレート上に整列されています。 48時間後、ベースプレートを除去し、定義された組織は、支柱上で培養される、NBSメディア反転まま。
図4：代表的な画像と定義された人間工学的心臓組織の機能測定マルチ組織bioreactまたはシステムは、並行して6組織（A、矢印）を保持します。定義された組織は、自己集合組織の作成 後7日以内（上面図、Bおよび斜め側面図、C）です。 （D）。定義されたHECTの部分は、心筋トロポニンT（cTnTの）について染色しました。 （E）代表単収縮トレースは、電場刺激によってペーシング1 Hzの間に時間をかけて生の力を示しています。 （F）は、両方の非補足規定されたhECTsための周波数の変化（実線）をマーキング矢印で、1ヘルツ（0-2秒）及び2ヘルツ（2-4秒）ペーシングで刺激中トレースけいれん、組織を10％のhMSCを補充します（点線）。
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Discussion
定義された人間工学的心臓組織（HECT）の構築は、人間の心筋細胞機能のより一貫性と信頼性の高いモデルを提供することができます。批判的に、システム内のすべての細胞および細胞外成分が知られており、従って、分化過程に起因する他の未知の細胞型の交絡の影響を除去し、所望のように操作することができます。急速な細胞増殖と高い収率のバランスをとるためには、分化は、理想的には四日間プレーティング後、hESCの75％コンフルエンスで開始することが好ましいです。さらに、非常に選別後の細胞の解離および再凝集の両方の間にROCK阻害剤Y-27632の使用は、細胞の生存率を高めます。分化プロセス中の筋細胞の自発的な鼓動の存在は、分化の効率化と健康の重要な指標です。自発的な鼓動が観察されていない場合、これは効果がない試薬または損失によるいずれかで、貧しい分化効率を示すことができます幹細胞の多能性。
組織構築時に、PDMSポストが収縮機能を測定するために十分長くは続かよく形成された組織を作成するために、ベースプレートのチャネルと適切に整列する必要があります。デバイスアライメントの容易さを高め、それらが破壊を受けやすいポストの周囲の組織の形成を強化するために、示されているように、チャネルの末端に余分な幅（ポストのそれぞれの側に約1のポストの直径）を追加することも可能です「犬用の骨」によって、図3Aのチャンネルを字形。適切なデバイスアライメントがなければ組織はまもなく培養後のポストから離脱するか、ベースプレートが除去されたときにウェル内に残ります。よく形成された組織は、ベースプレートの除去中に脱落した場合、十分な注意が取られていない場合繊細hECTsを損傷することは容易であるものの、優しく解剖顕微鏡下で微細な鉗子を使用してポストに組織を再接続することが可能です。</ P>
記載定義されたシステムの主要な強さは、細胞組成物の特定の制御に基づいて、心臓の細胞療法における直接細胞 - 細胞相互作用機構の寄与を調べるための能力です。動物中の細胞の注射は不正確と低生存率およびリテンション33の対象となります。さらに、標的組織に注入された細胞の効果は、免疫系のような他の生理学的システムとの相互作用によって複雑になります。このように、心臓の細胞療法における直接の細胞間相互作用の寄与を理解することは、モデル生物に対処するために挑戦されています。したがって、記載された方法の利点は、細胞 - 細胞相互作用は、心臓のニッチの重要な側面を維持し、生体模倣三次元環境で分析し、目的の特定の細胞型の存在下でされていることである - すなわち、心筋細胞及び線維芽細胞。定義されたHECTシステムを使用しての有用性はdemonstrです人間の骨髄34,35に由 来し、組織の作成 時に細胞混合物への臨床試験で使用される10％のhMSCの補充とated。 hMSCを補充したこれらの組織は、非補充規定されたヒト組織（ 図4F）よりも大きな収縮力を示しました。組織環境と組成が制御されているので、MSC補充と組織機能の強化は、心筋細胞の機能上のhMSCを本来の効果を反映しています。システムの別の強度は、組織が 以前に使用さよりも小さいので、細胞源としての多能性幹細胞の指向微分を使用した場合、1,7セルの使用は、重要な考慮事項でより効率的であるということです。
細胞療法のメカニズムを研究超え、定義HECTシステムは、心臓血管細胞間相互作用の細胞基盤の検査を可能にします。組織定数の前に、細胞の生物学の摂動騒動、shRNAを有する例えば、細胞 - 細胞及び細胞 - マトリックス相互作用を支配する分子メカニズムの調査を可能にします。組織工学システムのさらなる利点は、機能的な収縮が可能な整列筋原線維の形成です。したがって、定義されたHECTシステムを使用して、筋原線維形成、心筋細胞の発達および組織構造の組織のダイナミクスは、全ての細胞の細胞外マトリックスまたは分子操作の構成要素の変更を介して調べることができます。人間とHECTシステムの3-Dの性質は、さらに、調査結果の翻訳可能を増加させます。
記載されているシステムは、心臓血管生物学の基本的な質問を理解するための強力な方法を提供していますが、それは制限がないわけではありません。まず、操作された組織は、新生児心筋サンプル7から公開された単収縮力のデータと一致する未成熟表現型を呈する。一方で表現型の未成熟は、細胞間相互作用のメカニズムを評価する交絡因子であることができ、病気の心筋細胞は、胎児の遺伝子プログラム7,36-38に戻すという証拠があります。 HECTシステムからの知見は、心不全の状況で関連性があると判明した場合、これは、心臓の治療を試験するために有利であり得ます。プロトコルはまた、組織構造中のhESC修飾基底膜マトリックスを使用します。このマトリックスの組成は、ロットごとに変えることができ、および定義された地下行列の選択肢が用意されていながら、彼らはhECTsのコンテキストで評価されるには至っていません。
他の制限は、血管系の欠如なしシステム・レベルの相互作用の効果を含みます。組織の大きさを考えると、代謝要求は、拡散のみによって満たされているので、全く血管系は、細胞の生存を確保するために必要とされません。しかしながら、内皮細胞のシグナル伝達は、特定の細胞療法における重要な因子であり得ます。遠藤のこのような場合は、特定の番号thelial細胞は、単に組織構造中に定義された細胞混合物に添加することができます。システムレベルの相互作用は、細胞のメカニズムを完全に理解するために重要ですが、改変された組織のシステムは、体系的メカニズムに対処するために、問題を単純化する還元主義的なアプローチを提供しています。そのような免疫応答を組み込むため、白血球などのシステム関連の影響の導入を介して、またはパラ分泌シグナル伝達を調べるために、隣接する組織の種類を追加することにより、必要に応じて複雑さが定義された組織系に添加することができます。
調査ツールとして、心臓組織のシステムを設計し定義された人間は、制御された生物複雑性、収縮機能の簡単な縦監視、および定義された細胞およびマトリックス組成物を用いたバイオミメティック3次元培養環境を種特異的ヒト細胞の利点を提供しています。 HECTシステムの今後の方向性は、関心のウィットの治療用細胞の種類を操作含ま時間のsiRNAまたはshRNA細胞間相互作用の特定の分子の詳細を調べるために組織への導入に先立っ。さらに、むしろ心臓細胞を形成するためにヒトES細胞を使用するよりも、操作組織において関連する心疾患の症状をモデル化するための努力の遺伝変異を有する患者から人工多能性幹細胞（iPS細胞）を使用することが可能です。したがって、定義された細胞集団を持つ人間工学的心臓組織を作成する私たちの方法は、心疾患患者のための新規治療法の開発を迅速化するために、心臓細胞治療を研究するための新たな道を開くことを約束します。
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Acknowledgments
この作品は、BDG、アメリカに香港TRS T13-706 / 11（KDC）、NIH（R01 HL113499）の研究助成協議会、KDCにTJC、NIH / NHLBI PEN契約HHSN268201000045CにNIH（1F30HL118923-01A1）によってサポートされていましたRJ、および香港特別行政区の研究助成評議会（TBRS、T13-706 / 11）に心臓協会（12PRE12060254）追加の資金調達をRLには、NIH DRB 5T32GM008553-18によって、およびシステムと発達におけるNIDCR、学際的訓練に訓練生としてTJCに提供されました生物学と先天異常T32HD075735。また、作者は感謝して技術支援のためのバイオリアクターとMamdouh Eldalyの加工の支援のためにニューヨークのシティカレッジのザーンセンターでアーサーAutzを認識したいです。我々はまた、寛大にヒト間葉系幹細胞を提供するための心臓分化に関するアドバイス博士ケネスBoheler、博士ジョシュアウサギに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10x PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
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