Introduction
Kardiyak doku mühendisliği daha yakın hem de fare kardiyomiyositlerinin 1-6 ve yapılan tam fonksiyonel, dayak dokular, insan kök hücresi kaynaklı kalp miyositlere 7-12 sonuçlarını yayınlayarak çoklu gruplar, son on yılda büyük ölçüde ilerlemiştir. Kalp doku mühendisliği alanında iki birincil ve esas bağımsız hedefler tarafından tahrik edilmektedir: 1) işlevini 4-6 iyileştirmek için kalpleri başarısız içine transplante edilebilir eksojen greft geliştirmek; ve 2) fizyoloji ve hastalık eğitimi için in vitro modellerinde geliştirmek, ya da terapötik gelişim 2,7 için tarama araçları olarak.
Üç boyutlu (3-D) hücre kültürü 3-D matrisi geleneksel 2-D tek tabakalı hücre kültürü daha doğal kalp mikro yansıtır, yeni nesil tarama araçları geliştirmek için gerekli olarak kabul edilir; Gerçekten hücre biyolojisi bazı yönlerini 2-D vs 3-D kültürlerinde 13,14 temelde farklıdır 9 veya kollajen 7,8,10) sıkı kontrol edilirken geleneksel mühendislik insan kalp dokuları için giriş hücre kompozisyon daha az bir yönlendirilmiş kalp farklılaşma hücrelerin tüm karışımı ile tanımlanır ya embriyonik kök hücreler (ESC 7,9) ya da uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC 10,12) dokulara ilave edilir. Spesifik hücre hattı ve ikinci farklılaşma protokolünün verimliliğine bağlı olarak, kardiyomiyositlerin sonuçtaki yüzdesi üzerinden% 90 den az% 25, belirli kardiyomiyosit fenotipi arasında olabilir (yani, ventricular-, atrial-, kalp pili gibi ya da) Ayrıca bile olmayan kardiyomiyosit fraksiyon 15,16 derece heterojen ve farklılaşmış kardiyak m olgunluk değiştirebilir, değişir17 yocytes.
Son kardiyak doku mühendisliği çalışmaları kalp reporter insan embriyonik kök hücre hattı 8 veya hücre yüzey işaretleyicileri 18 farklılaşma kardiyak miyosit bileşenini izole etmek için kullanılan biriyle, hücrelerin giriş nüfusunu kontrol etmek için çalıştı. Sadece kalp miyositler oluşan başlangıçta doku ideal gibi görünüyor olsa da, bu gerçeği değil durumda olduğunu; Kalp miyositler 1 oranında: fibroblastlar yüksek seğirme kuvveti 8 üreten sadece kardiyak miyositler oluşan hECTs bazı gruplar, 3 bulma, fonksiyonel dokulara sıkıştırmak için başarısız. Canlı hücre sıralama için yüzey belirteçleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre seçim yöntemleri kullanılarak, tanımlanmış hücre populasyonlarına sahip hECTs oluşturmak mümkündür. Kardiyak olmayan stromal hücrelerin belirteçleri CD90 19,20 gibi, farazi fibroblast markeri olarak bir süre için uygun olduğu halde, kardiyak miyositler yüzey işaretleyicileri daha zor olmuşturtespit etmek. SIRPα insan kalp miyositlere 18 için belirlenen ilk kalp yüzey belirteçleri arasında yer aldı ve kalp soy için son derece seçici olduğu gösterilmiştir. Hücreler bir fibroblast-benzeri fenotip (Josowitz, yayınlanmamış gözlemler) sergileyen CD90 + nüfusu ile hemen hemen saf kardiyomiyositlerde verir - Son zamanlarda, iki sıralama SIRPα + ve CD90 için bulduk. Kardiyomiyositlerde ve CD90 + fibroblastlar - SIRPα + / CD90 1 kombinasyonu: Bu toplanan bulgulara dayanarak, burada biz bir 3 kullanan hECTs oluşturmak açıklar.
tamamen tanımlanmış insan kalp dokusu mühendisi yeteneği güçlü tarama araçları oluşturmak için değil, aynı zamanda gelişmekte olan hücreye ve gen bazlı kardiyak tedaviler araştırmak için bir model sistemleri geliştirmek için değil, sadece esastır. Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) 21 olmak üzere hücre tipleri kullanan kalp yetmezliği için özellikle çok sayıda hücre tedavileri, içinde 22 ve kemik iliği mononükleer hücreleri 23-25, klinik çalışmalarda test edilmiştir. İlk sonuçların pek 21,23,25 umut verici olsa da, ilk fayda genellikle zaman 26-29 üzerinde azalır. Benzer bir eğilim nedeniyle MSC takviyesi önemli bir fonksiyonel fayda gösterir kemirgen mühendislik kardiyak dokularda rapor edilmiştir, ancak fayda uzun vadeli kültürü 1 sırasında sürekli değildir. sub-optimal performans altında yatan hücre tedavileri düzenleyen mekanizmaların bizim sınırlı bilgidir. onların olumlu etkisi yanı sıra, miyosit-nonmyocyte etkileşimlerin potansiyel olumsuz sonuçların uygulamak nasıl tedavi hücreler daha derin bir anlayış, kalp yetmezliği olan hastalarda minimal yan etkileri klinik olarak anlamlı ve sürekli faydalar veren gelişmiş tedavilerin gelişimini, sağlayacaktır.
Burada, interrog tanımlanmış hECTs kullanımını tarifhücre tabanlı tedavinin mekanizmaları yedik. kontrollü doku kompozisyonu kardiyomiyosit performansını etkilemeden belirli faktörleri belirlemek önemlidir. Sıçan AKTS 1'de gösterildiği gibi, doğrudan ilgi terapötik hücre tipi (örneğin, MKH) ile hECTs tamamlayan, kardiyak miyosit performansı üzerindeki etkileri ortaya çıkarabilir.
Aşağıdaki çok adımlı protokol çoklu doku biyoreaktör imalatı izledi ve doku yapımı ve fonksiyonel analiz bir açıklama ile sonuçlandırılması, yönetmenliğini kardiyak kök hücre farklılaşması ile başlar. Bizim deneyler NIH onaylı H7 insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, aşağıdaki protokol ayrıca bir HESC hattı ve benzer sonuçlar ile üç uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) çizgileri kullanılarak test edilmiştir. Biz Hect üretiminde kardiyomiyosit farklılaşma ve başarı verimlilik, özellikle fo, hücre hattı bağımlı olabilir buldukBireysel hastalar türetilen R hiPSC hatları. Bu protokolü takip ederek, iki adet 6-kuyu yemekleri 20 gün boyunca ayırt ve yeterince altı tanımlanan dokuları yapmak için, sıraladıktan sonra yaklaşık 2,5 milyon miyositleri verir 1680000 hESC (oyuk başına 140,000 hücre), toplam kaplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bir HEPA filtreli sınıf II biyolojik güvenlik kabini kullanılarak aseptik koşullarda tüm hücre manipülasyonlar gerçekleştirin ve 0.2 mikron filtre aracılığıyla filtre edilerek tüm çözümler sterilize edin. Aynı aseptik şartlarda ya da bir laminer akış kaputu ya doku yapım ve fonksiyon testlerini gerçekleştirmek.
Kardiyak Farklılaşma için Hazırlık H7 hESC 1. Tohum
- (Gün 1) bazal membran Matrix hazırlanması
- 4 ° C'de bir gece boyunca buz üzerinde HESC kalifiye bazal membran matrisi 150 ul tablet çözülme.
- Kaplama Tabaklar üzerinde hESC (Gün 0-4) Kaplama
- buz soğukluğundaki DMEM / F12 12 ml çözülmüş matris seyreltilir ve iyice karıştırın.
- Transfer 6-yuvalı doku kültürü çanağı tedavi her oyuğuna DMEM / F12-matris solüsyon içerisinde 1 mi. Matris kapladığı iki adet 6 oyuklu plakaların her bir kısım.
- en az 1 saat oda sıcaklığında kaplanır inkübe edin.
Not: InTecrübe, parafin ile sızdırmaz kaplanmış tabaklar kullanımdan önce 10 güne kadar, 4 ° C de bir matris çözelti içinde saklanabilir. - Yaklaşık% 75 izdiham, non-enzimatik ayrışma reaktif 6 ml kullanılarak 10 cm çanak H7 hESC ayırmak. 5 dakika sonra, yumuşak bir tek hücre kazıyıcı kullanılarak kültür yüzey hücreleri kazıyın ve steril bir 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
- kök hücre hattı yayılma için (daha fazla hESC ayırmak ayrılma reaktifi 5.5 mi bırakarak) yeni bir steril 15 ml tüp 15 ml tüp ve transferi hücreleri ile ayrıştırma çözeltisinin 0.5 ml çıkarın.
- 20 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre 0.5 ml Pelet. Süpernatantı ve sonra yavaşça yeni, kaplamalı, 10 cm doku kültür tabağına aktarın ve kök hücre hattı sağlamak için 37 ° C ve% 5 CO2 muhafaza penisilin-streptomisin,% 1 ihtiva eden, pluripotent kök hücre ortamı 8 ml tekrar süspansiyon.
Not: Ortam değişiklikleri sırasında buz üzerinde pluripotent kök hücre ortamını tutun. - Bu sırada, geri kalan ayrışma 5.5 mi çözeltisine 10 mm kaya önleyicisi Y-27632 5.5 ul ve başka 5-10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin devam etmektedir. Yavaşça 5 ml serolojik pipet ile hücreleri karıştırın. tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar, daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de topak hücrelere inkübe devam edin.
- pluripotent kök hücre medya 5 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanılarak bir hücre sayımı gerçekleştirin.
- Tohum oyuk başına 140,000 hücrelik bir yoğunlukta 6-çukurlu çanak her bir. Altı tanımlanan dokuların toplam oluşturmak için iki adet 6-kuyucuğu Tohum. kaplama sonrası kalan hücrelerin imha edin.
- Pluripotent kök hücre ortamı ile de 1 ml doldurmak ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir. Yirmi dört saat sonra, ortamı çıkartın ve her bir kuyu (Şekil 1A taze pluripotent kök hücre medya 2 ml ekleyin
- Her gün plakalarının izdiham kontrol edin ve hücreler yaklaşık% 75 izdiham ulaştığınızda farklılaşma başlar (Şekil 1B - D).
Kardiyomiyositlerde 30,31 İnsan Embriyonik Kök Hücreleri 2. (Gün 4-24) Farklılaşma
- (Gün 4-7, Farklılaşma Gün 0-3) Mesoderm İndüksiyon
- 10 mi B27 (insülin) olmadan ek ve penisilin-streptomisin stok solüsyonu (10,000 ug / ml streptomisin 10.000 lU / ml penisilin), 5 ml, 500 ml RPMI 1640 birleştirerek RPMI farklılaşma ortamı I (Tablo 1) hazırlayın. 4 ° C'de 50 ml tüpler içinde buz üzerinde kısım, ve depolamak.
- (Gün 4, Farklılaşma Gün 0) I, her kuyudan pluripotent kök hücre ortamını çıkarın RPMI farklılaşma ortamı 12 ml (10 mM stok, 6 uM nihai konsantrasyon) küçük molekül GSK3 inhibitörü CHIR99021 2.4 ul ekleyerek mezoderm endüksiyon ortamı hazırlamak birND mezoderm indüksiyon ortamı 2 ml oyuk başına değiştirin. inkübatör plaka dönün.
Not: çok hücre ölümü genellikle CHIR99021 (Şekil 1 E) eklenmesi ile meydana gelir. tek tabaka iyileşir fakat uzak DMEM / F12 durulaması ile ölü hücreleri durulanması önemlidir. - Yukarıda açıklandığı gibi (Gün 5, Türev Gün 1) taze mezoderm indüksiyon ortamını hazırlayın. her bir eski Ortamı çıkarın ve DMEM / F12, 1 ml ile bir kez durulama ile sabitleştirilir. her bir kuyunun taze mezoderm indüksiyon medya 2 ml ekleyin.
Not: Ortalama 0-10 her gün Durulama ölçüde kardiyak miyositlerinin verim ve saflık arttırır. - (Gün 6, Türev Gün 2) kalp indüksiyon ortamı çıkarın ve oyuk başına 1 ml DMEM / F12 ile bir kez yıkayın. (Hiçbir küçük moleküller ama hala insülin) takviyesi olmadan B27 (ilave) 2 ml RPMI farklılaşma medya ile durulama değiştirin ve inkübatör dönmek.
- (Gün 7-13, Farklılaşma Day 3-10) Kalp Mesoderm İndüksiyon
- (Gün 7, Türev Gün 3) RPMI farklılaşma ortam I'in 12 ml küçük molekül Wnt önleyicisi IWR-1 (nihai 10 mM stok, 5 uM), 6 ul ekleyerek kalp mezoderm endüksiyon ortamı hazırlamak
- , Her bir medya çıkarın oyuk başına 1 mi DMEM / F12 ile bir kez yıkayın ve kardiyak mezoderm indüksiyon ortamı 2 ml yerine ile sabitleştirilir.
- yukarıda tarif edildiği gibi (Gün 8, Farklılaşma Gün 4) kalp mezoderm indüksiyon ortamı ilave 12 ml hazırlayın. Medya önce gün eklenen kaldır oyuk başına 1 ml DMEM / F12 ile bir kez yıkayın ve kuyu başına taze kardiyak mezoderm farklılaşma medya 2 ml ile değiştirin ve inkübatör dönmek.
- (Gün 9-10, Farklılaşma Gün 5-6) İki gün, kalp mezoderm indüksiyon ortamını çıkarın ve DMEM / F12 her kuyu ile 1 ml durulayın.
- Taze RPMI farklılaşma medya 2 ml ekleyin (hiçbir küçük moleküller ama hala insülin olmadan B27 () ek ilave)ve her bir kuyu için inkübatöre plaka dönüş.
- (Gün 11-24, Farklılaşma Gün 7-20) embriyonik kök türetilmiş kardiyak miyosit Organizasyon / Olgunlaşma
- 10 mi B27 (insülin) takviyesi ve penisilin-streptomisin stok çözeltisi, 5 ml, 500 ml RPMI 1640 birleştirerek RPMI farklılaşma ortam II (Tablo 1) hazırlayın. 4 ° C'de 50 ml tüpler içinde buz üzerinde kısım, ve depolamak.
- (Gün 11, Türev Günlük 7) her gelen (insülin olmadan) RPMI farklılaşma ortamı çıkarın ve 1 ml DMEM / F12 ile durulayın. her birine (insülin) yeni bir RPMI farklılaşma medya II 2 ml de yerine ve inkübatör geri döner.
Not: Kendiliğinden atan önce Gün 7 ve 10 arasında dikkat edilmelidir dayak bu süre içinde gözlenmez, bu tipik olarak kötü farklılaşma etkinliğini göstermektedir. protokol dayak gözlemlemek için bir çaba güne 15 yılına kadar devam edilebilir, ancak hiçbir dayak gün 15 ile çıkmış ise st en iyisidirYeni bir farklılaşma sanat. - (Gün 12-24, Farklılaşma Gün 8-20) Her gün, eski farklılaşma ortamı çıkarın ve taze RPMI farklılaşma medya II 2 ml ile değiştirin dayak tek tabaka hücre olgunlaşmasını ve organizasyonunu izin vermek de (Şekil 1F, Video Şekil 1 başına ).
Not: Kalan hücre ölümü bağlı olarak, farklılaşma 10 gün boyunca DMEM, 1 ml / F12 ile durulanması gerekli olabilir.
3. (Gün 24 Farklılaşma Gün 20) kardiyak miyositler ve Fibroblast benzeri Hücreleri İzolasyon
- Monolayer gelen Hücreleri ayırmak
- farklılaşma ortamı çıkarın ve 1 ml PBS ile bir kez yıkayın.
- her bir enzimatik ayrılma çözeltisi (% 0.04 tripsin /% 0.03 EDTA) 1 ml tek tabakaları ayrıştırmaları.
- 10 dakika kuvöz içine plaka taşıyın. Bu arada, tripsin nötralizasyon çözeltisinin 6 ml ROCK inhibitörünün 12 ul ekle.
- gentlY tripsin solüsyonu nötralize etmek için plakanın her oyuğuna ROCK inhibitörü içeren tripsin nötralizasyon çözeltisinin 1 ml.
- Steril bir aktarım pipeti kullanarak, yavaşça hücre kümeleri bozmaya her iyi karıştırın.
- 15 ml bir santrifüj tüpüne 6-çukurlu plaka 12 ml aktarın.
Not: iki adet 6 oyuklu plakalar Bu protokolde kullanılan olduğundan, iki adet 15 ml'lik tüp gerekli olacaktır. - daha sonra bir plakanın her bir kuyucuğu, ve transfer 3 mL PBS sıralı çanak üzerinde kalan hücreleri toplamak için her bir sonraki oyuk aynı 3 ml aktarın. de hücre içeren aynı 15 ml santrifüj borusu ile son kalan 3 ml aktarın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet.
- FACS Canlı Hücre Sıralama için Hücreleri hazırlayın
- KAYA inhibitörünün 50 ul buz üzerinde PBS, 45 ml Fetal Sığır Serumu 5 ml ekleyerek boyama tamponu hazırlayın.
- Hücre pel süpernatantı(3.1.8 olarak) izin ve boyama tamponu 1.2 ml süspansiyon haline getirin.
- Buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş, 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 200 ul aktarın. Bu negatif boyama kontrolü olacak.
- (: 500 dilüsyon 1), 4 ul CD90-FITC (1: 250 seyreltme) 2 ul SIRPα-PE / Cy7 buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş, 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu geriye kalan 1 ml aktarın ve ekleme . Yavaşça bir transfer pipet ile hücre süspansiyonu karıştırmak ve buz dönün.
- 1 saat süre ile 4 ° C 'de, buz üzerinde bir kavrama çalkalayıcıda, negatif kontrol ve numune, inkübe edin.
- İki 15 ml santrifüj tüplerine (insülin) RPMI medya 3 ml ekleyerek numune toplama tüpleri hazırlayın. Her tüpe ROCK inhibitörü 3 ul ekleyin ve buz üzerinde saklayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de boyanan hücrelerin pelet ve durulama başına buz soğukluğunda PBS en az 10 ml ile iki kez yıkayın.
- lekeleme tampon maddesi, 5 ml DAPI (1 ug / ml) 1 ul ekle. NazikçeBir transfer pipeti kullanarak, DAPI içeren lekeleme tampon maddesi 1-3 ml numune pelletini.
- Negatif kontrol (hiçbir DAPI eklenen) boyama tampon 500 ul ekleyin.
- Yavaşça hücre kümeleri kaldırmak ve buz üzerinde FACS tüpler Polistiren aktarmak için 40 mikron hücre süzgecinden negatif kontrol ve numune hem filtre. Hemen hücre sıralayıcı numune getirecek.
- Kurulan canlı hücreye benzer sıralama yöntemleri 18, (negatif DAPI) canlı hücreler için seçin kapıları ayarlamak için negatif kontrol kullanın ve FITC + (yani, CD90 + fibroblastlar) ve PE / Cy7 + (yani, SIRPα + kardiyomiyositlerde hem toplamak ) 20 psi (Şekil 2) bağımsız nüfustur.
Not: Kapıları ayarladıktan sonra, negatif kontrol kardiyak troponin-T boyanarak farklılaşma etkinliğini belirlemek için% 4 PFA sabit olabilir.
Not: Bazı araştırmacılar, bir kullanmayı tercihizotop kontrol yerine lekesiz kontrolü non-spesifik antikor bağlanması için telafi etmek için kapıları ayarlamak için kullanılır. Bir sözde floresans eksi bir (FMO) kontrol başka bir olasılıktır. Nedeniyle FITC, DAPI ve PE-Cy7 sinyallerinin net bimodal dağılımı, biz konservatif muhtemelen bazı gerçek pozitifler dışlar, ancak herhangi bir yanlış pozitif en aza indirmek için yardımcı olumlu kapısı içine kadar amaçlayan, pozitif nüfustan Geçitli.
- Doku Mühendisliği Hazırlama Hücre reaggregation
- Hücre tür sonra,% 10 Fetal Sığır Serumu, penisilin-streptomisin,% 1 ve% 0.2 Amfoterisin B ( "NBS media") ihtiva eden DMEM 1 ml toplama tüpleri ve tekrar süspansiyon iki pelet.
- 60 cm2 (10 cm tabak) başına 2 milyon hücre yoğunluğunda petri tedavi 1 oranında olmayan bir doku kültüründe Birleştirilen hücreler plaka a 3 SIRPα + ve CD90 + hücreler bir araya toplamaktadır. NBS medya ve 10 10 ml ekleyin1 ve Kaya önleyicisi Y 27632 l.
- küçük kümeler halinde hücre reaggregation izin vermek için 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde bir hücre süspansiyonu yerleştirin.
4. İnsan kalp doku mühendisliği
- Çok doku-biyo reaktörünün fabricate
Not: Şekil 3A illüstrasyonlar tamamlamak için detaylı biyoreaktör tasarımı şemaları ile CAD dosyaları yazarlardan istek üzerine temin edilir.- Makine politetrafluoroetilen 9 x 33 x 3.25 mm kuboidinin içine 0,5 mm çapında altı eşit aralıklı delik PDMS ana kalıp.
- Bir parmak frezemi, makine 25 x 35 x 11 mm 3 ölçüm polisülfon bir çerçeve kullanılması. Çerçevenin amacı tablaya kuyulara aynı hizada (yukarıda yapılan döküm inşa) PDMS mesajları tutmaktır.
- 1 mm parmak frezemi kullanarak, makine 6 kuyu (6 x 1 x 1 mm3), siyah bir poli 20 x 40 x 5 mm 3 parça halinde ayrı, 4 mmtetrafloroetilen taban plakasını oluşturmak için.
- / Oranı ağırlıkça 1 ve altı kuvvet algılama mesajların iki satır oluşturmak için özel politetrafloroetilen kalıp (adım 4.1.1) ekleyin ve bir gecede ve altında inkübe: 10 elastomerik taban ve polidimetilsiloksan (PDMS) için kür ajanı karıştırın 80 ° C'de vakum altında kurutuldu. Kür sonra, yavaşça ana kalıp PDMS çıkarın ve dikkatlice geliştirilmiş kontrast ve otomatik gerçek zamanlı sonrası saptırma izleme için siyah kalıcı bir kalem ile her yazının başında işaretleyin.
Not: polytetrafluorethylene oldukça yumuşak ve kolayca zarar görebilir. sistemi ve tutarlı PDMS sonrası geometri uzun ömürlü olması için döküm PDMS için ana kalıp önce temizlerken dikkatli kullanın. A 0.5 mm tel her kullanımdan sonra mesaj için delikler temiz, ama deliklerin içini kazımak değil dikkat çekmek için kullanılabilir.
Not: Alternatif bir oda sıcaklığında birkaç saat boyunca gazdan arındırın vakum altında PDMS, daha sonra çevre basıncında kanşım tedavi sağlar.Bu sertleştirme işlemi sırasında PDMS oluşturan daha az artık gaz kabarcıklarına neden olabilir. - Buhar Otoklav tüm bileşenleri sterilize edin.
Not: PDMS ana kalıp (adım 4.1.1) ve polisülfon çerçevesi (adım 4.1.2) hem de tekrar kullanılabilir. döküm (adım 4.1.4) oluşturulan PDMS mesajlar da yeniden kullanılabilir ancak yaklaşık 10 kullanımlar içindir. ana kalıp kullanılarak gerektiği kadar Ancak, daha PDMS mesaj oluşturulabilir.
- Reaggregated Kalp Hücreleri toplamak
- inkübatör reaggregated hücreleri çıkarın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne reaggregation ortam 10 ml aktarın.
- PBS 3 ml plaka yıkayın ve reaggregation ortamı içeren aynı bir 50 ml santrifüj tüpüne durulama aktarın.
- 10 cm tabak% 0.04 tripsin /% 0.03 EDTA 3 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca inkübatör dönmek.
- 5 dakika sonra, tam hücre dissocia sağlamak için 10X büyütmede bir ters bileşik mikroskop ile plaka incelenmesiçanak yon. Bazı kalıntı kümeleri hala bağlı ise, yavaşça kümeleri ayırmak için plakayı çalkalayın. kümeler bağlı kalır, başka bir 2-3 dakika boyunca inkübatör dönmek. daha uzun on dakika ya da oluşabilir önemli hücre ölümünü inkübe etmeyin.
- Bir kez tüm Hücreler, tripsin nötralizasyon çözeltisinin 3 ml ekleyin, ayrılır. Yavaşça reaggregation ortamı içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne tripsin hücre çözeltisi ve transferi ile nötralizasyon çözeltisi karışımı ve bir kez PBS ile yıkayın.
- 5 ml PBS ile tüm çanak durulayın ve hücreleri ihtiva eden aynı bir 50 ml tüp aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri.
- Süpernatantı ve NBS ortam 1 ml pelletini, daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g pelet ve supernatant çıkarın. Kardiyak hücreler (CD90 + hücreleri ve SIRPα + myocytes) artık doku yapımı için hazırız.
- (İsteğe bağlı) İlgi Yan Hücreleri Toplama
Not: Yalnızca SIRPα + kardiyomiyositlerde ve CD90 + fibroblast benzeri hücreleri ihtiva eden tanımlanmış dokulara ek olarak, doku işlevi üzerindeki etkilerini sorgulamak için ilgi ek hücrelerin ilave edilmesi mümkündür. Örneğin sıçan erişkin sıçan tasarlanmış kardiyak dokular 1 işlevini geliştirmek için gösterilmiştir. Aşağıdaki isteğe bağlı adım tanımlanan sistem için ek hücrelerin toplanmasını açıklar.- Ilgi ek hücre tipi% 0.25 tripsin /% 0.1 EDTA kullanılarak (örneğin, mezenkimal kök hücreleri) toplayın.
- daha sonra ilgi hücre tipi için uygun hücre kültür ortamı, 5 ml tekrar süspansiyon, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri. Örneğin erişkin için, DMEM,% 20 fetal sığır serumu, kültür Cı penisilin-streptomisin,% 1 ve% 0.2 amfoterisin B ile desteklenmiş kullanımıarşın.
- Bir hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirmek daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar pelet hücreleri.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücre kültür ortamı ve transfer 1 ml süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri.
- süpernatantı. ek hücreler artık doku yapımı için hazır.
Not: Yan hücreler doku toplam hücre sayısının% 10 arasında bir konsantrasyonda ilave edilir, her doku 500.000 kardiyak hücreler (CD90 + stromal hücreler hem de içerdiği için, daha sonra tarif dokuların bu doku başına 50.000 takviye hücreleri gerektirir ve SIRPα + miyositler).
- İnsan Engineered Kalp Dokuları oluşturma
Not: Oda sıcaklığında buz üzerinde tüm çözümler ve hücreleri saklayın. Aşağıda listelenen tüm hacimler doku başına bulunmaktadır. Tipik haliyle, yaklaşık altı dokuları iki inşa edilebilir 6 oyuklu PLKalp farklılaşmalar ve ates.- 1 M NaOH 1,5 ul 10x PBS 9.6 ul ve steril aşırı saf deiyonize su 24.9 ul mi 3.125 mg / 5 mg / ml kolajen stokunun 60.0 ul seyreltilir.
Kritik adım: hava kabarcıkları düzgün doku oluşumunu bozacak şekilde hazırlanması sırasında her çözüme hava kabarcıklarının giriş kaçının. - Kollajen mix oluşturmak için hem 10x MEM 12.0 ul ve seyreltilmiş kollajen karışıma 0.2 N HEPES pH değeri 9 ekleyin. kollajen karışıma hava kabarcıklarının girmesinin önünü almak amacıyla 15 ml santrifüj tüpüne tarafında aşağı her iki çözüm ekleyin.
- Kollajen karışımına mi 0.9 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar bazal membran matris ekleme ve son doku karışımı oluşturmak için buz üzerinde muhafaza edin. kollajen nihai konsantrasyon ml / 2 mg olmalıdır.
- 25 ul bir son hacim başına doku karışımı reaggregated hücrelerin 500,000 ekler (miyosit + fibroblast konsantrasyonu 20.000.000 / ml) ve dolguhücresiz NBS ortam veya ilgi duyulan (ör hMSCs) arasında ek bir hücre tipinin 50,000 hücre ve iyice karıştırın ya doku daha hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere.
Not: takviye hücrelerin sayısı, farklı uygulamalar için değişecektir. İşte% 10 takviyesi kullanılır. - kuyuya hava baloncuklarının oluşumunu olmayan bakımı, pipet biyoreaktör taban plakası altı kuyu her hücre süspansiyonu 25 ul ile.
- mesaj bir çift her bir hücre süspansiyonu ihtiva eden girecek şekilde karşıt mesajların 6 çift oluşturan polisülfon çerçevenin her iki yanında PDMS kuvvet sensörleri iki sıra itin ve ardından taban plakası üstünde çerçeve ters çevirin.
Not: polisülfon çerçeve PDMS uyum yardımcı olmak için sekmeleri içerir. - Dikkatle sonra 10 cm çanak içine onun kapaksız çanak yerleştirin, bir 60 mm çanak içine, aşağı baseplate, biyoreaktör yerleştirin üstünde 10 cm kapağını yerleştirin ve bütün biyoreaktör düzeneğini taşımakdoku kültürü inkübatör, jel doku için iki saat bekledikten.
- 2 saat sonra, inkübatörden biyoreaktör çıkarın ve taban plakasını kaplayacak kadar bütün takımın NBS ortam 14 ml, ekleyin. inkübatör dönmek ve her gün medyanın yarısını değiştirmek.
- Kırk sekiz saat sonra, dikkatli, hafifçe bir seferde çerçeve kapalı birkaç milimetre taban plakası her tarafı hareket ettirerek taban plakasını kaldırmak ortamı değiştirmek, sonra dokular medyaya, aşağı bakacak şekilde, biyoreaktör dönün.
- Her gün NBS kültür ortamı yarısını değiştirerek devam edin.
Not: doku Spontan kasılmalar olarak günün erken saatlerinde 5 olarak 7 ölçülebilir seğirme kuvvetleri üreten, en erken 3 gün gibi doku inşaat sonrası görülebilir.
- 1 M NaOH 1,5 ul 10x PBS 9.6 ul ve steril aşırı saf deiyonize su 24.9 ul mi 3.125 mg / 5 mg / ml kolajen stokunun 60.0 ul seyreltilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalp miyositleri elde etmek için, Boheler ve Lian farklılaşma yöntemleri biraz değiştirilmiş bir sürümü 30,31 kullanılır. Farklılaşma, hücre büyümesi log-faz esnasında başlar, ama aynı zamanda başlangıç popülasyonu (yaklaşık% 75 en uygunudur) sıralama sonra bir hücre kullanılabilir sayısını elde etmek için yeterli sıvıyla zorunludur. Tipik haliyle, H7 hESC için, 37 ° C 'de muhafaza esas 8 ortam ve% 5 CO2 inkübatöründe 6 oyuklu çanak oyuk başına 140,000 HESC yoğunluğunda kaplama gösterildiği gibi, farklılaşma başlatmak için 4 gün sonra yeterli konfluen kültürlerin elde edilir Şekil 1A - D. İnsülin farklılaşma sürecinde 32 sırasında kalp şartname, insülin serbest medya (farklılaşma medya I, Tablo 1) inhibe yana farklılaşma ilk 10 gün için kullanılır. farklılaşma GSK3 inhibitörü CHIR99021 uygulaması ile başlatılan sonra,çok hücre ölümü (Şekil 1 E) ortaya çıkar. Bunun bir sonucu olarak, her gün ortam değiştirmek için gereklidir. farklılaşma 2. günde hücreler CHIR99021 çıkarılır ve 24 saat süreyle (hiç bir küçük moleküller ilave edilerek) farklılaşma ortam içinde dayanıyordu. Farklılaşma medya 24 saat dinlendikten sonra, hücreler başlar sonra 48 saat için Iwr-1 ile tedavi edilir farklılaşma başlatılmasını gibi erken yedi gün yendi kümeler (Şekil 1F) içine kendini organize. Kalp şartname Iwr-1 uygulamasından sonra oluştu bu yana, medya insülin (farklılaşma medya II, Tablo 1) içeren ortam değiştirilir. Farklılaşma 18 gün ile, dayak hücrelerin koloniler bağlandıktan ve kısmen çanak (Video Şekil 1) boyunca "ağları" dayak sağlam şekillendirme, hücre yüzeyinde müstakil.
günde 20, dayak tek tabaka hafifçe vi ayrışmışBir enzimatik yöntemler sıralama canlı floresan ilişkili hücreye (FACS) tek hücre elde etmek. Yukarıda açıklanan farklılaşma yöntemi kullanarak, biz konservatif SIRPα + olarak nüfusun yaklaşık% 65'ini ve CD90 + gibi% 10 (Şekil 2) hasat. Genel olarak 1-2.000.000 SIRPα + hücreler 6-çukurlu plaka başına elde edilir.
SIRPα + 1 oranında: 3 48 saat boyunca reaggregation sonra CD90 + hücreler, tanımlanmış hücre agregatları, bir kollajen bazlı hidrojel ile karıştırılır ve çoklu doku biyoreaktör taban plakası dar oyuklarına pipetle. Tipik olarak, bir çanak sökmeden önce, 5-10 küçük hücre kümeleri çanak yüzeyinde dayak görülecektir. tanımlanmış doku biyoreaktör üç bileşenden oluşmaktadır: PDMS mesajları atmak için bir ana kalıp; Bir çerçeve mesajların iki PDMS rafları tutmak için; ve siyah politetrafloretilen taban plakası (Şek doku karışımı altı kuyu içerenure 3A). Tüm doku inşaat süreci buz üzerinde ve aseptik koşullarda gerçekleştirilir. Taban plakasına kuyu sıvı hücre-matriks karışımları ekledikten sonra, PDMS mesajlar polisülfon çerçeveye bağlı ve mesaj taban plakası (Şekil 3B) kuyulardan hizaya gelecek şekilde sonra ters çevrilir. inkübasyondan 48 saat sonra, dokular taban plakası çıkarılabilir şekilde yeterince sıkıştırılmış olması gerekir. Taban plakası en kolay medyadan tüm sistemi ayıklanması ve yavaşça PDMS ve taban plakası arasında herhangi bir aşırı medya kaldırarak ayrılır. Tüm medya kaldırılmazsa, geri kalan sıvının yüzey gerilimi mesajların kapalı dokuları indirebiliriz. Medya kaldırıldıktan sonra, yavaşça tablaya doku gevşemesi yardımcı olmak için geri PDMS mesajların karşı taban plakasını itin. Sonra yavaş yavaş yavaşça birkaç milimetre, daha sonra diğer tarafı yukarı aynı miktarda bir tarafı yukarı hareket ettirerek taban plakasını defol. ba kadar bu işlemi tekrarlayın6 hECTs ilgili PDMS son mesaj (Şekil 4A) eklenmiş olan seplate kaldırılır. taban plakasını çıkarma bir dakikadan fazla sürer. Tüm dokular, hücre kültür ortamı ile kaplıdır, böylece ters hücre kültür ortamı içine sistemini değiştirin.
Yaklaşık bir gün taban plakasını çıkardıktan sonra, zayıf lokalize kasılmalar parlak bir alan mikroskobu altında tanımlanan hECTs gözlemlenebilir olmalıdır. 7 gün sonra, dokular ve olgunlaşmış olan hizalanmış sarkomer (Şekil 4D), sıkıştırılmış (Şekil 4B-C). Dokular görünür gücün 5-15 μN (Şekil 4E) ortalama PDMS mesajlarını saptırır. tanımlanan mühendislik kardiyak dokular, yüksek hızlı kamera ve özel veri toplama yazılımı ile yazılan ucu sapma gerçek zamanlı izleme ile ölçülebilir için kuvvet ölçümleri seğirme ve belirlendikten sonra teoriyi bükme kiriş sonrası saptırma uygulanmasıVeri toplama sırasında sterilite bakımı daha detaylı, daha önce. 1,7 açıklandığı gibi bir kuvvet transdüser kullanılarak silikon mesajların Young modülü, zamanla doku fonksiyonu değişiklikleri ölçmek için yeteneği sağlar. Başka 1 daha detaylı olarak açıklandığı gibi, biz, birkaç hafta içinde fonksiyonel dokular korumuştur. Dokular, 1 Hz ve 2 Hz ilerleme hızı frekansları (Şekil 4F) hem de% 10 insan mezenkimal kök hücreleri ile takviye edildiğinde Bu bulgular Hect kasılma gücünün önemli bir artışı göstermektedir.
Şekil 1: genişleme ve kalp farklılaşma sürecinde H7 hESC Temsilcisi görüntüler. Genişletme aşaması (48 (B) 72, 24 (a) genişleyen kolonilerin büyüme ile 4 gün C sürmelidir (D). Büyüme 96 saat sonra, farklılaşma CHIR99021 tedavisinde (E) ilk 48 saat içinde önemli bir hücre ölümü ile sonuçlanan, başlatılır. IWR-1 tedavi iki gün sonra, reorganizasyon (F) 7. Daha fazla organizasyon mono tabakaları için ayrışmış olan bir sağlam dayak "web" Günün 20 güne 7'den oluşur içine kadar erken gün olarak yendi hücrelerin kümeleri oluşturmak için meydana işlenmiş kardiyak dokular oluşturma.
Video Şekil 1:. Farklılaşma 17 gün sonra Temsilcisi kardiyak tek tabaka . Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız tek tabaka içinde spontan dayak genellikle ilk günden 7 ve gün 10 arasında görülmektedir ve farklılaşma 17 gün tek tabaka birbirine "ağları kurdu "bu sağlam yendi.
| isim | kompozisyon | Farklılaşma gün kullanılan |
| Farklılaşma Medya I | RPMI 1640 B27 Supplement (eksi insülin) Penisilin-Streptomisin | (CHIR99021) ile D0-D1 D2 D3, D5 (IWR-1) D5-D7 |
| Farklılaşma Medya II | RPMI 1640 B27 eki (insülin) Penisilin-Streptomisin | D7-D20 |
Tablo 1: Farklılaşma Medias Kompozisyonu.
Şekil 2: Temsilci canlı hücre sıralamasonuçlar ing İki numune hazırlandı. lekelenmemiş kontrolü ve 1 ile lekeli kontrolü: SIRPα-PE / Cy7 antikorun 500 seyreltme 1: CD90-FITC antikoru 250 seyreltme. Boyama işleminden sonra hücreler, PBS,% 10 yenidoğan sığır serumu, 10 uM ROCK önleyicisi Y-27632 ve 1 ug / ml DAPI oluşan tampon sıralama 20 psi'de kriteri edildi. Her iki hücre popülasyonlarının forward scatter (B, mavi çizgi) hem de (genişlik analizi darbe) sonra tek hücre darbe genişliğini ve yüksekliğini karşılaştırarak seçildi enkaz (A, mavi çizgi) dışlamak için ileri ve yan dağılım profilleri kapı ve yan dağılım kanalları (C, mavi çizgi). Nüfusu (D, mavi çizgi) - Sonra, canlı hücreler DAPI yolluk tarafından seçildi. toplanması için son hücre popülasyonları canlı popülasyonlarının FITC ve PE-Cy7 ekspresyon seviyelerini incelenerek belirlenmiştir. Lekesiz kontrolü (E sol) için kullanılanFITC + (CD90) ve lekeli numunede mevcut SIRPα-PE / Cy7 + (kardiyomiyosit) nüfus (E sağ) seçmek için uygun kapısı kurmak. FITC ve SIRPα-PE / Cy7 + poplations ayrı 15 ml santrifüj tüplerine toplanır.
Şekil 3:. 1), bir politetrafluoroetilen ana kalıp 9 x 33 x 5 mm, 3, 6 eşit aralıklı deliklerle: çoklu doku biyoreaktör ve kardiyak doku mühendisliği işlemi çoklu doku-biyo reaktörünün Yapım şematik üç bileşen (A) gerektirir çapı 0,5 mm; 2) 25 x 35 x 11 mm 3 polisülfon çerçeve doku yapımı ve kültür sırasında PDMS mesajları tutmak için; 6 x 1 x 1 mm 3 boyutlu 6 kuyuları ile ve 3) 20 x 40 x 5 mm 3 siyah politetrafloretilen baseplate, spauzunluğu boyunca 4 mm aralıklı ced. İnsan mühendisliği kalp dokularını (B) oluşturmak için, PDMS mesajlar daha sonra kuvvet algılama konsol mesajların 6 çift oluşturmak için polisülfon çerçevenin sekmeler üzerine basıldığında ikisi politetrafloretilen ana kalıp kullanarak PDMS yumuşak litografi tarafından üretilmektedir. Doku çözüm siyah politetrafloretilen taban plakası kuyuların pipetlenir. Çerçeve ve mesajlar daha sonra ters ve mesajların bir çift her kuyuya doku karışımı içeren girecek şekilde politetrafloretilen taban plakası üzerinde hizalanır. 48 saat sonra, taban plakası çıkarılır ve tanımlanmış dokularda NBS ortamında ters kalan, destekler üzerinde kültürlenmiştir.
Şekil 4:. Örnek görüntüler ve tanımlanmış insan tasarlanmış kardiyak dokularda işlevsel ölçümleri çoklu doku bioreactveya sistem paralel (A, ok uçları) altı dokuları tutar. Tanımlı dokular kendini monte doku oluşturulduktan sonra yedi gün içinde (üstten görünüm, B ve eğik yan görünüm, C). (D). Tanımlanmış bir Hect kısmı kardiyak troponin-T (cTnT) için boyandı. (E) Örnek seğirme izleme elektriksel saha uyarısıyla 1 Hz atışı sırasında zaman içinde ham kuvvetini göstermektedir. (F) her iki katkısız tanımlanmış hECTs için frekansındaki değişimi, (düz çizgi), işaret ok, 1 Hz (0-2 saniye) ve 2 Hz (2-4 saniye) ilerleme hızı da uyarılması sırasında izleme Seğirme ve dokular% 10 hMSCs ile desteklenmiş (noktalı çizgi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tanımlanmış insan mühendisliği kalp dokularında (Hect) İnşaatı insan kalp miyosit fonksiyonunun daha tutarlı ve güvenilir bir model sağlayabilir. Kritik olarak, sistemdeki tüm hücre ve hücre-dışı bileşenler bilinmektedir ve dolayısıyla farklılaşma işleminden kaynaklanan diğer bilinmeyen hücre tipleri karıştırıcı etki çıkarılması istendiği gibi işlenebilir. hızlı hücre büyümesi ve yüksek verim dengelemek için, farklılaşma ideal dört gün sonra kaplama HESC% 75 birleşme noktasında başlar tercih edilir. Ayrıca, sıraladıktan sonra hücre ayrılma ve reaggregation hem esnasında ROCK inhibitörü Y-27632 kullanımı büyük ölçüde hücre canlılığı artırır. farklılaşma sürecinde miyositler kendiliğinden dayak varlığı farklılaşma verimliliği ve sağlık önemli bir göstergesidir. spontan dayak gözlenmez ise bu, etkisiz reaktifler veya kaybı nedeniyle ya kötü farklılaşma verimliliği gösterebilirkök hücrelerin pluripotency.
Doku yapımı sırasında, PDMS mesajlar kasılma fonksiyonunu ölçmek için yeterince uzun sürecek iyi biçimlendirilmiş dokuları oluşturmak için taban plakası kanalları ile düzgün hizada olmalıdır. Cihaz hizalama kolaylığını artırmak, ve kırılma duyarlı mesaj etrafında doku oluşumunu güçlendirmek için, gösterildiği gibi, kanal uçlarına ilave genişlik (yayının her iki tarafında yaklaşık bir sonrası çap) eklemek mümkündür "köpek kemiği" ile Şekil 3A kanalları şeklindeki. Uygun cihaz hizalama olmadan doku kısa bir süre kültürden sonra mesaj ayırmak olacak ya veya kaide kaldırıldığında kuyuda kalır. Bir iyi biçimli doku taban plakası çıkarılması sırasında düşerse yeterli özen değilse o narin hECTs zarar kolay olmasına rağmen, yavaşça bir mikroskop altında ince forseps kullanarak mesajlarý doku yeniden bağlanması mümkündür. </ P>
tarif tanımlanan sistemin önemli bir mukavemet hücresi bileşimin belirli bir kontrol göre kalp hücre tedavileri doğrudan hücre-hücre etkileşim mekanizmalarının katkı sorgulamak için yeteneğidir. Hayvan hücreleri enjekte kesin ve düşük canlılığı ve tutma 33 bağlıdır. Buna ek olarak, hedef doku ile enjekte edilen hücrelerin etkisi, bağışıklık sistemi gibi diğer fizyolojik sistemleri ile etkileşim dolayısıyla karmaşıktır. Bu nedenle, kalp hücre tedavileri doğrudan hücre-hücre etkileşimleri katkısını anlamak model organizmaların ele zordur. Bu nedenle, açıklanan yönteme bir avantaj hücre-hücre etkileşimleri kalp niş temel yönlerini koruyarak, bir biomimetic üç boyutlu ortamda analiz ve özel ilgi hücre tiplerinin varlığı olmasıdır - yani, kardiyak miyositler ve fibroblastlar. tanımlanan Hect sistemini kullanarak faydası demonstr olduğunuİnsan kemik iliği 34,35 türetilen ve doku oluşturma esnasında hücre karışımına klinik çalışmalarda kullanılan% 10 hMSCs takviyesi olarak saptandı. HMSCs ile takviye edilmiştir, bu dokulardaki katkısız tanımlanan insan dokularıyla (Şekil 4F) daha büyük gerilme kuvveti sergiledi. Doku ortamı ve kompozisyon kontrollü beri MSC takviyesi ile doku işlevinin artırılması kardiyomiyosit fonksiyonu üzerindeki hMSCs doğal bir etkisini yansıtmaktadır. Sistemin bir başka gücü dokuları önceden kullanılan daha küçük olduğu için, hücre kaynağı olarak pluripotent kök hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşmaları kullanıldığında, 1,7 hücre kullanımı, önemli bir husus daha etkili olmasıdır.
hücre tedavisinin mekanizmaları çalışmak ötesinde, tanımlanmış Hect sistemi kardiyovasküler hücre-hücre etkileşimleri hücresel bazda incelenmesi sağlayacaktır. Doku const öncesinde hücrelerin biyolojisi Tedirgemekarışıklık, shRNAs örneğin, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini düzenleyen molekül mekanizmalarının incelenmesi izin verecektir. Doku mühendisliği sisteme ek bir avantajı, fonksiyonel kasılma yeteneğine sahip hizalanmış miyofibril oluşumudur. Bu nedenle, tanımlanan Hect sistemi kullanılarak, myofibril oluşumu, kardiyomiyosit gelişimi ve doku mimarisinin organizasyonu dinamikleri, tüm hücre-dışı matris veya hücre moleküler manipülasyona bileşenlerinin değiştirilmesi ile araştırılabilir. Hect sisteminin insan ve 3-D doğa ayrıca bulguların çevirilebilirlik artırır.
açıklanan sistem, kardiyovasküler biyolojinin temel soruları anlamak için güçlü bir yöntem sunarken, bu sınırlamalar olmadan değildir. İlk olarak, mühendislik dokular yenidoğan miyokard örneklerinden 7 yayınlanmış seğirme gücü verileri ile tutarlı bir olgunlaşmamış fenotip sergilerler. Ikenfenotipik immatüritesi hücre etkileşim mekanizmalarını değerlendirilmesinde bir karıştırıcı faktör olabilir, hastalıklı kardiyomyositler fetal gen programına 7,36-38 geri dair kanıtlar vardır. Hect sisteminden elde edilen bulgular başarısız kalp bağlamında ilgili olarak kanıtlamak, bu kalp tedavileri test etmek için avantajlı olabilir. protokol ayrıca doku yapımı sırasında bir HESC nitelikli bazal membran matris kullanır. Bu matrisin kompozisyonu sürü sürü değişebilir ve tanımlanmış bodrum matris alternatifleri bulunurken, bunlar hECTs bağlamında değerlendirilmelidir henüz.
Diğer sınırlamalar bir damar sisteminin eksikliği ve hiçbir sistem düzeyinde etkileşim etkileri içerir. dokuların büyüklüğü göz önüne alındığında, metabolik ihtiyaçlarının Difüzyon tarafından karşılanmaktadır hiçbir damar sistemi hücre canlılığı sağlamak için gereklidir. Ancak, endotel hücre sinyal belirli bir hücre terapisi önemli bir faktör olabilir. Bu durumda, endo belirli bir sayı iseendotel hücreleri basitçe doku yapımı sırasında tanımlanan hücre karışımına ilave edilebilir. Sistemler düzey etkileşimleri hücre mekanizmalarının anlaşılması için önemli olmakla birlikte, mühendislik doku sistemi sistematik mekanizma ele almak üzere sorunu basitleştirmek için bir indirgemeci bir yaklaşım sunuyor. Böyle veya parakrin sinyalizasyon sorguya komşu doku tiplerini ekleyerek bir bağışıklık tepkisi dahil lökositler olarak sistem ile ilgili etkiler, tanıtım yoluyla gerektiği gibi Karmaşıklık tanımlanan doku sistemine eklenebilir.
Bir araştırma aracı, tanımlanmış insan tasarlanmış kardiyak doku sistemi türe özgü insan hücrelerinin avantajları sunar, kontrollü biyokompleksliği, kontraktil fonksiyonun basit ve boyuna izleme ile biomimetik 3-D kültür ortamı, ve belli bir hücresel matris bileşimi vardır. Hect sistemi için gelecekteki tarifi faiz zekâ terapötik hücre tipi manipüle dahilHücre-hücre etkileşimi için belirli moleküler ayrıntıları araştırmak amacıyla doku GİRİŞ H siRNA veya shRNA önce. Buna ek olarak, daha ziyade, kalp hücreleri oluşturmak için hESC kullanmak yerine, mühendislik dokularının benzer kalp hastalığı belirtilerinin modellemek amacıyla kalıtsal mutasyonu ile hastaların uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kullanmak mümkündür. Böylece, belirlenen hücre popülasyonlarının insan mühendisliği kalp dokuları oluşturmak bizim yöntem kalp hastalığı olan hastalar için yeni tedavilerin gelişimini hızlandırmak yardımcı olmak için kalp hücre terapilerinin çalışmak için yeni yollar açmak için vaat ediyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma TJC, KDC, Amerikan BDG Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) araştırma hibe konseyi NIH / NHLBI PEN sözleşme HHSN268201000045C için NIH (1F30HL118923-01A1) tarafından desteklenmiştir Ek finansman rl NIH DRB 5T32GM008553-18 tarafından ve Sistemleri ve gelişimsel olarak NIDCR-Disiplinlerarası Eğitim bir staj olarak TJC sağlanmıştır kalp Derneği (12PRE12060254) RJ ve HKSAR Araştırma Hibe Konseyi (/ 11 T13-706 TBRS) Biyoloji ve Doğum Kusurları T32HD075735. Yazarlar ayrıca minnetle, teknik yardım için biyoreaktör ve Memduh Eldaly işleme ile yardım için New York City College of Zahn Merkezi'nde Arthur Autz kabul etmek istiyoruz. Biz de cömertçe insan mezenkimal kök hücreleri sağlamak için kalp farklılaşma tavsiye Dr. Kenneth Boheler, Dr. Joshua Hare teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10x PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
- Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
- Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
- Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
- Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
- Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
- Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
- Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
- Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
