Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L' ingénierie tissulaire cardiaque a beaucoup progressé dans la dernière décennie, avec plusieurs groupes d' édition de résultats, les tissus entièrement fonctionnels en battant fabriqués à partir de deux cardiomyocytes murins 1-6 et, plus récemment, les myocytes cardiaques de cellules souches dérivées humaines 7-12. Le domaine de l' ingénierie du tissu cardiaque est entraîné par deux objectifs principaux et essentiellement indépendants: 1) pour développer des greffes exogènes qui peuvent être transplantées dans des cœurs défaillants pour améliorer la fonction 4-6; et 2) pour développer des modèles in vitro pour étudier la physiologie et de la maladie, ou comme outils de dépistage pour le développement thérapeutique 2,7.

Dimensions Trois (3-D) culture cellulaire est considérée comme essentielle pour le développement d'outils de dépistage de la prochaine génération, comme la matrice 3-D reflète un microenvironnement cardiaque plus naturel que la culture traditionnelle 2-D cellulaire monocouche; En effet , certains aspects de la biologie cellulaire sont fondamentalement différents en 2-D cultures par rapport à 3-D 13,14 9 7,8,10) est strictement contrôlée, la composition de la cellule d'entrée est moins bien définie, avec l'ensemble du mélange de cellules à partir d' une différenciation cardiaque dirigée soit les cellules souches embryonnaires (ESC 7,9) ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP 10,12) étant ajoutés aux tissus. En fonction de la lignée cellulaire spécifique et l'efficacité du protocole de différenciation utilisé, le pourcentage résultant de cardiomyocytes peut varier de moins de 25% à plus de 90%, le phénotype des cardiomyocytes spécifique (c. -à ventricular-, atrial- ou pacemaker) peut également varier, même la fraction non-cardiomyocytes peut être très hétérogène 15,16 et de modifier la maturité du m cardiaque différenciéyocytes 17.

Récentes cardiaque travaux de génie tissulaire a tenté de contrôler la population d'entrée des cellules, soit avec une surface les marqueurs 18 reporter cardiaque lignée de cellules souches embryonnaires humaines 8 ou de la cellule utilisée pour isoler la composante de myocytes cardiaques de la différenciation. Bien qu'initialement un tissu composé de seulement myocytes cardiaques semble être l'idéal, cela est en fait pas le cas; hECTs composés uniquement de myocytes cardiaques ne parviennent pas à compacter dans des tissus fonctionnels, avec certains groupes de trouver un rapport de 3: 1 des myocytes cardiaques: fibroblastes produisant la force de contraction le plus élevé 8. En utilisant différents procédés de sélection de cellules, y compris les marqueurs de surface pour le tri des cellules vivantes, il est possible de créer hECTs avec des populations cellulaires définies. Tandis que les marqueurs de cellules stromales non cardiaques sont disponibles depuis un certain temps, tels que le marqueur CD90 des fibroblastes putatif 19,20, les marqueurs de surface des myocytes cardiaques ont été plus difficilespour identifier. SIRPα a été parmi les premiers marqueurs de surface cardiaques identifiés pour les cardiomyocytes humains 18 et il a été montré très sélectif pour la lignée cardiaque. Récemment, nous avons constaté que double tri pour SIRPα + et CD90 - cellules cardiomyocytes rendements presque purs, avec le CD90 + population présentant un phénotype de type fibroblaste (Josowitz, observations non publiées). Sur la base de ces constatations recueillies, nous décrivons ici la création d' hECTs en utilisant un 3: 1 combinaison de SIRPα + / CD90 - cardiomyocytes et CD90 + fibroblastes.

La capacité à concevoir un tissu cardiaque humain complètement défini est essentiel non seulement pour créer des outils de dépistage robustes, mais aussi pour le développement de systèmes modèles pour étudier émergents cellules et thérapies cardiaques géniques. En particulier, de nombreuses thérapies cellulaires pour l' insuffisance cardiaque, en utilisant des types de cellules incluant des cellules souches mésenchymateuses (MSC) 21 22 et les cellules mononucléaires de la moelle osseuse 23-25 ​​ont été testés dans des essais cliniques. Bien que plusieurs des premiers résultats ont été prometteurs 21,23,25, la prestation initiale diminue souvent au fil du temps 26-29. Une tendance similaire a été rapportée dans murins d' ingénierie des tissus cardiaques, qui présentent un avantage fonctionnel important en raison de MSC supplémentation, mais l'avantage ne ​​soit pas soutenue pendant la culture à long terme 1. Sous-jacent la performance sous-optimale est notre connaissance limitée des mécanismes régissant les thérapies cellulaires. Une meilleure compréhension de la façon dont les cellules thérapeutiques exercer leur influence bénéfique, ainsi que les conséquences négatives potentielles des interactions myocytes-nonmyocyte, permettrait le développement de thérapies améliorées qui donne des avantages cliniquement significatifs et durables, avec des effets secondaires minimes, pour les patients atteints d'insuffisance cardiaque.

Ici, nous décrivons l'utilisation de hECTs définies à interrogate mécanismes de thérapie cellulaire. La composition tissulaire contrôlé est essentiel d'identifier les facteurs spécifiques qui influent les performances des cardiomyocytes. Directement complétant hECTs avec le type de cellules d'intérêt thérapeutique (par exemple, MSCs), peut révéler les effets sur la performance cardiaque de myocytes, comme nous l' avons démontré dans ECTs de rat 1.

Le protocole en plusieurs étapes suivant commence par la différenciation des cellules souches cardiaques dirigée, suivie par la fabrication du bioréacteur multi-tissulaire, et se terminant par une description de la construction de tissu et l'analyse fonctionnelle. Nos expériences sont effectuées en utilisant la ligne H7 NIH approuvé les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Cependant, les protocoles suivants ont également été testés en utilisant une lignée de CSEh supplémentaire et trois induite cellules souches pluripotentes (hiPSC) lignes avec des résultats similaires. Nous avons constaté que l'efficacité dans la différenciation des cardiomyocytes et de succès dans la fabrication HECT peut être lignée cellulaire dépendante, en particulier for lignes hiPSC dérivées de patients individuels. En suivant ce protocole, deux plats de 6 puits sont plaquées avec un total de 1,68 millions de CSEh (140.000 cellules par puits), ce qui donne environ 2,5 millions de myocytes après différenciation pendant 20 jours et le tri, assez pour faire six tissus définis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Remarque: Effectuez toutes les manipulations de cellules dans des conditions aseptiques en utilisant une classe II enceinte de sécurité biologique de filtre HEPA et stériliser toutes les solutions en les filtrant à travers un filtre de 0,2 um. Effectuer la construction des tissus et des tests de fonction soit dans les mêmes conditions aseptiques ou une hotte à flux laminaire.

1. Ensemencement des H7 CSEh dans la préparation pour Différenciation cardiaque

  1. (Jour 1) Préparation de la membrane basale Matrice
    1. Décongeler 150 ul aliquote de CSEh matrice de membrane basale qualifiée sur la glace durant la nuit à 4 ° C.
  2. (Jour 0-4) Placage des CSEh sur des plaques revêtues
    1. Diluer la matrice décongelé dans 12 ml de glace-froid DMEM / F12 et bien mélanger.
    2. Transfert 1 ml de la solution / F12-matrice DMEM dans chaque puits d'une boîte de culture de tissu à 6 puits traités. Chaque aliquote de matrice peut recouvrir deux plaques 6 puits.
    3. Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant au moins 1 h.
      Remarque:notre expérience, les plats revêtus scellés avec de la paraffine peuvent être stockés dans une solution de matrice à 4 ° C pendant jusqu'à 10 jours avant utilisation.
    4. À environ 75% de confluence, se dissocier hESC H7 de l'antenne parabolique de 10 cm en utilisant 6 ml de réactif de dissociation non enzymatique. Après 5 min, gratter doucement les cellules de la surface de culture en utilisant un grattoir à cellules à usage unique et transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml de centrifugation stérile.
    5. Retirer 0,5 ml de la solution de dissociation des cellules provenant du tube de 15 ml et le transfert à un nouveau tube ml stérile 15 (en laissant 5,5 ml du réactif de dissociation pour dissocier en outre l'hESC) pour la propagation de la lignée de cellules souches.
    6. Pellet les 0,5 ml de cellules à 300 xg pendant 5 min à 20 ° C. Eliminer le surnageant et remettre en suspension doucement dans 8 ml de milieu de cellules souches pluripotentes contenant 1% de pénicilline-streptomycine , puis transfert à un nouveau revêtu, de 10 cm pour culture de tissus et de maintenir 37 ° C et 5% de CO 2 pour maintenir la lignée de cellules souches.
      Remarque: Gardez les médias sur les cellules souches pluripotentes sur la glace lors des changements de médias.
    7. Pendant ce temps, ajouter 5,5 ul de 10 mM d'inhibiteur de ROCK Y-27632 à 5,5 ml de solution restante de dissociation et de continuer à incuber à la température ambiante pendant encore 5 à 10 min. Mélanger délicatement les cellules avec un 5 ml pipettes sérologiques. Continuer à incuber jusqu'à obtenir une suspension cellulaire unique est obtenue, puis sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
    8. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu de cellules souches pluripotentes et d'effectuer un comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre.
    9. Seed chaque puits de la plaque à 6 puits à une densité de 140.000 cellules par puits. Ensemencer deux plaques 6 puits pour créer un total de six tissus définis. Éliminer toutes les cellules restantes après placage.
    10. Remplir les puits de 1 ml avec des milieux de cellules souches pluripotentes et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Vingt-quatre heures plus tard, retirez le support et ajouter 2 ml de milieu de cellules souches pluripotentes frais à chaque puits (figure 1A
    11. Vérifiez la confluence des plaques chaque jour et commencer la différenciation une fois que les cellules atteignent environ 75% de confluence (Figure 1B - D).

2. (Jour 4-24) Différenciation des embryons humains Cellules souches à cardiomyocytes 30,31

  1. (Jour 4-7, Différenciation Day 0-3) Mesoderm Induction
    1. Préparer un milieu RPMI différenciation I (tableau 1) en combinant 500 ml de RPMI 1640 avec 10 supplément ml B27 (sans insuline) et 5 ml de solution mère de pénicilline-streptomycine (10 000 UI / ml de pénicilline, 10 000 ug / ml de streptomycine). Aliquoter, sur la glace, en tubes de 50 ml et conserver à 4 ° C.
    2. (Jour 4, Différenciation jour 0) Préparer mésoderme médias d'induction en ajoutant 2,4 ul du CHIR99021 petit inhibiteur de GSK3 molécule (10 mM, 6 pM concentration finale) à 12 ml de milieu de différenciation RPMI I. Supprimer les médias de cellules souches pluripotentes de chaque puits unend remplacer par 2 ml de médias mésoderme d'induction par puits. Remettre la plaque dans l'incubateur.
      Remarque: la mort cellulaire significative se produit généralement avec l'addition d'CHIR99021 (figure 1E). La monocouche se rétablira, mais il est important de rincer les cellules mortes loin avec le rinçage DMEM / F12.
    3. (Jour 5, Différenciation Jour 1) Préparer les médias mésoderme à induction frais comme décrit ci-dessus. Retirez les médias de chaque puits et rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits. Ajouter 2 ml de milieu mésoderme d'induction fraîche à chaque puits.
      Remarque: Rinçage chaque jour de la Journée 0-10 augmente considérablement le rendement et la pureté des myocytes cardiaques.
    4. (Jour 6, Différenciation Jour 2) Supprimer les médias d'induction cardiaques et rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits. Remplacer le rinçage avec 2 ml de RPMI médias de différenciation I (pas de petites molécules ajouté, mais toujours avec le B27 (sans insuline) supplément) et revenir à l'incubateur.
  2. (Jour 7-13, Différenciation Day 3-10) Cardiac Mesoderm Induction
    1. (Jour 7, Différenciation Jour 3) Préparer cardiaque médias mésoderme d'induction en ajoutant 6 pl de la petite molécule Wnt inhibiteur IWR-1 (10 mM, 5 uM final) à 12 ml de RPMI médias de différenciation I.
    2. Retirez le support de chaque puits, rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits et le remplacer par 2 ml de cardiaque médias mésoderme d'induction par puits.
    3. (Jour 8, Différenciation Jour 4) Préparer un 12 ml supplémentaires de milieu d'induction du mésoderme cardiaque comme décrit ci-dessus. Retirez le support ajouté la veille, rincer une fois avec 1 ml de DMEM / F12 par puits et le remplacer par 2 ml de milieu frais de différenciation mésoderme cardiaque par puits et retourner à l'incubateur.
    4. (Jour 9-10, Différenciation Day 5-6) Sur les deux jours, retirez les médias cardiaques mésoderme à induction et rincer chaque puits avec 1 ml de DMEM / F12.
    5. Ajouter 2 ml de milieu frais de différenciation RPMI I (pas de petites molécules ajoutées, mais toujours avec le B27 (sans insuline) supplément)à chaque puits et retourner la plaque dans l'incubateur.
  3. (Jour 11-24, Différenciation Day 7-20) hES dérivés cardiaque Organisation myocytes / Maturation
    1. Préparer le milieu RPMI de différenciation II (tableau 1) en combinant 500 ml de RPMI 1640 avec supplément de 10 ml de B27 (avec de l' insuline) et 5 ml de solution mère de pénicilline-streptomycine. Aliquoter, sur la glace, en tubes de 50 ml et conserver à 4 ° C.
    2. (Jour 11, Différenciation Jour 7) Retirez le support de différenciation RPMI (sans insuline) de chaque puits et rincer avec 1 ml de DMEM / F12. Remplacer par 2 ml de nouveaux médias de différenciation RPMI II (avec l'insuline) à chaque puits et revenir à l'incubateur.
      Remarque: battre spontanée doit d'abord être observée entre les jours 7 et 10. Si battage est pas observée pendant ce temps, il indique généralement une faible efficacité de différenciation. Le protocole peut être poursuivi jusqu'à ce jour 15 dans un effort pour observer les coups, mais si aucun battement est observé par jour 15 il est préférable de stes une nouvelle différenciation.
    3. (Jour 12-24, Différenciation Day 8-20) Chaque jour, supprimer les anciens médias de différenciation et le remplacer par 2 ml de RPMI frais médias de différenciation II par puits pour permettre la maturation des cellules et de l' organisation de la monocouche de battage (Figure 1F, Vidéo Figure 1 ).
      Remarque: En fonction de la mort cellulaire résiduelle, il peut être nécessaire de rincer avec 1 ml de DMEM / F12 par jour de différenciation 10.

3. (Jour 24, Différenciation Jour 20) Isolement de myocytes cardiaques et de cellules fibroblaste

  1. Dissocier les cellules de la monocouche
    1. Retirez le support de différenciation et rincer une fois avec 1 ml de PBS.
    2. Désolidariser les monocouches avec 1 ml de la solution de dissociation enzymatique (0,04% trypsine / 0,03% d'EDTA) dans chaque puits.
    3. Déplacer la plaque dans l'incubateur pendant 10 min. Pendant ce temps, ajouter 12 ul d'inhibiteur de ROCK 6 ml de solution de trypsine de neutralisation.
    4. Gently ajouter 1 ml de la solution de trypsine de neutralisation contenant l'inhibiteur de ROCK à chaque puits de la plaque pour neutraliser la solution de trypsine.
    5. L'utilisation d'un transfert pipette stérile, mélanger doucement chaque puits pour briser les amas de cellules.
    6. Transférer tous les 12 ml de la plaque de 6 puits dans un tube de 15 ml centrifugeuse.
      Note: Depuis deux plaques de 6 puits sont utilisés dans ce protocole, deux tubes de 15 ml seront nécessaires.
    7. Transfert 3 ml de PBS dans un puits de la plaque, puis transférer séquentiellement les mêmes 3 ml à chaque puits à la suite de recueillir toutes les cellules résiduelles sur le plat. Transférer les 3 ml restants de la finale et dans le même tube de 15 ml de centrifugeuse contenant les cellules.
    8. Pellet à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C.
  2. Préparer les cellules pour cellules vivantes Tri par FACS
    1. Préparer le tampon de coloration en ajoutant 5 ml de sérum bovin fœtal à 45 ml de PBS sur de la glace avec 50 ul d'inhibiteur de ROCK.
    2. Retirer le surnageant de la cellule pelsoit (dans 3.1.8) et remettre en suspension dans 1,2 ml de tampon de coloration.
    3. Transférer 200 pi de la suspension cellulaire à une nouvelle pré-refroidi, 50 ml tube de centrifugation sur la glace. Ce sera le contrôle de la coloration négative.
    4. Transférer le 1 ml restante de la suspension cellulaire à une nouvelle pré-refroidi, 50 ml tube de centrifugation sur la glace et ajouter 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (dilution 1: 500) et 4 pi de CD90-FITC (dilution 1: 250) . Mélanger délicatement la suspension cellulaire avec une pipette de transfert et de retour sur la glace.
    5. Incuber à la fois le contrôle négatif et de l'échantillon, sur un agitateur à bascule, sur la glace, à 4 ° C pendant 1 heure.
    6. Préparer des tubes de prélèvement d'échantillons en ajoutant 3 ml de milieu RPMI (avec de l'insuline) à deux tubes de 15 ml de centrifugeuse. Ajouter 3 ul d'inhibiteur de ROCK à chaque tube et stocker sur la glace.
    7. Pellet les cellules colorées à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et rincer deux fois avec au moins 10 ml de PBS glacé par rinçage.
    8. Ajouter 1 pi de DAPI (1 pg / ml) à 5 ml de tampon de coloration. Doucementremettre en suspension le culot échantillon avec 1-3 ml de tampon de coloration contenant DAPI à l'aide d'une pipette de transfert.
    9. Ajouter 500 pi de tampon de coloration (sans DAPI ajouté) au témoin négatif.
    10. filtrer doucement à la fois le contrôle négatif et de l'échantillon à travers un tamis de 40 um cellulaire pour éliminer des amas de cellules et transférer au polystyrène tubes FACS sur la glace. amener immédiatement les échantillons à la trieuse de cellules.
    11. Similaires à des cellules vivantes établi des méthodes de tri 18, utilisent le contrôle négatif pour définir les portes, sélectionner des cellules vivantes (DAPI négatif) et recueillir les deux le FITC + (ie, CD90 + fibroblastes) et PE / Cy7 + (ie, SIRPα + cardiomyocytes ) populations indépendamment à 20 psi (Figure 2).
      Remarque: Après avoir réglé les portes, le contrôle négatif peut être fixé dans 4% PFA afin de déterminer l'efficacité de la différenciation par coloration pour la troponine cardiaque-T.
      Remarque: Certains chercheurs préfèrent utiliser unisotype contrôle plutôt que le contrôle des souillures pour régler les portes afin de compenser pour la liaison d'anticorps non spécifique. Un soi-disant fluorescence moins un (FMO) le contrôle est une autre possibilité. En raison de la distribution bimodale claire de la FITC, DAPI et signaux PE-Cy7, nous gated de la population positive conservatrice visant loin dans la grille positive, ce qui exclut peut-être quelques vrais positifs, mais contribue à minimiser les faux positifs.
  3. Cellule réagrégation dans la préparation pour le génie tissulaire
    1. Une fois le tri cellulaire, sédimenter les deux tubes de prélèvement et remettre en suspension dans 1 ml de DMEM contenant 10% de sérum bovin néonatale, 1% de pénicilline-streptomycine et 0,2% amphotéricine B ( "media NBS").
    2. Combinez le SIRPα + et CD90 + dans un rapport de 3: 1 et plaque les cellules combinées dans une culture non-tissu traité boîte de Pétri à une densité de 2 millions de cellules par 60 cm 2 (boîte de 10 cm). Ajouter 10 ml de milieu NBS et 101; l d'inhibiteur de ROCK Y-27632.
    3. Placer une suspension de cellules dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures pour permettre la réagrégation cellulaire en petits amas.

Tissue Engineering 4. cardiaque humaine

  1. Fabriquer le bioréacteur multi-tissus
    Remarque: Pour compléter les illustrations de la figure 3A, les fichiers CAO avec des schémas de conception de bioréacteurs détaillées sont disponibles sur demande auprès des auteurs.
    1. Machine maître moule PDMS par forage de six trous espacés de 0,5 mm de diamètre dans un 9 x 33 x 3,25 mm parallélépipède de polytétrafluoroéthylène.
    2. L' utilisation d' une fraise, machine à un cadre de polysulfone mesurant 25 x 35 x 11 mm 3. Le but du cadre est de tenir les PDMS postes (construits à partir de la distribution faite ci-dessus) en alignement avec les puits de la plaque de base.
    3. L' utilisation d' un 1 mm endmill, machine 6 puits (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm à l' écart dans un morceau de poly noir 20 x 40 x 5 mm 3tétrafluoroéthylène pour former le socle.
    4. Mélanger la base élastomère et un agent de durcissement pour polydiméthylsiloxane (PDMS) en 10: 1 rapport p / p et ajouter au moule de polytétrafluoroéthylène personnalisé (étape 4.1.1) pour créer deux rangées de six postes de force de détection, et incuber pendant la nuit et sous vide à 80 ° C. Après durcissement, enlever délicatement les PDMS du moule maître et marquez soigneusement les sommets de chaque poste avec un marqueur permanent noir pour un contraste amélioré et automatisé en temps réel le suivi post déviation.
      Remarque: polytétrafluoroéthylène est assez doux et peut être facilement endommagés. Faites attention lors du nettoyage du moule maître avant PDMS coulée pour assurer la longévité du système et de la géométrie PDMS post cohérente. Un fil de 0,5 mm peut être utilisé pour nettoyer les trous pour les poteaux après chaque utilisation, mais prendre soin de ne pas racler l'intérieur des trous.
      Note: Une alternative est de dégazer les PDMS sous vide pendant plusieurs heures à la température ambiante, puis laisser le remède mélange à la pression ambiante.Cela peut conduire à moins de bulles de gaz résiduels qui se forment dans le PDMS pendant le processus de durcissement.
    5. Stériliser tous les composants dans un autoclave à vapeur.
      Remarque: Le maître moule PDMS (étape 4.1.1) et le cadre de polysulfone (étape 4.1.2) sont à la fois réutilisables. Les PDMS postes créés à partir de la distribution (étape 4.1.4) est également réutilisable, mais seulement pour environ 10 utilisations. Cependant, plus PDMS messages peuvent être créés au besoin à l'aide du moule maître.
  2. Recueillir les cellules cardiaques refusionnés
    1. Retirer les cellules refusionnés de l'incubateur et transférer tous les 10 ml du milieu de la réagrégation dans un tube centrifuge de 50 ml.
    2. Rincer la plaque avec 3 ml de PBS et transférer le liquide de rinçage dans le même tube centrifuge de 50 ml contenant le milieu de la réagrégation.
    3. Ajouter 3 ml de 0,04% de trypsine / 0,03% d'EDTA à la boîte de 10 cm et revenir à l'incubateur pendant 5 min.
    4. Après 5 min, examiner la plaque avec un microscope composé inversé à un grossissement de 10X pour assurer dissocia cellulaire complètetion de l'antenne. Si certains groupes résiduels sont encore attachés, agiter doucement la plaque pour détacher les touffes. Si les grappes restent attachés, revenir à l'incubateur pour un autre 2-3 min. Ne pas incuber plus de dix minutes ou la mort cellulaire significative peut se produire.
    5. Une fois que toutes les cellules sont détachées, ajouter 3 ml de solution de trypsine de neutralisation. Mélanger doucement la solution de neutralisation de la solution de trypsine-cellule et transfert vers le tube de centrifugeuse de 50 ml contenant les médias de réagrégation et rincer une fois avec PBS.
    6. Rincer l'ensemble de récipient avec 5 ml de PBS et transférer dans le même tube de 50 ml contenant les cellules.
    7. Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
    8. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de NBS médias, puis transfert à un tube de 1,5 ml.
    9. Pellet à 300 xg pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant. Les cellules cardiaques (CD90 + et les cellules stromales SIRPα + MYOCytes) sont maintenant prêts pour la construction des tissus.
  3. (Facultatif) Recueillir les cellules supplémentaires d'intérêt
    Remarque: En plus des tissus définis contenant uniquement SIRPα + cardiomyocytes et les cellules de type fibroblaste CD90 +, il est possible d'ajouter des cellules d'intérêt supplémentaires pour interroger leur effet sur ​​la fonction des tissus. Par exemple il a été démontré MSCs de rat pour améliorer la fonction de rat d' ingénierie des tissus cardiaques 1. L'étape optionnelle suivante décrit la collecte de cellules supplémentaires pour le système défini.
    1. Recueillir le type de cellule supplémentaire d'intérêt (par exemple, les cellules souches mésenchymateuses) en utilisant 0,25% de trypsine / EDTA 0,1%.
    2. Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante, puis remise en suspension dans 5 ml de milieu de culture cellulaire approprié pour le type cellulaire d'intérêt. Par exemple, pour les cellules souches mésenchymateuses, l'utilisation DMEM additionné de 20% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine et 0,2% de l'amphotéricine B à la culture du caunes.
    3. Effectuer une numération cellulaire en utilisant un hémocytomètre, puis sédimenter les cellules à nouveau à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
    4. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de milieu de culture cellulaire et le transfert à un tube de 1,5 ml.
    5. Sédimenter les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
    6. Retirer le surnageant. Les cellules supplémentaires sont maintenant prêts pour la construction des tissus.
      Remarque: si les cellules supplémentaires sont ajoutés à une concentration de 10% du nombre total de cellules dans le tissu, puis pour les tissus définis, il faudra 50.000 cellules supplémentaires par le tissu que chaque tissu contient 500.000 cellules cardiaques ( les deux cellules stromales CD90 + et les myocytes SIRPα +).
  4. Créer les droits Engineered cardiaques Tissues
    Remarque: Conservez toutes les solutions sur la glace et les cellules à la température ambiante. Tous les volumes indiqués ci-dessous sont par le tissu. En règle générale, environ six tissus peuvent être construits à partir de deux 6 puits plates de différenciations cardiaques.
    1. Diluer 60,0 pi de 5 mg / ml de collagène disponible à 3,125 mg / ml avec 1,5 pi de 1 M NaOH, 9,6 pi de 10x PBS et 24,9 pi d'eau stérile désionisée ultrapure.
      étape critique: Eviter l'introduction de bulles d'air à chaque solution lors de la préparation sous forme de bulles d'air vont perturber la formation de tissu propre.
    2. Ajouter 12,0 ul de fois 10x MEM et 0,2 N HEPES pH 9 au mélange dilué de collagène pour créer le mélange de collagène. Ajouter les deux solutions sur le côté du tube de centrifugeuse de 15 ml afin d'éviter l'introduction de bulles d'air dans le mélange de collagène.
    3. Ajouter la matrice de membrane basale jusqu'à une concentration finale de 0,9 mg / ml au mélange de collagène et de stocker de la glace pour créer le mélange de tissu final. La concentration finale de collagène doit être de 2 mg / ml.
    4. Ajouter 500.000 des cellules refusionnés au mélange de tissu (myocytes + concentration de fibroblaste est de 20 millions / ml) et remplir un volume final de 25 ul partissus soit avec les médias NBS exempts de cellules ou 50.000 cellules du type de cellule supplémentaire d'intérêt (par exemple, CSMh) et bien mélanger pour former une suspension homogène de la cellule.
      Note: Le nombre de cellules supplémentées varie d'une des différentes applications. Ici 10% supplémentation est utilisé.
    5. Avec soin, la pipette 25 ul de la suspension cellulaire dans chacun des six puits dans la plaque de fond du bioréacteur, sans introduire de bulles d'air dans le puits.
    6. Poussez deux rangées de capteurs de force de PDMS sur chaque côté du cadre de polysulfone, formant 6 paires de messages opposés, puis inversez le cadre sur le dessus de la plaque de base de sorte qu'une paire de messages entre chaque puits contenant la suspension cellulaire.
      Remarque: Le cadre de polysulfone comprend des onglets pour faciliter l'alignement des PDMS.
    7. Placez délicatement le bioréacteur, socle vers le bas, dans un plat de 60 mm, puis placez le plat sans son couvercle à l'intérieur d'un plat de 10 cm, placez le couvercle de 10 cm sur le dessus, et déplacer l'ensemble du bioréacteur entier dansau tissu incubateur de culture, deux heures d'attente pour que le tissu gel.
    8. Après 2 heures, retirer le bioréacteur de l'incubateur et ajouter 14 ml de NBS médias à la totalité de l'ensemble, assez pour couvrir la plaque de base. Retour à l'incubateur, et changer la moitié des médias chaque jour.
    9. Quarante-huit heures plus tard, retirez soigneusement la plaque de base en déplaçant doucement chaque côté de l'embase hors du cadre de quelques millimètres à un moment, changer les médias, puis retourner le bioréacteur, les tissus vers le bas, aux médias.
    10. Continuez de changer la moitié des milieux de culture NBS chaque jour.
      Note: les contractions spontanées du tissu peuvent être observés dès 3 jours après la construction des tissus, générant des forces de contraction mesurables dès le jour 5 à 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pour obtenir les myocytes cardiaques, une version légèrement modifiée des méthodes de différenciation Boheler et Lian est utilisé 30,31. Il est impératif que la différenciation commence au cours de la phase logarithmique de la croissance cellulaire, mais aussi que la population de départ est suffisamment confluentes pour obtenir un nombre utilisable de cellules après tri (environ 75% est optimal). Typiquement, pour H7 CSEh, placage à une densité de 140.000 CSEh par puits d'un plat à 6 puits dans essentiel 8 médias et 5% de CO 2 incubateur maintenu à 37 ° C donne des cultures suffisamment confluentes après 4 jours pour commencer la différenciation, comme illustré la figure 1A - D. L'insuline inhibe la spécification cardiaque pendant le processus de différenciation 32, l' insuline médias libres (différenciation des médias I, tableau 1) est utilisé pour les 10 premiers jours de différenciation. Une fois que la différenciation est déclenchée par l'application de la CHIR99021 inhibiteur de GSK3,la mort cellulaire importante se produira (figure 1E). En conséquence, il est essentiel de changer les médias chaque jour. Au jour 2 de la différenciation, les cellules sont retirées de CHIR99021 et reposés dans un milieu de différenciation I (sans addition de petites molécules) pendant 24 heures. Après 24 heures de repos dans les médias de différenciation, les cellules sont traitées avec IWR-1 pendant 48 heures, après quoi ils commencent à auto-organiser en clusters (figure 1F) qui a battu aussi tôt que sept jours à partir de la différenciation. Depuis la spécification cardiaque a eu lieu après l'application de IWR-1, le support est changé pour les médias contenant de l' insuline (média de différenciation II, tableau 1). Par 18 jours de différenciation, les colonies de cellules sont connectés en battant et partiellement détachée de la surface de la cellule, formant battant robuste "nappes" à travers le plat (Video Figure 1).

Au jour 20, la monocouche battant doucement dissocié viune des méthodes enzymatiques pour obtenir des cellules individuelles pour fluorescent direct cellule associée (FACS). En utilisant la méthode de différenciation décrite ci - dessus, on récolte conservative environ 65% de la population SIRPα + et 10% CD90 + (figure 2). Généralement 1-2 millions SIRPα + cellules sont obtenues par plaque de 6 puits.

Après avoir réagrégation pendant 48 heures dans un rapport de 3: 1 de SIRPα +: + CD90 des cellules, les agrégats cellulaires définis sont mélangés avec un hydrogel à base de collagène et pipetés dans les puits étroits dans la plaque de fond du bioréacteur à plusieurs tissus. En règle générale, avant le retrait de l'antenne, de petits groupes de 5-10 cellules seront vus battre sur la surface de la boîte. Le bioréacteur de tissu défini est constitué de trois composants: un moule maître pour jeter les PDMS postes; un cadre pour tenir deux PDMS racks de postes; et un polytétrafluoroéthylène socle noir contenant six puits pour le mélange de tissus (Figure 3A). L'ensemble du processus de construction des tissus est réalisée sur la glace et dans des conditions aseptiques. Après avoir ajouté les mélanges liquides à matrice cellulaire dans les puits de la plaque de base, les messages sont PDMS fixés au cadre de polysulfone, puis inversées pour que les messages soient alignés avec les puits dans la plaque de base (figure 3B). Au bout de 48 heures d'incubation, les tissus doivent être suffisamment compacte que la plaque de base peut être enlevée. La semelle est plus facilement détaché par l'extraction de l'ensemble du système des médias et enlever délicatement tout les supports en excès entre les PDMS et platine. Si tous les médias ne sont pas supprimés, la tension superficielle du liquide restant peut tirer les tissus au large des messages. Une fois que le support est retiré, appuyez doucement sur la plaque de base arrière contre les PDMS messages pour aider à déloger le tissu de la plaque de base. Poussez ensuite progressivement la semelle off en déplaçant doucement un côté de quelques millimètres, puis l'autre côté le même montant. Répétez ce processus jusqu'à ce que le baseplate est enlevé, avec les 6 hECTs attachés à leurs PDMS finaux postes respectifs (figure 4A). Retrait de la plaque de base ne devrait pas prendre plus d'une minute. Remplacer le système dans les milieux de culture cellulaire, inversé, de sorte que tous les tissus sont couverts par les milieux de culture cellulaire.

Environ un jour après retrait de la plaque de base, la faiblesse des contractions localisées devraient être observables dans les hECTs définies sous microscopie en champ lumineux. Au bout de 7 jours, les tissus ont mûri et compactée (figure 4B-C) avec sarcomères alignées (figure 4D). Les tissus dévient visiblement les postes PDMS avec une moyenne de 5-15 μN de la force (Figure 4E). Twitch mesures de force pour les tissus cardiaques ingénierie définis peuvent être mesurés par le suivi en temps réel de la fonction béquillage avec un logiciel d'acquisition de données de la caméra et personnalisés haut débit, et l'application de la déviation des montants à poutre de pliage théorie après la détermination de laLe module de Young des postes de silicone en utilisant un capteur de force, comme expliqué plus en détail précédemment. 1,7 Maintenir la stérilité lors de l' acquisition de données garantit la capacité de mesurer les changements dans la fonction des tissus au fil du temps. Nous avons maintenu les tissus fonctionnels pendant plusieurs semaines, comme expliqué plus en détail ailleurs 1. Nos résultats préliminaires indiquent une amélioration substantielle de la force contractile HECT lorsque les tissus sont complétés avec 10% de cellules souches mésenchymateuses humaines à la fois 1 Hz et 2 fréquences Hz de stimulation (Figure 4F).

Figure 1
Figure 1: Des images représentatives de H7 CSEh pendant l'expansion et le processus de différenciation cardiaque. La phase d'expansion devrait durer de 4 jours, la croissance des colonies en expansion de 24 (A) à 48 (B) 72 (C (D). Après 96 h de croissance de la différenciation est commencée, ce qui entraîne la mort cellulaire substantielle au cours de la 48 première heure de traitement CHIR99021 (E). Après deux jours de IWR-1 traitement, la réorganisation se produit (F) pour former des amas de cellules qui a battu dès le jour 7. En outre l' organisation dans une "web" en battant robuste se produit du jour 7 au jour 20, lorsque les monocouches sont dissociées pour créer des tissus cardiaques artificielles.

Vidéo Figure 1:. Monocouche cardiaque Représentant après 17 jours de différenciation . S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo battre spontanée au sein de la monocouche est habituellement d' abord observé entre le jour 7 et le jour 10, et de 17 jours de différenciation la monocouche a formé des bandes interconnectées " »qui a battu vigoureusement.

prénom Composition Jours de différenciation utilisés
Différenciation médias I RPMI 1640
Supplément de B27 (moins d'insuline)
Pénicilline- streptomycine
D0-D1 (avec CHIR99021)
D2
D3-D5 (avec IWR-1)
D5 à D7
Différenciation Media II RPMI 1640
Supplément de B27 (avec de l'insuline)
Pénicilline- streptomycine
J7-J20

Tableau 1: Composition des Différenciation Médias.

Figure 2
Figure 2: Représentant tri de cellules vivantesing résultats Deux échantillons ont été préparés:. un témoin non coloré et une commande colorées à l' aide dilution 1: 500 de l'anticorps SIRPα-PE / Cy7 et dilution 1: 250 de l'anticorps CD90-FITC. Après coloration, les cellules ont été triées à 20 psi dans un tampon composé de PBS, 10% de sérum de veau nouveau-né, un inhibiteur de ROCK 10 uM Y-27632 et 1 pg / ml de DAPI tri. Deux populations cellulaires ont été bloqués dans les profils avant et dispersion latérale pour exclure les débris (A, ligne bleue) , puis des cellules individuelles ont été sélectionnées en comparant la largeur d'impulsion et de la hauteur (impulsion analyse largeur) tant dans la diffusion vers l' avant (B, ligne bleue) et canaux de diffusion latérale (C, ligne bleue). Ensuite, les cellules vivantes ont été sélectionnés par le gating DAPI - population (D, ligne bleue). Les populations de cellules finales de collecte ont été déterminées en examinant les taux d'expression FITC et PE-Cy7 des populations vivantes. Le contrôle des souillures (E, à gauche) a été utilisé pourétablir la grille appropriée pour sélectionner le FITC + (CD90) et SIRPα-PE / Cy7 + (cardiomyocytes) population présente dans l'échantillon coloré (E, à droite). Le FITC et SIRPα-PE / Cy7 + poplations ont été recueillies dans 15 ml tubes de centrifugation séparés.

Figure 3
Figure 3:. Schématique du bioréacteur multi-tissulaire et le processus d'ingénierie de tissu cardiaque Construction du bioréacteur multi tissu nécessite trois composants (A): 1) un polytétrafluoroéthylène moule maître 9 x 33 x 5 mm 3, avec 6 trous régulièrement espacés 0,5 mm de diamètre; 2) un cadre de 25 x 35 x 11 mm 3 polysulfone pour tenir les PDMS postes pendant la construction et de la culture tissulaire; et 3) un 20 x 40 x 5 mm 3 noir plaque de base de polytétrafluoroéthylène avec 6 puits de 6 x 1 x 1 mm 3 dimensions, spaced 4 mm de distance le long de sa longueur. Pour créer des tissus humains modifiés cardiaques (B), les PDMS postes sont fabriqués par PDMS de lithographie douce à l' aide du moule maître de polytétrafluoroéthylène, dont deux sont ensuite pressée sur les pattes du cadre de polysulfone pour former 6 paires de poteaux en porte à faux de détection de force. La solution de tissu est pipette dans les puits du polytétrafluoroéthylène socle noir. Le cadre et les messages sont ensuite inversés et alignés sur la plaque de polytétrafluoroéthylène de sorte qu'une paire de messages entre chaque puits contenant le mélange de tissus. Après 48 h, la plaque de base est retiré et les tissus définis sont cultivés sur les poteaux, restant inversée dans NBS médias.

Figure 4
Figure 4:. Des images représentatives et les mesures fonctionnelles des tissus cardiaques humaines ingénierie définies Le bioreact multi-tissusou le système détient six tissus en parallèle (A, pointes de flèches). Tissus définies sont auto-assemblés dans les sept jours qui suivent la création de tissus (vue de dessus, B et vue de côté oblique, C). (D). Portion d'un hect défini colorée pour la troponine cardiaque-T (cTnT). (E) twitch traçage Représentant montre la force brute au fil du temps au cours de 1 Hz de stimulation par la stimulation de champ électrique. (F) Twitch traçage pendant la stimulation à 1 Hz (0-2 sec) et 2 Hz (2-4 sec) de stimulation, avec un marquage changement de fréquence, pour les deux hECTs définies non complémentés (trait plein) flèche et tissus additionné de 10% CSMh (ligne pointillée).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La construction de tissus humains définis par génie cardiaque (HECT) peut fournir un modèle plus cohérent et fiable de la fonction cardiaque humaine myocytes. Critique, tous les composants cellulaires et extracellulaires dans le système sont connus et peuvent être manipulées comme désiré, en éliminant ainsi l'influence des facteurs de confusion d'autres types cellulaires inconnus résultant du processus de différenciation. Pour équilibrer la croissance cellulaire rapide et un rendement élevé, il est préférable que la différenciation à partir de 75% de confluence des cellules hES, idéalement quatre jours après l'étalement. En outre, l'utilisation d'un inhibiteur de ROCK Y-27632 à la fois pendant la dissociation cellulaire et la réagrégation après triage augmente considérablement la viabilité cellulaire. La présence de battements spontanés de myocytes pendant le processus de différenciation est un indicateur important de l'efficacité et de la santé de la différenciation. Si battements spontanés est pas observée, cela peut indiquer une faible efficacité de différenciation, soit en raison de réactifs inefficaces ou une pertede la pluripotence des cellules souches.

Lors de la construction des tissus, les PDMS messages doivent aligner correctement avec les canaux dans la plaque de base pour créer des tissus bien formés qui durent assez longtemps pour mesurer la fonction contractile. Pour améliorer la facilité d'alignement de l'appareil, et de renforcer la formation des tissus autour des postes où ils sont sensibles à la rupture, il est possible d'ajouter la largeur supplémentaire (environ un diamètre de poste de chaque côté de la poste) aux extrémités des canaux, comme l'a démontré par le "os de chien" canaux dans la figure 3A en forme. Sans alignement de périphérique approprié le tissu sera soit détacher des postes peu après la culture, ou restera dans le puits lorsque la plaque de base est supprimée. Si un tissu bien formé tombe lors de l'enlèvement de plaque de base, il est possible de rattacher délicatement le tissu aux poteaux à l'aide de pinces fines sous un microscope de dissection, mais il est facile d'endommager les hECTs délicates si des soins adéquats ne sont pas prises. </ P>

Un atout majeur du système défini décrit est la capacité d'interroger la contribution des mécanismes d'interaction cellule-cellule directs dans les thérapies cellulaires cardiaques basée sur le contrôle spécifique de la composition cellulaire. L'injection de cellules chez les animaux est imprécis et soumis à une faible viabilité et la rétention 33. En outre, l'effet des cellules injectées sur le tissu cible est compliquée par des interactions avec d'autres systèmes physiologiques, tels que le système immunitaire. A ce titre, la compréhension de la contribution des interactions cellule-cellule directe dans des thérapies cellulaires cardiaques est difficile à traiter dans des organismes modèles. Par conséquent, un avantage du procédé décrit est que les interactions entre les cellules sont analysées dans un environnement en trois dimensions biomimétique, en conservant les aspects clés de la niche cardiaque, et en présence des types de cellules spécifiques d'intérêt - à savoir les myocytes cardiaques et les fibroblastes. L'utilité de l'utilisation du système HECT défini est demonstrciés à la complémentation de 10% hMSC dérivées de moelle osseuse humaine et 34,35 utilisées dans les essais cliniques pour le mélange de cellules pendant la création de tissus. Ces tissus qui ont été complétées par les CSMh exposées force contractile plus grande que les tissus humains définis non complémentés (Figure 4F). Etant donné que l'environnement tissulaire et la composition a été contrôlée, l'amélioration de la fonction des tissus MSC complémentation reflète un effet inhérent de CSMh sur la fonction des cardiomyocytes. Une autre force du système est que , puisque les tissus sont plus petites que celle utilisée précédemment, le 1,7 utilisation de cellules est plus efficace, une considération importante lors de l' utilisation différenciations dirigés des cellules souches pluripotentes en tant que source de cellules.

Au-delà des mécanismes de la thérapie cellulaire à étudier, le système HECT défini permettrait l'examen de base cellulaire des interactions cellule-cellule cardiovasculaires. Perturbation de la biologie des cellules avant l'const tissulaireruction, par exemple avec des shRNA, permettrait l'étude des mécanismes moléculaires qui régissent les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Un avantage supplémentaire du système d'ingénierie tissulaire est la formation de myofibrilles alignés capables de contractions fonctionnelles. Ainsi, en utilisant le système défini HECT, la dynamique de formation myofibril, le développement des cardiomyocytes et l'organisation de l'architecture tissulaire peuvent tous être étudiés par la modification des composants de la matrice extra-cellulaire ou une manipulation moléculaire des cellules. La nature humaine et 3-D du système HECT augmente en outre l'traductibilité des résultats.

Bien que le système décrit offre une méthode puissante pour la compréhension des questions fondamentales de la biologie cardiovasculaire, il est pas sans limites. Tout d' abord, les tissus d' ingénierie présentent un phénotype immature, compatible avec les données de la force de contraction publiées à partir d' échantillons du myocarde nés 7. Bien que laimmaturité phénotypique pourrait être un facteur de confusion dans l' évaluation des mécanismes d'interaction cellulaire, il est prouvé que les cardiomyocytes malades reviennent à un programme de gène foetal 7,36-38. Si les résultats du système HECT se révéler pertinent dans le contexte d'un cœur défaillant, il peut être avantageux pour tester des thérapies cardiaques. Le protocole utilise également un sous-sol qualifié matrice de la membrane CSEh pendant la construction des tissus. La composition de cette matrice peut varier d'un lot à, et tout en sous-sol alternatives de matrice définies sont disponibles, ils doivent encore être évalués dans le contexte de hECTs.

D'autres limitations comprennent l'absence d'un système vasculaire et aucun effet d'interaction au niveau des systèmes. Compte tenu de la taille des tissus, des demandes métaboliques sont satisfaits par la diffusion seul donc pas de système vasculaire est nécessaire pour assurer la viabilité des cellules. Cependant, la signalisation des cellules endotheliales peut être un facteur important dans les thérapies cellulaires spécifiques. Si tel est le cas, un nombre spécifique de l'endocellules thelial peuvent être simplement ajoutés au mélange de cellules défini lors de la construction des tissus. Alors que les interactions au niveau des systèmes sont importants pour la compréhension complète des mécanismes cellulaires, le système de l'ingénierie tissulaire offre une approche réductionniste pour simplifier le problème afin d'aborder le mécanisme systématique. La complexité peut être ajouté au système de tissu définie en fonction des besoins par l'introduction des systèmes d'effets liés, tels que les leucocytes pour incorporer une réponse immunitaire, ou en ajoutant des types de tissus voisins pour interroger la signalisation paracrine.

Comme un outil d'enquête, le système de tissu cardiaque humain conçu défini offre les avantages de cellules humaines spécifiques à l'espèce, un biomimétique 3-D environnement de culture avec biocomplexité contrôlée, la surveillance directe et longitudinale de la fonction contractile, et une composition cellulaire et matrice définie. Orientations futures pour le système HECT comprennent la manipulation du type de cellules d'intérêt thérapeutique with siRNA ou shRNA avant l'introduction dans le tissu afin d'enquêter sur les détails moléculaires spécifiques de l'interaction cellule-cellule. En outre, plutôt que d'utiliser hESC pour former les cellules cardiaques, il est possible d'utiliser des cellules pluripotentes induites souches (CISP) provenant de patients avec une mutation héréditaire dans le but de modéliser les manifestations de la maladie cardiaque apparentées dans les tissus d'ingénierie. Ainsi, notre méthode de création de tissus cardiaques humains conçus avec des populations de cellules définies promet d'ouvrir de nouvelles voies pour étudier les thérapies cellulaires cardiaques pour aider à accélérer le développement de nouveaux traitements pour les patients atteints de maladies cardiaques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le NIH (1F30HL118923-01A1) à TJC, contrat NIH / NHLBI PEN HHSN268201000045C à KDC, le conseil de subvention de recherche de Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) à BDG, l'American Heart Association (12PRE12060254) à RJ, et de la recherche du Conseil de Grant RASHK (TBRS, T13-706 / 11) à RL des fonds supplémentaires ont été fournis à TJC par le NIH DRB 5T32GM008553-18 et comme un stage sur la formation NIDCR-interdisciplinaire dans les systèmes et le développement Biologie et anomalies congénitales T32HD075735. Les auteurs tiennent également à remercier Arthur Autz au Centre Zahn du City College de New York pour l'assistance à l'usinage du bioréacteur et Mamdouh Eldaly pour l'assistance technique. Nous remercions également le Dr Kenneth Boheler pour obtenir des conseils sur la différenciation cardiaque, et le Dr Joshua Hare pour fournir généreusement des cellules souches mésenchymateuses humaines.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28, (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6, (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35, (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7, (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42, (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2, (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364, (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152, (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126, (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30, (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113, (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32, (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114, (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161, (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108, (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104, (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12, (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter