Introduction
Активные Колонки Технология потока
Технология Активный поток (AFT) хроматографические колонки были недавно разработаны, чтобы преодолеть неэффективность разделения, связанных с неоднородностью потока 1-6, а также для того, чтобы мультиплексированный обнаружения. В данном сообщении мы подробно оперативный процесс параллельно на сегменты колонну потока (PSF) с мультиплексной детекции. Ключевые функциональные преимущества колонке ФСФ являются: (1) поток из радиального центральной области слой колонки изолирован от периферической или стенки области течения, (2) объем подвижной фазы, которые должны быть обработаны обнаружения Источник уменьшается, а источники (3) обнаружения могут быть объединены, чтобы расширить информацию об образце без привития задержки обнаружения на каждом процессе обнаружения, или впоследствии требуя расщепление потока послеколоночной потока 7,8. Ключевой особенностью в конструкции колонны ФСФ, что позволяет Advantage мультиплексированных обнаружения является новым выходной патрубок и фритты сборки. Рисунок 1 представляет собой фотографию кормовой колонне по сравнению с обычным колонке. Важно понимать, что процесс расщепления получены с использованием колонки параллельные сегментированный поток не такой же, как поток поток после колонки расщепления. В потоке потока после колонки разделить весь диапазон выборки от передней кромки к конечностей хвоста, отобранных поровну (т.е., по оси), тем самым, каждый поток поток равен по отношению к эффективности и чувствительности; величина чувствительности, таким образом, время делится на число расколов. В PSF, однако, образцы, расщепление группа радиально, не в осевом направлении. Таким образом, центральные образцы порта пик вершина - наиболее концентрированным области пика. Таким образом, чувствительность здесь высокая, как пик не разбавляется диффузного хвостовых области. Образец элюирование от периферийных портов не так эффективно, как и в Centraл зона, но, так как эта полоса пробы в радиальном направлении, а не в осевом направлении, ширина пика уже, чем было бы в случае для процесса отбора проб, который делит пика в осевом направлении, т.е. раскол после столбца. Таким образом, чувствительность при использовании зависимым от концентрации детектор не уменьшается.
В столбце ФСФ, фитинг на выходе содержит множество выпускных окон и на внутренней стороне этой концевой заделки есть расположен кольцевой фритты. Внутренняя часть этого кольцевых каналов фритты вытекать из колонны через радиальной центральной выпускного отверстия, в то время как радиальная внешняя часть розетки фритты каналов вытекать из колонны через периферийные стенки или область портов поток на выходе. Внутренние и наружные части выпускного фритты разделены непроницаемым барьером, который предотвращает сечения потока между этими областями потока 2. Вследствие этой конструкции центральный поток радиального потока через слой колонки отделяют от потока модулей стенки областиIDE колонки. Относительная доля потока из этих двух областей может изменяться почти любом желаемом соотношении под давлением через управление с целью оптимизации различных функциональных аспектов технологии колонны, такие как эффективность сепарации или чувствительности обнаружения. В сущности, эта конструкция эффективно устанавливает в большей колонке формате «виртуальной» колонки, имеющие узкую внутренний диаметр, а следовательно, и функции столбцов, как истинный стенки менее колонке, преодолевая столбца кровать неоднородность и настенные эффекты 9,10.
Основные преимущества колонн ФСФ являются повышение эффективности колонки, минимизации обработки растворителем для источника обнаружения (ов) и позволяет мультиплексированных обнаружения. Тем не менее, дополнительным преимуществом является то, что, поскольку хвостохранилище и выходящие участки любой группы удаляют из общего Профиль элюции растворенное вещество в элюирование или обнаружения присутствует в более высокой концентрации, чем в противном случае будет наблюдаться при тех же хolute инъекции и нагрузку концентрации на обычном столбце, в зависимости от сегментации отношение занятого. Как следствие, часто наблюдается усиление интенсивности сигнала для разделения, проводимых на ФСФ колонках 2. В самом деле, если отношение сегментации регулируют таким образом, что 25% из выходов потока из каждого из четырех портов выхода, интенсивность сигнала, что наблюдается с помощью ультра обнаружения (УФ) практически показывает точно такой же интенсивности сигнала, как очевидно, при использовании обычного Колонка где вся (100%) подвижной фазы анализируют 7. Кроме того, тонкая настройка соотношения продукта между регионами центральной и стеновых потока позволяет эффективность колонки должны быть оптимизированы. Прибыль в эффективность колонки, наблюдаемые с помощью AFT столбцы не может быть указано в одном значении, так как эти повышение эффективности являются функцией трех факторов: (1) скорость потока, (2) отношение сегментации, и (3) коэффициент удержания растворенного , Тем не менее, успехи в эффективности по сравнению с услentional колонки почти всегда наблюдается, и иногда эти доходы более чем на 100% по количеству теоретических тарелок 1,2. Возможность настраивать коэффициент сегментации позволяет аналитику адаптировать эффективно диаметр "виртуальной" колонны, и это является важным фактором по отношению к процессу обнаружения. Например, столбец виртуальный 2,1 мм внутренний диаметр (ID) устанавливается с физической 4,6 мм Идентификатор столбца, когда отношение сегментация 21% подвижной фазы при элюировании с радиальной центральной порта выхода. В этих условиях, виртуальный 2,1 мм колонка ID выполняет с эффективностью, которая может быть больше, чем 70% больше, чем обычный 2,1 мм Идентификатор столбца, в зависимости от скорости потока, растворенного вещества и фактора удерживания 10.
Текущий дизайн колонка ПСФ, который используется для обнаружения мультиплексного включает 4 порта выходного патрубка, но колонна может быть оснащена 2-порт конечного монтажа и, тем не менее, это ограничивает обнаружения тО только двух детекторов. Основная операция из этих колонн, однако, тот же, кроме того, что четыре детектора может быть соединен одновременно с 4-порт выходе из колонки ФСФ расширение сферы для мультиплексированного обнаружения. Помимо до и после колоночной соединительной трубки, только дополнительные требования для работы колонки ФРТ трубки, которые могут быть подключены к периферийным портам розетки и средством, с помощью которого количество подвижной фазы, проходящей через каждую пробирку могут быть измерены, как правило, либо измерение массы или объемный измерения. Для простоты настройки, внутренний диаметр трубы всего потока на выходе должна быть такой же. Отношение потока между периферийными и радиальными отверстиями Центральный выход затем изменяться посредством использования управления давлением, просто путем изменения длины трубопровода, расположенного на периферийной выходного патрубка, или высота столба трубки детектора на радиальной центральной выпускного отверстия.
Обнаружение Мультиплексное Использование ФСФ Колонны
Важным преимуществом колонн ФСФ в том, что каждое из отверстий выхода выпускных может быть подключен непосредственно к источнику обнаружения, что позволяет мультиплексированных обнаружения. В хорошо спроектированной системе обнаружения одного анализа с мультиплексной обнаружения может оказать существенную информацию в отношении характера компонентов в образце. Важно отметить, что деструктивные и неразрушающих испытаний могут быть проведены в одно и то же время, без задержки обнаружения. Это позволяет абсолютное назначение, например, антиоксиданты, используя ДФПГ • реагент, с компонентами наблюдается для элюирования с УФ и / или масс-спектрометрии (МС) ответов обнаружения 7,11. Таким образом, четыре независимых детекторов могут работать одновременно с соответствующими частями потока, направленных на каждого детектора с помощью любого из четырех выпускных патрубков. Поскольку поток через эти порты можно легко регулировать количество вещества, достигающего любой из детекторов могут быть скорректированы с учетомчувствительность данного источника детектора. Следует отметить, однако, что наиболее эффективным миграции растворенных веществ наблюдается через радиальный центральной выпускного отверстия. Каждый из периферийных портов предложить эквивалентную эффективность разделения, который при установке на 25% через каждый порт, лишь немного менее эффективен, чем обычный колонке. Таким образом, важно, что количественное детектор быть установлен, чтобы проанализировать образец от радиального центральной порта выхода.
При настройке столбец PSF с целью мультиплексирования обнаружения есть ряд соображений, которые должны быть сделаны, чтобы достичь эффективного и высокое качество результата; что размеры трубы для каждого порта, выбор которых порт для типа детектора и регулировки расхода.
Трубные Размеры для каждого порта
В хроматографии длина трубки после колоночной играет решающую роль в эффективности и производительности разделения. Большой DEAд-объем в результате длительного или широкой трубки из идентификаторов выходе из колонки на детекторе приведет к потере эффективности, разрешения и чувствительности. Таким образом, соответствующие размеры трубки должны быть использованы при создании столбца PSF для достижения максимального потенциала в обеспечении эффективного отделения, обеспечивая при преимущества мультиплексирования.
Порт для детектора
Фиг.2 представляет собой иллюстрацию типовой установки мультиплексированного обнаружения (Ультрафиолетовые-Видимый (U-Vis), масс-спектрометр (MS) и 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ •) обнаружения). На рисунке показан центральный порт присоединен к детектору MS, в то время как ДФПГ • и UV-VIS детекторы прикреплены к периферийным портам. Поскольку МС является наиболее чувствительным детектором из трех, поступать в этом детекторе была направлена от центрального выпускного отверстия. Как ДФПГ • обнаружение является селективным к presencе антиоксидантов, а наименее чувствительным и наиболее терпимы к уширения полос, течь этого детектора была направлена из периферийного порта. УФ-Вис было вторичным "родовое" детектор, так поступать этого детектора была направлена от второго периферийного порта.
Регулировка потока
После того, как соответствующие трубки был присоединен от порта к детектору, выходящий поток из каждого из детекторов можно регулировать до требуемого размера. Простой способ измерения количества потока, выходящего из каждого детектора взвешивать количество подвижной фазы, что элюирует через каждый порт в течение заданного периода времени. Процент потока таким образом, может быть определено, и отношения потоков можно регулировать путем либо сокращения или удлинения трубы, прикрепленный к выходной линии на детекторах, соответственно, чтобы удовлетворить требованиям детекторов выбора. Различные детекторы имеют различные требования потока, например, потока ячейкадетектор флуоресценции (ДПД) не расход ограничен, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать чрезмерного давления в проточной ячейке. Таким образом, контроль потока через FLD обычно достигается путем регулировки перепада давления других детекторов и остаток потока затем проходит через FLD. Детектор, чувствительный к сумме потока, которая предоставляется в МС. Как правило, текущие масс-спектрометры высокого класса могут легко обрабатывать около 1 до 1,5 мл / мин умеренно водной подвижной фазы. Выше этой скорости потока, наводнения источника может сделать MS строя. Тем не менее, чувствительность обнаружения в большинстве массовых спектрометров выгоду от использования более низких скоростей потока; следовательно, возможности расщепления PSF потока чрезвычайно полезны для приложений, связанных обнаружение MS. Высокое столбцов значения объемного расхода могут быть использованы, но с низкими нагрузками объем транспортируемых к детектору MS. Настройка потока на детектор MS, однако, должны быть сделаны путем изменения падения давления доДетектор МС, чем разместить МС. Здесь, использование узкой трубки отверстие (0,1 мм ID) очень полезно, поскольку давление можно легко регулировать без добавления несоответствующее мертвый объем.
В зависимости от типа детектора корректировка соотношения сегментации может быть сделано либо до или после детектора. Если неразрушающего детектора, например, используется в УФ-видимой, процент потока могут быть измерены и настроены после детектора. Если один детектор разрушительной используется в мультиплексном созданной процент потока определяется назад расчета по отношению к другим процентным потока порт. Если детектор на основе Реагент используют такие как ДФПГ • процент потока измеряется после детектора без добавления реагента; и если используют два или более разрушительным детекторы, то отношение потока измеряется предварительной детектор. Обнаружение системы, которые могут потребовать дополнительные приборы, такие ДФПГ • будет иметь дополнительное давление системы, которые могут изменить потокПроцент раз, подключенные к системе обнаружения. Таким образом, серьезное внимание следует уделить давления в системе деструктивного детектора, при регулировке потока процент предварительной детектора. Независимо от соотношения потока, который установлен через любой из портов, количественной информации должна быть получена с помощью соответствующего стандартизации. После того, как коэффициенты потока установлены, однако, они являются надежными, и они не изменяются даже при градиентных условий элюирования 7,
Детальный протокол видео сопровождающих эту рукопись призвана показать, как использовать и настраивать функционирование столбца PSF в режиме мультиплексирования обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол содержит инструкции о том, как использовать столбец PSF в системе ВЭЖХ в сочетании с несколькими детекторами для обнаружения мультиплексного. Протокол был написан при условии читатель имеет базовые знания и опыт работы в хроматографии и ВЭЖХ различных методов обнаружения.
Внимание: Пожалуйста, обратитесь к паспорте безопасности (MSDS) для всех материалов и реагентов перед использованием (т.е. паспорт безопасности для метанола). Обеспечивать использование всех соответствующих правил безопасности при работе с растворителями и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) элюент. Обеспечить надлежащее использование технических средств контроля ВЭЖХ, аналитические весы и детектор приборов, а также обеспечить использование средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, халат, полная длина брюк и закрытую обувь).
1. Настройка ВЭЖХ инструмент
- Подготовьте инструмент ВЭЖХ с сверхчистой воды (например, 100% Milli-Q воды) для Linе А и 100% метанола для линии В качестве подвижной фазы и очистить насосы согласно требованию производителя. Если один из датчиков, используемых в MS, как это здесь, добавьте 0,1% муравьиной кислоты в обоих подвижных фаз А и В.
- Настройка ВЭЖХ инструментальные компоненты и детекторы, как показано на фиг.2. Это требует удобного размещения детекторов относительно колонны таким образом, чтобы свести к минимуму мертвый объем между детектором и колонкой. Гибкость в конфигурации системы ВЭЖХ желательно.
2. Настройка УФ-Вис и MS-детекторов
- Установите детектор UV-VIS, чтобы в зависимости от образца интерес (например, 280 нм) на требуемой длины волны.
- Установите детектор MS в режиме положительного для анализа Общая Ион Граф (ТИЦ), используя метод обнаружения Полное сканирование. Кроме отрегулировать следующие параметры MS соответственно: температура испарителя 500 ° С, капиллярная температура 350 ° С, оболочка газа установлен в размере 60 единиц, вспомогательные газового потока40 и подметать поток газа на 5 единиц, и спрей напряжение 3,5 кВ. Эти параметры могут быть скорректированы позднее конкретных потребностей пользователей в зависимости от анализируемой пробе.
3. Получение 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила радикальной (ДФПГ •) реагента установки ДФПГ • System Detector
- Взвешивают 25 мг ДФПГ • и растворить в 250 мл метанола в мерной колбе.
- Добавить 250 мкл муравьиной кислоты в ДФПГ • реагента. Накройте колбу в фольгу, чтобы предотвратить воздействие света.
- Разрушать ультразвуком колбу, содержащую ДФПГ • реагент в течение 10 мин.
- Выпустите ДФПГ • насос с подготовленной ДФПГ • реагента согласно требованию изготовителя.
- Настройка ДФПГ • системы в соответствии с фиг.2, прилагая линию насоса к впускному отверстию тройника.
- Прикрепите 100 мкл реакционной катушку йе на выходе из тройника и присоединить другой конец реакционной катушки к детектору.
- Encase реакционной катушки в нагревателе колонки и установить температуру колонки нагревателя до 60 ° С.
- Установите ДФПГ •-Vis УФ детектор 520 нм.
4. Настройка ФСФ колонке
- Подключение входе колонки ФСФ к инструменту ВЭЖХ.
- Подключите центральный порт на детектор MS, используя 15 см длины 0,13 мм трубки идентификатора.
- Подключите периферийный порт с детектором UV-VIS, используя 15 см длины 0,13 мм трубки идентификатора.
- Подключите другой периферийный порт в T-кусок ДФПГ • системы обнаружения с использованием 15 см длины 0,13 мм трубки идентификатора.
- Блок неиспользованную периферийный порт с помощью столбца пробку.
- Доведите скорость потока насоса ВЭЖХ до 1 мл мин-1 при 100% линии В - 100% метаноле (0,1% муравьиная кислота).
- Уравновешивают колонку с 100% -ным метанолом сотовыASE в течение 20 мин для 4,6 мм внутренний диаметр х 250 колонны длиной мм. На этот раз масштабируется в соответствии с размерами других столбцов пользователь может используют.
5. Настройка колонна PSF для обнаружения мультиплексного
- Измерить массу по меньшей мере двух пустых сосудов сбора (по одному на порт, соединенный с детектором UV-VIS и один для ДФПГ • детектора) с использованием аналитических весов.
- Соберите подвижной фазы от УФ-Вис и в ДФПГ • портов в двух отдельных, заранее взвесить сосудов сбора (5.1). Запишите период времени для сбора. Собирают по крайней мере, 500 мг растворителя в каждом сосуде.
- Взвесьте сосуды сбора и определения массы подвижной фазы. Учитывая плотность метанола 0,791 г мл -1, определяют объем подвижной фазы, полученной от каждого порта.
- По разности, то есть Номинальный расход насоса набор минус расход через ДФПГ • и УФ-Вис DetectoПорты г потока, определить расход на детектор MS. Экспресс каждый часть потока в процентах от общего потока.
Примечание: В идеальном случае проценты потока являются: МС 18% от общего расхода, к UV-VIS 22%, в ДФПГ • детектор 60%. - Если нет, отрегулируйте процент потока путем изменения обратного давления на детекторе УФ-Вис. Например, если поток к УФ-Вид слишком высока, уменьшить долю добавлением добавить 15 см секцию 0,13 мм трубки идентификатор выходе детектора UV-VIS. Затем повторите шаги 5.1 до 5.5.
6. Заключительные условия установки
- Установите расход реагента ДФПГ • насоса к той же скорости потока, выходящего из выпускного отверстия, подключенный к ДФПГ • детектора.
Примечание: В столбце PSF мультиплексирован с UV-VIS, ДФПГ • и МС готов для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мультиплексированном анализ ВЭЖХ проводили с использованием AFT колонки в режиме ФСФ (рис 1) и установить, как показано на рисунке 2. Этот тип установки позволили образец кофе, которые будут проанализированы одновременно с помощью UV-VIS, DPPH • и магистра в области Total Ион Граф режим (ТИЦ). Соединения образца кофе, которые ответили на ДФПГ • Затем может быть легко подобран к UV-VIS и MS - ответов TIC на основе выравнивания времени удерживания, как показано на рисунке 3, так как хроматограммы были записаны одновременно. Где положительный ответ был замечен с детектором МС-TIC, молекулярная масса пика был записан. В таблице 1 приведены времена удерживания ДФПГ • пиков, и реакция таких пиков в УФ-видимой и / или МС Детектор, который, таким образом, при условии, что молекулярная масса. Легкость в соответствие пики между различными процессами обнаружения допускается AFАСТ и более эффективной формой скрининга и характеристики для комплексного образца, таких как кофе.
Рисунок 1. Изображение активной колонке Technology потока по сравнению с обычным колонке. Кормовой колонка снабжена выходной патрубок четырехоконной, где находится кольцевой фритты благоприятных пик выборки по радиальное сечение образца группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 2. Пример иллюстрация мультиплексированных устройством ВЭЖХ с использованием колонки с PSF ДФПГ •, UV-VIS и МС детекторов. Каждый Detecto R присоединен к отдельному выпускного отверстия. В этом случае МС используется для количественного и установить, чтобы собрать образец от радиальной центральной выпускного отверстия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. хроматограммы кофейного анализируемого образца с помощью мультиплексной системы ВЭЖХ с использованием колонки с PSF ДФПГ •, UV-VIS и МС детекторов: (а) ДФПГ • 520 нм, (б) УФ-Вид 280 нм, (с ) МС - ТИЦ. Каждый детектор следов совершенно совпадает во времени, так что смещение регулировка не требуется для того, чтобы компенсировать время простоя между каждым детектором.Arget = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Кофе ДФПГ • Пик Ответ и массовых | |||||
| ДФПГ • Пик | Время удержания | ДФПГ • | УФ-Вид | МС - ТИЦ Ответ | Масса |
| (мин) | отклик | отклик | |||
| 1 | 6,74 | да | да | да | 123,84 |
| 2 </ TD> | 7,54 | да | да | да | 125,83 |
| 3 | 8.94 | да | Нет | Нет | - |
| 4 | 10.05 | да | Нет | да | 135.83 |
| 5 | 13.15 | да | Нет | Нет | - |
| 6 | 16.22 | да | Нет | Нет | - |
| 7 | 18.14 | да | да | да | 126.82 |
| 8 | 19.4 | да | да | да | 162.81 |
| 9 | 20.46 | да | да | да | 187,89 |
| 10 | 24.71 | да | да | да | 162.81 |
| 11 | 26.27 | да | да | да | 162,8 |
| 12 | 26.97 | да | да | да | 194,87 |
| 13 | 31.84 | да | да | да | 162,8 |
| 14 | 32.02 | да | да | да | 162,78 | 15 | 32.56 | да | да | да | 176,82 |
| 16 | 33.94 | да | да | да | 176.83 |
| 17 | 41.26 | да | да | Нет | - |
| 18 | 42.72 | да | Нет | да | 284,93 |
| 19 | 46.07 | да | да | да | 190,83 |
| 20 | 49.21 | да | да | да | 162,75 |
Таблица 1. Обнаружен ДФПГ • пики ответ на UV-VIS и MS - TIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование включает в себя характеристику и профилирование с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии кофе с мультиплексированных обнаружения с использованием колонки параллельно сегментированный поток (PSF). Мультиплексный методом ВЭЖХ с использованием колонки ФСФ позволяет характеристику и определение ключевых химических объектов путем уменьшения сложности данных образца в то время как получение более высокой степени информации молекулы конкретных пределах фракции времени, которое требуется при использовании обычных процессов с участием многих обнаружения. Колонка PSF позволяет не только платформу для мультиплексированного обнаружения, но и сочетание обоих разрушительных и неразрушающего детекторов, без дополнительного мертвого объема и трубки. ДФПГ •, в УФ-видимой и МС (TIC) были мультиплексированы для анализа кофе эспрессо.
Колонна PSF-4 порт используется для мультиплексированного анализа кофе с использованием трех различных детекторов. Центральный порт выходе из колонки ПСФ был подключен к детектору MS и два Автошоуе периферийные порты подключен либо к ДФПГ • системы обнаружения или детектором UV-VIS. Третий доступны периферийный порт не используется, и поэтому блокируется с колонной пробкой, но это можно было бы использовать для сбора образца, или для другого детектора. Процесс настройки этого мультиплексной настроить конкретно к детектору, где произошло измерение сегментации потока пост-детектор для УФ-Вис и ДФПГ • систем обнаружения. Поскольку МС является разрушающим детектор, процент потока была определена разность (общего номинального расхода минус потока от других портов выход).
В этом исследовании, анализ кофе с ДФПГ • реагента в результате 20 хорошо разрешенных пиков, 13 из которых также показали ответ в детекторах UV-VIS и MS. Рисунок 3 сравнивает хроматограммы, полученные каждого детектора. Есть четыре региона, которые имеют тот же профиль хроматографического внутри каждогоХроматограмма, указывается красные коробки. В этих коробках, где УФ-Вид и МС показали слабую реакцию на этих соединений, было сильное ответ от ДФПГ • детектора. Четыре компонента, которые ответили на ДФПГ • реагента не были обнаружены либо детекторов UV-VIS или MS и три из компонентов, которые откликнулись на ДФПГ • реагента не дал никакого ответа UV-VIS или MS вообще. Молекулярная масса компонентов, которые откликнулись на МС приведены в таблице 1. Компонент, который элюировали в 10 мин был сильный ДФПГ • ответ, без ответа от детектора UV-VIS и только очень небольшой ответ от детектора MS ,
Муфта из AFT столбца в режиме ФСФ дал возможность запуска нескольких детекторов в режиме мультиплексирования, где все детекторы, независимо от требований ВЭЖХ-детектор были запущены одновременно в одной инъекции и разделения этой сложной SAMPле. Мульти-порт тяги Место дизайн кормовой колонки предлагает дополнительное преимущество предоставления возможности для мультиплексирования процессов обнаружения, уступая подробную информацию образец и абсолютную надежность в присвоении компонентов между каждом режиме обнаружения. Мультиплексный обнаружение с колоннами ФСФ условии большого количества образцов информации, трех детекторов работают одновременно в течение времени, необходимого для выполнения одного детектора. Точное совпадение времени удерживания пиков в пределах каждого режима обнаружения было невозможно. Два из детекторов, используемых были деструктивные детекторы.
Мультиплексирования возможности колонке ФСФ, однако ограничен доступными инструментальными компонентов ВЭЖХ и приборов для обнаружения. Данный метод требует несколько методов обнаружения и необходимые дополнения для каждого конкретного режима обнаружения, т.е., насосы, катушки реакции, обогреватели и т.д. Основное преимущество мультиплексирования обнаружения с использованием колонки PSF одно и то доведениеп во времени анализа до четырех раз (при использовании 4 детекторы), что минимизирует изменчивость выборки между анализы для каждого отдельного режима обнаружения. Кроме того, назначение компонентного отношения внутри образца обнаружены с одного детектора на другой гораздо проще, и менее склонны к ошибке, чем если каждый детектор были использованы отдельно. Это позволяет избежать несоответствия в компоненте заданий, которые часто является проблемой в анализе сложных образцов.
Это важно подчеркнуть, что количественное должны быть сделаны на основе детектора, расположенного на радиальной центральной выпускного отверстия, так как эффективность разделения здесь самая высокая, следовательно, пик эффекты хвостохранилища являются минимальными и количественное, таким образом, наиболее точным. Сегментация поток был показан, чтобы быть надежным путем анализа, но даже это так, то хорошей лабораторной практики поддерживать регулярные стандартизации. Следовательно, в любой количественной работы важно, чтобы запустить стандартов по мере необходимости. Если детектор используется чистыйлы как средство понимания сложности пробы через визуальной информации выборки составляющих, количественное может не потребоваться, как это имеет место здесь протокола обнаружения антиоксидантной ответ.
Мы показали здесь пример тройной обнаружения, УФ, МС и антиоксидантной реагировать обнаружения. Мультиплексные системы обнаружения, использующие AFT столбцы могут быть использованы практически в любой ситуации, когда аналитики требует многомерного информацию образец, и это включает в себя несколько протоколов обнаружения. Использование AFT колонки значительно упростить и ускорить процесс выборки характеристик.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
