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Bioengineering

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

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심장 조직 공학은 최근 두 쥐의 심근 1-6과에서 만든 완전한 기능을, 구타 조직, 인간 줄기 세포 유래 심장 근육 세포 7-12의 결과를 게시하는 여러 그룹으로, 지난 10 년간 크게 발전하고있다. 심근 조직 공학 분야는 두 가지 주요 본질적으로 독립적 인 목적에 의해 구동된다 : 1) 기능을 개선하기 위해 4-6 하트 실패에 이식 할 수 외래 이식을 개발; 2) 생리 및 질병 연구를위한 체외 모델에서 개발, 또는 치료 개발 2,7 선별 도구로합니다.

3 차원 (3-D) 세포 배양 물은 3-D 행렬은 기존의 2-D 단층 세포 배양 물보다 더 자연 심장 미세 환경을 반영하는 바와 같이, 차세대 스크리닝 도구 개발에 필수적인 것으로 간주된다; 실제로 세포 생물학의 일부 측면은 2-D 대 3-D 배양 13,14 근본적으로 다르다 9 콜라겐 7,8,10)이 엄격하게 통제하면서 전통적인 설계 인간의 심장 조직의 경우, 입력 셀 조성물은 덜의 지시 심장 분화에서 세포의 전체 혼합물로 정의된다 어느 배아 줄기 세포 (ESC 7,9) 또는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC 10, 12)는 조직에 추가. 특정 세포주에 사용 된 분화 프로토콜의 효율에 따라, 심근의 생성 비율이 90 % 이상 25 % 미만에서 특정 심근 표현형의 범위 일 수있다 (즉, ventricular-, atrial- 심박 형 또는) 수도도 아닌 심근 분획 (15, 16)을 매우 이질적인하고 차별화 된 심장 m의 성숙을 변경할 수 있습니다 다양17 yocytes.

최근 심근 조직 공학 연구는 심장 리포터 인간 배아 줄기 세포주 8 세포 표면 마커 (18)가 분화 심장 근세포 성분을 분리하는 데 사용되는 하나와, 셀 입력 인구를 제어하려고 하였다. 단지 심장 근육 세포로 구성 초기에 조직이 이상적 일 것 같다 있지만,이 사실이 아닌 경우에; 심장 근육 세포의 1의 비율 : 섬유 아세포가 가장 높은 트의 힘 (8)을 생산 전적으로 심장 근육 세포로 구성 hECTs 일부 그룹 3을 찾는, 기능 조직으로 압축하지 못한다. 생균 정렬 용 표면 마커를 포함하여 다양한 세포의 선택 방법을 이용함으로써, 한정된 세포 집단과 hECTs를 생성 할 수있다. 비 심장 기질 세포의 마커 CD90 19,20 이러한 추정 섬유 아세포 마커로서 당분간 사용할되었지만, 심장 근육 세포 표면 마커는보다 어려웠확인하다. SIRPα 인간 심장 근세포 18 식별 제 심장 표면 마커 사이이고 심장 리니지 고도로 선택적인 것으로 밝혀졌다. 세포 섬유 아세포와 같은 표현형 (Josowitz, 게시되지 않은 관찰)을 나타내는 CD90 + 인구, 거의 순수한 심근 세포를 얻을 수 - 최근에, 우리는 두 번 정렬 SIRPα + 및 CD90에 대한이 있음을 발견했다. 심근 세포와 CD90 + 섬유 아세포 - SIRPα + / CD90의 1 조합 :이 수집 된 결과를 바탕으로, 여기에 우리는 3를 사용하여 hECTs을 만들 설명합니다.

완전히 정의 인간 심장 조직을 설계하는 능력은 강력한 선별 도구를 만드는, 또한 새로운 세포 - 기반 유전자 심장 치료를 조사하기위한 모형을 개발하는 시스템뿐만 아니라 필수적이다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) (21)를 포함한 세포 유형 이용한 심부전 특히, 다수의 세포 치료에서, (22) 및 골수 단핵구 23-25은 임상 시험에서 시험되고있다. 초기 결과 많은 21,23,25 유망되었지만, 초기 이득은 종종 26-29 시간에 걸쳐 감소한다. 유사한 경향으로 인해 MSC 보충에 중요한 기능적 이득을 표시 뮤린 설계 심장 조직에서보고되었지만 이득 장기 배양 동안 유지되지 않는다. 서브 최적의 성능을 기본 것은 세포 치료를 지배하는 메커니즘의 우리의 제한된 지식이다. 자신의 유익한 영향뿐만 아니라 심근-nonmyocyte 상호 작용의 잠재적 인 부정적 영향을 미치는 방법을 치료 세포의 깊은 이해는 심부전 환자에 대한 최소한의 부작용이 임상 적으로 유의 한 지속적인 혜택을 얻었다 개선 된 치료법의 개발을 활성화합니다.

여기, 우리는 interrog 정의 hECTs의 사용을 설명세포 기반 치료의 메커니즘을 먹었다. 제어 조직 조성물은 심근 성능에 영향을 특정 요소를 식별하는 데 중요하다. 우리 래트 ECTS 1에서 보여준 바와 같이 직접 관심 치료 세포 유형 (예, 중간 엽 줄기 세포)를 hECTs 보충, 심장 근세포의 성능에 미치는 영향을 나타내있다.

다음 다단계 프로토콜 멀티 조직 생물 반응기의 제조이어서, 조직 구조 및 기능 분석에 대한 설명으로 종결 지시 된 심장 줄기 세포의 분화와 함께 시작된다. 우리의 실험은 NIH 승인 H7 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인을 사용하여 수행됩니다. 그러나, 다음의 프로토콜들이 또한 추가 hESC의 라인과 유사한 결과 세 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 라인을 사용하여 테스트되었다. 우리는 hECT 제조에서 심근 차별화와 성공의 효율성, 특히 fo를, 세포주 의존 할 수 있다는 것을 발견했다개별 환자에서 파생 된 연구 hiPSC 라인. 이 프로토콜에 따라, 두 개의 6 잘 요리 20 일 동안 차별화 충분히 여섯 정의 된 조직을 만들기 위해, 정렬 후 약 250 만 근육 세포를 얻을 수 1,680,000 hESCs는 (물론 당 140,000 셀), 총으로 도금되어있다.

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Protocol

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참고 : HEPA 필터 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하여 무균 상태의 모든 세포 조작을 수행하고 0.2 μm의 필터를 통해 필터링 모든 솔루션을 소독. 같은 무균 조건 또는 층류 후드 하나로 조직 구조 및 기능 테스트를 수행한다.

심장 차별화를위한 준비에 H7 hESCs는 1. 시드

  1. (주 1) 지하실 막 매트릭스 준비
    1. 4 ℃에서 밤새 얼음에 hESC의 자격을 갖춘 지하 막 매트릭스의 150 μl의 나누어지는을 녹여.
  2. 코팅 플레이트에 hESCs는의 (주 0-4) 도금
    1. 얼음처럼 차가운 DMEM / F12 12 ml의에 해동 행렬을 희석하고 잘 섞는다.
    2. 전송 6- 웰 조직 배양 접시의 처리를 각 웰에 DMEM / F12 매트릭스 액 1ml. 매트릭스 캔 코팅이 6 웰 플레이트의 각 나누어지는.
    3. 적어도 1 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 인큐베이션.
      참고 :에서경험은 파라핀으로 밀봉 피복 요리를 사용하기 전에 최대 10 일 동안 39 ° C에서 매트릭스 용액에 저장 될 수있다.
    4. 약 75 % 합류에, 비 효소 분해 시약 용액 6을 사용하여 10cm 접시의 H7을 hESCs는 해리. 5 분 후, 부드럽게 일회용 셀 스크레이퍼를 사용하여 배양 표면에서 세포를 긁어 멸균 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
    5. 줄기 세포주 전파 (상기 hESCs는를 해리 해리 시약 5.5 ml를 떠나) 새로운 무균 15 ㎖의 튜브에 15 ㎖의 튜브 양도 세포 해리 용액 0.5ml를 제거.
    6. 20 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 세포의 0.5ml를 펠렛. 상등액을 제거하고 부드럽게 한 다음 새로운 코팅 10cm 조직 배양 접시로 옮기고 줄기 세포주를 유지하도록 37 ° C, 5 % CO 2 유지 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 %를 함유하는 다 능성 줄기 세포 배지 8 ㎖에 재현 탁.
      참고 : 미디어 변경하는 동안 얼음에 다 능성 줄기 세포 미디어를 유지합니다.
    7. 한편, 나머지 해리 5.5 ml의 용액에 10 mM의 ROCK 억제제 Y-27632 5.5 μL를 추가하여 다른 50-10 분 동안 실온에서 배양을 계속. 부드럽게 5 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 세포를 섞는다. 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지, 실온에서 5 분 동안 300 XG에 펠렛 세포 배양을 계속.
    8. 다 능성 줄기 세포 배지 5ml에 재현 탁하고 세포를 이용하여 혈구 세포 수를 수행한다.
    9. 시드 웰 당 140,000 세포의 밀도로 6 웰 접시의 각 웰. 여섯 정의 조직의 합계를 만들기 위해 두 개의 6- 웰 플레이트 종자. 도금 후 남아있는 세포를 폐기하십시오.
    10. 다 능성 줄기 세포 미디어를 잘 1 ml에 입력하고 37 ° C, 5 % CO 2 부화. 24 시간 후, 미디어를 분리하고, 각 웰 (도 1a에 신선한 능성 줄기 세포 배지 2 ㎖를 추가
    11. 매일 판의 합류를 확인하고 세포가 약 75 %의 합류에 도달하면 분화를 시작합니다 (그림 1B - D)를.

심근 (30, 31)에 인간 배아 줄기 세포의 2. (일 4-24) 차별화

  1. (주 4-7, 차별화 날 0-3) 중배엽 유도
    1. 10 ㎖의 B27의 (인슐린)없이 보충 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 스톡 용액 (10,000 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 10,000 IU / ml의 페니실린) 5 ㎖를 500 ㎖의에게 RPMI 1640을 조합하여 RPMI 분화 배지 I (표 1)을 준비한다. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 얼음에 나누어지는, 저장.
    2. (4 일, 차별화 날 0) I. 각 우물에서 다 능성 줄기 세포 용지를 제거 RPMI 차별화 미디어의 12 ml의 (10 mM의 재고, 6 μm의 최종 농도) 작은 분자 GSK3 억제제 CHIR99021의 2.4 μl를 추가하여 중배엽 유도 매체를 준비 에이차 중배엽 유도 매체의 2 ㎖로 당 잘 교체합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
      참고 : 중요한 세포 죽음은 일반적으로 CHIR99021 (그림 1E)의 추가 발생합니다. 단층은 회복하지만 떨어져 DMEM / F12 린스와 사균 린스하는 것이 중요하다.
    3. 상술 한 바와 같이 (5 일, 차별화 1 일) 신선한 중배엽 유도 미디어를 준비합니다. 물론 각에서 기존의 미디어를 제거하고 DMEM / F12 1 ㎖로 한번 씻어 당 잘. 각 웰에 신선한 중배엽 유도 매체의 2 ML을 추가합니다.
      참고 : 하루 0-10에서 매일 세척하는 것은 크게 심장 근육 세포의 수율과 순도를 증가시킨다.
    4. (6 일, 차별화의 날 2) 심장 유도 용지를 제거하고 잘 당 1 ml의 DMEM / F12로 한번 씻어. I (더 작은 분자는하지만 여전히 인슐린) 보충없이 B27 (첨가) 2 ml의 RPMI 차별화 미디어와 린스를 교체하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
  2. (주 7-13, 차별화 다Y 3-10) 심장 중배엽 유도
    1. (7 일, 차별화 3 일) RPMI 차별화 미디어 I. 12 ml의 작은 분자의 Wnt 억제제 IWR-1 (최종 10 mM의 재고, 5 μM)의 6 μl를 추가하여 심장 중배엽 유도 매체를 준비
    2. 물론 각각의 용지를 제거 웰 당 1 ml의 DMEM / F12와 함께 한 번 헹군 심장 중배엽 유도 미디어 2 ㎖로 교체 당 잘.
    3. 상기 한 바와 같이 (8 일, 차별화 4 일) 심장 중배엽 유도 매체의 추가 12 ml의를 준비합니다. 미디어가 이전에 하루를 추가 제거 웰 당 1 ml의 DMEM / F12에 한 번 씻어 잘 당 신선한 심장 중배엽 차별화 미디어의 2 ㎖로 교체하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
    4. (주 9 ~ 10, 차별화 날 5-6) 모두 일에는 심장 중배엽 유도 매체를 제거하고 DMEM / F12의 각 웰에 1 ml에 헹군다.
    5. 신선한 RPMI 차별화 매체의 2 ML을 추가 I (더 작은 분자가 여전히 인슐린없이 B27 () 보완과 추가 없음)각 웰에 인큐베이터에 접시를 반환합니다.
  3. (주 11-24, 차별화 날 7-20) 배아 줄기 유래 심장 심근 조직 / 성숙
    1. 10 ㎖의 B27의 (인슐린) 보충 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 스톡 용액 5 ㎖를 500 ㎖의 RPMI 1640을 조합하여 RPMI II 분화 배지 (표 1)을 준비한다. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 얼음에 나누어지는, 저장.
    2. (주 11, 차별화 7 일)도 각에서 (인슐린 제외) RPMI 차별화 미디어를 제거하고 1 ml의 DMEM / F12 씻어. 각 (인슐린) 새로운 RPMI 차별화 미디어 II 2 ㎖ 잘 교체하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
      주 : 자율 박동이 제 7 및 10 일 사이에 관찰되어야 매질이 시간 동안 관찰되지 않으면, 그것이 일반적으로 불량한 분화 효율을 나타낸다. 이 프로토콜은 박동을 관찰하기위한 노력의 일환으로 하루에 15 일까지 계속 될 수 있지만 박동이 하루 15 관찰되지 않는 경우는 일에 최고새로운 차별화 예술.
    3. (주 12 ~ 24, 차별화 날 8-20) 매일, 기존의 차별화 미디어를 제거하고 신선한 RPMI 차별화 미디어 II 2 ㎖로 교체 박동 단층의 세포 성숙과 조직을 허용하는 잘 (그림 1 층, 비디오 그림 1 당 ).
      주 : 잔류 세포사에 따라, 차별화 날 (10)을 통해 1 mL의 DMEM / F12로 세정 할 필요가있다.

3. (주 24, 차별화의 날 20) 심장 근육 세포와 섬유 아세포와 같은 세포의 분리

  1. 단일 플라이에서 세포를 떼어 놓다
    1. 차별화 용지를 제거하고 1 ml의 PBS로 한번 씻어.
    2. 각 웰에 효소 분해 용액 (0.04 % 트립신 / 0.03 % EDTA) 1 ㎖의 단일 층을 해리.
    3. 10 분 동안 인큐베이터에 플레이트를 이동합니다. 한편, 트립신 중화 용액 6 ml의 ROCK 억제제의 12 μl를 추가합니다.
    4. GentlY는 트립신 중화 용액 플레이트의 각 웰에 ROCK 억제제를 함유하는 트립신 중화 액 1ml를 추가한다.
    5. 멸균 전송 피펫을 사용하여 부드럽게 세포 클러스터를 깨지 잘 각각 섞는다.
    6. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 6 웰 플레이트의 모든 12 ml에 전송합니다.
      주 : 6 개의 웰 플레이트는이 프로토콜에서 사용되기 때문에, 두 개의 15-㎖의 튜브가 필요하다.
    7. 다음 한 판의 잘, 그리고로 전송 PBS의 3 ㎖를 순차적으로 접시에 남아있는 세포를 수집하기 위해 각 후속 아니라 동일한 3 ㎖를 전송합니다. 웰 세포를 포함하는 15 mL의 동일한 원심 분리 튜브에 남아있는 마지막에서 3 ㎖를 옮긴다.
    8. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 펠렛.
  2. FACS에 의해 라이브 셀의 정렬을 위해 세포를 준비
    1. ROCK 저해제 50 μl의 빙냉 PBS로 45 ml의 태아 소 혈청을 5 ml를 첨가하여 염색 버퍼를 준비한다.
    2. 셀 화소에서 뜨는을 제거(3.1.8에서)하자 염색 버퍼의 1.2 용액에 재현 탁.
    3. 얼음에 새로운 사전 냉장 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 200 μl를 옮긴다. 이것은 부정적인 염색 제어됩니다.
    4. (: 500 희석 1)의 4 μL CD90-FITC (1 : 250 희석) 2 μL SIRPα-PE / Cy7을 얼음에 새로운 사전 냉장, 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포 현탁액의 나머지 1 ml의 이동 및 추가 . 조심스럽게 전송 피펫으로 세포 현탁액을 혼합하고 얼음으로 돌아갑니다.
    5. 1 시간 동안 4 ℃에서 얼음에 로커 진탕, 음성 대조군 샘플 모두 부화.
    6. 두 개의 15 mL의 원심 분리 튜브 (인슐린) RPMI 배지 3 ㎖을 첨가하여 시료 채취 튜브를 준비한다. 각 튜브에 ROCK 저해제의 3 μl를 추가하고 얼음에 저장합니다.
    7. 39 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 염색 된 세포를 펠릿 린스 당 빙냉 PBS 중 적어도 10 ㎖로 두 번 씻어.
    8. 염색 버퍼 5 ㎖에 DAPI (1 μg의 / ㎖) 1 μl를 추가합니다. 부드럽게전달 피펫을 사용하여 함유 DAPI 염색 완충액 1-3 ml의 시료 펠릿을 재현 탁.
    9. 음성 대조군에 (더 DAPI가 추가되지로) 염색 버퍼의 500 μl를 추가합니다.
    10. 부드럽게 세포의 덩어리를 제거하고 얼음에 FACS 튜브 폴리스티렌 전송하는 데 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 음성 대조군과 샘플을 모두 필터링합니다. 바로 셀 소터에 샘플을 가져.
    11. 설립 살아있는 세포와 유사하게 정렬 방법 (18), (음 DAPI)를 살아있는 세포에 대한 선택 게이트를 설정하는 음성 대조군을 사용하고 FITC + (즉, CD90 + 섬유 아세포) 및 PE / Cy7 + (즉, SIRPα가 + 심근를 모두 수집 ) 20 PSI (그림 2)에서 독립적으로 인구.
      주 : 게이트를 설정 한 후, 대조군은 심장 트로포 닌 T-위한 염색하여 분화 효율을 결정하기 위해 4 % PFA로 고정 될 수있다.
      참고 : 일부 연구자를 사용하는 것을 선호아이소 타입 컨트롤보다 흠 제어 비특이적 항체 결합에 대해 보상하기 위해 게이트를 설정한다. 소위 형광 빼기 하나 (FMO) 컨트롤은 또 다른 가능성이다. 때문에 FITC, DAPI 및 PE-Cy7 신호의 명확한 바이 모달 분포, 우리는 보수적 가능성이 일부 사실 긍정을 제외 있지만 오탐 (false positive)을 최소화하는 데 도움이 긍정적 인 게이트로까지 목표로, 긍정적 인 인구에서 게이트.
  3. 조직 공학을위한 준비에 셀 재 응집
    1. 셀 정렬 후, 10 % 신생아 소 혈청, 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 % 및 0.2 % 암포 테리 신 B ( "NBS 매체")을 함유하는 DMEM 1 ㎖에 수집 튜브 및 재현 탁 모두 펠렛.
    2. 60cm 2 (10cm 접시) 당 2 백만 세포의 밀도로 배양 접시를 처리 한 비율이 아닌 조직 배양에서 세포를 결합 판 : 3 SIRPα + 및 CD90 + 세포 재결합. NBS 미디어와 (10)의 10 ML을 추가1, ROCK 저해제 Y-27632의 리터.
    3. 작은 클러스터로 셀 재 응집을 허용하도록 48 시간 동안 조직 배양 배양기에서 세포 현탁액을 놓는다.

4. 인간의 심장 조직 공학

  1. 멀티 조직의 생물 반응기를 제조
    참고 : 그림 3A의 그림을 보완하기 위해, 상세한 생물 반응기 설계 회로도와 CAD 파일은 저자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
    1. 기계 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (9) X 33 X 3.25 mm의 입방에 0.5 mm 직경의 여섯 일정한 간격으로 구멍을 드릴로 PDMS 마스터 몰드.
    2. 엔드 밀, 기계 25 X 35 X 11mm (3)를 측정 폴리 설폰에서 프레임을 사용. 프레임의 목적은베이스 플레이트의 웰과 정렬 (위 만든 캐스트로 구성) PDMS 게시물을 유지하는 것입니다.
    3. 1 mm 엔드 밀을 사용하여, 기계 6 우물 (6 × 1 × 1mm 3), 블랙 폴리 20 × 40 × 5 내지 3 mm 조각으로 떨어져 4mm테트라 플루오로 에틸렌은베이스 플레이트를 형성한다.
    4. / 비 w 1w 여섯 힘을 감지 게시물의 두 행을 만들기 위해 사용자 정의 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 금형 (단계 4.1.1)에 추가하고, 밤새에서 품어 : (10)의 탄성베이스와 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)에 대한 경화제를 혼합 80 ℃에서 진공. 경화 후, 부드럽게 마스터 금형에서 PDMS를 제거하고주의 깊게 향상된 대비 및 자동화 된 실시간 포스트 편향 추적을위한 검은 영구 마커와 각 게시물의 상단을 표시합니다.
      참고 : 폴리 테트라 플루오로 에틸렌은 매우 부드럽고 쉽게 손상 될 수 있습니다. 시스템 일관성 PDMS 포스트 형상의 수명을 보장하기 위해 캐스팅 PDMS에 마스터 몰드 전에 청소시주의하십시오. 0.5 mm의 와이어를 사용 후 소식 구멍 청소하지만 구멍의 내부를 긁어하지 않도록주의를 기울여야하는데 사용될 수있다.
      주의 : 다른 실온에서 수 시간 동안 진공 하에서 탈기 PDMS 인 후 주위 압력에서 혼합물을 경화하자.이는 경화 공정 동안 PDMS 형성 적은 잔류 기포가 발생할 수있다.
    5. 증기 오토 클레이브의 모든 구성 요소를 소독.
      참고 : PDMS 마스터 몰드 (단계 4.1.1) 및 폴리 설폰 프레임 (단계 4.1.2)를 모두 재사용합니다. 캐스트 (단계 4.1.4)에서 생성 된 PDMS 포스트는 재사용 만 약 10 사용을위한 것입니다. 마스터 몰드를 사용하여 필요에 따라하지만, 더 PDMS 게시물을 작성할 수 있습니다.
  2. Reaggregated 심장 세포를 수집
    1. 인큐베이터에서 reaggregated 세포를 제거하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 재 응집 매체의 10ml를 전송합니다.
    2. PBS의 3 ㎖와 함께 접시를 씻어 재 응집 매체를 포함하는 같은 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 린스를 전송합니다.
    3. 10cm 접시에 0.04 % 트립신 / 0.03 %의 EDTA의 3 ML을 추가하고 5 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.
    4. 5 분 후, 전체 셀 dissocia 있도록 10X 배율로 반전 화합물 현미경 검사 판접시에서 기. 일부 잔여 클러스터가 계속 연결된 경우, 부드럽게 덩어리를 분리 할 수​​있는 판을 선동. 클러스터가 부착 된 상태를 유지하는 경우, 다른 2 ~ 3 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. 이상보다 10 분 발생할 수있는 중요한 세포 사멸을 배양하지 마십시오.
    5. 일단 모든 세포는 트립신 중화 용액 3 ㎖을 추가 분리된다. 조심스럽게 재 응집 매체를 포함하는 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포를 트립신 용액 및 전송로 중화 용액을 혼합하고 PBS로 한번 씻어.
    6. PBS 5 ㎖와 전체 요리를 씻어 세포를 포함하는 동일한 50 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
    7. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 펠렛.
    8. 상층 액을 제거하고 NBS 미디어 1 ㎖의 펠렛을 재현 탁하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다.
    9. 실온에서 5 분 동안 300 XG에 펠릿 상청액을 제거한다. 심장 세포 (CD90 + 기질 세포와 SIRPα +의 myoc, 킬로바이트)는 이제 조직 건설을위한 준비가되어 있습니다.
  3. (선택 사항) 관심 보충 세포를 수집
    참고 : SIRPα 심근 + CD90 +섬유 아세포와 같은 세포를 포함하는 조직의 정의뿐만 아니라, 조직이 기능에 미치는 영향을 심문 밖의 관심 셀을 추가하는 것이 가능하다. 예를 들어 쥐의 중간 엽 줄기 세포는 쥐의 심근 조직 공학 (1)의 기능을 향상시키는 것으로 나타났다. 다음 선택적 단계는 정의 된 시스템에 대한 보충 세포의 컬렉션을 설명합니다.
    1. 관심 기업 셀형 0.25 % 트립신 / EDTA 0.1 %를 사용하여 (예를 들어, 중간 엽 줄기 세포)를 수집한다.
    2. 다음 관심 세포 유형에 적합한 세포 배양 배지 5ml에 재현 탁하고 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 펠렛. 예를 들어, 중간 엽 줄기 세포를 들면, DMEM 20 % 소 태아 혈청, 문화 C에 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 %와 0.2 % 암포 테리 신 B-보충 사용ELL 학생.
    3. , 혈구를 이용하여 세포 수를 수행 한 후 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 다시 세포 펠렛.
    4. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 배양 배지와 전사를 1ml 상등액 재현 탁을 제거한다.
    5. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 펠렛.
    6. 뜨는을 제거합니다. 추가 셀은 조직 건설을위한 준비가되어 있습니다.
      주 : 보조 세포 조직 총 세포 수의 10 %의 농도로 첨가하는 경우, 각 조직 500,000 심장 세포 (CD90 + 간질 세포가 모두 포함 같이 다음 정의 조직에 대해, 이것은 티슈 50,000 보완 세포를 필요 및 SIRPα +의 근육 세포).
  4. 인간 공학 심장 조직 만들기
    참고 : 실온에서 얼음에 모든 솔루션과 세포를 저장합니다. 아래에 나열된 모든 볼륨은 조직 당이다. 일반적으로, 조직은 약 6 개의 구성 될 수있는 6- 웰 PL심장 분화의 ATES.
    1. 1 M NaOH를 1.5 μL, 10 배 PBS의 9.6 μL 멸균 초순수 탈 이온수의 24.9 μL와 ml의 3.125 밀리그램 /에 5 ㎎ / ㎖ 콜라겐 주식의 60.0 μl를 희석.
      중요한 단계 : 기포가 적절한 조직 형성을 방해하므로 준비하는 동안 각 솔루션에 기포의 도입을 피하십시오.
    2. 콜라겐 믹스를 만들기 위해 모두 10 배 MEM의 12.0 μL 및 희석 콜라겐 혼합물에 0.2 N HEPES pH를 9를 추가합니다. 콜라겐 믹스 기포의 유입을 방지하기 위하여 15 mL의 원심 분리 튜브의 측면 아래 두 솔루션을 추가한다.
    3. 콜라겐 혼합 용액을 0.9 밀리그램 / 최종 농도 기저막 매트릭스를 넣고 최종 혼합 조직을 생성하기 위해 얼음에 저장한다. 콜라겐의 최종 농도는 ㎖ / 2 mg을해야한다.
    4. 25 ㎕의 최종 부피 기준으로 티슈 믹스 reaggregated 셀 500,000 추가 (+ 심근 섬유 아세포 농도 20,000,000 / ㎖ 임) 및 채우기무 세포 NBS 매체 또는 관심 (예를 들면, 중배엽 줄기 세포)의 부가 셀 타입 50000 세포와 잘 혼합하거나 함께 조직에도 세포 현탁액을 형성한다.
      참고 : 보충 세포의 수는 다른 응용 프로그램에서 달라질 수 있습니다. 여기에 10 %의 보충이 사용된다.
    5. 우물에 기포를 도입없이 치료, 피펫 생물 반응기에서베이스 플레이트 여섯 각 웰에 세포 현탁액 25 μL와.
    6. 포스트의 한 쌍은 각 웰의 세포 현탁액을 포함하는 입사되도록 대향 소식 6 쌍을 형성하고, 폴리 설폰 프레임의 양측에 PDMS 힘 센서의 두 행 푸시 후베이스 플레이트의 상부에 프레임을 반전한다.
      참고 : 폴리 설폰 프레임이 PDMS의 정렬에 도움이 탭이 포함되어 있습니다.
    7. 조심스럽게 다음 10cm 접시의 안쪽 표지없이 접시를 배치, 60mm 접시에, 아래베이스 플레이트, 생물 반응기를 배치, 상단에 10cm 커버를 배치하고있는 전체 생물 반응기 어셈블리를 이동조직 배양 인큐베이터, 겔 티슈 2 시간 대기.
    8. 2 시간 후, 배양기에서 생물 반응기를 제거한베이스 플레이트를 커버 할 정도로 전체 어셈블리 NBS 매체 14 mL로 추가. 인큐베이터로 돌아 가기, 매일 미디어의 절반을 변경합니다.
    9. 48 시간 후, 신중하게, 부드럽게 한 번에 프레임 떨​​어져 몇 mm를베이스 플레이트의 각면을 이동하여베이스 플레이트를 제거 미디어를 변경 한 다음 조직은 미디어에, 아래로 향하게, 생물 반응기를 반환합니다.
    10. 매일 NBS 문화 미디어의 절반을 변경 계속합니다.
      참고 : 조직의 자발적인 수축이 빠르면 5 일 등 7 측정 가능한 트 힘을 생성, 빠르면 3 일 정도 조직을 건설 한 후 관찰 할 수있다.

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Representative Results

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심장 근육 세포를 얻으려면, Boheler와 리안 분화 방법의 약간 수정 된 버전은 30, 31을 사용합니다. 분화 세포 성장의 로그 단계에서 시작되는지, 또한 출발 인구 (약 75 %가 최적 임) 정렬 후 세포의 가능한 수를 얻기 위해 충분히 융합 인 것이 필수적이다. 일반적 H7 hESCs는 들어 37 ° C로 유지 필수적 8 미디어 및 5 % CO 2 인큐베이터에서 6- 웰 접시의 웰 당 140,000 hESCs는 밀도에서 도금은 도시 된 바와 같이, 분화를 시작 4 일 후에 충분히 융합 배양 수득 그림 1A에서 - D. 인슐린 분화 과정 동안 32 심장 명세서 인슐린 가능한 미디어 (분화 미디어 I, 표 1)을 방해하기 때문에 분화의 처음 10 일 동안 사용된다. 분화 GSK3 억제제 CHIR99021의 애플리케이션을 통해 시작되면중요한 세포 사멸 (그림 1E)을 발생합니다. 결과적으로 매일 미디어를 변경하는 것이 필수적이다. 분화 2 일에, 세포는 CHIR99021에서 제거되고 24 시간 동안 (더 작은 분자를 추가로) 차별화 미디어 I에서 휴식 없습니다. 차별화 미디어에서 24 시간 휴식 후, 세포가에 시작 후 48 시간에 대한 IWR-1으로 처리 분화를 시작으로 초기 일곱 같은 일을 이길 클러스터 (그림 1 층)로 자체 구성 할 수 있습니다. 심장 사양 IWR-1의 도포 후에 발생하기 때문에, 매체는 인슐린 (분화 배지 II 표 1)을 포함하는 매체로 변경된다. 분화 18 일까지, 박동 세포 콜로니 연결된 부분적 접시 (비디오도 1)에 걸쳐 "웨브"구타 견고 형성 세포 표면으로부터 분리.

날 20 일, 박동 단층 부드럽게 VI를 분해한다효소 방법은 정렬 라이브 형광 관련된 셀 (FACS)에 대한 하나의 세포를 얻을 수있다. 상술 미분법을 사용하여, 보수적 SIRPα + 등 인구의 약 65 %와 같은 CD90 + 10 % (도 2)를 수확. 일반적으로 1-2000000 SIRPα + 세포를 6 웰 플레이트 당 얻을 수있다.

SIRPα +의 비율이 1 : 3에서 48 시간 동안 재 응집 한 후에 CD90 + 세포, 세포 집합체 정의는 콜라겐 계 하이드로 겔과 혼합하고, 다중 조직 생물 반응기의 바닥 판에 좁은 웰에 피펫. 일반적으로 접시에서 제거하기 전에, 5-10 세포의 작은 클러스터 접시의 표면에 때리고 알 수있을 것이다. 정의 된 조직을 생물 반응기는 세 가지 구성 요소로 구성 PDMS 게시물을 캐스팅 마스터 금형; 프레임은 게시물의 두 PDMS 랙을 잡아; 블랙과 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의베이스 플레이트 (도 조직 믹스 여섯 웰을 포함우레의 3A). 전체 조직 제작 과정을 얼음에 무균 조건에서 수행된다. 베이스 플레이트의 우물에 액체 셀 매트릭스 혼합물을 추가 한 후, PDMS 포스트는 폴리 설폰 프레임에 부착하고, 게시물베이스 플레이트 (그림 3B)의 우물과 일치하도록 다음 반전. 배양 48 시간 후에, 조직은베이스 플레이트가 제거 될 수 있음을 충분히 압축되어야한다. 베이스 플레이트는 쉽게 미디어에서 전체 시스템을 추출하고 부드럽게 PDMS와베이스 플레이트 사이에서 초과 용지를 제거하여 분리된다. 모든 미디어가 제거되지 않은 경우, 나머지 유체의 표면 장력은 포스트 오프 조직을 당길 수있다. 미디어가 제거되면, 부드럽게베이스 플레이트에서 조직을 느슨하게하기 위해 다시 PDMS 게시물에 대한베이스 플레이트를 밀어 넣습니다. 서서히 부드럽게 밀리미터 후 다른 쪽까지 동일한 양의 한쪽을 이동하여 바닥 판을 밀어. 바 때까지이 과정을 반복모든 6 hECTs는 해당 PDMS 최종 게시물 (그림 4A)에 부착하여 seplate가 제거됩니다. 베이스 플레이트를 제거하면 일분 이상 더 소요됩니다. 모든 조직은 세포 배양 배지에 포함되도록 반전 세포 배양 배지로 대체 시스템.

약 1 일베이스 플레이트를 제거한 후, 약한 국소 수축 밝은 필드 현미경 아래에서 정의 hECTs에서 관찰해야한다. 7 일 후, 조직은 성숙하고있다 정렬 근섬유 분절 (그림 4D)와 압축 (그림 4B-C). 조직은 눈에 띄게 힘의 5 ~ 15 μN (그림 4E)의 평균 PDMS 게시물을 편향. 정의 설계 심장 조직이 고속 카메라 및 사용자 데이터 수집 소프트웨어 포스트 팁 편향 실시간 추적에 의해 측정 될 수 시행 측정 트 및 결정 후에 이론 벤딩 빔 후 변형을 적용데이터 수집 동안 무균 유지보다 상세히 미리. -1,7-에서 설명한 힘 센서를 이용하여 실리콘 포스트 영률은 시간이 지남에 따라 조직 기능의 변화를 측정하는 능력을 보장한다. 다른 곳에서 1보다 상세하게 설명 된 바와 같이 우리는 몇 주 동안 기능 조직을 유지하고있다. 조직은 1 Hz의 2 Hz에서 페이싱 주파수 (그림 4 층)에서 모두 10 % 인간 중간 엽 줄기 세포를 보충 할 때 우리의 예비 결과는 hECT의 수축력의 실질적인 향상을 나타냅니다.

그림 1
그림 1 : 확장과 심장 분화 과정에서 H7 hESCs는 대표 이미지. 팽창 단계 (48 (B), 72, 24 (A)에서 팽창 콜로니의 성장, 사일 C 지속해야 (D). 성장은 96 시간 후에 차별화 CHIR99021 처리 (E)의 처음 48 시간 동안 실질적으로 세포 사멸을 초래하기 시작한다. IWR-1 치료 이틀 후, 재구성 (F)가 제 1 항에있어서, 조직 단일 층을위한 해리되어 견고하게 구타 "웹"하루 20 7 일부터 발생에 이른 날이 이길 세포의 클러스터를 형성하기 위해 발생 조작 된 심장 조직을 만드는.

비디오 그림 1 :. 분화 17 일 후 대표 심장 단층 .이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 단층 내의 자발적인 박동는 일반적으로 첫 번째 7 일 및 10 일 사이에 관찰되고, 분화 17 일까지 단일 층은 상호 연결된 "웹을 형성하고있다 "그 견고하게 이겼다.

이름 구성 차별화 일 사용
차별화 미디어 나 RPMI 1640
B27 보충 (마이너스 인슐린)
페니실린 - 스트렙토 마이신
(CHIR99021 포함) D0-D1
D2
D3-D5 (IWR-1)
D5-D7
차별화 미디어 II RPMI 1640
B27 보충 (인슐린)
페니실린 - 스트렙토 마이신
D7-D20

표 1 : 차별화 매개체의 조성.

그림 2
그림 2 : 대표 라이브 셀 정렬결과를 보내고 개의 샘플을 제조 하였다 :. 흠 제어하여 염색 한 제어 : SIRPα-PE / Cy7 항체 500 희석 1 : CD90-FITC 항체 250 희석. 염색 후, 세포를 PBS 10 % 신생아 혈청, 10 μM의 ROCK 억제제 Y-27632, 및 1 μg의 / ㎖ DAPI 이루어지는 버퍼 정렬 20 psi에서 분류 하였다. 두 세포 집단이 전방 산란 (B, 청색 라인) 모두 (가로 분석 펄스)를 단일 세포 펄스 폭과 높이를 비교하여 선별 하였다 파편 (A, 청색 라인)을 제외 전방 및 측면 스 캐터 프로파일에 게이팅하고 사이드 분산 형 채널 (C, 파란색 선). 인구 (D, 파란색 선) - 다음, 살아있는 세포를 DAPI 게이팅에 의해 선정되었다. 컬렉션에 대한 최종 세포 집단은 라이브 인구의 FITC 및 PE-Cy7 발현 수준을 검사하여 결정 하였다. 흠 제어 (E, 왼쪽)에 사용되었다FITC + (CD90)와 스테인드 샘플에 존재하는 SIRPα-PE / Cy7 + (심근) 인구 (E, 오른쪽)에 대한 선택 적절한 게이트를 설정합니다. FITC와 SIRPα-PE / Cy7 + poplations 별도의 15 mL의 원심 분리 튜브에 수집 하였다.

그림 3
그림 3 :. 1) 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 마스터 금형 9 X 33 X 5mm 3, 6 균등하게 구멍 : 다중 조직을 생물 반응기 및 심장 조직 공학 과정 다중 조직을 생물 반응기의 건설 도식은 세 가지 구성 요소 (A)가 필요합니다 직경 0.5 mm; 2) 25 X 35 X 11mm (3) 폴리 설폰 프레임은 조직 구조와 문화 동안 PDMS 게시물을 개최합니다; 6 × 1 × 1mm 3 차원의 6 우물와 3) 20 × 40 × 5 내지 3 mm 검은 색 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의베이스 플레이트, 스파그 길이를 따라 이격 4mm 세드릭. 인간 공학적 심장 조직 (B)을 생성하기 위해 PDMS 포스트이어서 힘 감지 캔틸레버 소식 6 쌍을 형성하는 폴리 설폰 프레임의 탭에 압착 두있는 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 마스터 몰드를 이용하여 PDMS 소프트 리소그래피에 의해 제조된다. 티슈 용액 블랙 폴리 테트라 플루오르 에틸렌의베이스 플레이트의 웰에 피펫 팅한다. 프레임과 게시물은 반전 및 게시물의 한 쌍은 각각 잘 조직 믹스를 포함하는 입력하도록 폴리 테트라 플루오로 에틸렌베이스 플레이트에 정렬됩니다. 48 시간 후,베이스 플레이트를 제거하고 정의 조직 NBS 매체 반전 남아 소식에 배양한다.

그림 4
그림 4 :. 대표 이미지와 정의 인간 공학 심장 조직의 기능 측정 멀티 조직 bioreact또는 시스템은 병렬 (A, 화살촉)에서 여섯 조직을 보유하고있다. 정의 조직은 자기 조립 조직 생성 후 7 일 이내에 (평면도, B 및 경사 측면보기, C)입니다. (D). 정의 hECT의 부분은 심장 트로포 닌-T (cTnT의)에 대한 스테인드. (E)는 대표적인 트 추적은 전기장 자극에 의해 1 Hz에서 조율하는 동안 시간이 지남에 원시의 힘을 보여줍니다. (F)는 모두 비추 정의 hECTs에 대한 주파수의 변화, (실선)을 표시하는 화살표로, 1 Hz에서 (0-2 초), 2 Hz에서 (2-4 초) 간격으로 자극하는 동안 추적 트 위치 및 조직 10 % 중배엽 줄기 세포 보충 (점선).

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Discussion

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정의 인간 공학 심장 조직 (hECT)의 건축은 인간의 심장 심근 기능의 일관성과 신뢰성있는 모델을 제공 할 수 있습니다. 결정적으로, 시스템의 모든 세포 및 세포 외 성분은 공지되어 있으며, 따라서 분화 과정으로 인한 다른 미지의 세포 유형의 교란의 영향을 제거하고 원하는대로 조작 할 수있다. 빠른 세포 증식과 높은 수율의 균형을 위해서, 이상적으로 분화 사일 도금 후 hESCs는 75 %의 합류점에서 시작하는 것이 바람직하다. 또한, 정렬 후 세포 해리 재 응집 둘 중 ROCK 억제제 Y-27632의 사용은 크게 세포 생존 능력을 향상시킨다. 분화 과정의 자율 박동 근세포의 존재는 분화 효율 보건의 중요한 지표이다. 자연 박동이 관찰되지 않으면이는 효과 시약 또는 손실로 인한를 가난한 분화 효율을 나타낼 수있다줄기 세포의 다 능성의.

조직 건설하는 동안, PDMS 포스트는 수축 기능을 측정하기 위해 오랫동안 지속될 잘 구성된 조직을 만들 수있는베이스 플레이트의 채널을 올바르게 정렬해야합니다. 장치의 정렬의 용이성을 향상시키고 이들이 파괴되기 쉽다 포스트 주위 조직 형성을 강화하기 위해, 입증 된 바와 같이, 채널의 말단에 여분의 폭 (포스트의 각 측면에 약 포스트 직경)을 추가 할 수있다 "개 뼈"에 의해도 3a에 채널을 모양의. 적절한 장치 정렬이 없으면 조직은 곧 문화 후 게시물에서 분리됩니다하거나,베이스 플레이트를 제거 할 때 잘 유지됩니다. 잘 형성된 티슈베이스 플레이트를 제거하는 동안 떨어지면 충분한주의를 기울이지 않으면이 섬세 hECTs 손상이 용이하지만, 부드럽게 해부 현미경 하에서 미세 핀셋을 이용하여 포스트에 조직을 다시 부착 할 수있다. </ P>

설명 된 정의 된 시스템의 주요 장점은 세포 조성물의 특정 제어에 기초하여 심장 세포 치료에 직접 세포 - 세포 상호 작용기구의 기여를 심문하는 능력이다. 동물 세포의 주입은 부정확 낮은 생존 및 보존 (33)의 적용을받습니다. 또한, 대상 조직에 분사 셀의 효과는 이러한 면역 체계와 같은 다른 생리 학적 시스템과의 상호 작용에 의해 복잡하게된다. 이와 같이, 심장 세포 치료에 직접 세포 - 세포 상호 작용의 기여를 이해하는 모델 생물에서 해결하기 위해 도전하고있다. 따라서, 상술 한 방법에 대한 이점은 세포 - 세포 상호 작용이 심장 틈새의 주요 부분을 보존하는 생체 모방 삼차원 환경에서 분석하고, 관심있는 특정 세포 유형의 존재한다는 것이다 - 즉, 심장 근세포 및 섬유 아세포. 정의 hECT 시스템을 사용하는 유틸리티이다 demonstr인간의 골수 (34, 35)에서 파생 된 조직을 만드는 동안 세포 혼합물에 임상 시험에 사용되는 10 %의 중배엽 줄기 세포의 보충과 ated. 중배엽 줄기 세포로 보충 된 이들 조직은 비추 정의 된 인체 조직 (그림 4 층)보다 더 큰 수축력을 나타냈다. 조직 환경과 구성이 제어되어 있기 때문에, MSC 보충과 조직 기능의 향상은 심근 기능에 중배엽 줄기 세포의 고유 한 효과를 반영한​​다. 시스템의 또 다른 장점은 이전에 사용 된 조직은보다 작은 때문에 셀 소스와 같은 다 능성 줄기 세포의 분화를 지시 할 때 사용하는 1,7- 셀 사용은 중요한 고려 효율적이라는 것이다.

세포 치료의 기전을 연구 이외에도 한정된 hECT 시스템은 심장 혈관 세포 - 세포 상호 작용에 기초하여 세포의 시험을 가능하게한다. 조직 CONST 전에 세포 생물학 섭동소란, shRNA를 가진 예를 들면, 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 지배하는 분자 메커니즘의 조사를 허용합니다. 조직 공학 시스템의 또 다른 장점은 기능적 수축 가능한 근원 섬유 배열을 형성하는 것이다. 따라서, 정의 hECT 시스템을 이용하여, 근원 섬유 형성 심근 개발 및 조직 구조의 조직 역학 모든 세포 외 매트릭스 또는 세포의 분자 조작 부품의 변형 예를 통해 조사 할 수있다. hECT 시스템의 인간 및 3-D 특성은 별도로 발견 번역 가능성을 증가시킨다.

서술 된 시스템은 심장 혈관 생물학의 기본적인 질문에 대한 이해를위한 강력한 방법을 제공하지만, 그것은 한계가없는 것은 아니다. 우선, 조작 된 신생아 심근 조직 샘플 7에서 게시 트 포스 데이터와 일치 미성숙 표현형을 나타낸다. 반면표현형 미성숙 세포의 상호 작용 메커니즘을 평가하는 혼란 요인이 될 수있다, 병 심근가 태아 유전자 프로그램 7,36-38로 되돌아 있다는 증거가있다. hECT 시스템에서 결과는 실패 마음의 맥락에서 관련성이 입증되는 경우,이 심장 치료를 테스트하는 것이 유리할 수있다. 프로토콜은 또한 티슈 제조 중 hESC의 정규화 기저막 매트릭스를 사용한다. 이 행렬의 조성물은 로트 (lot)마다 상이 할 수 및 정의 지하 매트릭스 대안 사용할 수 있지만 그들은 hECTs의 맥락에서 평가 아직.

다른 제한은 혈관계의 부족없이 시스템 레벨의 상호 작용의 효과를 포함한다. 조직의 크기를 감안하면, 대사 요구 형 확산에 의해 충족 그래서 혈관계는 세포 생존을 위해 필요하지 않다. 그러나 내피 세포 시그널링은 특정 세포 치료에서 중요한 요인이 될 수있다. 이 경우, 엔도 특정 개수이면상피 세포는 단순히 조직 구조 중에 정의 셀 믹스에 첨가 될 수있다. 시스템 레벨의 상호 작용은 세포 메커니즘을 완전히 이해하는 데 중요하지만, 조직 공학 시스템 체계적기구를 해결하기 위해 문제를 단순화하는 환원 방법을 제공한다. 이러한 또는 분비 신호를 심문 인접 조직 유형을 추가하여 면역 반응을 포함하는 백혈구와 같은 시스템과 관련된 효과를 도입하여 필요에 따라 복잡도 정의 조직 시스템에 첨가 될 수있다.

조사 도구 정의 인간 공학적 심장 조직 시스템이 종 특이 인간 세포의 이점을 구비하고, 제어있는 복합성, 수축 기능을 간단하고 길이 모니터링 생체 모방 3-D 배양 환경, 정의 셀룰러 및 매트릭스 조성물로서. hECT 시스템의 미래 방향이자 지혜의 치료 세포 유형을 조작 포함세포 - 세포 상호 작용의 특정한 세부 분자를 조사하기 위해 조직 H 도입 된 siRNA 또는 shRNA를 사전. 또한 아니라 심장 세포를 형성 hESCs는 사용하는 것보다, 상기 조작 조직에 관련된 심장 질환 증상을 모델링하기위한 노력으로 유전 변이 환자로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 정의 된 세포 집단으로 인간의 설계 심장 조직을 만드는 우리의 방법은 심장 질환 환자에 대한 새로운 치료의 개발을 가속화하기 위해 심장 세포 치료 연구를위한 새로운 길을 열 것을 약속드립니다.

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Acknowledgments

이 작품은 TJC, KDC, 미국 BDG 홍콩 TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499)의 연구 보조금위원회에 NIH / NHLBI PEN 계약 HHSN268201000045C에 NIH (1F30HL118923-01A1)에 의해 지원되었다 추가 자금을 RL하는 NIH DRB 5T32GM008553-18에 의해 시스템 및 발달에 NIDCR - 학제 간 교육에 traineeship로 TJC에 제공 한 심장 협회 (12PRE12060254) RJ, 그리고 홍콩 특별 행정구의 연구 그랜트위원회 (/ 11 T13-706가 TBRS) 생물학, 출생 결함 T32HD075735. 저자는 또한 감사 기술 지원을위한 생물 반응기 및 Mamdouh Eldaly 가공과 지원을 뉴욕의 도시 대학은 Zahn 센터에서 아서 Autz을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 아낌없이 인간 중간 엽 줄기 세포를 제공하기 위해 심장 차별화에 대한 조언 박사 케네스 Boheler, 박사 여호수아 토끼 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

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References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
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정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는
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Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

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