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Bioengineering

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

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Ingeniería de tejido cardiaco ha avanzado considerablemente en la última década, con múltiples grupos editoriales resultados de tejidos totalmente funcionales, superando confeccionada con cardiomiocitos murinos 1-6 y, más recientemente, los miocitos cardíacos derivados de células madre humanas 7-12. El campo de la ingeniería de tejido cardiaco se debe a dos objetivos primarios y esencialmente independientes entre sí: 1) para desarrollar injertos exógenos que pueden trasplantarse en su defecto corazones para mejorar la función 4-6; y 2) el desarrollo de modelos in vitro para el estudio de la fisiología y la enfermedad, o como instrumentos de evaluación para el desarrollo terapéutico 2,7.

Tridimensional (3-D) de cultivo celular se considera esencial para el desarrollo de herramientas de detección de próxima generación, como la matriz 3-D refleja un microambiente cardiaca más natural que la cultura tradicional monocapa de células 2-D; de hecho, algunos aspectos de la biología celular son fundamentalmente diferentes en 2-D culturas vs. 3-D 13,14 9 7,8,10) está estrictamente controlada, la composición celda de entrada no está bien definido, con toda la mezcla de células a partir de una diferenciación cardiaca dirigido de cualquiera células madre embrionarias (ESC 7,9) o células madre pluripotentes inducidas (IPSC 10,12) que se añaden a los tejidos. Dependiendo de la línea celular específica y la eficiencia del protocolo de diferenciación se utiliza, el porcentaje resultante de los cardiomiocitos puede variar desde menos de 25% a más del 90%, el fenotipo de cardiomiocitos específico (es decir, ventricular-, atrial-, o similar al marcapasos) también puede variar, aunque la fracción no cardiomiocitos puede ser muy heterogéneo 15,16 y alterar la madurez de la m cardiaca diferenciadayocytes 17.

Recientes trabajos de ingeniería de tejido cardiaco ha intentado controlar la población de entrada de las células, ya sea con una superficie de la línea de células madre embrionarias humanas reportero cardiaca 8 o 18 células marcadores se utiliza para aislar el componente de los cardiomiocitos de la diferenciación. Aunque en un principio un tejido compuesto de sólo miocitos cardíacos parece ser el ideal, esto es, de hecho, no es el caso; hECTs compuestas únicamente de los miocitos cardíacos no pueden compactar en tejidos funcionales, con algunos grupos encontrar una relación 3: 1 de los miocitos cardíacos: fibroblastos producir la más alta fuerza de contracción 8. Mediante el uso de diferentes métodos de selección de células, incluyendo marcadores de la superficie para la clasificación de células en vivo, es posible crear hECTs con poblaciones de células definidas. Mientras que los marcadores de las células del estroma no cardíacas han estado disponibles durante algún tiempo, tal como el marcador de fibroblastos putativo CD90 19,20, marcadores de superficie de los miocitos cardíacos han sido más difícilesidentificar. SIRPα estaba entre los primeros marcadores de superficie cardíacos identificados para los miocitos cardiacos humanos 18 y se ha demostrado ser altamente selectivo para el linaje cardiaco. Recientemente, hemos encontrado que la doble clasificación para SIRPα + y CD90 - células rendimientos cardiomiocitos casi puros, con el CD90 + de la población que presenta un fenotipo similar a fibroblastos (Josowitz, observaciones no publicadas). Sobre la base de estos hallazgos recogidos, Aquí se describe la creación de hECTs utilizando una mezcla 3: 1 de combinación SIRPα + / CD90 - cardiomiocitos y fibroblastos CD90 +.

La capacidad de diseñar un tejido cardiaco humano completamente definido es esencial no sólo para la creación de herramientas de detección sólidas, sino también para el desarrollo de sistemas modelo para investigar por células emergentes y las terapias basadas en genes cardiacos. En particular, numerosas terapias con células para la insuficiencia cardíaca, utilizando tipos de células incluyendo las células madre mesenquimales (MSC) 21 22 y las células mononucleares de médula ósea 23-25, se han probado en ensayos clínicos. Mientras que muchos de los resultados iniciales han sido prometedores 21,23,25, el beneficio inicial con frecuencia disminuye con el tiempo 26-29. Una tendencia similar se ha reportado en los tejidos cardiacos murinos ingeniería, que muestran un beneficio funcional significativa debido a la suplementación MSC, pero el beneficio no se mantiene durante el cultivo a largo plazo 1. Subyace el rendimiento subóptimo es nuestro conocimiento limitado de los mecanismos que regulan las terapias celulares. Una comprensión más profunda de cómo las células terapéutica ejercer su influencia beneficiosa, así como las posibles consecuencias negativas de las interacciones de los miocitos-nonmyocyte, permitiría el desarrollo de mejores terapias produciendo beneficios clínicamente significativos y sostenidos, con efectos secundarios mínimos, para los pacientes con insuficiencia cardíaca.

A continuación, describimos el uso de hECTs definidos para interrogcomió mecanismos de terapia basada en células. La composición del tejido controlada es esencial para identificar los factores específicos que afectan el rendimiento de los cardiomiocitos. Directamente complementar hECTs con el tipo de célula terapéutico de interés (por ejemplo, MSC), puede revelar los efectos sobre el rendimiento de miocitos cardiacos, como hemos demostrado en el ECTS rata 1.

El siguiente protocolo multi-paso comienza con la diferenciación de células madre cardiaca dirigida, seguido por la fabricación del biorreactor multi-tejido, y concluyendo con una descripción de la construcción de tejidos y análisis funcional. Nuestros experimentos se realizaron con la línea de células madre de embriones humanos aprobados por el NIH H7 (células madre). Sin embargo, los siguientes protocolos también se han probado utilizando una línea de células madre adicionales y tres líneas de célula madre pluripotente inducida (hiPSC) con resultados similares. Hemos encontrado que la eficiencia en la diferenciación de los cardiomiocitos y el éxito en Hect fabricación puede ser línea celular dependiente, particularmente folíneas r hiPSC derivadas de pacientes individuales. Siguiendo este protocolo, dos placas de 6 pocillos se sembraron con un total de 1,68 millones de hESCs (140.000 células por pocillo), que produce aproximadamente 2,5 millones de miocitos después de la diferenciación durante 20 días y clasificación, lo suficiente como para hacer seis tejidos definidos.

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Protocol

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Nota: Realice todas las manipulaciones celulares en condiciones asépticas utilizando una cabina de seguridad biológica con filtro HEPA de clase II y esterilizar todas las soluciones filtrando a través de un filtro de 0,2 micras. Realizar creación de tejidos y pruebas de función, ya sea en las mismas condiciones asépticas o una campana de flujo laminar.

1. Siembra de hESCs H7 en preparación para la diferenciación cardiaca

  1. (Día 1) Preparación de la membrana basal para la matriz
    1. Descongelar 150 l alícuota de la matriz de la membrana basal cualificado células madre en el hielo durante la noche a 4 ° C.
  2. (Día 0-4) Revestimiento de hESCs sobre placas recubiertas
    1. Diluir la matriz descongelado en 12 ml de helado de DMEM / F12 y mezclar bien.
    2. Transferir 1 ml de la solución / F12-matriz de DMEM en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos tratada. Cada alícuota de la matriz de la capa es posible que dos placas de 6 pocillos.
    3. Se incuban las placas recubiertas a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
      Nota: Ennuestra experiencia, placas revestidas sellados con parafina se puede almacenar en solución de matriz a 4 ° C durante un máximo de 10 días antes de su uso.
    4. En aproximadamente 75% de confluencia, disociar el H7 hESCs de la placa de 10 cm usando 6 ml del reactivo de disociación no enzimática. Después de 5 min, raspar suavemente las células de la superficie de cultivo usando un rascador de células desechable y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril.
    5. Retirar 0,5 ml de la solución de disociación con las células desde el tubo de 15 ml y la transferencia a un nuevo tubo estéril ml 15 (dejando 5,5 ml del reactivo de disociación de disociar aún más la hESCs) para la propagación de la línea de células madre.
    6. Se precipitan los 0,5 ml de células a 300 xg durante 5 min a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente en 8 ml de medio de células madre pluripotentes que contiene penicilina-estreptomicina al 1% y luego transferir a una nueva, recubiertas, 10 cm placa de cultivo tisular y mantener 37 ° C y 5% de CO 2 para mantener la línea de células madre.
      Nota: Mantenga los medios de células madre pluripotentes en hielo durante los cambios de los medios de comunicación.
    7. Mientras tanto, añadir 5,5 l de 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 de la solución restante 5,5 ml de la disociación y continuar incubar a temperatura ambiente durante otros 5 a 10 min. Mezclar suavemente las células con una pipeta serológica de 5 ml. Continuar incubar hasta que se consigue una suspensión de células, entonces sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    8. Resuspender las células en 5 ml de medio de células madre pluripotentes y realizar un recuento de células usando un hemocitómetro.
    9. Seed cada pocillo de la placa de 6 pocillos a una densidad de 140.000 células por pocillo. Seed dos placas de 6 pocillos para crear un total de seis tejidos definidos. Disponer de cualquier resto de las células después de la siembra.
    10. Llenar los bien a 1 ml con medios de células madre pluripotentes y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Veinticuatro horas más tarde, saque la tarjeta y añadir 2 ml de medio de células madre pluripotentes fresca a cada pocillo (Figura 1A
    11. Compruebe la confluencia de las placas de cada día y comenzar la diferenciación una vez que las células alcanzan aproximadamente el 75% de confluencia (Figura 1B - D).

2. (día 4-24) diferenciación de células madre embrionarias humanas a cardiomiocitos 30,31

  1. (Día 4-7, 0-3 Diferenciación Día) mesodermo Inducción
    1. Preparar RPMI medio de diferenciación I (Tabla 1) mediante la combinación de 500 ml RPMI 1640 con 10 ml de suplemento B27 (sin insulina) y 5 ml de la solución madre de penicilina-estreptomicina (10.000 IU / ml de penicilina; 10.000 g / ml de estreptomicina). Alícuota, en el hielo, en tubos de 50 ml y se almacena a 4 ° C.
    2. (Día 4, Diferenciación Día 0) Preparar los medios de inducción del mesodermo mediante la adición de 2,4 l de la CHIR99021 pequeña molécula inhibidora de GSK3 (madre 10 mM, 6 mM de concentración final) a 12 ml de medio RPMI diferenciación I. Quitar medio de células madre pluripotentes de cada pocillo unnd sustituir con 2 ml de los medios de inducción del mesodermo por pocillo. Devolver la placa a la incubadora.
      Nota: la muerte celular significativa se produce normalmente con la adición de CHIR99021 (Figura 1E). La monocapa se recuperará, pero es importante para enjuagar las células muertas de la distancia con el enjuague DMEM / F12.
    3. (Día 5, diferenciación Día 1) preparar los medios de inducción del mesodermo fresco como se describe anteriormente. Eliminar los viejos medios de cada pocillo y se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo. Añadir 2 ml de medio de inducción mesodermo fresco a cada pocillo.
      Nota: Enjuague de cada día desde el día 0 hasta 10 aumenta en gran medida el rendimiento y la pureza de los miocitos cardíacos.
    4. (Día 6, Diferenciación Día 2) Eliminar los medios de inducción cardíacos y enjuagar una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo. Vuelva a colocar el enjuague con 2 ml de RPMI medio de diferenciación I (no hay moléculas pequeñas añadido, pero aún con la B27 (sin insulina suplemento)) y volver a la incubadora.
  2. (Día 7-13, Diferenciación Day 3-10) mesodermo cardíaco Inducción
    1. (Día 7, Día Diferenciación 3) Preparar los medios de inducción del mesodermo cardíaco mediante la adición de 6 l de la pequeña molécula inhibidor de Wnt-1 IWR (madre 10 mM, 5 mM final) a 12 ml de RPMI medio de diferenciación I.
    2. Retire el medio de cada pocillo, se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo y reemplazar con 2 ml de medio de inducción del mesodermo cardíaco por pocillo.
    3. (Día 8 de Diferenciación día 4) Preparar un adicional de 12 ml de medio de inducción del mesodermo cardíaco como se ha descrito anteriormente. Eliminar los medios de comunicación añadió el día anterior, se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo y se reemplaza con 2 ml de medio de diferenciación del mesodermo cardíaco fresco por pocillo y volver a la incubadora.
    4. (Día 9-10, Diferenciación Día 5-6) En ambos días, retire los medios de inducción del mesodermo cardíaco y enjuagar cada pocillo con 1 ml de DMEM / F12.
    5. Añadir 2 ml de RPMI fresco medio de diferenciación I (no hay moléculas pequeñas añadieron pero aún con la B27 (sin insulina) suplemento)a cada pocillo y la placa de volver a la incubadora.
  3. (Día 11-24, Diferenciación Día 7-20) derivado de HES cardiaca Organización de los miocitos / Maduración
    1. Preparar el RPMI medio de diferenciación II (Tabla 1) mediante la combinación de 500 ml RPMI 1640 con 10 ml de suplemento B27 (con insulina) y 5 ml de la solución madre de penicilina-estreptomicina. Alícuota, en el hielo, en tubos de 50 ml y se almacena a 4 ° C.
    2. (Día 11, Día Diferenciación 7) Retire medio de diferenciación RPMI (sin insulina) de cada pocillo y enjuague con 1 ml de DMEM / F12. Reemplazar con 2 ml de los nuevos medios de diferenciación RPMI II (con insulina) a cada pocillo y volver a la incubadora.
      Nota: latido espontáneo primero debe observarse entre los días 7 y 10. Si golpeo no se observa durante este tiempo, por lo general indica una pobre eficiencia de diferenciación. El protocolo puede ser continuado hasta el día 15 en un esfuerzo por observar que late, pero si hay golpeo se observó el día 15 lo mejor es steres una nueva diferenciación.
    3. (Día 12-24, Diferenciación Día 8-20) Todos los días, quitar los viejos medios de diferenciación y reemplazar con 2 ml de RPMI medio de diferenciación II por pozo para permitir la maduración de las células y la organización de la monocapa de golpeo (Figura 1F, Video Figura 1 ).
      Nota: Dependiendo de la muerte celular residual, puede ser necesario enjuagar con 1 ml de DMEM / F12 hasta el día 10 de diferenciación.

3. (Día 24, Día Diferenciación 20) El aislamiento de miocitos cardíacos y células similares a fibroblastos

  1. Disociar celdas de la monocapa
    1. Retire el medio de diferenciación y se lava una vez con 1 ml de PBS.
    2. Disociar las monocapas con 1 ml de la solución de disociación enzimática (0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA) a cada pocillo.
    3. Mueva la placa en la incubadora durante 10 minutos. Mientras tanto, añadir 12 l de inhibidor de Rock a 6 ml de solución de tripsina neutralización.
    4. GenTLY Agregar 1 ml de la solución de tripsina de neutralización que contiene el inhibidor de la roca para cada pocillo de la placa para neutralizar la solución de tripsina.
    5. Con una pipeta de transferencia estéril, mezclar suavemente cada pocillo para separar los grupos de células.
    6. Transferir los 12 ml de la placa de 6 pocillos a un tubo de centrífuga de 15 ml.
      Nota: Puesto que dos placas de 6 pocillos se utilizan en este protocolo, se necesitarán dos tubos de 15 ml.
    7. Transferencia de 3 ml de PBS a un pocillo de la placa, y luego transferir secuencialmente los mismos 3 ml a cada pocillo subsiguiente para recoger las células residuales en el plato. La transferencia de los restantes 3 ml de la final bien en el mismo tubo de centrífuga de 15 ml que contiene las células.
    8. Pellet a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
  2. Preparar las células para la clasificación de células en vivo por FACS
    1. Preparar el tampón de tinción mediante la adición de 5 ml de suero bovino fetal a 45 ml de PBS en hielo con 50 l de inhibidor de la roca.
    2. Eliminar el sobrenadante de la pel celulardejar que (en 3.1.8) y se vuelve a suspender en 1,2 ml de tampón de tinción.
    3. Transferir 200 l de la suspensión celular a un nuevo, pre-refrigerado, 50 ml tubo de centrífuga en hielo. Este será el control de la tinción negativa.
    4. Transferir el restante 1 ml de suspensión celular a un nuevo, pre-refrigerado, 50 ml tubo de centrífuga en hielo y añadir 2 l SIRPα-PE / Cy7 (dilución 1: 500) y 4 l de CD90-FITC (dilución 1: 250) . Mezclar suavemente la suspensión de células con una pipeta de transferencia y volver al hielo.
    5. Incubar tanto el control negativo y la muestra, en un agitador de eje de balancín, en hielo, a 4 ° C durante 1 hr.
    6. Preparar tubos de recogida de muestras mediante la adición de 3 ml de medio RPMI (con insulina) a dos tubos de centrífuga de 15 ml. Añadir 3 l de inhibidor de roca para cada tubo y almacenar en hielo.
    7. Sedimentar las células teñidas a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y enjuagar dos veces con al menos 10 ml de PBS enfriado con hielo por enjuague.
    8. Añadir 1 l de DAPI (1 mg / ml) a 5 ml de tampón de tinción. Suavementeresuspender el precipitado muestra con 1-3 ml del tampón de tinción que contiene DAPI-utilizando una pipeta de transferencia.
    9. Añadir 500 l de tampón de tinción (sin DAPI añadido) con el control negativo.
    10. filtrado suavemente tanto el control negativo y la muestra a través de un filtro de 40 micras de células para eliminar grupos de células y transferir al poliestireno tubos FACS en hielo. Inmediatamente traer muestras a la clasificación de células.
    11. Similares a células vivas establecido métodos de clasificación 18, use el control negativo para ajustar las puertas, seleccionar las células vivas (DAPI negativo) y recogen tanto el FITC + (es decir, CD90 + fibroblastos) y PE Cy7 + (es decir, SIRPα + cardiomiocitos / ) las poblaciones de forma independiente a 20 psi (Figura 2).
      Nota: Después de ajustar las puertas, el control negativo puede ser fijado en el 4% PFA para determinar la eficiencia de la diferenciación mediante la tinción de troponina T cardiaca.
      Nota: Algunos investigadores prefieren utilizar unacontrol de isotipo en lugar del control sin teñir para ajustar las puertas a fin de compensar por la unión de anticuerpo no específica. Un control de llamada de fluorescencia menos uno (FMO) es otra posibilidad. Debido a la clara distribución bimodal de las señales de PE-Cy7 FITC, y DAPI, que GaTeD de la población positiva, de manera conservadora que apunta lejos en la puerta positiva, lo que posiblemente excluye algunos verdaderos positivos, pero ayuda a minimizar los falsos positivos.
  3. Reagrupamiento de células en preparación para la Ingeniería de Tejidos
    1. Después de que el tipo de células, Pellet ambos tubos de recogida y volver a suspender en 1 ml de DMEM que contiene 10% de suero bovino neonatal, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,2% de anfotericina B ( "medios NBS").
    2. Recombinar la SIRPα + y células CD90 + en una proporción de 3: 1 y la placa de las células combinadas en una cultura no tejido tratado placa de Petri a una densidad de 2 millones de células por 60 cm 2 (10 cm plato). Añadir 10 ml de medios del NBS y 101; l de inhibidor ROCA Y-27632.
    3. Coloque suspensión de células en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas para permitir la reagregación de células en pequeños clusters.

4. Ingeniería de Tejidos Humanos cardiaca

  1. Fabricar el biorreactor Multi-tejido
    Nota: Para complementar las ilustraciones de la figura 3A, archivos CAD con esquemas de diseño de biorreactores detallada están disponibles bajo petición de los autores.
    1. Máquina del molde maestro PDMS mediante la perforación de seis agujeros uniformemente espaciados de 0,5 mm de diámetro en un 9 x 33 x 3,25 mm paralelepípedo de politetrafluoroetileno.
    2. El uso de una fresa radial, máquina de un fotograma de polisulfona de 25 x 35 x 11 mm 3. El propósito de la trama es mantener los puestos de PDMS (construidas a partir del fundido hecho anteriormente) en alineación con los pozos de la placa de base.
    3. El uso de un 1 mm de fresa radial, máquina de 6 pocillos (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm de separación, en un 20 x 40 x 5 mm 3 pieza de poli negrotetrafluoroetileno para formar la placa de base.
    4. Mezclar la base elastomérica y agente de curado para el polidimetilsiloxano (PDMS) en un 10: 1 w / w proporción y añadir al molde politetrafluoroetileno personalizado (etapa 4.1.1) para crear dos filas de seis puestos de detección de fuerza, y se incuba durante la noche y bajo vacío a 80 ° C. Después del curado, retire con cuidado el PDMS del molde principal y marque cuidadosamente la parte superior de cada poste con un marcador permanente negro para mejorar el contraste y automatizado de seguimiento posterior de desviación en tiempo real.
      Nota: politetrafluoretileno es bastante suave y se puede dañar fácilmente. Tenga cuidado al limpiar el molde maestro antes de PDMS fundición para garantizar la longevidad del sistema y la geometría palo PDMS consistente. Un alambre de 0,5 mm se puede usar para limpiar los orificios de los mensajes después de cada uso, pero tenga cuidado de no raspar el interior de los agujeros.
      Nota: Una alternativa es para desgasificar los PDMS bajo vacío durante varias horas a temperatura ambiente, a continuación, dejar que la cura mezcla a presión ambiente.Esto puede dar lugar a un menor número de burbujas de gas residual que se forman en el PDMS durante el proceso de curado.
    5. Esterilizar todos los componentes en un autoclave de vapor.
      Nota: El molde de PDMS maestra (paso 4.1.1) y el marco de polisulfona (paso 4.1.2) son tanto reutilizable. Los mensajes creados a partir de PDMS del molde (paso 4.1.4) también es reutilizable pero sólo durante unos 10 usos. Sin embargo, más puestos de PDMS se pueden crear como sea necesario con el molde maestro.
  2. Recoger las células cardiacas reagregadas
    1. Eliminar las células reagregadas de la incubadora y transferir los 10 ml de los medios de comunicación reagregación a un tubo de centrífuga de 50 ml.
    2. Aclarar la placa con 3 ml de PBS y transferir el enjuague a la misma 50 ml tubo de centrífuga que contiene los medios de comunicación reagregación.
    3. Añadir 3 ml de 0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA a la placa de 10 cm y volver a la incubadora durante 5 min.
    4. Después de 5 minutos, examinar la placa con un microscopio compuesto invertida en un aumento de 10X para asegurar dissocia celular completala de la placa. Si algunos grupos residuales todavía están unidos, agitar suavemente la placa para separar los grumos. Si los grupos permanecen unidos, volver a la incubadora durante otros 2-3 minutos. No incubar más de diez minutos o muerte celular significativa puede ocurrir.
    5. Una vez se separan todas las células, añadir 3 ml de solución de tripsina de neutralización. Mezclar suavemente la solución de neutralización con la solución de células con tripsina y traslado al tubo de centrífuga de 50 ml que contiene los medios de reagrupamiento y se lava una vez con PBS.
    6. Enjuague el plato entero con 5 ml de PBS y transferir al mismo tubo 50 ml que contiene las células.
    7. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    8. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de NBS, a continuación, transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    9. Se precipitan a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Las células cardíacas (células CD90 + estroma y SIRPα + MYOCytes) ahora están listos para la construcción de tejido.
  3. (Opcional) recoger células Suplementarios de interés
    Nota: Además de los tejidos definidos que contienen sólo SIRPα + cardiomiocitos y células similares a fibroblastos CD90 +, es posible añadir las células de interés adicionales para interrogar a su efecto sobre la función del tejido. Por ejemplo MSC de rata se ha demostrado para mejorar la función de los tejidos cardiacos de rata ingeniería 1. El siguiente paso opcional describe la colección de células suplementarios para el sistema definido.
    1. Recoger el tipo de célula suplementaria de interés (por ejemplo, células madre mesenquimales) usando 0,25% de tripsina / 0,1% de EDTA.
    2. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y después volver a suspender en 5 ml de medio de cultivo celular adecuado para el tipo de célula de interés. Por ejemplo, para las MSC, utilice DMEM suplementado con suero bovino fetal 20%, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,2% anfotericina-B a la cultura de la cells.
    3. Realizar un recuento de células usando un hemocitómetro, entonces sedimentar las células de nuevo a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio de cultivo celular y transferir a un tubo de 1.5 ml.
    5. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    6. Eliminar el sobrenadante. Las células suplementarios ya están listos para la construcción de tejido.
      Nota: si se añaden las células suplementarios a una concentración de 10% del número total de células en el tejido, a continuación, para los tejidos definidos, esto requerirá 50.000 células suplementarios por el tejido, ya que cada tejido contiene 500.000 células cardíacas (tanto las células del estroma CD90 + y miocitos SIRPα +).
  4. Crear las Engineered cardíacos Tejidos Humanos
    Nota: Almacenar todas las soluciones en el hielo y las células a temperatura ambiente. Todos los volúmenes que aparecen abajo son por el tejido. Típicamente, aproximadamente seis tejidos pueden construirse a partir de dos de 6 pocillos plAtes de diferenciaciones cardíacas.
    1. Diluir 60,0 l de la 5 mg / ml de stock de colágeno a 3,125 mg / ml con 1,5 l de NaOH 1 M, 9,6 l de 10x PBS y 24,9 l de agua desionizada ultrapura estéril.
      paso crítico: evitar la introducción de burbujas de aire para cada solución durante la preparación como burbujas de aire interrumpir la formación de tejido adecuada.
    2. Añadir 12,0 l de 10x tanto MEM y 0,2 N HEPES pH 9 a la mezcla de colágeno diluido para crear la mezcla de colágeno. Añadir las dos soluciones por el lado del tubo de centrífuga de 15 ml con el fin de evitar la introducción de burbujas de aire en la mezcla de colágeno.
    3. Añadir la matriz de la membrana basal a una concentración final de 0,9 mg / ml a la mezcla de colágeno y almacenar en hielo para crear la mezcla final de tejido. La concentración final de colágeno debe ser de 2 mg / ml.
    4. Añadir 500.000 de las células reagregadas a la mezcla tejido (concentración de fibroblastos miocitos + es de 20 millones / ml) y rellenar hasta un volumen final de 25 l portejido, ya sea con medios NBS libres de células o 50.000 células del tipo de célula suplementaria de interés (por ejemplo, las hMSC) y mezclar bien para formar una suspensión celular uniforme.
      Nota: El número de células suplementadas variará de para diferentes aplicaciones. Aquí se utiliza la administración de suplementos 10%.
    5. Con cuidado, pipeta de 25 l de la suspensión celular en cada uno de los seis pozos de la placa de base biorreactor, sin introducir burbujas de aire en el pozo.
    6. Empuje dos filas de los sensores de fuerza PDMS en cada lado del bastidor de polisulfona, formando 6 pares de postes opuestos, a continuación, invertir el marco en la parte superior de la placa de base de modo que un par de postes entra en cada pocillo que contiene la suspensión celular.
      Nota: El marco de polisulfona incluye pestañas para ayudar en la alineación de los PDMS.
    7. Con cuidado, coloque el biorreactor, placa de base hacia abajo, en una placa de 60 mm, a continuación la cápsula sin su cubierta interior de una placa de 10 cm, coloque la cubierta de 10 cm en la parte superior, y mover todo el conjunto en biorreactora la incubadora de cultivo de tejidos, a la espera de dos horas para el tejido de gel.
    8. Después de 2 horas, retire el biorreactor de la incubadora y añadir 14 ml de medio de NBS a todo el conjunto, lo suficiente para cubrir la placa de base. Volver a la incubadora, y cambiar la mitad de los medios de comunicación todos los días.
    9. Cuarenta y ocho horas más tarde, retire con cuidado la base moviendo suavemente cada lado de la placa base fuera del marco de unos pocos milímetros a la vez, cambiar los medios de comunicación, a continuación, devolver el biorreactor, tejidos hacia abajo, a los medios de comunicación.
    10. Continuar el cambio medio de los medios de cultivo de NBS cada día.
      Nota: Las contracciones espontáneas de los tejidos pueden ser observados a los 3 días después de la construcción del tejido, generando fuerzas de contracción medibles ya en el día 5 a 7.

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Representative Results

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Para obtener los miocitos cardíacos, una versión ligeramente modificada de los métodos de diferenciación Boheler y Lian se utiliza 30,31. Es imperativo que la diferenciación se inicia durante el registro de la fase de crecimiento celular, sino también que la población inicial es suficientemente confluente para obtener un número utilizable de las células después de la clasificación (aproximadamente 75% es óptimo). Típicamente, para H7 hESCs, placas a una densidad de 140.000 hESCs por pocillo de una placa de 6 pocillos en esencial 8 medios de comunicación y 5% de CO 2 incubadora mantenida a 37 ° C produce culturas suficientemente confluentes después de 4 días para iniciar la diferenciación, tal como se ilustra en la Figura 1A - D. Dado que la insulina inhibe la especificación cardíaco durante el proceso de diferenciación 32, la insulina medios de comunicación libres (diferenciación de los medios de comunicación I, Tabla 1) se utiliza para los primeros 10 días de diferenciación. Una vez que la diferenciación se inicia a través de la aplicación de la CHIR99021 inhibidor de GSK3,muerte celular significativa ocurrirá (Figura 1E). Como consecuencia de ello, es esencial para cambiar los medios de comunicación cada día. El día 2 de diferenciación, las células se retiran de CHIR99021 y se asentó en medio de diferenciación I (sin añaden moléculas pequeñas) durante 24 horas. Después de 24 horas el descanso en medio de diferenciación, las células se tratan con IWR-1 durante 48 horas, después de lo cual comienzan a auto-organizarse en grupos (Figura 1F) que laten tan pronto como siete días a partir de la diferenciación. Desde que se produjo la especificación cardiaca después de la aplicación de IWR-1, los medios de comunicación se cambia a un medio que contiene insulina (medio de diferenciación II, Tabla 1). A los 18 días de diferenciación, las colonias de células que baten han conectado y parcialmente separado de la superficie de la célula, formando robustamente golpeo "redes" en todo el plato (Video Figura 1).

En el día 20, la monocapa se disocia golpeo suavemente viunos métodos enzimáticos para obtener células individuales para vivir celular asociada fluorescentes (FACS). Utilizando el método de la diferenciación se ha descrito anteriormente, que forma conservadora cosechar aproximadamente 65% de la población como SIRPα + y 10% como CD90 + (Figura 2). Generalmente 1-2 millones SIRPα + células se obtienen por placa de 6 pocillos.

Después de reagregación durante 48 horas en una relación 3: 1 de SIRPα +: CD90 + células, los agregados de células definidos se mezclan con un hidrogel a base de colágeno y con pipeta en los pozos estrechos en la placa de base del biorreactor de múltiples tejidos. Por lo general, antes de la retirada de la placa, se observaron pequeños grupos de 5-10 células golpes en la superficie del plato. El biorreactor de tejido definido consta de tres componentes: un molde maestro para emitir los mensajes PDMS; un marco para almacenar dos bastidores de PDMS de mensajes; y una placa de base de politetrafluoroetileno negro que contiene seis pozos para la mezcla de tejidos (Figure 3A). Todo el proceso de construcción de tejido se lleva a cabo en el hielo y en condiciones asépticas. Después de la adición de las mezclas de célula-matriz líquidas a los pocillos en la placa de base, los mensajes de PDMS están unidos al bastidor de polisulfona, y luego invierte de modo que los postes estén alineados con los pozos de la placa de base (Figura 3B). Después de 48 h de incubación, los tejidos deben ser suficientemente compactado que la placa de base se puede quitar. La placa base es más fácil de separar mediante la extracción de todo el sistema desde los medios de comunicación y retirar con cuidado el exceso de sustratos de entre el PDMS y la placa de base. Si todos los medios de comunicación no se elimina, la tensión superficial del líquido restante puede tirar de los tejidos frente a los postes. Una vez que se retiró el medio, empuje suavemente la placa base contra los postes de PDMS para ayudar a aflojar el tejido de la placa base. A continuación, empuje gradualmente la placa base fuera moviendo suavemente de un lado a unos pocos milímetros, entonces el otro lado hasta la misma cantidad. Repita este proceso hasta que el baseplate se elimina, con los 6 hECTs unidos a sus respectivos finales mensajes PDMS (Figura 4A). Extracción de la placa base no debe tardar más de un minuto. Reemplazar el sistema en el medio de cultivo celular, invertida, de modo que todos los tejidos están cubiertas por los medios de cultivo celular.

Aproximadamente un día después de la eliminación de la placa base, la debilidad de las contracciones localizadas deben ser observables en los hECTs definidos bajo microscopía de campo claro. Después de 7 días, los tejidos han madurado y se compacta (Figura 4B-C) con sarcómeros alineados (Figura 4D). Los tejidos desvían visiblemente los puestos de PDMS con un promedio de 5 a 15 μN de la fuerza (Figura 4E). Twitch las medidas de fuerza de los tejidos cardíacos ingeniería definidos pueden medirse mediante el seguimiento en tiempo real de la desviación de la punta poste con un software de adquisición de datos de la cámara y personalizados de alta velocidad, y la aplicación de la desviación posterior a la viga teoría de la flexión después de determinar elEl módulo de Young de los puestos de silicona utilizando un transductor de fuerza, como se explica en más detalle anteriormente. 1,7 El mantenimiento de la esterilidad durante la adquisición de datos garantiza la capacidad de medir los cambios en la función del tejido en el tiempo. Hemos mantenido tejidos funcionales durante varias semanas, tal como se explica en más detalle en otra parte 1. Nuestros resultados preliminares indican una mejora sustancial de la fuerza contráctil Hect cuando los tejidos se complementan con células madre mesenquimatosas humanas 10% tanto a 1 Hz y 2 Hz frecuencias de estimulación (Figura 4F).

Figura 1
Figura 1: Imágenes representativas de hESCs H7 durante el proceso de expansión y diferenciación cardiaca. La fase de expansión debe durar 4 días, con un crecimiento de las colonias en expansión de 24 (A), a 48 (B), 72 (C (D). Después de 96 h de crecimiento se inicia la diferenciación, lo que resulta en la muerte celular sustancial durante las primeras 48 h de tratamiento CHIR99021 (E). Después de dos días de IWR-1 tratamiento, se produce una reorganización (F) para formar grupos de células que laten ya en el día 7. Además organización en una forma robusta vencer "web" que ocurre desde el día 7 al día 20, cuando las monocapas se disocian para la creación de tejidos cardíacos de ingeniería.

Vídeo Figura 1:. Monocapa cardiaca Representante después de 17 días de diferenciación . Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo latidos espontánea dentro de la monocapa generalmente se observó por primera vez entre el día 7 y el día 10, y por 17 días a partir de la diferenciación de la monocapa se ha formado redes interconectadas " "que vencieron con firmeza.

Nombre Composición Días de diferenciación utilizados
Diferenciación Media I RPMI 1640
Suplemento B27 (menos insulina)
Penicilina-estreptomicina
D0-D1 (con CHIR99021)
D2
D3-D5 (con IWR-1)
D5-D7
Diferenciación Media II RPMI 1640
Suplemento B27 (con insulina)
Penicilina-estreptomicina
D7-D20

Tabla 1: Composición de la diferenciación de Medios.

Figura 2
Figura 2: Representante tipo de células vivasing resultados Se prepararon dos muestras:. un control sin teñir y un control teñidas utilizando una dilución 1: 500 del anticuerpo SIRPα-PE / Cy7 y 1: dilución del anticuerpo CD90-FITC 250. Después de la tinción, las células se clasificaron en 20 psi en un tampón compuesto de PBS, 10% de suero bovino neonatal, 10 mM inhibidor ROCA Y-27632, y 1 mg / ml DAPI clasificación. Ambas poblaciones de células fueron cerrada en los perfiles de dispersión frontal y lateral para excluir a continuación, se seleccionaron las células individuales mediante la comparación de la anchura de impulso y la altura de los desechos (A, línea azul) (pulso análisis anchura) tanto en la dispersión hacia adelante (B, línea azul) y canales de difusión lateral (C, línea azul). A continuación, las células vivas fueron seleccionados por la compuerta DAPI - población (D, línea azul). Las poblaciones de células finales para la recolección se determinaron mediante el examen de las FITC y PE-Cy7 los niveles de expresión de las poblaciones en vivo. El control sin teñir (E, izquierda) se utilizó paraestablecer la puerta apropiada para seleccionar para el FITC + (CD90) y-SIRPα PE población / Cy7 + (cardiomiocitos) presente en la muestra teñida (E, derecha). El FITC y SIRPα-PE / Cy7 + poplations se recogieron en tubos de 15 ml de centrífuga separados.

figura 3
Figura 3:. Esquemática del biorreactor multi-tejido y el proceso de ingeniería de tejido cardiaco de la construcción del biorreactor multi-tejido requiere de tres componentes (A): 1) un molde maestro politetrafluoroetileno 9 x 33 x 5 mm 3, con 6 agujeros uniformemente espaciados 0,5 mm de diámetro; 2) un marco de polisulfona de 25 x 35 x 11 mm 3 para mantener los puestos de PDMS durante la construcción y cultivo de tejidos; y 3) un 20 x 40 x 5 mm 3 placa base de politetrafluoroetileno negro con 6 pozos de 6 x 1 x 1 mm 3 dimensiones, spaced 4 mm entre sí a lo largo de su longitud. Para crear tejidos cardíacos humanos de ingeniería (B), los mensajes de PDMS se fabrican mediante PDMS litografía blanda utilizando el molde maestro politetrafluoroetileno, dos de los cuales son luego presiona sobre las lengüetas del marco de polisulfona para formar 6 pares de postes en voladizo con sensor de fuerza. La solución tejido se pipetearon en los pocillos en la placa de base de politetrafluoretileno negro. El marco y los mensajes son entonces invertidas y alineados en la placa de base de politetrafluoretileno de modo que un par de postes entra en cada pocillo que contiene la mezcla de tejidos. Después de 48 horas, la placa base se retira y los tejidos definidos son cultivadas en los postes, quedando invertida en medios NBS.

Figura 4
Figura 4:. Las imágenes representativas y mediciones funcionales de los tejidos cardíacos humanos definidos por ingeniería La bioreact múltiples tejidoso el sistema tiene seis tejidos en paralelo (A, puntas de flecha). Tejidos definidos son auto-ensamblado dentro de los siete días después de la creación de tejido (vista desde arriba, B y una vista lateral oblicua, C). (D). Parte de una hect definido manchada de troponina T cardiaca (cTnT). (E) Representante trazado de contracción muestra la fuerza bruta con el tiempo durante 1 Hz estimulación por la estimulación del campo eléctrico. (F) Twitch rastreo durante la estimulación a 1 Hz (0-2 segundos) y 2 Hz (2-4 segundos) de estimulación, con la flecha marcado cambio en la frecuencia, tanto para hECTs definidos no suplementados (línea continua) y de los tejidos suplementado con 10% hMSCs (linea punteada).

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Discussion

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Construcción de tejidos humanos definidos por ingeniería cardíacas (hect) puede proporcionar un modelo más consistente y fiable de la función de los cardiomiocitos humanos. Fundamentalmente, todos los componentes celulares y extracelulares en el sistema son conocidos y se pueden manipular como se desee, eliminando así la influencia de confusión de otros tipos de células desconocidos que resultan del proceso de diferenciación. Para equilibrar el crecimiento celular rápido y de alto rendimiento, es preferible que la diferenciación se inicia en 75% de confluencia de las hESCs, idealmente cuatro días después de la siembra. Además, el uso de inhibidor de ROCA Y-27632 tanto durante la disociación celular y la reagregación después de la clasificación mejora en gran medida la viabilidad celular. La presencia de latido espontáneo de los miocitos durante el proceso de diferenciación es un indicador importante de la eficacia y la salud de la diferenciación. Si no se observa latidos espontáneos esto puede indicar una pobre eficiencia de diferenciación, ya sea debido a la ineficacia de los reactivos o una pérdidade la pluripotencia de las células madre.

Durante la construcción de tejidos, los mensajes de PDMS deben alinearse correctamente con los canales de la placa de base para crear tejidos bien formadas que duran el tiempo suficiente para la medición de la función contráctil. Para mejorar la facilidad de alineación de dispositivo, y fortalecer la formación de tejido alrededor de los puestos en los que son susceptibles a la rotura, es posible añadir anchura adicional (aproximadamente un diámetro del poste en cada lado de la entrada) a los extremos de los canales, como se ha demostrado por el "hueso de perro" canales en la figura 3A en forma. Sin la alineación adecuada del dispositivo al tejido o bien separar de los puestos poco después del cultivo, o se mantendrá en el pozo cuando se retira la placa de base. Si un tejido bien formada se cae durante la eliminación de la placa de base, es posible volver a colocar suavemente el tejido a los postes utilizando unas pinzas finas bajo un microscopio de disección, aunque es fácil de dañar los delicados hECTs si no se tiene cuidado adecuado. </ P>

Una de las principales del sistema definido descrito es la capacidad de interrogar a la contribución de los mecanismos directos de interacción célula-célula en las terapias con células cardiacas basado en el control específico de la composición de células. La inyección de células en animales es impreciso y sujeto a la baja viabilidad y retención 33. Además, el efecto de las células inyectadas en el tejido diana se complica por las interacciones con otros sistemas fisiológicos, tales como el sistema inmunológico. Como tal, la comprensión de la contribución de las interacciones célula-célula directos en las terapias con células cardiacas es difícil de abordar en organismos modelo. Por lo tanto, una ventaja con el método descrito es que las interacciones célula-célula se analizan en un entorno tridimensional biomimética, la preservación de los aspectos clave del nicho cardiaca, y en presencia de los tipos de células específicas de interés - a saber, los miocitos cardíacos y fibroblastos. La utilidad de usar el sistema Hect definido es demonstrated con la suplementación de 10% hMSCs derivadas de médula humana 34,35 y usados ​​en ensayos clínicos para la mezcla de células durante la creación de tejido. Aquellos tejidos que se complementaron con los hMSCs exhibieron mayor fuerza de contracción de los tejidos humanos definidos no suplementados (Figura 4F). Dado que el entorno del tejido y la composición ha sido controlada, la mejora de la función del tejido con la suplementación MSC refleja un efecto inherente de hMSC en la función de los cardiomiocitos. Otra fuerza para el sistema es que, dado que los tejidos son más pequeños que utilizó anteriormente, 1,7 uso de células es más eficiente, una consideración importante cuando se utiliza diferenciaciones dirigida de células madre pluripotentes como la fuente de células.

Más allá de estudio de los mecanismos de la terapia celular, el sistema Hect definido permitiría el examen de base celular de interacciones célula-célula cardiovasculares. La perturbación de la biología de las células antes de const tejidoruction, por ejemplo, con shRNAs, permitiría la investigación de los mecanismos moleculares que regulan interacciones célula-célula y célula-matriz. Una ventaja adicional para el sistema de ingeniería de tejidos es la formación de miofibrillas alineados capaces de contracciones funcionales. Por lo tanto, utilizando el sistema de Hect definido, la dinámica de la formación de las miofibrillas, el desarrollo de los cardiomiocitos y la organización de la arquitectura de los tejidos pueden ser investigados por medio de la modificación de los componentes de la matriz extra-celular o manipulación molecular de las células. La naturaleza humana y en 3-D del sistema hect aumenta, además, la traducibilidad de los hallazgos.

Si bien el sistema descrito ofrece un método potente para la comprensión de las cuestiones básicas de la biología cardiovascular, no es sin limitaciones. En primer lugar, los tejidos de ingeniería exhiben un fenotipo inmaduro, de acuerdo con datos de la fuerza de contracción del miocardio publicados a partir de muestras de recién nacidos 7. Mientras que lainmadurez fenotípica podría ser un factor de confusión en la evaluación de los mecanismos de interacción de las células, hay pruebas de que los cardiomiocitos enfermas revierten a un programa de gen fetal 7,36-38. Si los resultados del sistema de Hect llegar a ser relevante en el contexto de un corazón insuficiente, esto puede ser ventajoso para probar terapias cardíacas. El protocolo también utiliza una matriz de membrana basal cualificado células madre durante la construcción del tejido. La composición de esta matriz puede variar de un lote a otro, y mientras que las alternativas de la matriz del sótano definidos están disponibles aún tienen que ser evaluados en el contexto de hECTs.

Otras limitaciones incluyen la falta de un sistema vascular y no hay efectos de interacción sistemas de nivel. Dado el tamaño de los tejidos, las demandas metabólicas se cumplen solamente por difusión por lo que no se necesita el sistema vascular para asegurar la viabilidad celular. Sin embargo, la señalización de las células endoteliales puede ser un factor importante en terapias celulares específicos. Si este es el caso, un número específico de endocélulas telial simplemente se pueden añadir a la mezcla de células se define durante la construcción del tejido. Mientras que las interacciones a nivel de sistemas son importantes para la completa comprensión de los mecanismos celulares, el sistema de ingeniería tisular ofrece un enfoque reduccionista para simplificar el problema con el fin de abordar el mecanismo de forma sistemática. Complejidad se puede añadir al sistema de tejido definido según sea necesario a través de la introducción de los efectos de los sistemas relacionados, tales como leucocitos de incorporar una respuesta inmune, o mediante la adición de tipos de tejidos vecinos para interrogar señalización paracrina.

Como herramienta de investigación, el sistema de ingeniería de tejido cardiaco humano se define ofrece los beneficios de las células humanas específicas de especie, un entorno de cultivo de 3-D biomimético con biocomplejidad controlada, la vigilancia directa y longitudinal de la función contráctil, y una composición celular y la matriz definida. la orientación futura del sistema de hect incluyen la manipulación del tipo de célula terapéutica de ingenio interésh siRNA o shRNA antes de la introducción en el tejido con el fin de investigar los detalles moleculares específicos de interacción célula-célula. Además, en lugar de utilizar hESCs para formar las células cardíacas, es posible utilizar células inducidas pluripotentes madre (iPSCs) de pacientes con una mutación heredada en un esfuerzo para modelar manifestaciones de la enfermedad cardíaca relacionados en los tejidos de ingeniería. Por lo tanto, nuestro método de crear tejidos cardíacos humanos diseñados con poblaciones de células definidas promete abrir nuevas vías para el estudio de las terapias con células cardíacas para ayudar a acelerar el desarrollo de nuevos tratamientos para los pacientes con enfermedades del corazón.

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Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el NIH (1F30HL118923-01A1) a la Joint Commission, NIH / NHLBI PEN contrato HHSN268201000045C al KDC, el consejo beca de investigación de Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), el NIH (R01 HL113499) para BDG, la American Heart Association (12PRE12060254) a RJ, y del Consejo de Investigación de subvención de la RAE (TBR, T13-706 / 11) en RL financiación adicional fue proporcionada por el NIH para TJC DRB 5T32GM008553-18 y como un periodo de prácticas de Formación NIDCR-Interdisciplinario en Sistemas y Desarrollo biología y defectos congénitos T32HD075735. Los autores también desean expresar su agradecimiento por Arthur Autz en el Centro de Zahn El City College de Nueva York para obtener ayuda con el mecanizado del biorreactor y Mamdouh Eldaly para la asistencia técnica. También agradecemos al Dr. Kenneth Boheler para el asesoramiento sobre la diferenciación cardiaca, y el Dr. Joshua Hare generosamente para proporcionar células madre mesenquimales humanas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

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References

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Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca
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Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

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