Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53447
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 2, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

Introduction

وقد تقدمت هندسة الأنسجة القلبية إلى حد كبير في العقد الماضي، مع مجموعات متعددة نشر نتائج وظيفية بالكامل، والضرب الأنسجة المصنوعة من كلا العضلية الفئران 1-6، وفي الآونة الأخيرة، myocytes القلب الإنسان المستمدة الخلايا الجذعية 7-12. إن مجال هندسة الأنسجة القلبية من قبل اثنين من الأهداف الرئيسية والمستقلة أساسا: 1) لتطوير ترقيع الخارجية التي يمكن زرعها في قلوب فشلها في تحسين وظيفة 4-6. و2) لتطوير نماذج في المختبر لدراسة علم وظائف الأعضاء والمرض، أو أدوات الفحص للتنمية العلاجية 2،7.

يعتبر ثلاثي الأبعاد (3-D) زراعة الخلايا ضرورية لتطوير أدوات الفحص الجيل القادم، كما تعكس المصفوفة 3-D المكروية القلب أكثر طبيعية من ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية 2-D. في الواقع بعض جوانب بيولوجيا الخلية تختلف اختلافا جوهريا في 2-D الثقافات مقابل 3-D 13،14 9 أو الكولاجين 7،8،10) بدقة، يتم تعريف تكوين خلية مدخلات أقل بشكل جيد، مع خليط كامل من الخلايا من تمايز القلب موجهة إما الخلايا الجذعية الجنينية (ESC 7،9) أو التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (IPSC 10،12) يتم إضافتها إلى الأنسجة. اعتمادا على خط خلية معينة وكفاءة بروتوكول التمايز المستخدمة، ونسبة الناتج العضلية يمكن أن تتراوح بين أقل من 25٪ إلى أكثر من 90٪، والنمط الظاهري cardiomyocyte محددة (على سبيل المثال، ventricular-، atrial-، أو تنظيم ضربات القلب مثل) يمكن أيضا تختلف، حتى جزء غير cardiomyocyte يمكن أن تكون متباينة للغاية 15،16 ويغير نضج م القلب متباينةyocytes 17.

وقد حاولت مؤخرا القلب عمل هندسة الأنسجة للسيطرة على السكان المدخلات من الخلايا، إما مع مراسل القلب الجذعية الجنينية البشرية خط الخلية 8 أو خلية السطح علامات 18 تستخدم لعزل المكون العضلية القلبية من التمايز. بينما في البداية الأنسجة المكونة من myocytes القلب الوحيدة التي يبدو أن المثل الأعلى، وهذا هو في الواقع ليس كذلك. فشل hECTs تتألف فقط من myocytes القلب ضغط إلى أنسجة وظيفية، مع بعض الجماعات كشفت عن نسبة 3: 1 من myocytes القلب: الخلايا الليفية المنتجة أعلى قوة نشل 8. باستخدام مختلف أساليب تحديد الخلية، بما في ذلك علامات سطح لفرز الخلايا الحية، فمن الممكن لخلق hECTs مع السكان الخلية المحددة. بينما علامات خلايا انسجة غير القلب كانت متاحة لبعض الوقت، مثل علامة الليفية المفترضة CD90 19،20، كانت علامات سطح myocytes القلب أكثر صعوبةالتعرف عليها. كان SIRPα من بين أولى علامات سطح القلب التي تم تحديدها لmyocytes القلب الإنسان 18 ولقد ثبت أن تكون انتقائية للغاية لنسب القلب. مؤخرا، وجدنا أن مزدوجة والفرز لSIRPα + وCD90 - الخلايا العضلية ينتج نقية تقريبا، مع CD90 + سكان واظهار مثل الخلايا الليفية النمط الظاهري (Josowitz والملاحظات غير منشورة). وبناء على هذه النتائج التي تم جمعها، هنا وصفنا خلق hECTs باستخدام 3: مجموعة 1 من SIRPα + / CD90 - العضلية وCD90 + الخلايا الليفية.

القدرة على هندسة الأنسجة القلبية الإنسان يعرف تماما أمر ضروري ليس فقط لخلق أدوات الفحص قوية، ولكن أيضا لتطوير نظم نموذج للتحقيق الخلوي الناشئة وعلاجات القلب على أساس الجينات. وعلى وجه الخصوص، والعديد من علاجات الخلايا لقصور القلب، وذلك باستخدام أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الجذعية الوسيطة (MSC) 21 22 والخلايا وحيدة النواة نخاع العظام 23-25، قد تم اختبارها في التجارب السريرية. في حين أن العديد من النتائج الأولية قد وعد 21،23،25، والاستفادة الأولية غالبا ما يقلل مرور الوقت 26-29. تم الإبلاغ عن وجود اتجاه مماثل في الفئران المهندسة أنسجة القلب، الذي عرض فائدة وظيفية كبيرة بسبب MSC مكملات، ولكن لم تتم المحافظة صالح خلال ثقافة طويل الأجل 1. الكامنة وراء الأداء دون المستوى الأمثل هو معرفتنا محدودة من الآليات التي تحكم علاجات الخلايا. فهم أعمق لكيفية الخلايا العلاجية ممارسة تأثير مفيد، وكذلك العواقب السلبية المحتملة من التفاعلات العضلية nonmyocyte، سيمكن تطوير وتحسين العلاجات تحقق فوائد هامة سريريا ومستدامة، مع آثار جانبية أقل، للمرضى المصابين بقصور في القلب.

هنا، نحن تصف استخدام hECTs محددة لinterrogأكل آليات العلاج المبني على الخلية. تكوين الأنسجة التي تسيطر عليها أمر ضروري لتحديد العوامل المحددة التي تؤثر على أداء cardiomyocyte. المكمل مباشرة hECTs مع نوع من الخلايا العلاجية من الفائدة (على سبيل المثال، اللجان الدائمة)، يمكن أن تكشف عن الآثار المترتبة على أداء العضلية القلبية، ولقد أثبتنا في النظام الأوروبي الفئران 1.

يبدأ بعد بروتوكول متعددة الخطوات مع توجه القلب تمايز الخلايا الجذعية، تليها تصنيع مفاعل حيوي متعدد الأنسجة، وعقد مع وصفا لبناء الأنسجة والتحليل الوظيفي. يتم تنفيذ تجاربنا باستخدام سطر وافق NIH-H7 الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (HESC). ومع ذلك، كما تم اختبار البروتوكولات التالية باستخدام خط HESC إضافية وثلاثة الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) خطوط مع نتائج مماثلة. لقد وجدنا أن الكفاءة في تمايز cardiomyocyte والنجاح في كان الحاخام هيشت تلفيق يمكن أن يكون خط الخلية التابعة، لا سيما FOخطوط ص hiPSC المستمدة من مريض على حدة. باتباع هذا البروتوكول، ومطلي طبقين 6 جيدا مع ما مجموعه 1680000 hESCs (140،000 الخلايا لكل بئر)، والتي ينتج ما يقرب من 2.5 مليون myocytes بعد التفريق لمدة 20 أيام والفرز، وهو ما يكفي لجعل ستة الأنسجة محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تنفيذ كافة التلاعب خلية في ظروف معقمة باستخدام الدرجة الثانية خزانة السلامة البيولوجية تصفية HEPA وتعقيم جميع الحلول من خلال تصفية لهم من خلال مرشح 0.2 ميكرون. أداء بناء الأنسجة واختبار وظيفة سواء في نفس ظروف معقمة أو غطاء تدفق الصفحي.

1. البذر من H7 hESCs في التحضير للتمايز القلب

  1. (يوم 1) إعداد بدروم غشاء مصفوفة
    1. ذوبان الجليد 150 ميكرولتر قسامة من HESC المؤهلة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. (يوم 0-4) الطلاء من hESCs على لوحات المغلفة
    1. تمييع مصفوفة إذابة إلى 12 مل من الجليد الباردة DMEM / F12 وتخلط جيدا.
    2. نقل 1 مل من محلول DMEM / F12 مصفوفة في كل بئر من صحن زراعة الأنسجة 6-جيدا المعالجة. كل قسامة من المصفوفة يمكن معطف صفيحتين 6 جيدا.
    3. احتضان لوحات مغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: فيتجربتنا، أطباق المغلفة مختومة مع البارافين ويمكن تخزينها في حل مصفوفة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 أيام قبل الاستخدام.
    4. وفي حوالي 75٪ التقاء، تنأى H7 hESCs من الطبق 10 سم باستخدام 6 مل من كاشف تفارق غير الأنزيمية. بعد 5 دقائق، كشط بلطف الخلايا من سطح الثقافة باستخدام مكشطة الخلية يمكن التخلص منها ونقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي معقمة.
    5. إزالة 0.5 مل من محلول التفكك مع الخلايا من أنبوب 15 مل ونقل إلى العقيمة 15 مل أنبوب جديد (ترك 5.5 مل من كاشف تفارق لزيادة يفرق بين hESCs) لنشر خط الخلايا الجذعية.
    6. بيليه 0.5 مل من الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية. إزالة طاف و resuspend بلطف في 8 مل من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية المحفزة التي تحتوي على 1٪ البنسلين ستربتومايسين ثم نقل إلى المغلفة، 10 سم طبق جديد، وزراعة الأنسجة والحفاظ على 37 درجة مئوية، وCO 2 5٪ للحفاظ على خط الخلايا الجذعية.
      ملاحظة: حافظ على المحفزة وسائل الاعلام الخلايا الجذعية على الجليد خلال التغيرات وسائل الإعلام.
    7. وفي الوقت نفسه، إضافة 5.5 ميكرولتر من 10 ملي ROCK المانع Y-27632 إلى 5.5 مل من التفكك حل المتبقية والاستمرار في احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق أخرى. المزيج بلطف الخلايا مع 5 مل الماصة المصلية. الاستمرار في احتضان حتى يتم التوصل إلى تعليق خلية واحدة، ثم بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. resuspend الخلايا في 5 مل من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية المحفزة وإجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات.
    9. بذور كل بئر من صحن 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 140،000 الخلايا لكل بئر. البذور اثنين 6 لوحات جيدا لإنشاء ما مجموعه ستة الأنسجة محددة. تخلص من أي الخلايا المتبقية بعد الطلاء.
    10. ملء البئر إلى 1 مل مع وسائل الاعلام الخلية الجذعية المحفزة واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. في وقت لاحق أربع وعشرين ساعة، وإزالة وسائل الإعلام وإضافة 2 مل من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية المحفزة جديدة إلى كل بئر (الشكل 1A
    11. تحقق التقاء لوحات كل يوم، ويبدأ التمايز مرة واحدة الخلايا تصل إلى ما يقرب من 75٪ التقاء (الشكل 1B - D).

2. (يوم 24/4) تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لالعضلية 30،31

  1. (يوم 4-7، التمايز يوم 0-3) الأديم المتوسط ​​الحث
    1. إعداد RPMI وسائل الإعلام التمايز الأول (الجدول 1) عن طريق الجمع بين 500 مل RPMI 1640 مع 10 ملحق مل B27 (بدون الأنسولين) و 5 مل من محلول المخزون البنسلين ستربتومايسين (10000 وحدة دولية / مل البنسلين، 10000 ميكروغرام / مل الستربتومايسين). قسامة، على الجليد، إلى 50 مل الأنابيب وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. (يوم 4، التمايز يوم 0) إعداد وسائل الاعلام الاستقراء الأديم المتوسط ​​بإضافة 2.4 ميكرولتر من CHIR99021 صغيرة جزيء GSK3 المانع (10 ملي الأسهم، 6 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى 12 مل من وسائل الاعلام التمايز RPMI أولا إزالة المحفزة وسائل الاعلام الخلايا الجذعية من كل جانب االثانية استبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض لكل بئر. العودة إلى لوحة الحاضنة.
      ملاحظة: كبير موت الخلية يحدث عادة مع إضافة CHIR99021 (الشكل 1E). سوف أحادي الطبقة على التعافي، ولكن من المهم لشطف الخلايا الميتة بعيدا مع شطف DMEM / F12.
    3. (يوم 5، التمايز يوم 1) إعداد وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض جديدة كما هو موضح أعلاه. إزالة وسائل الإعلام القديمة من كل بئر وشطف مرة واحدة مع 1 مل من DMEM / F12 لكل بئر. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض جديدة إلى كل بئر.
      ملاحظة: الشطف كل يوم من يوم 0-10 يزيد كثيرا المحصول ونقاء myocytes القلب.
    4. (يوم 6 التمايز يوم 2) إزالة وسائل الإعلام تحريض القلب وشطف مرة واحدة مع 1 مل DMEM / F12 لكل بئر. استبدال شطف مع 2 مل سائل الإعلام التمايز RPMI الأول (أي جزيئات صغيرة أضفت لكن لا يزال مع B27 (بدون الأنسولين) ملحق) والعودة إلى الحاضنة.
  2. (يوم 13/7، التمايز داص 3-10) قلب الأديم المتوسط ​​الحث
    1. (يوم 7 التمايز يوم 3) إعداد وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض القلب عن طريق إضافة 6 ميكرولتر من جزيء صغير WNT المانع IWR-1 (10 ملي الأسهم، 5 ميكرومتر النهائي) إلى 12 مل من RPMI وسائل الاعلام التفريق أولا
    2. إزالة وسائل الإعلام من كل بئر، وشطف مرة واحدة مع 1 مل DMEM / F12 لكل بئر واستبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض القلب لكل بئر.
    3. (يوم 8 التمايز يوم 4) إعداد مدة 12 مل إضافية من وسائل الإعلام تحريض الأديم المتوسط ​​القلب كما هو موضح أعلاه. إزالة وسائل الإعلام وأضاف في اليوم السابق، وشطف مرة واحدة مع 1 مل DMEM / F12 لكل بئر واستبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​التمايز القلب النقي لكل بئر والعودة إلى الحاضنة.
    4. (يوم 10/9، التمايز يوم 5-6) على كلا أيام، وإزالة وسائل الإعلام الأديم المتوسط ​​تحريض القلب وشطف كل جيدا مع 1 مل من DMEM / F12.
    5. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام التمايز RPMI الطازجة الأول (أي جزيئات صغيرة وأضافت ولكن لا يزال مع B27 (بدون الأنسولين) ملحق)إلى كل بئر والعودة إلى لوحة الحاضنة.
  3. (يوم 11-24، التمايز يوم 7-20) المستمدة [هس-منظمة العضلية للقلب / النضج
    1. إعداد RPMI وسائل الإعلام التمايز الثاني (الجدول 1) عن طريق الجمع بين 500 مل RPMI 1640 مع 10 ملحق مل B27 (مع الأنسولين) و 5 مل من البنسلين ستربتومايسين حل الأسهم. قسامة، على الجليد، إلى 50 مل الأنابيب وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. (يوم 11 التفاضل يوم 7) إزالة RPMI وسائل الإعلام التمايز (بدون الأنسولين) من كل بئر وشطف مع 1 مل DMEM / F12. استبدال 2 مل من RPMI وسائل الإعلام التمايز الجديد الثاني (مع الأنسولين) إلى كل بئر والعودة إلى الحاضنة.
      ملاحظة: يجب أولا أن لاحظ الضرب العفوي بين أيام 7 و 10. إذا لم يكن لوحظ الضرب خلال هذا الوقت، فإنه يشير إلى عادة ضعف كفاءة التمايز. لا يمكن أن تستمر على البروتوكول حتى يوم 15 في محاولة لمراقبة الضرب، ولكن إذا لوحظ أي ضرب من قبل يوم 15 فمن الأفضل أن الواحدالفن تمايز جديد.
    3. (يوم 12-24، التمايز يوم 8-20) كل يوم، وإزالة وسائل الإعلام التمايز القديمة واستبدالها مع 2 مل من جديد RPMI وسائل الإعلام التمايز الثاني في البئر للسماح نضوج الخلايا وتنظيم أحادي الطبقة الضرب (الشكل 1F، فيديو الشكل 1 ).
      ملاحظة: اعتمادا على موت الخلايا المتبقية، قد يكون من الضروري لشطف مع 1 مل من DMEM / F12 خلال يوم التمايز 10.

3. (يوم 24 التفاضل يوم 20) عزل من القلب Myocytes والخلايا الليفية مثل

  1. فصل الخلايا من أحادي الطبقة
    1. إزالة وسائل الاعلام التمايز وشطف مرة واحدة مع 1 مل برنامج تلفزيوني.
    2. يفرق بين الطبقات الوحيدة مع 1 مل من محلول التفكك الأنزيمي (0.04٪ التربسين / 0.03٪ EDTA) إلى كل بئر.
    3. نقل لوحة في الحاضنة لمدة 10 دقيقة. وفي الوقت نفسه، إضافة 12 ميكرولتر من مثبط ROCK إلى 6 مل من محلول التربسين التعادل.
    4. Gentlذ إضافة 1 مل من محلول التربسين تحييد تحتوي على مثبط ROCK إلى كل بئر من لوحة لتحييد حل التربسين.
    5. باستخدام الماصة نقل معقمة، مزيج بلطف كل بئر لتحطيم مجموعات الخلايا.
    6. نقل كل 12 مل من لوحة 6 جيدا لأنبوب الطرد المركزي 15 مل.
      ملاحظة: نظرا لاستخدام لوحين 6 جيدا في هذا البروتوكول، وسوف تكون هناك حاجة إلى أنبوبين 15 مل.
    7. نقل 3 مل من برنامج تلفزيوني إلى جانب واحد من لوحة، ومن ثم نقل بالتسلسل نفس 3 مل إلى كل بئر لاحقة لجمع أي الخلايا المتبقية على طبق. نقل ما تبقى من 3 مل من المباراة النهائية بشكل جيد في نفس أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على خلايا.
    8. بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد الخلايا لفرز خلايا الحية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية
    1. إعداد عازلة تلطيخ بإضافة 5 مل من مصل بقري جنيني إلى 45 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد مع 50 ميكرولتر من مثبط ROCK.
    2. إزالة طاف من ااا خليةأبلاغ (في 3.1.8) و resuspend في 1.2 مل من العازلة تلطيخ.
    3. نقل 200 ميكرولتر من تعليق خلية ل، قبل المبردة، 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة على الجليد. وستكون هذه السيطرة تلطيخ السلبية.
    4. نقل ما تبقى من 1 مل من خلية إلى تعليق لذلك، قبل المبردة، 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة على الجليد وإضافة 2 ميكرولتر SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 تمييع) و 4 ميكرولتر من CD90-FITC (1: 250 تمييع) . المزيج بلطف تعليق الخلية مع الماصة نقل والعودة إلى الجليد.
    5. احتضان كل من سيطرة السلبية وعينة، على شاكر الروك، على الجليد، في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. إعداد أنابيب جمع العينات عن طريق إضافة 3 مل من وسائل الاعلام RPMI (مع الأنسولين) لمدة 15 مل أنابيب الطرد المركزي. إضافة 3 ميكرولتر من مثبط ROCK إلى كل أنبوب وتخزينها على الجليد.
    7. بيليه الخلايا الملون في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وشطف مرتين مع 10 مل على الأقل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في الشطف.
    8. إضافة 1 ميكرولتر من دابي (1 ميكروغرام / مل) إلى 5 مل من العازلة تلطيخ. بلطفresuspend الكرية عينة مع 1-3 مل من عازلة تلطيخ التي تحتوي على دابي باستخدام الماصة نقل.
    9. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (مع إضافة أي دابي) إلى سيطرة سلبية.
    10. تصفية بلطف كل من سيطرة السلبية وعينة من خلال مصفاة 40 ميكرومتر خلية لإزالة كتل من الخلايا ونقل إلى البوليسترين أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد. تحقيق على الفور العينات إلى فارز الخلية.
    11. تشبه الخلية الحية إنشاء طرق فرز 18، استخدم سيطرة سلبية لضبط البوابات، حدد الخلايا الحية (دابي السلبية) وجمع كل من FITC + (أي CD90 + الخلايا الليفية) وPE / Cy7 + (أي SIRPα + العضلية ) ظل السكان بشكل مستقل في 20 رطل (الشكل 2).
      ملاحظة: بعد وضع البوابات، ويمكن أن تكون ثابتة سيطرة سلبية في 4٪ PFA لتحديد كفاءة التمايز من تلطيخ للالقلب تروبونين-T.
      ملاحظة: بعض الباحثين يفضلون استخدامisotype السيطرة بدلا من سيطرة غير ملوثين لضبط البوابات من أجل التعويض عن الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. عنصر تحكم ما يسمى مضان ناقص واحد (FMO) هي احتمال آخر. بسبب التوزيع ذات النسقين واضح للFITC، دابي وإشارات PE-Cy7، نحن بوابات من السكان الإيجابي بهدف متحفظ بعيدا في بوابة الإيجابية، التي ربما تستبعد بعض الإيجابيات الحقيقية ولكن يساعد على تقليل أي ايجابيات كاذبة.
  3. إعادة تجميع خلية في التحضير للهندسة الأنسجة
    1. بعد الفرز الخلية، بيليه كلا أنابيب جمع وresuspend في 1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ حديثي الولادة المصل البقري، 1٪ البنسلين ستربتومايسين و 0.2٪ الامفوتريسين ( "وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء").
    2. إعادة تجميع SIRPα + وCD90 + الخلايا في نسبة 3: 1 و لوحة الخلايا مجتمعة في الثقافة غير الأنسجة تعامل طبق بتري في مناطق ذات كثافة من 2 مليون خلية لكل 60 سم 2 (صحن 10 سم). إضافة 10 مل من وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء و 101؛ لتر من ROCK المانع Y-27632.
    3. ضع تعليق خلية في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 48 ساعة للسماح إعادة تجميع الخلية إلى مجموعات صغيرة.

4. قلب الإنسان هندسة الأنسجة

  1. افتعال مفاعل حيوي متعدد الأنسجة
    ملاحظة: لاستكمال الرسوم التوضيحية في الشكل 3A، متوفرة عند الطلب من المؤلفين ملفات CAD مع الخطط تصميم مفاعل حيوي مفصل.
    1. آلة القالب الرئيسي PDMS من خلال حفر ستة ثقوب متباعدة بشكل متساو من قطر 0.5 ملم في متوازي المستطيلات 9 × 33 س 3.25 ملم من تترافلوروإيثيلين.
    2. باستخدام endmill، آلة إطار من متعدد السلفون قياس 25 × 35 × 11 مم 3. والغرض من هذا الإطار هو أن تتولى المناصب PDMS (شيدت من الزهر الواردة أعلاه) في المواءمة مع الآبار في اللوح الأساس.
    3. باستخدام endmill 1 ملم، آلة 6 آبار (6 × 1 × 1 مم 3)، 4 مم وبصرف النظر إلى قطعة 20 × 40 × 5 مم 3 من بولي الأسودtetrafluoroethylene لتشكيل اللوح الأساس.
    4. مزيج القاعدة المرنة وكيل علاج ل(PDMS) ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان في 10: 1 ث / ث نسبة وإضافة إلى تترافلوروإيثيلين مخصصة العفن (الخطوة 4.1.1) لإنشاء صفين من ست وظائف قوة الاستشعار، واحتضان بين عشية وضحاها، وتحت فراغ في 80 درجة مئوية. بعد المعالجة، وإزالة بلطف PDMS من القالب الرئيسي ووضع علامة بعناية قمم كل وظيفة مع علامة دائمة سوداء لتعزيز التباين والآلية في الوقت الحقيقي تتبع آخر انحراف.
      ملاحظة: بوليتيترافلوريثيليني لينة نوعا ما ويمكن أن تتلف بسهولة. استخدام الحذر عند تنظيف القالب الرئيسي قبل PDMS الصب لضمان طول العمر للنظام ومتسقة آخر PDMS الهندسة. سلك 0.5 مم يمكن استخدامها لتنظيف فتحات للوظائف بعد كل استخدام، ولكن الحرص على عدم كشط داخل الثقوب.
      ملاحظة: بديل هو ديغا في PDMS تحت فراغ لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة، ثم السماح للشفاء الخليط في الضغط المحيط.وهذا قد يؤدي إلى عدد أقل من فقاعات الغاز المتبقية تشكيل في PDMS أثناء عملية المعالجة.
    5. تعقيم جميع مكونات في الأوتوكلاف بخار.
      ملاحظة: قالب PDMS سيد (الخطوة 4.1.1) والإطار متعدد السلفون (الخطوة 4.1.2) على حد سواء ويمكن إعادة استخدامها. الوظائف PDMS التي تم إنشاؤها من المدلى بها (الخطوة 4.1.4) هي أيضا قابلة لإعادة الاستخدام ولكن فقط لنحو 10 الاستخدامات. ومع ذلك، المزيد من المشاركات PDMS يمكن أن تنشأ حسب الحاجة باستخدام القالب الرئيسي.
  2. جمع الخلايا قمنا بإعادة تجميع القلب
    1. إزالة الخلايا قمنا بإعادة تجميع من الحاضنة ونقل كل 10 مل من وسائل الاعلام إعادة تجميع لأنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    2. شطف لوحة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني ونقل شطف إلى نفس 50 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على وسائل الإعلام إعادة تجميع.
    3. إضافة 3 مل من 0.04٪ التربسين / 0.03٪ EDTA إلى صحن 10 سم والعودة إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق.
    4. بعد 5 دقائق، ودراسة اللوحة مع مجهر مركب مقلوب في التكبير 10x لضمان dissocia خلية كاملةنشوئها من الطبق. إذا لا تزال تعلق بعض الكتل المتبقية، تستنهض الهمم بلطف لوحة لفصل كتل. إذا ظلت مجموعات المرفقة، والعودة إلى الحاضنة لمدة 2-3 دقائق أخرى. لا احتضان أطول من عشر دقائق أو موت الخلية كبيرا قد تحدث.
    5. مرة واحدة يتم فصل كل الخلايا، إضافة 3 مل من محلول التربسين التعادل. المزيج بلطف الحل تحييد مع الحل التربسين خلية ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على وسائل الإعلام إعادة تجميع وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    6. شطف طبق كامل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى نفس أنبوب 50 مل تحتوي على خلايا.
    7. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. إزالة طاف و resuspend بيليه في 1 مل من وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء، ثم نقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    9. بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. خلايا القلب (CD90 + انسجة الخلايا وSIRPα + myocytes) جاهزة الآن لبناء الأنسجة.
  3. (اختياري) جمع خلايا خلفية الاهتمام
    ملاحظة: بالإضافة إلى الأنسجة محددة تحتوي فقط SIRPα + العضلية وCD90 + خلايا تشبه الخلايا الليفية، فمن الممكن إضافة خلايا إضافية من الاهتمام لاستجواب تأثيرها على وظيفة الأنسجة. على سبيل المثال وقد ثبت اللجان الدائمة الفئران لتعزيز وظيفة من الفئران المهندسة أنسجة القلب 1. الخطوة الاختيارية التالية يصف مجموعة من الخلايا تكميلية لنظام محدد.
    1. جمع نوع من الخلايا التكميلي لمصلحة (على سبيل المثال، الخلايا الجذعية الوسيطة) باستخدام 0.25٪ التربسين / EDTA 0.1٪.
    2. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم resuspend في 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية المناسب لنوع من الخلايا في المصالح. على سبيل المثال، عن اللجان الدائمة، استخدم DMEM تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين ستربتومايسين و 0.2٪ أمفوتيريسين-B لثقافة جملتعلمي اللغة اإلنكليزية.
    3. إجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات، ثم بيليه الخلايا مرة أخرى في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة طاف، resuspend في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    5. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. إزالة طاف. الخلايا تكميلية هي الآن جاهزة لبناء الأنسجة.
      ملاحظة: إذا تم إضافة خلايا إضافية عند تركيز 10٪ من إجمالي عدد الخلايا في الأنسجة، ثم لأنسجة محددة، وهذا يتطلب 50،000 خلايا إضافية في الأنسجة كما في كل الأنسجة تحتوي على 500،000 خلايا القلب (كل من خلايا انسجة CD90 + وmyocytes SIRPα +).
  4. إنشاء المهندسة القلب الأنسجة البشرية
    ملاحظة: قم بتخزين كافة الحلول على الجليد والخلايا في درجة حرارة الغرفة. كافة وحدات التخزين المدرجة أدناه هي في الأنسجة. عادة، ما يقرب من ستة الأنسجة يمكن بناؤها من اثنين 6 جيدا ررآتش من التفرقة في القلب.
    1. تمييع 60.0 ميكرولتر من 5 ملغ / مل الأسهم الكولاجين إلى 3.125 ملغ / مل مع 1.5 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم، 9.6 ميكرولتر من 10X برنامج تلفزيوني و 24.9 ميكرولتر من عالى النقاء الماء المعقم منزوع الأيونات.
      خطوة حاسمة: تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى كل حل خلال التحضير لها فقاعات الهواء سوف يعطل تشكيل النسيج السليم.
    2. إضافة 12.0 ميكرولتر من كل من 10X MEM و 0.2 N HEPES الرقم الهيدروجيني 9 إلى خليط مخفف الكولاجين لخلق مزيج الكولاجين. إضافة كل الحلول أسفل الجانب من أنبوب الطرد المركزي 15 مل من أجل تجنب إدخال فقاعات الهواء في مزيج الكولاجين.
    3. إضافة مصفوفة الغشاء القاعدي إلى تركيز النهائي من 0.9 ملغ / مل إلى مزيج الكولاجين وتخزينها على الجليد لخلق مزيج النسيج النهائي. يجب أن يكون تركيز النهائي من الكولاجين 2 ملغ / مل.
    4. إضافة 500،000 الخلايا قمنا بإعادة تجميع لمزيج النسيج (العضلية + تركيز الخلايا الليفية هي 20 مليون / مل)، وملء إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر فيالأنسجة مع أي خالية من الخلايا وسائل الإعلام مصلحة الدولة للاحصاء أو 50،000 خلايا نوع من الخلايا التكميلي لمصلحة (على سبيل المثال، hMSCs) وتخلط جيدا لتشكيل حتى تعليق خلية.
      ملاحظة: إن عدد الخلايا تستكمل تختلف من لمختلف التطبيقات. هنا يستخدم 10٪ التكميلية.
    5. مع الرعاية، والماصة 25 ميكرولتر من تعليق خلية في كل من الآبار الستة في اللوح الأساس مفاعل حيوي، دون إدخال فقاعات الهواء إلى البئر.
    6. دفع صفين من أجهزة الاستشعار قوة PDMS على جانبي الإطار متعدد السلفون، وتشكيل 6 أزواج من المشاركات معارضة، ثم قلب الإطار على أعلى اللوح الأساس بحيث زوج واحد من المشاركات يدخل تحتوي كل منها على جانب تعليق الخلية.
      ملاحظة: يتضمن الإطار متعدد السلفون علامات التبويب للمساعدة في محاذاة PDMS.
    7. وضع بعناية مفاعل حيوي، اللوح الأساس إلى أسفل، في طبق 60 ملم، ثم ضع الطبق بدون غطاء في الداخل من صحن 10 سم، ووضع غطاء 10 سم على القمة، ونقل التجمع مفاعل حيوي كامل فيإلى الحاضنة زراعة الأنسجة، والانتظار ساعتين لالأنسجة إلى هلام.
    8. بعد 2 ساعة، وإزالة مفاعل حيوي من الحاضنة وإضافة 14 مل من وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء الى الجمعية العامة بأكمله، بما يكفي لتغطية اللوح الأساس. العودة إلى الحاضنة، وتغيير نصف وسائل الإعلام كل يوم.
    9. وبعد ثمانية وأربعين ساعة، وإزالة بعناية اللوح الأساس عن طريق تحريك بلطف كل جانب من اللوح الأساس خارج إطار بضعة ملليمترات في وقت واحد، تغيير وسائل الإعلام، ثم العودة مفاعل حيوي والأنسجة لأسفل، إلى وسائل الإعلام.
    10. مواصلة تغيير نصف وسائل الإعلام ثقافة مصلحة الدولة للاحصاء كل يوم.
      ملاحظة: تقلصات عفوية من الأنسجة يمكن ملاحظتها في أقرب وقت بعد 3 أيام بناء الأنسجة، توليد القوى نشل قابلة للقياس في وقت مبكر من يوم 5-7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للحصول على myocytes القلب، يتم استخدام نسخة معدلة قليلا من الطرق التمايز Boheler وليان 30،31. ومن الضروري أن التمايز يبدأ خلال المرحلة سجل نمو الخلايا، ولكن أيضا أن سكان البداية هي متكدسة بما فيه الكفاية للحصول على رقم صالحة للاستعمال من الخلايا بعد الفرز (ما يقرب من 75٪ هو الأمثل). عادة، لH7 hESCs، والطلاء في مناطق ذات كثافة من 140،000 hESCs لكل بئر من صحن 6 جيدا في الأساسية 8 وسائل الإعلام و 5٪ CO 2 حاضنة الحفاظ على 37 درجة مئوية ينتج الثقافات متكدسة بما فيه الكفاية بعد 4 أيام لبدء التمايز، كما هو موضح في الشكل 1A - D. منذ الأنسولين يمنع مواصفات القلب خلال عملية التمايز 32، الأنسولين وسائل الإعلام الحرة (التفاضل وسائل الإعلام الأول، الجدول 1) يستخدم لأول 10 أيام من التمايز. مرة واحدة يبدأ التمايز عن طريق تطبيق CHIR99021 GSK3 المانع،سوف يحدث موت الخلايا كبير (الشكل 1E). ونتيجة لذلك لا بد من تغيير وسائل الاعلام كل يوم. في يوم 2 من التمايز، تتم إزالة الخلايا من CHIR99021 واستراح في وسائل الإعلام التمايز الأول (مع عدم وجود أضاف جزيئات صغيرة) لمدة 24 ساعة. بعد راحة 24 ساعة في وسائل الإعلام التمايز، ويتم التعامل مع الخلايا مع IWR-1 لمدة 48 ساعة، وبعد ذلك تبدأ في تقرير المصير، تنظيم في مجموعات (الشكل 1F) الذي فاز في وقت مبكر من سبعة أيام من بدء التمايز. منذ مواصفات القلب حدث بعد تطبيق IWR-1، يتم تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على الأنسولين (وسائل الإعلام التمايز الثاني، الجدول 1). قبل 18 يوما من التمايز، وربط مستعمرات الخلايا الضرب وفصل جزئيا من سطح الخلية، وتشكيل بقوة بفوزه على "شبكات" في جميع أنحاء طبق (فيديو الشكل 1).

في يوم 20، وهناك فصل أحادي الطبقة الضرب بلطف السادسأساليب الأنزيمية للحصول على الخلايا وحيدة لحية الفلورسنت الخلايا المرتبطة الفرز (FACS). باستخدام طريقة المفاضلة المذكورة أعلاه، ونحن حصاد متحفظ ما يقرب من 65٪ من السكان كما SIRPα + و 10٪ كما CD90 + (الشكل 2). عموما يتم الحصول على 1-2٬000٬000 SIRPα + خلايا لكل لوحة 6 جيدا.

بعد إعادة تجميع لمدة 48 ساعة في نسبة 3: 1 من SIRPα +: CD90 + الخلايا، يتم خلط الركام الخلية المحددة مع هيدروجيل القائم على الكولاجين وpipetted في الآبار الضيقة في اللوح الأساس من مفاعل حيوي متعدد الأنسجة. عادة، قبل إزالة من الطبق، سوف ينظر مجموعات صغيرة من 5-10 خلايا الضرب على سطح الطبق. يتكون مفاعل حيوي الأنسجة محددة من ثلاثة عناصر هي: القالب الرئيسي للادلاء المشاركات PDMS. إطار لعقد اثنين من PDMS رفوف الوظائف؛ وبوليتيترافلوريثيليني اللوح الأساس السوداء التي تحتوي على ست آبار لمزيج النسيج (الشكل3A لدى عودتهم). تتم عملية بناء الأنسجة كامل على الجليد وفي ظروف معقمة. بعد إضافة السائل المزيج من الخلايا مصفوفة إلى الآبار في اللوح الأساس، هي التي تعلق على المشاركات PDMS إلى الإطار متعدد السلفون، ثم مقلوب بحيث المشاركات التي تتلاءم مع الآبار في اللوح الأساس (الشكل 3B). بعد 48 ساعة من الحضانة، يجب أن تكون الأنسجة المضغوطة بما فيه الكفاية أن اللوح الأساس يمكن إزالتها. يتم فصل اللوح الأساس بسهولة عن طريق استخراج النظام بأكمله من وسائل الإعلام وإزالة بلطف بأية وسيلة الزائدة من بين PDMS واللوح الأساس. إذا لم يتم إزالة كافة وسائل الإعلام، التوتر السطحي للسائل المتبقي يمكن سحب الأنسجة من الوظائف. وبمجرد إزالة وسائل الإعلام، ودفع بلطف اللوح الأساس إلى الخلف ضد الوظائف PDMS للمساعدة في تخفيف الأنسجة من اللوح الأساس. ثم دفع تدريجيا اللوح الأساس قبالة عن طريق تحريك بلطف جانب واحد حتى بضعة ملليمترات، ثم الجانب الآخر حتى نفس المبلغ. كرر هذه العملية حتى باتتم إزالة seplate، مع كل hECTs 6 تعلق منها PDMS نهاية مناصبهم الشكل (4A). يجب إزالة اللوح الأساس اتخاذ أي أكثر من دقيقة واحدة. استبدال النظام في وسائل الإعلام ثقافة الخلية، مقلوب، بحيث يتم تغطية جميع الأنسجة وسائل الإعلام ثقافة الخلية.

بعد يوم واحد تقريبا إزالة اللوح الأساس، يجب أن تكون ضعيفة تقلصات محلية يمكن ملاحظتها في hECTs محددة تحت المجهر مشرق الميدان. بعد 7 أيام، قد نضجت الأنسجة والمضغوط (الشكل 4B-C) مع ساركومير الانحياز (الشكل 4D). الأنسجة بشكل واضح يصرف الوظائف PDMS بمتوسط ​​5-15 μN القوة (الشكل 4E). نشل قياسات القوة لأنسجة القلب المهندسة محددة يمكن قياسها عن طريق تتبع في الوقت الحقيقي للانحراف آخر طرف مع سرعة عالية برنامج الحصول على كاميرا والعرف البيانات، وتطبيق آخر انحراف لشعاع الانحناء النظرية بعد تحديدمعامل يونج من المشاركات سيليكون باستخدام محول القوة، كما هو موضح في مزيد من التفاصيل في وقت سابق. 1،7 الحفاظ على عقم خلال الحصول على البيانات يضمن القدرة على قياس التغيرات في وظيفة الأنسجة مع مرور الوقت. لقد حافظنا على أنسجة وظيفية لعدة أسابيع، كما هو موضح في مزيد من التفاصيل في أماكن أخرى 1. وتشير النتائج التي توصلنا إليها الأولية على تعزيز كبير للقوة مقلص كان الحاخام هيشت عندما يتم استكمال الأنسجة مع 10٪ الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان في كل من 1 هرتز و 2 ترددات هرتز سرعة (الشكل 4F).

الشكل 1
الشكل 1: صور الممثل H7 hESCs خلال توسيع وعملية التمايز في القلب. يجب أن تستمر مرحلة التوسع 4 أيام، مع نمو المستعمرات توسيع من 24 (أ)، و 48 (ب)، 72 (C قوية>) و 96 ساعة (D). بعد 96 ساعة من النمو بدأ التمايز، مما أدى إلى موت الخلايا كبيرة خلال ساعة 48 الأولى من العلاج CHIR99021 (E). بعد يومين من IWR-1 العلاج، يحدث إعادة التنظيم (F) لتشكيل مجموعات من الخلايا التي فازت في وقت مبكر من يوم 7. مزيد من المنظمة إلى "شبكة" الضرب بقوة يحدث من يوم 7 إلى 20 يوما، عندما يتم فصل في الطبقات الوحيدة ل خلق أنسجة القلب هندسيا.

الممثل أحادي الطبقة القلب بعد 17 يوما من التمايز: فيديو الشكل 1. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. ويلاحظ عادة الضرب العفوي داخل أحادي الطبقة الأولى بين يوم 7 ويوم 10، و17 يوما من التمايز أحادي الطبقة وشكلت شبكات مترابطة " "الذي فاز بقوة.

ضمن الصفحات = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
اسم تركيب أيام التمايز المستخدمة
التمايز وسائل الإعلام أنا RPMI 1640
B27 الملحق (ناقص الأنسولين)
البنسلين، الستربتوميسين 		D0-D1 (مع CHIR99021)
D2
D3-D5 (مع IWR-1)
D5-D7
التمايز وسائل الإعلام الثاني RPMI 1640
B27 الملحق (مع الأنسولين)
البنسلين، الستربتوميسين 		D7-D20

الجدول 1: تكوين التمايز الأوساط.

الشكل 2
الشكل 2: الممثل الحية خلية نوعجي النتائج أعدت عينتين: عنصر تحكم غير ملوثين والسيطرة الملون باستخدام 1: 500 التخفيف من الأجسام المضادة SIRPα-PE / Cy7 و 1: 250 التخفيف من الأجسام المضادة CD90-FITC. بعد التلوين، تم فرز الخلايا في 20 رطل في فرز عازلة مكونة من برنامج تلفزيوني، و 10٪ البقري حديثي الولادة المصل، 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632، و 1 ميكروغرام / مل دابي. تم بوابات على حد سواء السكان الخلية في الشخصية إلى الأمام والجانب مبعثر لاستبعاد الحطام (A، الخط الأزرق) ثم تم تحديد الخلايا واحدة بمقارنة عرض النبض وارتفاع (نبض تحليل العرض) في كل من مبعثر إلى الأمام (B، الخط الأزرق) و قنوات مبعثر الجانب (C، الخط الأزرق). بعد ذلك، تم تحديد الخلايا الحية النابضة للدابي - السكان (D، الخط الأزرق). تم تحديد السكان الخلية النهائي لجمع عن طريق فحص مستويات التعبير FITC و PE-Cy7 من سكان الحي. واستخدمت سيطرة غير ملوثين (E، يسار) لإنشاء بوابة المناسبة لتحديد لFITC + (CD90) وSIRPα-PE / Cy7 + (cardiomyocyte) السكان في العينة الملون (E، يمين). وFITC وSIRPα-PE / Cy7 + جمعت poplations في 15 مل أنابيب الطرد المركزي منفصلة.

الشكل (3)
الشكل (3):. تخطيطي لمفاعل حيوي متعدد الأنسجة وعملية هندسة الأنسجة القلبية بناء مفاعل حيوي متعدد الأنسجة يتطلب ثلاثة عناصر (A): 1) تترافلوروإيثيلين القالب الرئيسي 9 × 33 × 5 مم 3، مع 6 فتحات متباعدة بشكل متساو 0.5 ملم في القطر. 2) 25 × 35 × 11 مم 3 إطار متعدد السلفون لعقد المشاركات PDMS خلال بناء الأنسجة والثقافة؛ و 3) 20 × 40 × 5 مم 3 أسود بوليتيترافلوريثيليني اللوح الأساس مع 6 آبار من 6 × 1 × 1 مم 3 أبعاد، ومنتجع صحيدائرة الهندسة المدنية 4 مم وبصرف النظر على طول طوله. لخلق أنسجة القلب المهندسة الإنسان (B)، هي ملفقة الوظائف PDMS من قبل PDMS الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام القالب الرئيسي بوليتيترافلوريثيليني، اثنان منها ثم يتم الضغط على علامات التبويب في إطار متعدد السلفون لتشكيل 6 أزواج من المشاركات ناتئ الاستشعار قوة. وpipetted الحل الأنسجة في الآبار في اللوح الأساس بوليتيترافلوريثيليني الأسود. الإطار والمشاركات بعد ذلك مقلوب والانحياز على اللوح الأساس بوليتيترافلوريثيليني بحيث زوج واحد من المشاركات يدخل تحتوي كل منها على جانب مزيج النسيج. بعد 48 ساعة، واللوح الأساس هو إزالة وأنسجة محددة ومثقف على المناصب وتبقى مقلوب في وسائل الإعلام مصلحة الدولة للاحصاء.

الشكل (4)
الرقم 4: صور الممثل والقياسات الوظيفية البشرية هندسة الأنسجة القلبية تعريف bioreact متعددة الأنسجةأو نظام يحمل ستة الأنسجة في موازية (A، السهام). الأنسجة محددة هي في غضون سبعة أيام بعد خلق نسيج تجميعها ذاتيا (أعلى عرض وباء وعرض الجانب المائل، C). (D). جزء من كان الحاخام هيشت محددة ملطخة عن القلب تروبونين-T (cTnT). (E) يظهر الممثل تتبع نشل القوة الخام مع مرور الوقت خلال 1 هرتز سرعة عن طريق تحفيز الحقل الكهربائي. (F) نشل تتبع خلال التحفيز في 1 هرتز (0-2 ثانية) و 2 هرتز (2-4 ثانية) سرعة، مع سهم وسم التغير في تردد، على حد سواء hECTs المحددة، unsupplemented (خط الصلبة) والأنسجة تستكمل مع 10٪ hMSCs (خط منقط).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بناء الأنسجة تعريف الإنسان المهندسة القلب (كان الحاخام هيشت) يمكن أن تقدم نموذجا أكثر اتساقا وموثوق بها وظيفة العضلية القلبية الإنسان. الأهم من ذلك، جميع المكونات الخلوية وخارج الخلية في نظام معروفة ويمكن التلاعب بها كما هو مطلوب، وبالتالي إزالة تأثير الخلط من أنواع الخلايا غير معروفة أخرى ناجمة عن عملية التمايز. لتحقيق التوازن بين النمو السريع للخلايا وعالية الغلة، فمن الأفضل أن التمايز يبدأ في 75٪ التقاء hESCs، من الناحية المثالية بعد أربعة أيام من الطلاء. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام ROCK المانع Y-27632 خلال كل من التفكك الخلايا وإعادة تجميع بعد فرز يعزز إلى حد كبير بقاء الخلية. وجود الضرب العفوي myocytes خلال عملية التمايز هو مؤشر مهم للكفاءة وصحة التمايز. إن لم يكن لوحظ الضرب العفوي هذا قد يشير إلى ضعف كفاءة التمايز، إما بسبب الكواشف غير فعالة أو خسارةمن تعدد القدرات للخلايا الجذعية.

خلال بناء الأنسجة، ويجب على المشاركات PDMS محاذاة بشكل صحيح مع القنوات في اللوح الأساس لخلق الأنسجة بشكل جيد أن تستمر طويلا بما فيه الكفاية لقياس وظيفة مقلص. لتعزيز سهولة محاذاة الجهاز، وتعزيز تكوين الأنسجة حول الوظائف حيث أنهم عرضة للكسر، فمن الممكن لإضافة عرض إضافي (تقريبا قطرها وظيفة واحدة على كل جانب من آخر) إلى نهايات القنوات، كما هو موضح من قبل "عظم الكلب" على شكل القنوات في الشكل 3A. دون محاذاة جهاز مناسبة الأنسجة إما فصل من الوظائف بعد فترة وجيزة من الثقافة، أو يبقى في البئر عند إزالة اللوح الأساس. إذا الأنسجة بشكل جيد يقع قبالة خلال إزالة اللوح الأساس، فمن الممكن أن أعد بلطف الأنسجة إلى الوظائف باستخدام ملقط غرامة تحت المجهر تشريح، على الرغم من أنه من السهل أن تلحق الضرر hECTs حساسة إذا لم تتخذ الرعاية الكافية. </ P>

ومن نقاط القوة الرئيسية لنظام محدد وصفها هي القدرة على استجواب مساهمة آليات التفاعل خلية خلية مباشرة في علاجات الخلايا القلبية على أساس السيطرة محددة من تكوين خلية. حقن الخلايا في الحيوانات غير دقيق ويخضع لانخفاض الجدوى والاحتفاظ 33. بالإضافة إلى ذلك، معقد تأثير حقن الخلايا على النسيج المستهدف من التفاعلات مع الأنظمة الفسيولوجية الأخرى، مثل نظام المناعة. على هذا النحو، فهم المساهمة من التفاعلات خلية خلية مباشرة في علاجات الخلايا القلبية يمثل تحديا للتصدي لفي الكائنات نموذج. ولذلك، ميزة لطريقة وصفها هو أن يتم تحليل التفاعلات خلية خلية في بيئة ثلاثية الأبعاد الجزيئية الحيوية، والحفاظ على الجوانب الرئيسية من مكانة في القلب، وفي وجود أنواع معينة من الخلايا من الفائدة - وهي myocytes القلب و الليفية. فائدة استخدام نظام كان الحاخام هيشت محددة هي demonstrATED مع مكملات hMSCs 10٪ المشتقة من نخاع الإنسان 34،35 واستخدامها في التجارب السريرية إلى خليط الخلية أثناء إنشاء الأنسجة. تلك الأنسجة التي استكملت مع hMSCs أظهرت أكبر قوة مقلص من unsupplemented الأنسجة البشرية تحديدا (الشكل 4F). ومنذ سيطر على البيئة الأنسجة والتكوين، وتعزيز وظيفة الأنسجة مع لجنة السلامة البحرية مكملات يعكس تأثير المتأصل في hMSCs على وظيفة cardiomyocyte. قوة أخرى لهذا النظام هو أنه منذ الأنسجة هي أصغر مما كانت في السابق، 1،7 استخدام الخلايا أكثر كفاءة، وهو عامل مهم عند استخدام التفرقة توجه الخلايا الجذعية المحفزة كمصدر للخلية.

ما وراء دراسة آليات العلاج بالخلايا، فإن النظام كان الحاخام هيشت تعريف تمكين فحص الأساس الخلوي للخلية خلية التفاعلات القلب والأوعية الدموية. اضطراب بيولوجيا الخلايا قبل CONST الأنسجةخصام، على سبيل المثال مع shRNAs، من شأنه أن يسمح للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تحكم خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات. ميزة إضافية لنظام هندسة الأنسجة هو تشكيل من اللييفات العضلية الانحياز قادرة على تقلصات وظيفية. وهكذا، وذلك باستخدام نظام كان الحاخام هيشت محددة، وديناميات تشكيل لييفة عضلية والتنمية cardiomyocyte وتنظيم بنية الأنسجة يمكن أن تكون جميع التحقيق عبر تعديل مكونات المصفوفة خارج الخلوي أو التلاعب الجزيئي للخلايا. الطبيعة البشرية و3-D للنظام كان الحاخام هيشت يزيد بالإضافة إلى ترجمتها من النتائج.

في حين يقدم النظام المذكور وسيلة قوية لفهم الأسئلة الأساسية لعلم الأحياء القلب والأوعية الدموية، فإنه ليس من دون قيود. أولا، الأنسجة المهندسة يحمل النمط الظاهري غير ناضجة، بما يتفق مع بيانات القوى نشل نشرت من عينات عضلة القلب حديثي الولادة 7. في حين أنعدم النضج المظهري يمكن أن يكون عاملا الخلط في تقييم آليات التفاعل خلية، هناك أدلة على أن العضلية المريضة تعود إلى برنامج الجينات الجنين 7،36-38. اذا اثبتت النتائج من نظام كان الحاخام هيشت أن تكون ذات صلة في سياق قلب الفشل، وهذا قد يكون من المفيد لاختبار علاجات القلب. يستخدم بروتوكول أيضا HESC الطابق السفلي المؤهلين غشاء مصفوفة خلال بناء الأنسجة. تكوين هذه المصفوفة يمكن أن تختلف من الكثير الكثير، وبينما هي محددة بدائل مصفوفة الطابق السفلي المتاحة لديهم لم يتم تقييمها في سياق hECTs.

وتشمل القيود الأخرى عدم وجود نظام الأوعية الدموية وليس له آثار التفاعل على مستوى النظم. نظرا لحجم الأنسجة، وتلبية مطالب الأيض عن طريق الانتشار وحدها لذلك ليس هناك حاجة إلى نظام الأوعية الدموية لضمان بقاء الخلية. ومع ذلك، قد تكون البطانية الخلايا مما يشير الى عامل مهم في علاجات الخلايا المحددة. إذا كان هذا هو الحال، على عدد محدد من إندويمكن ببساطة بإضافة خلايا thelial إلى المزيج الخلية المحددة خلال بناء الأنسجة. بينما التفاعلات على مستوى أنظمة مهمة لفهم كامل لآليات الخلية، ونظام الأنسجة المهندسة يقدم المقاربة الاختزالية لتبسيط المشكلة من أجل معالجة آلية منتظمة. يمكن إضافة التعقيد إلى نظام الأنسجة محددة حسب الحاجة من خلال إدخال الآثار المتعلقة أنظمة، مثل الكريات البيض لدمج استجابة مناعية، أو بإضافة أنواع الأنسجة المجاورة لاستجواب إشارات نظير الصماوي.

كأداة للتحقيق، يقدم نظام أنسجة القلب عند الإنسان يعرف فوائد الخلايا البشرية بين الأنواع، والمحاكاة البيولوجية بيئة ثقافة 3-D مع البنية البيولوجية للرقابة والرصد واضحة والطولي وظيفة مقلص، وتعريف تكوين الخلايا والمصفوفة. وتشمل التوجهات المستقبلية للنظام كان الحاخام هيشت التلاعب نوع من الخلايا العلاجية من الطرافة الفائدةح سيرنا أو shRNA قبل إدخالها في الأنسجة من أجل التحقيق في تفاصيل الجزيئية محددة من التفاعل خلية خلية. بالإضافة إلى ذلك، بدلا من استخدام hESCs لتشكيل خلايا القلب، فمن الممكن استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات (iPSCs) من المرضى الذين يعانون من الطفرات الموروثة في محاولة لنموذج مظاهر أمراض القلب ذات الصلة في الأنسجة هندسيا. وبالتالي، لدينا وسيلة لخلق الإنسان المهندسة أنسجة القلب مع السكان الخلية المحددة وعود لفتح مجالات جديدة للدراسة علاجات الخلايا القلبية للمساعدة على تسريع تطوير علاجات جديدة لمرضى القلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1F30HL118923-01A1) إلى TJC، المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI PEN عقد HHSN268201000045C إلى KDC، المجلس منحة بحثية من هونغ كونغ TRS T13-706 / 11 (KDC)، المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL113499) إلى BDG، أمريكا جمعية القلب (12PRE12060254) إلى الملكية الأردنية، ومجلس منحة بحثية من هونج كونج (TBRS، T13-706 / 11) وقدم إلى RL تمويل إضافي لTJC من المعاهد الوطنية للصحة DRB 5T32GM008553-18 ونتيجة لتدريب على التدريب NIDCR متعدد التخصصات في أنظمة والتنموية علم الأحياء والعيوب الخلقية T32HD075735. يرغب المؤلفون أيضا عن تقديره وامتنانه آرثر Autz في مركز زان من كلية مدينة نيويورك للحصول على المساعدة مع بالقطع مفاعل حيوي وممدوح الدالى للحصول على المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور كينيث Boheler لتقديم المشورة بشأن التمايز القلب، والدكتور جوشوا هير لتوفير بسخاء الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 109، العلاج بالخلايا وهندسة الأنسجة، المحفزة البشري الخلايا الجذعية المستمدة myocytes القلب، والخلايا الجذعية الوسيطة، خلايا اللحمة المتوسطة اللحمية، الهندسة الحيوية، المكروية الخلوية، والقلب والأوعية الدموية، سيربا، CD90
بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb,… More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter