Introduction
Aktif Akış Teknoloji Sütunlar
Aktif akım teknolojisi (AFT) kromatografi kolonları son zamanlarda akış heterojenite 1-6 ile bağlantılı ayrımları verimsizliğe üstesinden gelmek için geliştirilmiş ve aynı zamanda mültipleksli algılamayı etkinleştirmek için. Bu özel iletişim ayrıntılarıyla paralel operasyonel süreç mültipleksli algılama ile akış (PSF) sütun bölümlenmiş. PSF kolonun temel fonksiyonel avantajlar şunlardır: (1) kolon yatak radyal merkezi bölgeden akışı, (2), bir tespit tarafından işlenen mobil faz hacim akışının çevre ya da duvar bölgesinden izole edilir Kaynak azalır, ve (3) algılama kaynakları her algılama süreci boyunca tespit gecikmeleri instilling veya sonradan yazılan sütun akışın 7,8 yarma gerektirmeden örnek bilgileri genişletmek için çoğaltılmış olabilir. A sağlayan PSF sütunun tasarımında anahtar özelliğibirden fazla mesaj saptama dvantage yeni çıkış bağlantı ve frit düzeneği olup. 1, geleneksel bir kolona kıyasla AFT kolonun bir fotoğrafıdır. Bu bölme işlemi sonrası kolon akış akış bölme aynı değildir paralel parçalı akış sütunlar kullanılarak elde anlamak için önemlidir. Bir post kolon akımdan (yani, eksenel), böylece her bir akış akışı verimliliği ve duyarlılık ile eşit derecede örneklenir kuyruk ekstremitelere lider kenarından tüm numune bandı bölünmüş; duyarlılık büyüklüğü dolayısıyla sayısı böler tarafından bölünmüş. PSF ise, bölme işlemi örnekleri bant radyal, eksenel değil. Bu nedenle, merkez liman örnekleri zirve apeks - tepe en konsantre bölgesi. Pik yaygın atık bölgeye göre seyreltilmiş değildir Böylece, burada hassasiyet yüksektir. Periferik bağlantı noktalarından elüsyon Örnek merkezindeki kadar etkili değildirbandı yerine eksenel olarak daha radyal olarak örneklenmiş olduğu için l bölgesi, ancak, tepe genişliği, örneğin, eksenel yönde bir Kolon sonrası bölünme tepe bölen bir numune alma işlemi için olacağından daha dardır. Bu nedenle, konsantrasyon bağımlı bir detektör ile hassasiyet azaltılmaz.
PSF sütununda, çıkış bağlantı çok sayıda çıkış ağızlarından oluşan ve montaj bu amaçla iç kısmında halka şeklinde bir cam hamuru vardır yer almaktadır. Çıkış hamuru kanallarının dış radyal kısmı çevresel veya duvar kısmı çıkış akış portları yoluyla kolondan dışarı akarlar ise, bu halka şeklindeki frit kanallarının iç kısım, radyal merkezi çıkış portu üzerinden kolondan dışarı akarlar. Çıkış frit iç ve dış kısımlar, bu akım bölgeleri 2 arasındaki çapraz akışını önleyen bir geçirmez bir bariyer ile ayrılır. Bu tasarımın bir sonucu olarak, kolon yatağı üzerinden merkezi radyal akış akımı duvar kısmı akış bileşenler ayrılırsütun ide. Bu iki bölgeden akışının ilgili kısım bu tür bir ayırma verimliliği veya algılama hassasiyeti sütun teknolojinin çeşitli fonksiyonel yönleri, optimize etmek için, basınç yönetimi hemen hemen herhangi bir arzu edilen orana değiştirilebilir. Özünde, bu tasarım etkili bir dar iç çapa sahip, geniş formatlı sütununda bir 'sanal' sütunu içinde kurar ve kolon yatak heterojenitesini ve duvar efektleri 9,10 üstesinden gerçek bir duvar daha az sütun olarak dolayısıyla kolon fonksiyonları.
PSF sütunların önemli faydaları kolon verimliliği, algılama kaynağı (lar) ve mültipleksli algılama etkinleştirmek için çözücü işlem minimize gelişmeler vardır. Bununla birlikte, ek bir avantajı, herhangi bir bandın atık ve önü bölgeleri genel elüsyon çıkarılır, çünkü elüsyon veya saptama de çözünmüş madde profili olmasıdır, aksi takdirde, aynı s gözlemlenen edilenden daha yüksek bir konsantrasyonda mevcut olduğuKullanılan bölütleme oranına bağlı olarak, geleneksel bir sütun üzerinde enjeksiyon ve konsantrasyon yük olute. Bunun bir sonucu olarak genellikle PSF sütun 2 üzerinde yapılan ayırımlar için sinyal yoğunluğundaki bir kazanç olduğu gözlemlendi. Aslında, bölütleme oranı, dört çıkış ağızlarının her biri akış çıkış% 25, mor ötesi (UV) algılama kullanılarak gözlenir sinyal yoğunluğu, geleneksel bir ile belirgin olarak aynı sinyal yoğunluğu pratik gösterir, öyle ki düzeltilmiş olup olmadığını Hareketli fazın tamamı (% 100) 7 incelendiğinde kolonu. Ayrıca, merkez ve çeper akış bölgeleri arasındaki çıkış oranı ince ayar kolon verimliliği optimize edilmesini sağlar. (1) debi, (2) segmentasyon oranı ve (3) çözünen tutma faktörü: Sütun verimliliği kazançlar bu verimlilik kazançları üç faktörün fonksiyonu olduğundan, tek bir değere ifade edilemez AFT sütunlarını kullanarak gözlenen . Bununla birlikte, verimlilik kazanımları conv göreentional sütunlar hemen hemen her zaman gözlenir ve bazen bu kazanımlar teorik plaka 1,2 sayısında% 100'den fazla bulunmaktadır. Ayarlamak için yeteneği segmentasyon oranı analisti etkin bir 'sanal' sütununun çapı terzi sağlar ve bu algılama sürecine ilişkin önemli bir faktördür. Bölütleme nispeti dairesel merkez çıkış portundan elüsyon mobil faz% 21 olduğu zaman, örneğin, bir sanal 2.1 mm iç çapı (id) kolonu, fiziksel bir 4.6 mm id kolonundan kurulur. Bu koşullar altında, 2.1 mm id, sanal sütun, akış hızına bağlı olarak, geleneksel bir 2.1 mm id sütun daha fazla% 70 daha büyük olabilir verimlilik ve çözünen tutma faktörü 10 ile gerçekleştirir.
Mültipleksli tespiti için kullanılan geçerli PSF kolon tasarımı 4-portlu uydurma çıkış içeriyor, ancak sütun takılabilir 2 port uç parçası da, ancak, bu algılama t sınırlarSadece iki dedektör o. Bu dört dedektörleri mültipleksli tespiti için kapsamının genişletilmesi 4-port çıkış PSF sütun aynı anda bağlanabilir dışında bu sütunlardan temel çalışma, ancak, aynıdır. Kenara öncesi ve sonrası kolon bağ borudan, sadece ek gereklilikleri PSF sütun periferal çıkış delikleri bağlanabilir boru ve her tüpe geçen mobil faz miktarı ölçülebilir hangi bir vasıta olup çalıştırmak için, tipik bir kitle ölçümü veya hacimsel ölçüm ya. Ayarlama kolaylığı açısından, bütün çıkış akış boru iç çapı ile aynı olmalıdır. Periferik ve santral radyal çıkış limanları arasında akış oranı daha sonra sadece uydurma periferal çıkışında, veya radyal merkezi çıkış noktası üzerinde tüp sonrası dedektör uzunluğu bulunan boru uzunluğunu değiştirerek, basınç yönetimi kullanımı yoluyla değiştirilir.
Multiplexed Algılama PSF sütunlar kullanma
PSF gruplarından önemli bir avantajı, çıkış çıkış ağızlarının her biri, böylece birden fazla mesaj saptama sağlayan bir algılama kaynağına doğrudan bağlanabilir olmasıdır. Iyi tasarlanmış bir tespit sistemi olarak birden fazla mesaj göndermiş algılama ile tek bir analiz numunesi içindeki bileşenlerin doğası ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir. Önemlisi, yıkıcı ve tahribatsız testler algılama gecikmeden, tam olarak aynı anda yapılabilir. Bu bileşenler UV ve / veya kütle spektrometrisi (MS) tespit yanıtları 7,11 ile elüte gözlenmiştir ile DPPH • reaktifi kullanılarak, örnek, bir anti-oksidan için, mutlak atanmasına olanak verir. Bu nedenle, dört bağımsız detektörler, dört çıkış portu üzerinden her bir detektöre yönlendirilir akış uygun oranlarda eşzamanlı olarak çalıştırılabilir. Bu bağlantı noktaları üzerinden akışı kolayca dedektörleri herhangi ulaşan çözünen miktarı ayarlanabilir beri takım elbise ayarlanabilirAyrıca dedektörün kaynağının hassasiyeti. Bu en etkili çözünen geçiş radyal merkezi çıkış deliğinden görülmektedir ki, not edilmelidir. Periferik limanların her her port üzerinden% 25 olarak ayarlandığında, sadece biraz daha az verimli geleneksel sütunda daha eşdeğer ayırma verimliliği, sunuyoruz. Bunun gibi, nicel dedektör radyal merkezi çıkış ağzının numunenin analiz etmek için ayarlanmış olması önemlidir.
Çoğullama tespiti amacıyla bir PSF sütun kurarken, verimli ve yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için yapılması gereken hususlar bir dizi vardır; her port için tüp boyutları olduğunu, seçim dedektörü ve akış ayarlaması türü için hangi port.
Her Limanı için Tüp Boyutları
Kromatografide Kolon sonrası boru uzunluğu ayırma verimliliği ve performansında önemli bir rol oynar. Büyük deadetektöre kolon çıkışında, uzun ve geniş id boru sonucu d hacimli verimliliği, çözünürlük ve hassasiyet kaybına neden olur. Çoğullama faydalarını sağlarken etkili ayırma sağlayan maksimum potansiyel ulaşmak için PSF sütun kurarken Böylece, uygun boru ölçüleri kullanılmalıdır.
Dedektör Port
Şekil 2, birden fazla mesaj saptama (Ultraviyole-Görünür (U-Vis), kütle spektrometresi (MS) ve 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) • tespiti) bir örnek kurulumun bir gösterimidir. Illüstrasyon, merkezi liman DPPH • oysa MS dedektör bağlı olduğu ve UV-Vis dedektörleri periferik limanlarına bağlı olduğunuzu gösterir. MS üç en hassas dedektör olduğundan, merkezi çıkış deliğinden yönettiği bu dedektöre akar. DPPH • algılama gibi presenc seçicidirantioksidanların e ve bu dedektöre akış, en az duyarlı ve bant genişlemesine en hoşgörülü bir çevresel limandan yönetilmiştir. UV-Vis ikincil 'genel' dedektör olduğunu, bu yüzden ikinci bir çevresel limandan yönettiği bu dedektöre akar.
Akış Ayarı
Uygun boru dedektöre bir limandan bir kere yerleştirildikten sonra, dedektörden her biri çıkan akım gerekli miktara ayarlanabilir. Her dedektör çıkan akış miktarını ölçmek için basit bir yolu zaman belirli bir süre boyunca her port üzerinden elutes mobil faz miktarını tartmak etmektir. Yüzde akışı böylece tespit edilebilir ve akış oranları kısaltılması veya buna uygun olarak tercih edilen detektör gereksinimlerine uygun detektör üzerindeki çıkış hattına bağlı boru uzatma biri tarafından ayarlanabilir. Farklı detektörler, örneğin, akış hücresi, akış farklı gereksinimleri vardırBir floresan dedektörü (FLD) oranı sınırlı akış değil, ama bakım akış hücresi aşırı basınçlandırma önlemek için alınmalıdır. Bu nedenle FLD boyunca akış kontrolü genellikle, diğer dedektör boyunca basınç düşüşünü ve akışın geri kalan daha sonra FLD geçer ayarlanmasıyla elde edilir. Teslim edilir akış miktarı duyarlı olan bir detektör, MS olup. Genellikle, mevcut yüksek uç kütle spektrometre kolayca yaklaşık 1 ila 1.5 ml / orta sulu mobil faz min işleyebilir. Bu akış hızının üzerinde, kaynağın sel MS çalışamaz hale getirebilir. Ancak, çoğu kitle spektrometrelerde algılama hassasiyeti düşük akış oranları kullanılarak yararlandı; dolayısıyla PSF akış bölme yetenekleri, MS algılama içeren uygulamalar için son derece faydalıdır. Yüksek kolon hacimsel debiler ancak MS dedektör taşınan düşük hacimli yükleri ile, kullanılabilir. MS detektöre akış ayarlama Bununla birlikte, önceki basınç düşüşü ayarlama yapılmalıdırMS dedektör yerine yazılan MS. Basınç kolayca uygunsuz ölü hacim eklemeden ayarlanabilir olarak Burada, dar delik boru (0.1 mm id) kullanımı çok yararlıdır.
Dedektör tipine segmentasyon oranının ayarlanması bağlı öncesi ya da sonrası her iki dedektör yapılabilir. UV-Vis kullanıldığı gibi bir tahribatsız dedektör, akış yüzdesi ölçülür ve sonrası dedektörü ayarlanmış olsaydı. Tek bir yıkıcı dedektör kurmak multipleks kullanılması durumunda akış yüzdesi geri diğer liman akış yüzdeleri bakımından hesaplanarak belirlenir. Reaktif detektör gibi DPPH • olarak kullanılır ise, akış oranı reajanı eklenmesi olmaksızın direk detektörü ölçülür; İki veya daha fazla yıkıcı dedektörleri kullanılırsa, o zaman akış oranı öncesi dedektör ölçülür. Algılama ek enstrümantasyon gibi DPPH • gerektirebilir sistemleri, akış değiştirebilir ekstra sistem basıncını olacakyüzde kez algılama sistemine bağlı. Bu nedenle, dikkatli bir değerlendirme yıkıcı bir dedektörün sistem basıncı, debi oranını ayarlayarak ön dedektöre dikkat edilmelidir. Bakılmaksızın port herhangi aracılığıyla ayarlanır akış oranı, kantitatif bilgiler uygun standardizasyon yoluyla elde edilmelidir. Akış oranları ayarlandıktan sonra, ancak, bunlar sağlam ve hatta gradient çıkma koşulları 7 altında değişmeyen,
Bu yazının eşlik ayrıntılı video protokolü algılama çoklanmış modda PSF sütun işleyişini kullanmak ve ayarlamak nasıl göstermek için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu protokol mültipleksli tespiti için birden fazla dedektörleri ile birleştiğinde bir HPLC sistemi üzerinde bir PSF sütununu nasıl kullanılacağı ile ilgili talimatları içerir. Protokol okuyucu varsayarak kromatografi ve çeşitli HPLC algılama yöntemleri temel bilgi ve deneyime sahiptir yazılmıştır.
Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. Çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrolleri uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı ayakkabı ayak) kullanımını sağlamaktadır.
HPLC Enstrüman 1. Setup
- Lin için, aşırı saf su (örneğin,% 100 Milli-Q su) HPLC aleti hazırlayıne A ve mobil faz olarak B hattı için% 100 metanol ve üretici şartının olarak pompalar temizlemek. Kullanılan dedektörlerin biri MS ise burada olduğu gibi, hem mobil fazlar A ve B için% 0.1 formik asit eklemek
- Dedektör ve sütun arasındaki ölü hacmi en aza indirmek amacıyla, Şekil 2'de gösterildiği gibi HPLC enstrümantal parça ve dedektörler ayarlayın. Bu sütuna göre dedektörlerin uygun yerleştirilmesi gerekir. HPLC sistemi yapılandırmasında esneklik istenmektedir.
UV-Vis ve MS Dedektörleri 2. Kurulum
- İlgili örnek (örneğin, 280 nm) bağlı istenen dalga boyuna UV-Vis detektörü ayarlayın.
- Tam Tarama algılama yöntemi kullanılarak toplam İyon Sayısı (TIC) analizi için pozitif modda MS dedektörü ayarlayın. Ayrıca buna göre aşağıdaki MS parametrelerini ayarlamak: buharlaştırıcı sıcaklığı 500 60 birimlik bir oranda, yardımcı gaz akışı ayarlanır ° C, kılcal sıcaklığı 350 ° C, kılıf gaz40 ve 5 adet gaz akışı, ve sprey voltajı 3.5 kV süpürme. Bu ayarlar, numune analiz edilen bağımlı özel kullanıcı ihtiyaçlarına daha sonra ayarlanabilir.
DPPH • Sistem Dedektörü 2,2-Difenil-1 picrylhydrazyl Radikal (DPPH) • Reaktif Kur'un 3. Hazırlık
- DPPH • 25 mg tartılır ve volümetrik bir şişede 250 ml metanol içinde çözülür.
- DPPH • reaktifine formik asit 250 ul ekle. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo balon örtün.
- 10 dakika boyunca DPPH • reaktifi ihtiva eden bir şişeye sonikasyon.
- Üreticinin şartının gibi hazırlanan DPPH • reaktif ile DPPH • Pompayı temizleyin.
- T-parçasının girişine pompa hattı takarak Şekil 2'ye göre DPPH • sistemi kurmak.
- Inci bir 100 ul reaksiyon bobin takınT-parçasının e çıkış ve dedektör reaksiyon bobin diğer ucunu takın.
- Ve bir sütun ısıtıcı reaksiyon bobini örten 60 ° C kolon ısıtıcı sıcaklığını ayarlamak.
- 520 nm DPPH • UV-Vis detektörü ayarlayın.
PSF Sütun 4. Kur
- HPLC cihazına PSF sütunun girişini bağlayınız.
- 0,13 mm id bir boru uzunluğu 15 cm kullanarak MS dedektörü merkezi bağlantısı.
- 0,13 mm id bir boru uzunluğu 15 cm kullanılarak UV-Vis dedektörü çevresel bir bağlantı noktası bağlayın.
- 0,13 mm id bir boru uzunluğu 15 cm kullanarak DPPH • algılama sisteminin T-parçasına bir çevresel bağlantı noktası bağlayın.
- Bir sütun tıpa kullanarak kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin.
- 1 ml dk HPLC pompası akış hızını getirmek -1% 100 hattı B -% 100 metanol (% 0.1 formik asit).
- % 100 metanol mobil ph ile kolon dengeyeBir 4.6 mm id x 250 mm uzunlukta sütun için 20 dakika boyunca ase. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre tartılır.
5. Multiplexed Algılama için PSF Sütun Tuning
- En az iki boş toplama gemiler bir analitik terazi kullanılarak (DPPH • dedektörü UV-Vis dedektör ve birine bağlı port için bir) kütlesi ölçün.
- Iki ayrı, önceden tartılmış toplama kaplarının (5,1) içine, UV-Vis ve DPPH • bağlantı noktaları mobil fazı toplayın. Toplanması için süreyi kaydedin. Her bir kap içinde solventin en az 500 mg toplayın.
- Toplama kabının tartın ve mobil faz kütlesini belirler. 0.791 g ml -1 metanol yoğunluğu göz önüne alındığında, her bir port toplanan mobil faz hacmi belirlemek.
- Fark ile, yani anma pompa seti debisi eksi DPPH • aracılığıyla akış hızı ve UV-Vis Detector akış portu, MS dedektöre akış hızını belirler. Toplam akışın bir yüzdesi olarak, her bir akış oranını ifade eder.
Not: İdeal olarak, akış oranları aşağıdaki gibidir: MS toplam akış hızının% 18 da, UV-Vis% 22, DPPH • detektörü 60% kadar. - Eğer değilse, UV-Vis detektörü arka basıncı değiştirerek akış yüzdelerini ayarlayın. UV-Vis akış çok yüksek ise, örneğin, UV-Vis detektörü çıkışına 0,13 mm id bir boru 15 cm bölüm eklemek ekleyerek oranını azaltır. Sonra 5.5 adımları 5.1 tekrarlayın.
6. Final Kurulum Koşullar
- DPPH • detektöre bağlanan çıkış ağzı terk eden, aynı akış hızına DPPH • reaktifi pompa akış hızını ayarlayın.
Not: UV-Vis ile çoğullanır PSF sütun, DPPH • ve MS şimdi analiz için hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir multiplekslenmiş HPLC analizi PSF modunda (Şekil 1) bir AFT kolonu kullanılarak gerçekleştirilen ve Şekil 2 'de gösterildiği gibi oluşturuldu. Kurulum Bu tür kahve numunesi toplam UV-Vis, DPPH • ve MS kullanılarak eş zamanlı olarak analiz edilmesine izin İyon Sayısı (TIC) modu. Şekil 3'te görüldüğü gibi kromatogramları eş zamanlı olarak kaydedildi beri, tutma süresi uyum dayalı TIC tepkiler - DPPH • yanıtladı kahve örnek bileşikleri daha sonra kolayca UV-Vis ve MS kadar uyumlu olabilir. Olumlu bir yanıt MS-TIC dedektörden görüldü yerlerde, pik molekül kütlesi DPPH • doruklarına tutma süreleri Tablo. 1 listeleri kaydedildi ve UV-Vis ve / veya MS gibi zirvelerin tepkisi oldu Böylece, moleküler kütlesi mesafede dedektör. Af için izin verilen farklı algılama süreçleri arasındaki doruklarına eşleşen kolaylığıKarmaşık bir örnek için tarama ve karakterizasyonu ast ve daha verimli formu gibi kahve.
Şekil 1. geleneksel sütuna göre Aktif Akış Teknoloji sütunun bir görüntü. AFT sütun örnek bandının radyal kesiti boyunca zirve örnekleme sağlayan halka şeklindeki frit evler dört liman çıkış montaj ile donatılmıştır. Görüntülemek için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.
DPPH • UV-Vis ve MS dedektörleri ile PSF sütunu kullanarak Şekil 2. bir mültipleksli HPLC düzenlemesinin bir örneği illüstrasyon. Her Detecto r, ayrı bir çıkış deliğine bağlanır. Bu durumda, MS ölçümü için kullanılan ve radyal merkez çıkış noktasından örnek toplamak için ayarlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. DPPH • UV-Vis ve MS dedektörleri ile PSF kolon kullanılarak, bir HPLC sistemi birden fazla mesaj ile analiz kahve örnek kromatogramları: 520 nm • (a) DPPH, (b) UV-Vis 280 nm, (c ) MS - TIC. Her dedektör iz zaman içinde mükemmel bir tesadüf değildir, bu nedenle ofset ayarı her bir dedektörün arasında ölü zaman telafi etmek için gereklidir.arget = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Kahve DPPH • Tepe Tepki ve Kütle | |||||
| DPPH • Tepe | Alıkonma Süresi | DPPH • | UV-Vis | MS - TIC Tepki | kitle |
| (dakika) | Tepki | Tepki | |||
| 1 | 6.74 | Evet | Evet | Evet | 123,84 |
| 2. </ td> | 7.54 | Evet | Evet | Evet | 125,83 |
| 3 | 8.94 | Evet | Hayır | Hayır | - |
| 4 | 10.05 | Evet | Hayır | Evet | 135,83 |
| 5 | 13.15 | Evet | Hayır | Hayır | - |
| 6 | 16.22 | Evet | Hayır | Hayır | - |
| 7 | 18.14 | Evet | Evet | Evet | 126,82 |
| 8 | 19.4 | Evet | Evet | Evet | 162,81 |
| 9 | 20.46 | Evet | Evet | Evet | 187,89 |
| 10 | 24,71 | Evet | Evet | Evet | 162,81 |
| 11 | 26,27 | Evet | Evet | Evet | 162,8 |
| 12 | 26,97 | Evet | Evet | Evet | 194,87 |
| 13 | 31,84 | Evet | Evet | Evet | 162,8 |
| 14 | 32.02 | Evet | Evet | Evet | 162,78 | 15 | 32.56 | Evet | Evet | Evet | 176,82 |
| 16 | 33,94 | Evet | Evet | Evet | 176,83 |
| 17 | 41,26 | Evet | Evet | Hayır | - |
| 18 | 42.72 | Evet | Hayır | Evet | 284,93 |
| 19 | 46.07 | Evet | Evet | Evet | 190,83 |
| 20 | 49,21 | Evet | Evet | Evet | 162,75 |
Tablo 1. TIC - Rong> algılandı DPPH • UV-Vis ve MS yanıtı doruklarına.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma karakterizasyonu ve mültipleksli algılama paralel parçalı akış (PSF) sütunu istihdam ile HPLC kullanılarak kahve profilleme gerektirir. PSF sütunlarını kullanarak Multiplexed HPLC geleneksel multi-algılama süreçleri kullanarak alır zaman bir kısmını içinde molekül-özel bilgilerin daha yüksek derecede elde ederken örnek veri karmaşıklığını azaltarak önemli kimyasal kişilerin belirlenmesi ve tanımlanmasını sağlar. PSF sütun mültipleksli tespiti için bir platform sağlar, ancak sadece ek ölü hacim ve boru olmadan hem yıkıcı ve tahribatsız dedektörlerin kombinasyonu. DPPH •, UV-Vis ve MS (TIC) espresso kahve analizi için multiplekslenmektedir edildi.
A 4-port PSF sütun üç farklı dedektörleri kullanarak kahve mültipleksli analizi için kullanılmıştır. PSF sütun çıkışının merkez liman tasarımda MS dedektörü ve iki bağlanmıştıre periferik bağlantı noktaları DPPH • algılama sistemi veya bir UV-Vis dedektör ya bağlanmıştır. Üçüncü mevcut çevresel port kullanılmış ve bu nedenle bir sütun stoper ile bloke değildi, ama bu örnek toplanması için kullanılan, ya da başka bir dedektör için olabilirdi. Bu mültipleksli set up ayar işlemi segmentasyon akışının ölçümü UV-Vis ve DPPH • algılama sistemleri için post-dedektör meydana dedektör, özel oldu. MS yıkıcı bir dedektör olduğu için, akış oranı farkının (toplam nominal akış eksi diğer çıkış bağlantı noktalarından akış) ile belirlenmiştir.
Bu çalışmada, DPPH • belirteci ile kahve analizi de UV-Vis ve MS dedektörleri bir tepki gösterdi 13 olan 20 de çözülmesi zirveleri, sonuçlandı. 3 Her dedektör ile elde edilen kromatogramları karşılaştırır Şekil. Her içinde aynı kromatografik profile sahip dört bölge vardırkırmızı kutuları ile gösterilen kromatogram. Vis UV ve MS bu bileşiklerin küçük tepki gösterdi bu kutulara, ise, DPPH • dedektör güçlü bir tepki vardı. DPPH • reaktifi yanıtladı dört bileşenin UV-Vis veya MS dedektörleri tarafından tespit edilir ve ya DPPH • reaktifi yanıt bileşenleri üç hiç UV-Vis veya MS yanıtı verdi bulundu. MS yanıt bileşenlerinin moleküler kütlesi, Tablo 1 'de gösterilmektedir. 10 dakikada yıkanmış olan bileşen kesin DPPH • yanıt vardı, UV-Vis detektörü hiçbir yanıt ve MS detektörü sadece çok küçük bir tepki ile .
PSF modunda bir AFT sütun birleştirme bakılmaksızın HPLC-dedektör gereksinimleri her dedektörler bu karmaşık samp tek bir enjeksiyon ve ayrılık aynı anda çalıştırmak mültipleksli modunda, birden çok dedektörleri çalıştırmak için fırsat verdile. AFT sütun her algılama modu arasında bileşenlerin atama detaylı örnek bilgileri ve mutlak güvenilirlik veren, çoğullama algılama süreçleri için fırsatlar sağlayarak yararı sunuyor multi-port uydurma bir tasarım bitirmek. PSF sütunları ile Multiplexed tespiti örnek bilgiler, tek bir dedektör için gereken çalışma süresi içinde aynı anda ameliyat üç dedektör büyük miktarda sağladı. Her bir algılama modu içinde tepelerin tutunma süresi tam uyum sağlamak mümkün oldu. Kullanılan dedektörlerin iki yıkıcı dedektörler vardı.
Bir PSF sütunun çoklayıcı yetenekleri Ancak mevcut HPLC aracı bileşenleri ve bulma enstrümantasyon tarafından sınırlıdır. Teknik, çoklu algılama yöntemleri ve algılama her özel modu için gerekli eklentiler, yani, pompalar, reaksiyon bobinler, ısıtıcılar vb PSF sütunu kullanarak çoğullama algılama birincil yararı reductio olduğunu gerektirirn tarafından analiz zamanında tespit her bir mod için analizler arasında örnek değişkenliği en aza indirir dört kat (4 dedektörleri kullanılması durumunda), kadar. Ayrıca, başka bir detektörden gelen tespit numune içindeki bileşen ilişkileri tayin çok daha basit ve her bir detektör ayrı kullanılmıştır, daha az hata eğilimli. Bu genellikle kompleks numunelerin analizinde bir sorun olan, bileşen atamaları uyumsuzluğunu önler.
Burada ayırma verimliliği dolayısıyla zirve atık etkileri çok azdır ve miktar böylece en hassas, en yüksek beri miktar radyal merkezi çıkış noktası üzerinde bulunan dedektör dayalı yapılmalıdır yinelemek için önemlidir. Akış segmentasyon analizleri yoluyla sağlam olduğu gösterilmiştir, ama buna rağmen, düzenli standardizasyon sağlamak için iyi bir laboratuvar uygulamasıdır. Dolayısıyla herhangi bir nicel çalışmalarında uygun olarak standartların çalıştırmak için önemlidir. Bir detektör olarak saf kullanılırsaly örnek bileşenlerin görsel tasviri yoluyla numune karmaşıklığı anlamak için bir araç olarak, ölçme burada antioksidan yanıt algılama protokolü için olduğu gibi, gerekli olmayabilir.
Burada üçlü saptanması, UV, MS ve antioksidan yanıt tespitine ilişkin bir örneği gösterilmiştir. AFT sütunları kullanılarak Multiplexed algılama sistemleri bir analistler boyutlu numune bilgileri gerektirir hemen hemen her durumda kullanılabilecek ve bu çoklu algılama protokolleri içerir. Büyük ölçüde basitleştirmek ve örnek karakterizasyonu sürecini hızlandıracaktır AFT sütunları kullanma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
