Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Инженерные ткани сердца значительно продвинулся вперед в последнее десятилетие, с несколькими группами , публикующих результаты полностью функциональных, избивая тканей , изготовленных из обеих мышиных кардиомиоцитов 1-6 и, совсем недавно, стволовых клеток , полученных из человеческих кардиомиоцитов 7-12. Тканевой инженерии поле сердца приводится в движение двумя первичными и , по существу независимых целей: 1) разработать экзогенные трансплантаты , которые могут быть пересажены в отсутствии сердца , чтобы улучшить функцию 4-6; и 2) разработать в моделях пробирке для изучения физиологии и болезни, или как инструменты скрининга для терапевтического развития 2,7.

Трехмерная (3-D) для культивирования клеток считается необходимым для разработки скрининговых инструментов нового поколения, так как 3-D матрица отражает более естественный сердечный микросреду, чем традиционная 2-D культуре клеток монослоя; на самом деле некоторые аспекты клеточной биологии существенно отличаются в 2-D по сравнению с 3-D культур 13,14 9 или коллаген 7,8,10) строго контролируется, состав входной ячейки менее выражены, со всей смеси клеток из организма, направленной сердечной дифференциации либо эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или 7,9 индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSC 10,12) добавляется к тканям. В зависимости от конкретной клеточной линии и эффективности протокола дифференцировки , используемой, в результате процент кардиомиоцитов может находиться в диапазоне от менее 25% до более чем 90%, специфический для кардиомиоцитов фенотип (т.е. ventricular-, atrial-, или водитель ритма типа) может также варьироваться, даже не-кардиомиоциты фракция может быть весьма неоднородны 15,16 и изменять зрелость дифференцированного сердца мyocytes 17.

Последние тканевой инженерии работы сердца была предпринята попытка контролировать входную популяцию клеток, либо с сердечным репортер человеческих эмбриональных стволовых клеток линии 8 или маркеров клеточной поверхности 18 используется для изоляции сердца миоцитов компонент дифференциации. Хотя первоначально ткань состоит только из кардиомиоцитов, казалось бы идеальным, это на самом деле не так; hECTs , состоящие только из кардиомиоцитов не уплотнять в функциональные ткани, при этом некоторые группы найти соотношение 3: 1 кардиомиоцитов: фибробласты , продуцирующие самую высокую дергаться силу 8. Используя различные методы отбора клеток, в том числе поверхностных маркеров для сортировки живых клеток, то можно создать hECTs с определенными клеточными популяциями. В то время как маркеры несердечных стромальных клеток были доступны в течение некоторого времени, например, предположительной фибробластами маркера CD90 19,20, поверхностных маркеров кардиомиоцитов было труднееидентифицировать. SIRPα была среди первых сердечных поверхностных маркеров , идентифицированных для кардиомиоцитов человека 18 , и было показано, что высоко селективным для сердечной линии. В последнее время мы обнаружили , что двойные сортировки для SIRPα + и CD90 - клеток дает почти чистый кардиомиоциты, с CD90 + популяции , проявляющего фибробласта-фенотип (Josowitz, неопубликованные наблюдения). На основе этих собранных результатов, в настоящем документе мы описываем создание hECTs с использованием 3: 1 из комбинации SIRPα + / CD90 - кардиомиоциты и CD90 + фибробласты.

Способность спроектировать полностью определенную сердечную ткань человека имеет важное значение не только для создания надежных инструментов скрининга, но и для разработки модельных систем для изучения возникающих сотовом и генные на основе сердечной терапии. В частности, многочисленные методы лечения клеточных по поводу сердечной недостаточности, с использованием типов клеток , включая мезенхимальных стволовых клеток (МСК) 21 22 и костного мозга мононуклеары 23-25 ​​были протестированы в клинических испытаниях. В то время как многие из первоначальных результатов были многообещающими 21,23,25, первоначальная выгода часто уменьшается с течением времени 26-29. Аналогичная тенденция сообщается в мышиных инженерии сердечной ткани, которые показывают значительное функциональное преимущество за счет MSC добавок, но положительный результат не сохраняется при длительной культуре 1. В основе суб-оптимальную производительность наше ограниченное знание механизмов, регулирующих клеточной терапии. Более глубокое понимание того, как терапевтическое клетки оказывают свое благотворное влияние, а также возможные негативные последствия миоцитов-nonmyocyte взаимодействий, будет способствовать разработке усовершенствованных методов лечения, дающую клинически значимые и устойчивые преимущества, с минимальными побочными эффектами, для пациентов с сердечной недостаточностью.

Здесь мы опишем использование определенных hECTs для interrogпоел механизмы клеточной терапии. Композиция с контролируемым ткани имеет важное значение для выявления конкретных факторов, влияющих производительность кардиомиоцитов. Непосредственно дополняя hECTs с терапевтическим типа клеток , представляющих интерес (например, MSCs), может выявить влияние на работу сердца миоцитов, как мы показали в крысиных ЕКТС 1.

Следующий протокол многоэтапным начинается с направленной сердца дифференцировки стволовых клеток, с последующим изготовлением биореакторе с участием многих тканей, и заканчивая описанием конструкции ткани и функционального анализа. Наши эксперименты выполняются с использованием линии NIH утвержденных H7 человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК). Тем не менее, следующие протоколы также были протестированы с использованием дополнительной линии чЭСК и три индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линии с аналогичными результатами. Мы обнаружили, что эффективность кардиомиоцитов дифференциации и успеха в производстве HECT может быть клеточная линия зависит, в частности, FOлинии г hiPSC, полученные из отдельных пациентов. Следуя этому протоколу, два 6-луночных планшетах высевают в общей сложности 1,68 млн ЭСК (140000 клеток на лунку), что дает примерно 2,5 млн миоциты после дифференциации в течение 20 дней и сортировки, достаточно, чтобы сделать шесть определенных тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: Выполните все манипуляции клеток в асептических условиях с использованием шкаф биологической безопасности HEPA-фильтром класса II и стерилизовать все решения путем фильтрации их через фильтр 0,2 мкм. Выполнение строительно-монтажных тканей и тестирование функции в любом тех же асептических условиях или колпаком с ламинарным потоком.

1. Посев H7 ЭСК в рамках подготовки к кардиохирургии дифференциацию

  1. (День 1) Подготовка базальной мембраны Матрица
    1. Разморозить 150 мкл аликвоты чЭСК квалифицированных матрицы базальной мембраны на льду в течение ночи при температуре 4 ° С.
  2. (День 0-4) Покрытие из ЭСК на мелованной Плиты
    1. Развести талой матрицу в 12 мл ледяной DMEM / F12 и хорошо перемешать.
    2. Передача 1 мл раствора / F12-матрицы DMEM в каждую лунку 6-луночного культурального ткани обрабатывают блюдо. Каждый аликвоту матрицы может покрывать две 6-луночные планшеты.
    3. Инкубируйте пластины с нанесенным покрытием при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
      Примечание:наш опыт, блюда, покрытые запечатанные парафином можно хранить в матричном растворе при 4 ° С в течение до 10 дней перед использованием.
    4. Примерно 75% слияния, диссоциировать H7 ЭСК от 10 см чашку с использованием 6 мл реагента неферментативного диссоциации. Через 5 мин, осторожно скрести клетки с поверхности культуры с помощью одноразового использования клеточным скребком и передачи клеточной суспензии в стерильный 15 мл центрифужную пробирку.
    5. Удалить 0,5 мл диссоциации раствора с клетками из 15 мл трубки и передачи в новую стерильную 15 мл пробирку (оставляя 5,5 мл реагента диссоциации для дальнейшего диссоциировать ЭСК) для размножения клеток линии стволовых.
    6. Гранул 0,5 мл клеток при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют в 8 мл плюрипотентных стволовых клеток среды , содержащей 1% пенициллина-стрептомицина , а затем перенести на новую, с покрытием, 10 см блюдо культуры ткани и поддержание 37 ° С и 5% CO 2 для поддержания линии стволовых клеток,
      Примечание: Держите плюрипотентных стволовых клеток СМИ на льду во время смены носителя.
    7. В то же время, добавьте 5,5 мкл 10 мМ ингибитора ROCK Y-27632 к оставшейся 5,5 мл диссоциации раствора и продолжают инкубировать при комнатной температуре в течение еще 5-10 мин. Аккуратно перемешайте клетки с 5 мл серологической пипеткой. Продолжали инкубировать до суспензии отдельных клеток не будет достигнуто, то в пробирке осадка клеток при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Ресуспендируют клеток в 5 мл среды плюрипотентных стволовых клеток и выполнять подсчет клеток с помощью гемоцитометра.
    9. Семенной каждую лунку блюдо 6-луночного при плотности 140000 клеток на лунку. Семенной две 6-луночные планшеты для создания в общей сложности шесть определенных тканей. Утилизацию оставшихся клеток после посева.
    10. Заполните хорошо 1 мл со средствами массовой плюрипотентных стволовых клеток и инкубировать при температуре 37 ° С, 5% СО 2. Двадцать четыре часа спустя, удалите носитель и добавьте 2 мл свежей плюрипотентных стволовых клеток средств массовой информации в каждую лунку (рис 1А
    11. Проверьте слияние пластин каждый день и начать дифференцировку как только клетки достигают примерно 75% слияния (рис 1B - D).

2. (День 4-24) Дифференциация эмбриональных стволовых клеток человека для кардиомиоцитов 30,31

  1. (День 4-7, Дифференциация день 0-3) Мезодерма Индукционная
    1. Подготовка RPMI дифференцировки I (таблица 1) путем объединения по 500 мл среды RPMI 1640 с 10 мл B27 добавки (без инсулина) и 5 мл пенициллина-стрептомицина маточного раствора (10 000 МЕ / мл пенициллина; 10000 мкг / мл стрептомицина). Аликвоты, на льду, в 50 мл пробирки и хранят при температуре 4 ° С.
    2. (4-й день, дифференцировка День 0) Подготовить среду для индукции мезодермы путем добавления 2,4 мкл небольшой ингибитора GSK3 молекулы CHIR99021 (10 мМ маточного, 6 мкМ конечной концентрации), в 12 мл RPMI дифференцировки I. Удалить плюрипотентных стволовых клеток носитель из каждой лункий заменить 2 мл мезодерма индукционной сред на лунку. Возвращение пластины в инкубатор.
      Примечание: Значительная гибель клеток , как правило , происходит при добавлении CHIR99021 (рис 1E). Монослой будет восстанавливаться, но важно, чтобы ополоснуть мертвые клетки прочь с DMEM / F12 полоскании.
    3. (5-й день, дифференцировка день 1) Подготовить свежие мезодерма среду для индукции, как описано выше. Удалите старые средства массовой информации из каждой лунки и промыть один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку. Добавляют 2 мл свежей мезодерма индукции СМИ в каждую лунку.
      Примечание: Промывка каждый день с первого дня 0-10 значительно увеличивает выход и чистоту кардиомиоцитов.
    4. (6-й день, дифференцировка 2-й день) Удалить сердечную среду для индукции и промыть один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку. Заменить полоскание 2 мл RPMI среде для дифференцировки I (не малые молекулы добавляли, но до сих пор с B27 (без инсулина) дополнения) и вернуться в инкубатор.
  2. (День 7-13, Дифференциация Daу 3-10) кардиальной мезодермы Индукционная
    1. (7-й день, 3-й день Дифференцировка) Подготовить кардиальной мезодермы среду для индукции путем добавления 6 мкл небольшой молекулы Wnt ингибитор IWR-1 (10 мМ маточных, 5 мкМ конечная) до 12 мл RPMI дифференцировки I.
    2. Извлеките носитель из каждой лунки, промойте один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку и заменить 2 мл сердечной мезодермы индукции сред на лунку.
    3. (8-й день, дифференцировка 4-й день) Подготовьте дополнительные 12 мл кардиальной мезодермы индукционных средах, как описано выше. Удалить СМИ добавляют за день до, промыть один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку и заменить 2 мл свежей сердечной мезодермы дифференцировки на лунку и вернуться в инкубатор.
    4. (День 9-10 Дифференциация День 5-6) На оба дня, удалите кардиальной мезодермы среду для индукции и промыть каждую лунку с 1 мл DMEM / F12.
    5. Добавляют 2 мл свежей RPMI среде для дифференцировки I (не малые молекулы не добавил, но до сих пор с B27 (без инсулина) дополнения)в каждую лунку и вернуть пластину в инкубаторе.
  3. (День 11-24, Дифференциация день 7-20) ЭСК происхождения Сердечный миоцитов Организация / Созревание
    1. Готовят среду RPMI дифференцировки II (таблица 1) путем объединения по 500 мл среды RPMI 1640 с 10 мл B27 дополнения (с инсулином) и 5 мл пенициллина-стрептомицина маточного раствора. Аликвоты, на льду, в 50 мл пробирки и хранят при температуре 4 ° С.
    2. (День 11, день 7 Дифференциация) Удалить RPMI дифференцировки (без инсулина) из каждой лунки и промыть 1 мл DMEM / F12. Заменить 2 мл новой средой RPMI дифференцировки II (с инсулином) в каждую лунку, и вернуться в инкубатор.
      Примечание: Самопроизвольное Избиение следует сначала наблюдается между дни 7 и 10. Если отбивки не наблюдается в течение этого времени, оно, как правило, указывает на плохую эффективность дифференциации. Протокол может быть продолжено до 15-го дня в попытке наблюдать избиение, но если не бьющееся не наблюдается на 15 день, лучше улискусство новой дифференциации.
    3. (День 12-24, Дифференциация день 8-20) Каждый день, удалить старые дифференцировки и заменить 2 мл свежей RPMI дифференцировки II на лунку , чтобы обеспечить созревание клеток и организацию бьющегося монослоя (рис 1F, видео Рисунок 1 ).
      Примечание: В зависимости от остаточной гибели клеток, это может быть необходимо, чтобы промыть 1 мл DMEM / F12 через дифференциацию 10-й день.

3. (24 день, 20 день Дифференцировка) Выделение кардиомиоцитов и фибробластоподобных клеток

  1. Разбить ячейки из монослоя
    1. Удалить дифференцировки и промыть один раз с 1 мл PBS.
    2. Диссоциировать монослоев с 1 мл ферментативного раствора диссоциации (0,04% трипсина / 0,03% ЭДТА) в каждую лунку.
    3. Перемещение пластины в инкубаторе в течение 10 мин. В то же время, добавить 12 мкл ингибитора ROCK к 6 мл трипсина нейтрализации раствора.
    4. GentlY добавляют 1 мл трипсина нейтрализации раствора, содержащего ингибитор ROCK в каждую лунку пластины для нейтрализации раствора трипсина.
    5. С помощью стерильной пипетки передачи, аккуратно перемешать каждую лунку распадаться кластеров клеток.
    6. Перенос всех 12 мл из 6-луночного планшета в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
      Примечание: Так как две 6-луночные планшеты используются в этом протоколе, будут необходимы две 15 мл пробирки.
    7. Передача 3 мл ФБС в одну лунку планшета, а затем последовательно передавать одни и те же 3 мл на каждой последующей скважины для сбора любых остаточных клеток на блюдо. Перенесите оставшиеся 3 мл из окончательного хорошо в том же 15 мл центрифужную пробирку, содержащую клетки.
    8. Гранула при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  2. Подготовка клетки для живого сортировки клеток FACS
    1. Подготовка буфера для окрашивания путем добавления 5 мл фетальной бычьей сыворотки в 45 мл PBS на льду 50 мкл ингибитора ROCK.
    2. Удалить супернатант из клеток PELпусть (в 3.1.8) и ресуспендируют в 1,2 мл буфера для окрашивания.
    3. Перенести 200 мкл клеточной суспензии на новый, предварительно охлажденный, 50 мл центрифужную пробирку на льду. Это будет отрицательный контроль окрашивания.
    4. Перенесите оставшийся 1 мл суспензии клеток к новой, предварительно охлажденный, 50 мл центрифужную пробирку на льду и добавляют по 2 мкл SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 разведение) и 4 мкл CD90-FITC (1: 250 разведение) , Аккуратно перемешайте клеточную суспензию с пипеткой передачи и вернуться на лед.
    5. Инкубируют как отрицательный контроль и образец, на качалку шейкере, на льду, при температуре 4 ° С в течение 1 часа.
    6. Подготовьте для взятия проб труб путем добавления 3 мл RPMI сред (с инсулином) к двум 15 мл центрифужные пробирки. Добавьте 3 мкл ингибитора ROCK в каждую пробирку и хранить на льду.
    7. Гранул окрашенных клеток при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С и дважды промыть, по меньшей мере 10 мл охлажденного на льду PBS на полоскание.
    8. Добавить 1 мкл DAPI (1 мкг / мл) в 5 мл окрашивающего буфера. нежноресуспендируют образца гранул с 1-3 мл DAPI содержащих окрашивающего буфера с использованием переноса пипеткой.
    9. Добавьте 500 мкл окрашивающего буфера (без добавления DAPI) с отрицательным контролем.
    10. Осторожно фильтровать как отрицательный контроль и образец через 40 мкм клеточный фильтр с, чтобы удалить сгустки клеток и передачи с полистиролом FACS труб на льду. Сразу принести образцы к клеточному сортировщика.
    11. Похожие на установленной живой клетке методы сортировки 18, используйте отрицательный контроль , чтобы установить ворота, выберите для живых клеток (DAPI отрицательный) и собрать как ФИТЦ + (т.е. CD90 + фибробласты) и PE / Cy7 + (т.е. SIRPα + кардиомиоциты ) независимо друг от друга популяций при 20 фунтов на квадратный дюйм (рисунок 2).
      Примечание: После установки ворот, отрицательный контроль может быть зафиксирована в 4% PFA для определения эффективности дифференциации путем окрашивания для сердечного тропонина-Т.
      Примечание: Некоторые исследователи предпочитают использоватьконтроль изотипа, а не неокрашенными управления, чтобы установить ворота, чтобы компенсировать для связывания неспецифического антитела. Контрольную так называемый флуоресценция минус один (FMO) другая возможность. Из-за четкой бимодальным распределением FITC, DAPI и сигналов РЕ-Cy7, мы закрытого типа от положительного населения, консервативно прицеливание далеко в положительные ворота, которые, возможно, исключает некоторые истинные позитивы, но помогает минимизировать любые ложных срабатываний.
  3. Cell реагрегация в рамках подготовки к тканевой инженерии
    1. После того, как клетки сорта, Шарик обе трубки сбора и ресуспендируют в 1 мл среды DMEM, содержащей 10% неонатальной бычья сыворотка, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,2% амфотерицин В ( "НБС медиа").
    2. Рекомбинировать SIRPα + и CD90 + клеток в соотношении 3: 1 и пластинчатые объединенные клетки в культуре ткани , не обрабатывали чашку Петри при плотности 2 миллионов клеток на 60 см 2 (10 см чашку). Добавьте 10 мл NBS средств массовой информации и 101; л ингибитора ROCK Y-27632.
    3. Поместите суспензию клеток в культуре ткани инкубаторе в течение 48 часов, чтобы позволить клеток реагрегация небольшие кластеры.

4. Человеческий Сердечный тканевая инженерия

  1. Изготовить биореакторе Multi-ткани
    Примечание: В дополнение к иллюстрации на рисунке 3A, CAD - файлы с подробными биореакторе проектирования схемы могут быть предоставлены по запросу от авторов.
    1. Обработка PDMS мастер-формы путем бурения шесть равномерно расположенных отверстий диаметром 0,5 мм в 9 х 33 х 3,25 мм параллелепипеда из политетрафторэтилена.
    2. С помощью концевой фрезы, машины кадр из полисульфона измерения 25 х 35 х 11 мм 3. Цель кадра держать посты PDMS (сконструированных из литого сделанного выше) в соответствие с лунках в опорной плите.
    3. С помощью 1-мм концевой фрезы, машинные 6 лунок (6 х 1 х 1 мм 3), 4 мм друг от друга в 20 х 40 х 5 мм 3 кусок черного политетрафторэтилена, чтобы сформировать опорную плиту.
    4. Смешайте эластомерной основы и отвердителя для полидиметилсилоксана (PDMS) в 10: 1 вес / вес отношение и добавить к пользовательской формы политетрафторэтилена (этап 4.1.1), чтобы создать два ряда из шести силовых зондирования постов и инкубировать в течение ночи и под вакууме при 80 ° С. После отверждения, аккуратно удалите PDMS из основной формы и тщательно пометить вершины каждого поста с черным перманентным маркером для повышения контраста и автоматического реального времени отслеживать отклонения пост.
      Примечание: Фторопласт является достаточно мягким и может быть легко повреждены. Будьте осторожны при чистке мастер формы до PDMS литья для обеспечения долговечности системы и последовательного PDMS почтовой геометрии. 0,5 мм провод может быть использован для очистки отверстия для должностей после каждого использования, но будьте осторожны, чтобы не поцарапать внутреннюю поверхность отверстия.
      Примечание: альтернатива дегазировать PDMS в вакууме в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отверждения смеси при атмосферном давлении.Это может привести к уменьшению количества остаточных пузырьков газа, образующихся в PDMS в процессе отверждения.
    5. Стерилизовать всех компонентов в паровой автоклав.
      Примечание: мастер-формы PDMS (этап 4.1.1) и полисульфон кадра (этап 4.1.2) оба многоразового использования. В PDMS сообщения, созданные из литой (этап 4.1.4) также многоразового использования, но только в течение примерно 10 применений. Тем не менее, все больше PDMS должности могут быть созданы по мере необходимости с помощью мастер-формы.
  2. Сбор Reaggregated клеток сердца
    1. Удалите reaggregated клетки из инкубатора и передавать все 10 мл реагрегация сред в центрифужную пробирку на 50 мл.
    2. Промыть пластину с 3 мл PBS и переносят смыв в той же 50 мл центрифужную пробирку, содержащую реагрегация носитель.
    3. Добавьте 3 мл 0,04% трипсина / 0,03% ЭДТА до 10 см чашку и вернуться в инкубаторе в течение 5 мин.
    4. Через 5 минут, проверьте пластину с перевернутой сложного микроскопа при 10-кратным увеличением, чтобы обеспечить полное dissocia клетокния от блюда. Если какие-то остаточные кластеры все еще прикреплены, аккуратно перемешивать тарелку отделяться комки. Если кластеры остаются прикрепленными, вернитесь в инкубаторе в течение еще 2-3 мин. Не инкубировать дольше, чем десять минут или значительную гибель клеток может произойти.
    5. После того, как все клетки отделяют, добавляют 3 мл трипсина нейтрализации раствора. Аккуратно перемешайте нейтрализации раствора с раствором трипсина-клеток и переноса в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую реагрегация носитель и промыть один раз PBS.
    6. Промыть всю тарелку с 5 мл PBS и переносят в той же 50 мл пробирку, содержащую клетки.
    7. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл NBS сред, а затем перенести в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    9. Гранул при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Сердечные клетки (CD90 + клетки стромы и SIRPα + myocytes) теперь готовы к строительству ткани.
  3. (Необязательно) Сбор Справочная интересующих клеток
    Примечание: В дополнение к определенных тканей , содержащих только SIRPα + кардиомиоцитов и CD90 + фибробластоподобные клетки, можно добавить дополнительные ячейки , представляющие интерес для опрашивать их воздействие на функции тканей. Например MSCs крысах было показано, усиливает функцию крыс инженерии сердечной ткани 1. Следующий необязательный этап описывает набор дополнительных ячеек для определенной системы.
    1. Соберите дополнительный тип клеток , представляющих интерес (например, мезенхимальных стволовых клеток) с использованием 0,25% трипсина / 0,1% ЭДТА.
    2. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, затем ресуспендируют в 5 мл соответствующей среды для культивирования клеток для типа клеток, представляющих интерес. Например, для ПКЦ, использовать DMEM, дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,2% амфотерицина-В культуре с-гезов.
    3. Выполнить подсчет клеток с помощью гемоцитометра, затем в пробирке осадка клеток снова при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Удалить супернатант, ресуспендируют в 1 мл среды для культивирования клеток и переноса в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    5. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Удалить супернатант. Добавочные клетки теперь готовы к конструкции ткани.
      Примечание: если Добавочные клетки добавляют в концентрации 10% от общего числа клеток в ткани, то для определенных тканей, это потребует 50000 дополнительных клеток на ткани, а каждая ткань содержит 500000 кардиальные клетки (как клетки CD90 + стромальных и SIRPα + миоциты).
  4. Создание сконструированного сердечной ткани человека
    Примечание: Храните все решения на льду и клетки при комнатной температуре. Все тома, перечисленные ниже, в ткани. Как правило, около шести ткани могут быть построены из двух 6-хорошо мн.ч.Атес сердечных дифференцировок.
    1. Развести 60,0 мкл 5 мг / мл коллагена запаса до 3,125 мг / мл с 1,5 мкл 1 М NaOH, 9,6 мкл 10х PBS и 24,9 мкл стерильной сверхчистой деионизированной воды.
      Критический шаг: Избегайте введения пузырьков воздуха для каждого раствора в процессе приготовления, как пузырьки воздуха будут нарушать формирование правильной ткани.
    2. Добавить 12,0 мкл 10х обоих MEM и 0,2 N HEPES рН 9 к разбавленным коллагеновой смеси для создания коллагена смеси. Добавлять оба раствора вниз по стороне 15 мл центрифужную пробирку с тем, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в коллагеновую смесь.
    3. Добавьте матрицу базальной мембраны до конечной концентрации 0,9 мг / мл до коллагеновой смешивать и хранить на льду, чтобы создать смесь окончательной ткани. Конечная концентрация коллагена должна быть 2 мг / мл.
    4. Добавить 500000 из reaggregated клеток в смесь ткани (миоцитов + концентрация фибробласты составляет 20 млн / мл) и заполнить до конечного объема 25 мкл наткани либо с бесклеточных средах NBS или 50000 клеток дополнительного типа клеток , представляющих интерес (например, hMSCs) и хорошо перемешать , чтобы сформировать даже клеточную суспензию.
      Примечание: Число дополненной клеток будет варьироваться от для различных областей применения. Здесь используется 10% добавок.
    5. С осторожностью, пипетки по 25 мкл суспензии клеток в каждую из шести лунок в биореакторе опорной плите, без введения пузырьков воздуха в скважину.
    6. Нажмите два ряда датчиков ПДМС силы на обе стороны от полисульфона рамы, образуя 6 пар противоположных постов, а затем инвертировать рамку на верхней части опорной плиты так, что одна пара сообщений поступает в каждую лунку, содержащую суспензию клеток.
      Примечание: полисульфон кадр включает вкладки, чтобы помочь в выравнивании PDMS.
    7. Осторожно поместите биореактор, опорную плиту вниз, в 60 мм блюдо, а затем поместить блюдо без его покрытия внутри 10 см блюдо, поместите 10 см крышку на верхней части, и переместить весь узел биореакторев культуральную инкубаторе ткани, ожидая двух часов для ткани в гель.
    8. Через 2 часа, удалить биореактор из инкубатора и добавить 14 мл NBS сред на всей сборки, достаточно, чтобы покрыть опорную плиту. Возвращение в инкубатор, а также изменить половина средств массовой информации каждый день.
    9. Сорок восемь часов спустя, осторожно снимите опорную плиту, осторожно перемещая каждую сторону опорной плиты от рамы на несколько миллиметров, в то время, смены носителя, а затем вернуть биореактор, ткани лицевой стороной вниз, в средствах массовой информации.
    10. Продолжить изменение половину средств массовой культуры NBS каждый день.
      Примечание: Спонтанные сокращени ткани можно наблюдать уже через 3 дня после того, как строительство ткани, создавая измеримые сокращающиеся силы уже в 5-й день до 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Для получения кардиомиоцитов, слегка модифицированной версией методов дифференциации Boheler и Lian используется 30,31. Крайне важно, что дифференциация начинается во время логарифмической фазы роста клеток, но и о том, что начиная население достаточно сливающийся, чтобы получить годную к употреблению количество клеток после сортировки (приблизительно 75% является оптимальным). Как правило, для H7 ЭСК, металлизации при плотности 140000 ЭСК на лунку блюдо 6-луночного незаменимыми 8 средств массовой информации и 5% СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С дает достаточно вырожденные культур после 4 -х дней , чтобы начать дифференцировку, как показано на рисунке на рисунке 1А - D. Так как инсулин подавляет сердечный спецификации в процессе дифференцировки 32, инсулин свободных средств массовой информации (СМИ дифференциации I, таблица 1) используется в течение первых 10 дней дифференциации. После того, как дифференциация инициируется посредством применения ингибитора GSK3 CHIR99021,значительная гибель клеток будет происходить (рис 1E). Как следствие этого необходимо изменить СМИ каждый день. На 2-й день дифференцировки клетки удаляются из CHIR99021 и не упрется в среде для дифференцировки I (без добавления небольших молекул) в течение 24 ч. После 24 ч отдыха в среде для дифференцировки, клетки обрабатывают IWR-1 в течение 48 часов, после чего они начинают самоорганизовываться в кластеры (рис 1F) , которые избили уже через семь дней от начала дифференциации. Так как сердечная спецификация произошло после применения IWR-1, средства массовой информации изменяется на средах , содержащих инсулин (дифференцировки II, таблица 1). К 18 дней дифференциации, колонии бьющихся клеток соединили и частично отрывается от поверхности клетки, образуя робастно избивая "паутину" по всему блюдо (Видео Рисунок 1).

На 20-й день, бьющееся монослой мягко диссоциированных VIа ферментативные методы получения отдельных клеток для живого флуоресцентного связанной сортировки клеток (FACS). С помощью метода дифференцирования , описанного выше, мы консервативно урожай примерно 65% населения , как SIRPα + и 10% как CD90 + (рисунок 2). Как правило , на 1-2 миллиона SIRPα + клетки получают на 6-луночный планшет.

После того, как реагрегация в течение 48 ч в соотношении 3: 1: SIRPα + CD90 + клеток, что определенные клеточные агрегаты смешаны с коллагеновый гидрогель и пипеткой в узких скважинах в плите основания биореактора с участием многих тканей. Как правило, перед удалением из тарелки, небольшие кластеры из 5-10 клеток будет видно бьется на поверхности тарелки. Определенный биореактор ткань состоит из трех компонентов: мастер-формы для отливки сообщения PDMS; рама для хранения двух PDMS стойки постов; и черный политетрафторэтилена опорную плиту , содержащую шесть лунок для смеси ткани (рисЮр 3A). Процесс строительства ткани весь производится на льду и в асептических условиях. После добавления жидкости клетка-матрица смеси в лунки в плите основания, столбы PDMS прикреплены к полисульфона раме, а затем перевернутой таким образом , чтобы сообщения совпадали с скважин в опорной плите (рис 3б). После 48 ч инкубации, ткани должны быть достаточно уплотнен, что опорная плита может быть удалена. Опорная плита наиболее легко отделяется путем извлечения всей системы из средств массовой информации и аккуратно удаляя лишний носитель из между PDMS и опорной плитой. Если все средства массовой информации не удаляется, поверхностное натяжение оставшейся жидкости может тянуть ткани прочь посты. После того, как средства массовой информации удаляется, осторожно надавите на опорную плиту назад против постов PDMS, чтобы помочь ослабить ткань от опорной плиты. Затем постепенно толкать плиту основания прочь, осторожно двигая одну сторону на несколько миллиметров, то другой стороной вверх такое же количество. Повторяйте этот процесс до тех пор, баseplate удаляется, со всеми 6 hECTs прикреплены к соответствующим PDMS конечных постов (рис 4а). Удаление опорной плиты не должна занимать не более одной минуты. Заменить систему в среде для культивирования клеток, перевернутой, так что все ткани покрываются клеточной культуральной среде.

Примерно через один день после удаления опорной плиты, слабые локализованные сокращения должны наблюдаться в определенных hECTs при ярком микроскопии. Через 7 дней ткани созрели и уплотняются (рис 4B-C) с выровненных саркомеров (рис 4D). Ткани заметно отклонять сообщения PDMS в среднем 5-15 мкН силы (рис 4Е). Twitch измерения силы за определенный сконструированные сердечной ткани могут быть измерены в реальном масштабе времени отслеживать отклонения пост наконечника с программным обеспечением сбора данных камеры и пользовательские высокой скорости, и применяя пост прогиб балки теории изгиба после определенияМодуль Юнга постов силикона с помощью датчика силы, как объяснено более подробно ранее. 1,7 для сохранения стерильности во время сбора данных обеспечивает возможность измерения изменений в функции ткани с течением времени. Мы поддерживали функциональные ткани в течение нескольких недель, как описано более подробно в другом месте 1. Наши предварительные результаты указывают на существенное усиление HECT сократительной силы , когда ткани с добавлением 10% мезенхимальных стволовых клеток человека как при 1 Гц и 2 Гц ЭКС частот (рис 4F).

Рисунок 1
Рисунок 1: Типичные изображения H7 ЭСК во время расширения и сердца процесса дифференцировки. Фаза расширения должна продолжаться 4 дня, с ростом колоний расширяясь из 24 (а), до 48 (B), 72 (C (D). Через 96 ч роста дифференцировка начинается, что приводит к существенной клеточной смерти в течение первых 48 ч лечения CHIR99021 (Е). После двух дней IWR-1 лечение, реорганизация происходит (F) с образованием кластеров клеток , которые избили еще в день 7. Дальнейшая организация в робастно избиением "паутина" происходит от 7 -го дня до 20 -й день, когда монослои диссоциированы для создание спроектированных тканей сердца.

Видео Рисунок 1:. Представитель сердца монослой через 17 дней дифференциации . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть это видео Спонтанное бьющееся в пределах монослоя обычно сначала наблюдается между 7 -й день и 10 -й день, а на 17 дней дифференциации монослой сформировал взаимосвязанные "полотна "которые бьют решительно.

имя Состав Дифференциация дней используется
Дифференциация СМИ я среду RPMI 1640
B27 Дополнение (минус инсулин)
Пенициллин-стрептомицина
D0-D1 (с CHIR99021)
D2
Д3-Д5 (с IWR-1)
D5-D7
Дифференциация Медиа II среду RPMI 1640
B27 Дополнение (инсулин)
Пенициллин-стрептомицина
D7-D20

Таблица 1: Состав Дифференциация Medias.

фигура 2
Рисунок 2: Представитель клеток сортировать в прямом эфиреИНГ результаты были получены два образца:. неокрашенной управления и окрашивали контроль с использованием 1: 500 разбавление антитела SIRPα-PE / Cy7 и 1: 250 разведение антитела CD90-FITC. После окрашивания клетки сортировали при 20 фунтов на квадратный дюйм в сортировке буфере, содержащем PBS, 10% неонатальной бычьей сыворотки, ингибитор 10 мкМ ROCK Y-27632, и 1 мкг / мл DAPI. Обе клеточные популяции были закрытого типа в профилях вперед и боковое рассеивание , чтобы исключить мусор (A, синяя линия) , то отдельные клетки были отобраны путем сравнения ширины импульса и высоты (широтно - импульсная анализ) как в прямом , разбросом (B, синяя линия) и боковое рассеивание каналы (C, синяя линия). Затем живые клетки были выбраны стробирования DAPI - население (D, синяя линия). Конечные клеточные популяции для сбора были определены путем анализа уровней экспрессии FITC и PE-Cy7 живого населения. Неокрашенных управления (Е, слева) был использован дляустановить соответствующие ворота , чтобы выбрать для FITC + (CD90) и SIRPα-PE / Cy7 + (кардиомиоцитов) населения , присутствующего в образце , окрашенном (Е, справа). FITC и SIRPα-PE / Cy7 + poplations были собраны в отдельные 15 мл центрифужные пробирки.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Схема биореактора мульти-ткани и тканевой инженерии процесса кардиальной Конструирование биореакторе с участием многих тканей требует трех компонентов (А): 1) политетрафторэтилен мастер - форму 9 х 33 х 5 мм 3 при 6 равномерно расположенных отверстий 0,5 мм в диаметре; 2) 25 х 35 х 11 мм 3 полисульфон рама для хранения сообщения PDMS в процессе строительства и культуры тканей; и 3) 20 х 40 х 5 мм 3 черный политетрафторэтилена Опорная плита с 6 лунок 6 х 1 х 3 мм размеры 1, спаCED 4 мм друг от друга по всей его длине. Для создания спроектированных тканей сердца человека (В), посты PDMS измышлены PDMS мягкой литографии с использованием мастер - формы политетрафторэтилена, два из которых затем прижимают к закладках полисульфона кадра , чтобы сформировать 6 пар силовых зондирования постов кантилевера. Раствор ткани пипеткой в ​​лунки в черной фторопласта плите основания. Рама и посты затем переворачивают и выровнены по фторопласта опорной плите так, что одна пара сообщений поступает в каждую лунку, содержащую смесь ткани. Через 48 ч опорную плиту удаляют и определенные ткани культивируют на стойках, оставаясь инвертируется в NBS средах.

Рисунок 4
Рис . 4: Типичные изображения и функциональные измерения определенных сердечных тканей человека инженерии bioreact Мульти-тканьили система имеет шесть тканей в параллельных (A, наконечниками). Задаваемые ткани самоорганизующихся в течение семи дней после создания ткани (вид сверху, B и косой вид сбоку, C). (D). Порция определенного HECT окрашивали для сердечного тропонина-Т (cTnT). (E) Представитель трассировка подергивание показывает сырую силу с течением времени в течение 1 Гц стимуляции с помощью электрической стимуляции поля. (F) , Твитч трассировки во время стимуляции с частотой 1 Гц (0-2 сек) и 2 Гц (2-4 сек) стимуляцией, со стрелкой маркировки изменения частоты для обоих пищевую добавку четко определенных hECTs (сплошная линия) и тканей с добавлением 10% hMSCs (пунктирная линия).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Строительство определенных инженерных сердечных тканей человека (HECT) может обеспечить более последовательную и надежную модель человеческого сердца функции кардиомиоцитов. Чрезвычайно важно, все клеточные и внеклеточные компоненты системы, как известно, и ими можно манипулировать как желательно, таким образом, удаляя смешанное влияние других неизвестных типов клеток в результате процесса дифференцировки. Для того, чтобы сбалансировать быстрый рост клеток и высокий выход, то предпочтительно, чтобы дифференциация начинается при 75% слияния ЭСК, в идеале через четыре дня после посева. Кроме того, использование ингибитора ROCK Y-27632, как во время диссоциации клеток и реагрегация после сортировки значительно повышает жизнеспособность клеток. Наличие спонтанного избиения миоцитов в процессе дифференцировки является важным показателем эффективности и здоровья дифференциации. Если самопроизвольное биение не наблюдается это может указывать на низкую эффективность дифференциации, либо из-за неэффективных реагентов или потериплюрипотентности стволовых клеток.

Во время строительства тканей, посты PDMS должны выровнять должным образом с каналами в плите основания для создания хорошо сформированных тканей, которые длятся достаточно долго для измерения сократительной функции. Для повышения легкости выравнивания устройства, а также усилить образование ткани вокруг постов, где они лопаются, можно добавить дополнительную ширину (примерно один диаметр пост на каждой стороне поста) к концам каналов, как показано по "собачьей кости" -образные каналов на фигуре 3А. Без надлежащего выравнивания устройства ткань будет либо отделяться от должностей вскоре после того, как культуры, или останется в скважине, когда опорная плита удаляется. Если правильно сформированным ткань спадает при удалении опорной плиты, можно аккуратно прикрепить ткань к стойкам с использованием тонких щипцов под микроскопом рассекает, хотя это легко повредить тонкие hECTs, если достаточная помощь не принято. </ Р>

Одним из основных преимуществ описываемой определенной системы является возможность опрашивать вклад прямых механизмов взаимодействия между клетками в сердечной терапии клеток, основанный на специфических контроля клеточного состава. Инъекции клеток у животных , является неточным и при условии низкой жизнеспособности и удержания 33. Кроме того, эффект инжектированных клеток на ткани-мишени осложняется взаимодействием с другими физиологическими системами, такими как иммунной системы. Таким образом, понимание вклада прямых межклеточных взаимодействий в сердечной терапии клеток является сложной задачей для решения в модельных организмах. Таким образом, преимущество для описанного способа является то, что межклеточные взаимодействия анализируются в Биомиметический трехмерной среды, сохраняя ключевые аспекты сердечной ниши, и в присутствии специфических типов клеток, представляющих интерес, а именно - кардиомиоцитов и фибробластами. Полезность использования определенной системы HECT является demonstrованные с добавками 10% hMSCs , полученных из костного мозга человека 34,35 и используемых в клинических испытаниях клеточной смеси в процессе создания ткани. Эти ткани , которые были дополнены с hMSCs выставлены большую сократительную силу , чем пищевую добавку четко определенных тканей человека (рис 4F). Так как среда ткани и состав контролировался, усиление функции ткани с MSC добавок отражает присущий эффект hMSCs на функции кардиомиоцитов. Другая сила к системе является то , что , так как ткани меньше , чем использовались ранее, 1,7 использование клеток является более эффективным, является важным фактором при использовании направленных дифференциацию плюрипотентных стволовых клеток в качестве источника клеток.

Помимо изучения механизмов клеточной терапии, определенная система HECT позволит изучение клеточной основе сердечно-сосудистых межклеточных взаимодействий. Возмущение биологии клеток до тканей сопзЬгвалт, например, с помощью shRNAs, позволило бы исследование молекулярных механизмов, регулирующих межклеточные и клетка-матрица взаимодействий. Дополнительное преимущество в тканевой инженерии системы является формирование выровненных миофибрилл, способных функциональных сокращений. Таким образом, используя определенную систему HECT, динамика миофибрилл формирования, развития кардиомиоцитов и организации архитектуры ткани могут быть исследованы с помощью модификации компонентов внеклеточного матрикса или молекулярного манипулирования клетками. Человек и 3-D характер системы HECT дополнительно увеличивает переводимость выводов.

Хотя описанная система предлагает мощный метод для понимания основных вопросов сердечно-сосудистой биологии, не без ограничений. Во- первых, сконструированные ткани проявляют незрелый фенотип, в соответствии с опубликованными подергивание силовых данных от новорожденных миокарда образцов 7. В то время какфенотипическая незрелость может быть обескураживающий фактор в оценке механизмов взаимодействия клеток, существуют доказательства того, что больные кардиомиоциты вернуться к эмбриональной программе гена 7,36-38. Если выводы из системы HECT оказаться актуальными в контексте сердечной недостаточности, это может быть полезно для тестирования сердечной терапии. Протокол также использует квалифицированное базальной мембраны матрицу чЭСК в процессе строительства ткани. Состав этой матрицы может варьироваться от партии к партии, и в то время как определенная матрица альтернативы подвальных доступны они еще должны быть оценены в контексте hECTs.

Другие ограничения включают в себя отсутствие сосудистой системы и никаких эффектов взаимодействия систем на уровне. Учитывая размеры тканей, метаболические потребности удовлетворяются за счет диффузии в одиночку, так нет сосудистой системы не требуется, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток. Тем не менее, передача сигналов эндотелиальных клеток может быть важным фактором в специфической терапии клеток. Если это так, то определенное количество эндо-thelial клетки могут быть просто добавлены к определенной смеси клеток в процессе строительства ткани. В то время как взаимодействия систем на уровне имеют важное значение для полного понимания механизмов клеточных, инженерией система ткани предлагает редукционистский подход для упрощения задачи с целью решения механизма на систематической основе. Сложность может быть добавлена ​​к определенной системе ткани по мере необходимости за счет внедрения систем, связанных с эффектами, такими как лейкоциты инкорпорировать иммунный ответ, или путем добавления соседние типы тканей допросить паракринной сигнализации.

В качестве инструмента расследования, заданная система человеческой инженерии сердечной ткани предлагает преимущества конкретных видов клеток человека, Биомиметический 3-D культуральной среде с контролируемой biocomplexity, доходчивым и продольного мониторинга сократительной функции и определенной сотовой и матричной композиции. Будущие направления системы HECT включают манипуляции терапевтического типа клеток, представляющих интерес именноч миРНК или shRNA до введения в ткани для того, чтобы исследовать специфические молекулярные детали взаимодействия клетка-клетка. Кроме того, вместо того чтобы использовать ЭСК для формирования сердечных клеток, можно использовать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) от пациентов с наследственной мутацией в попытке модели, связанной с проявлениями сердечно-сосудистые заболевания в сконструированных тканях. Таким образом, наш метод создания тканей сердца человека инженерии с определенными клеточными популяциями обещает открыть новые возможности для изучения сердечной терапии клеток, чтобы помочь ускорить разработку новых методов лечения для пациентов с заболеваниями сердца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH (1F30HL118923-01A1) к ТСК, NIH / NHLBI PEN контракта HHSN268201000045C к KDC, исследование гранта совета Гонконга ТРС T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01) HL113499 к БДГ, американец Ассоциация сердца (12PRE12060254) к RJ, и научно-исследовательский совет Грант ОАРГ (TBRS, T13-706 / 11) RL Дополнительное финансирование было предоставлено ТСК по NIH DRB 5T32GM008553-18 и как стажировке на NIDCR-междисциплинарной подготовки кадров в области систем и связанных с развитием Биология и врожденным дефектам T32HD075735. Авторы также хотели бы с благодарностью признать Артура Autz в The Zahn центре города Колледж Нью-Йорка за помощь с обработкой биореактор и Mamdouh Eldaly об оказании технической помощи. Мы также благодарим доктора Кеннета Boheler за советом по сердечной дифференциации и доктор Джошуа Зайца за щедрое предоставление мезенхимальных стволовых клеток человека.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28, (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6, (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35, (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7, (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42, (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2, (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364, (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152, (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126, (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30, (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113, (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32, (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114, (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161, (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108, (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104, (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12, (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter