Introduction
Aktiva Flow Technology Kolumner
Aktiv flödesteknik (AFT) kromatografikolonner har nyligen utvecklats för att övervinna ineffektivitet i separationer i samband med flödes heterogenitet 1-6 och även för att möjliggöra multiplex detektion. I denna kommunikation vi detalj operativa processen för parallellsegmenterade flödeskolonn (PSF) med multiplex detektion. De viktigaste funktionella fördelar av PSF kolumnen är: (1) flödet från radiella centrala delarna av kolonnbädden isoleras från det perifera eller väggområde flödes, (2) volymen av mobila fasen som måste behandlas av en detekterings källa minskas, och (3) detekteringskällor kan multiplexeras att utöka prov information utan att ingjuta förseningar detektions över varje identifieringsprocessen, eller senare kräver en uppdelning av en efterkolonn flöde 7,8. Det viktigaste inslaget i utformningen av PSF-kolonnen som möjliggör endvantage av multiplexerad detektering är den nya utloppsanslutningen och fritta aggregatet. Figur 1 är ett fotografi av AFT-kolonnen jämfört med en konventionell kolonn. Det är viktigt att förstå att klyvningen erhållna med användning av parallella segmenterad flödes kolumner är inte samma sak som efterkolonnflödesströmmen klyvning. I en efterkolonn flöde dela hela provet bandet från framkanten till de yttre delarna av svansen samplas lika (dvs axiellt), vilket är varje flödet lika med avseende på effektivitet och känslighet; omfattningen av känsligheten därigenom dividerat med antalet splittringar. I PSF, dock dela processprover bandet radiellt, inte axiellt. Som sådan, den centrala hamn samplar toppens spets - det mest koncentrerade området av toppeffekten. Således är känsligheten här högsta som toppen inte späds av diffusa tailing regionen. Provet eluerades från de perifera portar är inte lika effektivt som i central zon, men, eftersom bandet samplas radiellt istället för axiellt, är bredden av toppen smalare än vad som skulle vara fallet för en samplingsprocess som delar toppen i den axiella riktningen, det vill säga, en efterkolonn split. Därför känsligheten med en beroende detektor koncentrationen inte minskas.
I PSF kolumnen innefattar utloppsanslutningen flera utgångsöppningar och på insidan av detta ändamål passar det ligger en ringformig frit. Den inre delen av denna ringformiga fritta kanaler strömma ut ur kolonnen via den radiella centrala utloppsporten, medan den yttre radiella delen av utlopps fritta kanalerna strömma ut ur kolonnen via de perifera eller väggområdet utloppsflödesportar. De inre och yttre delarna av utlopps frittan är separerade av en ogenomtränglig barriär som hindrar korsflödet mellan dessa flödesregioner 2. Som en följd av denna konstruktion den centrala radiella flödesströmmen genom kolonnen bädden separeras från väggområdet flödes inside kolonnen. Den relativa delen av flödet från dessa två regioner kan varieras för att nästan vilket som helst önskat förhållande genom tryckstyrning för att optimera olika funktionella aspekter av kolonnen teknik, såsom separationseffektivitet eller detektionskänslighet. I huvudsak denna design etablerar effektivt inom större format kolumnen en "virtuell" kolumnen, har en smalare inre diameter, och därmed fungerar kolumnen som en riktig vägg mindre kolonn, övervinna kolonnbädden heterogenitet och väggeffekter 9,10.
De stora fördelarna med PSF kolumner är förbättringar i kolumn effektivitet, minimering av lösningsmedels behandling för att upptäcka källan (s) och möjliggör multiplex detektion. Men det är en extra fördel att eftersom svans och fronting regioner av något band avlägsnas från den totala elueringsprofilen det lösta ämnet vid elueringen eller detektion förekommer i en högre koncentration än vad som annars skulle observeras för samma solute injektion och koncentration belastning på en konventionell kolonn, beroende på segmenteförhållandet användes. Som en konsekvens finns det ofta observeras en vinst i signalstyrka för separationer genomförda på PSF kolumn 2. I själva verket, om segmenteförhållandet justeras så att 25% av flödes utträder från var och en av de fyra utgångsportarna, signalintensiteten som observeras med användning av ultraviolett (UV) detektions visar praktiskt taget exakt samma signalintensiteten som framgår användning av en konventionell kolumn där hela (100%) av den mobila fasen analyseras 7. Dessutom finjustering av utlopps förhållandet mellan de centrala och väggflödesområden gör kolumnen effektivitet optimeras. Vinsterna i kolonneffektivitet observeras med hjälp av AFT kolumner kan inte anges till ett enda värde, eftersom dessa effektivitetsvinster är en funktion av tre faktorer: (1) flödet, (2) segmente förhållandet, och (3) det lösta ämnet retentionsfaktor . Trots effektivitetsvinster jämfört med omventional kolumner nästan alltid iakttas, och ibland dessa vinster är mer än 100% av antalet teoretiska bottnar 1,2. Förmågan att avstämma segmenteförhållandet tillåter analytikern att effektivt anpassa diametern på "virtuell" kolumnen, och detta är en viktig faktor i samband med upptäckt processen. Till exempel är en virtuell kolonn 2,1 mm innerdiameter (ID) som fastställts ur fysikalisk 4,6 mm ID-kolonn vid segmenteförhållandet är 21% av mobil fas eluerades från den radiella mittutgångsporten. Under dessa betingelser, utför den virtuella 2,1 mm ID-kolonn med en effektivitet som kan vara mer än 70% större än det konventionella id kolonn 2,1 mm, beroende på flödeshastigheten, och löst ämne retentionsfaktor 10.
Den nuvarande PSF kolumn design som används för multiplexerad detektering innefattar en 4-port utlopps montering, men kolonnen kan vara försedd med en 2-ports ändinpassningen också begränsar emellertid denna detekterings to endast två detektorer. Den grundläggande hanteringen av dessa kolumner är dock densamma, förutom att fyra detektorer kan kopplas samtidigt till 4-portars utlopps PSF kolumnen bredda räckvidden för multiplex detektion. Bortsett från före och efter kolonnen bind slang, att de enda ytterligare krav driva en PSF kolonn slang som kan kopplas till de perifera utloppsöppningarna, och ett organ med vilket mängden av mobila fasen passerar genom varje rör kan mätas, typiskt antingen en massa mätningar eller en volymmätning. För att underlätta trimning, bör den inre diametern hos alla utloppsflödes slangar vara samma. Den flödesförhållande mellan det perifera och radiella centralutloppsöppningar sedan varieras genom användning av tryckförvaltnings, helt enkelt genom att ändra längden på slangen belägen på den perifera utloppskopplingen, eller rörlängden inlägget detektorn på den radiella mittutloppsöppningen.
Multiplexad Detection Använda PSF Kolumner
En viktig fördel med PSF kolumner är att var och en av utloppsutloppsportarna kan anslutas direkt till en detekteringskälla, vilket möjliggör multiplexerad detektering. I en väl utformad detektionssystem en enda analys med multiplex detektion kan ge omfattande information när det gäller vilken typ av komponenter i provet. Viktigt kan destruktiva och oförstörande provning utföras på exakt samma tid, utan dröjsmål upptäckt. Detta gör den absoluta tilldelning av, till exempel, antioxidanter med hjälp av DPPH • reagens, med komponenter observer eluera med UV- och / eller masspektrometri (MS) detekterings svar 7,11. Därför kan fyra oberoende detektorer drivas samtidigt med lämpliga delar av flödet till varje detektor via någon av de fyra utloppsportar. Eftersom flödet genom dessa portar kan enkelt justeras mängden löst ämne når någon av detektorerna kan justeras för att passakänsligheten hos den givna detektorkällan. Det bör dock noteras, att det mest effektiva lösta ämnet migrering observeras genom den radiella mittutloppsöppningen. Var och en av de perifera hamnarna erbjuder motsvarande avskiljningsgrad, som när den satt till 25% genom varje port är endast något mindre effektiv än en konventionell kolonn. Som sådan, är det viktigt att den kvantitativa detektorn ställas in för att analysera prov från den radiella mittutgångsporten.
När du ställer in en PSF kolumn i syfte att multiplexering upptäckt finns ett antal överväganden som måste göras för att uppnå effektiva och höga resultat kvalitet; som är rördimensioner för varje port, val av vilken port för en typ av detektor och justering flöde.
Rördimensioner för varje hamn
I kromatografi längden på efterkolonnslangen spelar en avgörande roll i effektivitet och prestanda hos separationen. Stor dead-volym som en följd av lång eller bred id slang från kolumn utlopp till detektorn kommer att resultera i en förlust av effektivitet, upplösning och känslighet. Därför måste lämpliga slangdimensioner användas när du ställer in PSF kolumnen för att uppnå den maximala potential att ge effektiv separation samtidigt som fördelarna med multiplexering.
Hamnen till Detector
Figur 2 är en illustration av ett exempel installationen av multiplex detektion (Ultra Violet-Synlig (U-Vis), masspektrometer (MS) och 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) detektion). Illustrationen visar den centrala porten är fäst till MS-detektor, medan DPPH • och UV-Vis-detektorer är fastade till de perifera portar. Eftersom MS är den känsligaste detektorn enligt tre, flöde till denna detektor riktades från den centrala utloppsöppningen. Som DPPH • upptäckt är selektiv till presence av antioxidanter, och den minst känsliga och mest toleranta till bandbreddning, strömma till denna detektor riktades från en perifer hamn. UV-Vis var en sekundär "generisk" detektor, så strömmar till denna detektor leddes från en andra perifer port.
Flödesjusterings
När lämplig slangen har fästs från en hamn till detektor, kan den utgående flödet från var och en av detektorerna justeras till den erforderliga mängden. Ett enkelt sätt att mäta mängden av flödet ut från varje detektor är att väga den mängd mobila fasen som eluerar genom varje port under en given tidsperiod. Den procentuella flödet kan sålunda bestämmas, och flödesförhållanden kan justeras genom antingen förkortning eller förlängning av slangen ansluten till utloppsledningen på detektorerna i enlighet därmed för att passa kraven i detektorerna av valet. Olika detektorer har olika krav på flöde, exempelvis flödescellen fluorescensdetektor (FLD) inte flödeshastighet begränsad, men man måste vara försiktig för att undvika övertryck av flödescellen. Därav styrning av flödet genom FLD uppnås vanligtvis genom justering av tryckfallet över de andra detektorerna och återstoden av flödet passerar sedan genom den FLD. En detektor som är känslig för den mängd flöde som avges är MS. Generellt kan nuvarande high end masspektrometrar lätt bearbeta ca 1 till 1,5 ml / min av måttligt vatten rörlig fas. Ovanför detta flöde kan översvämning av källan gör MS obrukbara. Dock är detektionskänsligheten i de flesta masspektrometrar gynnats genom användning av lägre flödeshastigheter; Därav PSF flödesdelning kapacitet är mycket användbart för applikationer med MS-detektion. Hög kolonn volymetriska flödeshastigheter kan utnyttjas, men med låg volym laster transporteras till MS-detektor. Tuning av flödet till MS-detektorn måste emellertid göras genom att justera tryckfallet föreMS-detektor, i stället för post MS. Här, är användningen av smala innerdiameter (0,1 mm ID) mycket användbar, eftersom trycket kan lätt regleras utan att lägga till olämpligt dödvolym.
Beroende på vilken typ av detektor justeringen av segmenteförhållandet kan göras antingen före eller efter detektor. Om en icke-förstörande detektor, såsom UV-Vis användes, skulle den procentuella flödet mätas och avstämmas efterdetektor. Om en enda destruktiv detektor används i multiplex ställa in procentflödet bestäms genom tillbaka räkna med avseende på andra procentsatser port flöde. Om en reagens baserad detektor användas, såsom DPPH •, är den procentuella flödet mätt efter detektor utan tillsats av reagens; och om två eller flera destruktiva detektorer används, då flödesförhållandet mäts för-detektor. Detection system som kan kräva ytterligare instrumentering, såsom DPPH •, kommer att ha extra systemtryck som kan ändra flödetprocentsats gång ansluten till detekteringssystemet. Därför bör noggrann hänsyn tas till systemtrycket av en destruktiv detektor, när du justerar flödes procentuella pre-detektor. Oberoende av flödesförhållandet som ställs genom någon av portarna, bör kvantitativa information erhållas genom lämplig standardisering. När flödeskvoter är inställda, men de är robusta, och att de inte förändras ens under gradienteluering förhållanden 7,
Den detaljerade video protokollet åtföljer detta manuskript är avsett att visa hur man kan använda och ställa in en PSF kolonn fungerar i en multiplexering för upptäckt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Detta protokoll innehåller instruktioner om hur du använder en PSF kolumnen ett HPLC-system i kombination med flera detektorer för multiplex detektion. Protokollet har skrivits förutsatt att läsaren har grundläggande kunskaper och erfarenhet av kromatografi och olika HPLC detektionsmetoder.
Varning: Se säkerhetsdatablad (SDB) för alla material och reagenser före användning (dvs. säkerhetsdatablad för metanol). Se till att använda alla lämpliga säkerhetsrutiner vid hantering av lösningsmedel och High Performance Liquid Chromatography (HPLC) elueringsmedel. Säkerställa en lämplig användning av tekniska kontroller av HPLC, analytisk balans och detektor instrumentering, och se till att användningen av personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, fullängds byxor och slutna tå skor).
1. Inställning av HPLC-instrument
- Förbered HPLC-instrument med ultrarent vatten (t.ex. 100% Milli-Q-vatten) för line A och 100% metanol under linje B som den mobila fasen och rensa pumparna enligt tillverkarens krav. Om en av detektorerna som används är MS, eftersom det är här, lägga till 0,1% myrsyra till både mobila faserna A och B.
- Ställ in HPLC-instrumentella komponenter och detektorer såsom visas i fig 2. Detta kräver bekväm placering av detektorerna i förhållande till kolonnen för att minimera den döda volymen mellan detektorn och kolumn. Flexibel konfiguration HPLC-systemet är önskvärd.
2. Inställning av UV-Vis och MS Detektorer
- Ställ in UV-Vis-detektor till den önskade våglängden beroende provet av intresse (t.ex., 280 nm).
- Ställ in MS detektor i positiv mod för Total Ion Count (TIC) analys använder Full Scan detektionsmetod. Justera även följande MS parametrar enligt följande: förångare temperatur 500 ° C, kapillär temperatur 350 ° C, slida gas inställd på en hastighet av 60 enheter, extra gasflödet40 och sopa gasflödet vid 5 enheter, och sprutspänning 3,5 kV. Dessa inställningar kan justeras senare för specifika användarkrav beroende på det prov som analyseras.
3. Framställning av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl Radical (DPPH •) Reagens Uppsättning av DPPH • System Detector
- Väg upp 25 mg av DPPH • och lös upp i 250 ml metanol i en mätkolv.
- Lägg 250 ul myrsyra till DPPH • reagens. Täck kolven i folie för att förhindra exponering för ljus.
- Sonikera kolven innehållande DPPH • reagens under 10 minuter.
- Rensa DPPH • pumpen med det färdiga DPPH • reagens enligt tillverkarens krav.
- Konfigurera DPPH • systemet enligt figur 2 genom att fästa pumpkanalen till inloppet av ett T-stycke.
- Bifoga en 100 ul reaktionsslinga till the utlopp T-röret och fäst den andra änden av reaktionsslinga till detektorn.
- Inlägga reaktions spole i en kolonn värmaren och sätt kolonnvärmaren temperaturen till 60 ° C.
- Ställ DPPH • UV-Vis-detektor till 520 nm.
4. Inställning av PSF Column
- Anslut inloppet till PSF kolumnen till HPLC-instrument.
- Anslut den centrala porten till MS-detektor, med användning av en 15 cm längd av 0,13 mm ID rör.
- Anslut en perifer port till UV-Vis detektor med användning av en 15 cm längd av 0,13 mm ID rör.
- Anslut en annan periferi port till T-bit av DPPH • detektionssystem med en 15 cm längd på 0,13 mm id slang.
- Blockera oanvända perifera port med en kolonn propp.
- Bringa flödeshastigheten för HPLC-pump till en ml min -1 vid 100% linjen B - 100% metanol (0,1% myrsyra).
- Jämvikta kolonnen med 100% metanol mobiltelefoas under 20 minuter för en 4,6 mm id x 250 mm längd kolonn. Den här gången är skalas enligt måtten på andra kolumner användaren kan använda.
5. Trimma PSF Kolumn för Multiplexade Detection
- Mäta massan av minst två tomma uppsamlingskärl (en för porten som är ansluten till UV-Vis-detektor och en för DPPH • detektorn) med en analytisk balans.
- Samla mobil fas från UV-Vis och DPPH • portarna i två separata, pre-vägs uppsamlingskärl (5,1). Notera den tid för insamling. Samla minst 500 mg av lösningsmedel i varje kärl.
- Väg uppsamlingskärlen och bestämma massan av mobila fasen. Med tanke på densiteten metanol 0,791 g ml -1, fastställa omfattningen av mobila fasen samlas in från varje port.
- Genom skillnaden, det vill säga nominellt pump inställda flödet minus flödet genom DPPH • och UV-Vis Detector flödesportar, bestämma flödeshastigheten till MS-detektor. Uttryck varje flödes andel i procent av det totala flödet.
Notera: Helst flödes procenttal är: till MS är 18% av det totala flödet, för UV-Vis 22%, till DPPH • detektorn 60%. - Om inte, justera flödes procentsatserna genom att ändra tillbaka trycket på UV-Vis-detektor. Till exempel, om flödet till UV-Vis är för hög, minska andelen genom tillsats till en 15 cm sektion av 0,13 mm id slangen till utloppet av UV-Vis-detektor. Upprepa sedan steg från 5,1 till 5,5.
6. Slutliga Setup Villkor
- Ställ in flödeshastigheten för DPPH • reagenspump till samma flödeshastighet som lämnar utloppsporten är ansluten till DPPH • detektorn.
Obs! PSF kolumnen multiplexeras med UV-Vis är DPPH • och MS nu redo för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En multiplexerad HPLC-analys utfördes med hjälp av en AFT kolumn i PSF läge (Figur 1) och ställ in som visas i figur 2. Denna typ av installation får en kaffe prov som skall analyseras samtidigt med användning av UV-Vis, DPPH • och MS i Total Ion Count (TIC) läget. Föreningarna kaffe provet som svarade på DPPH • kunde sedan lätt matchas upp till UV-Vis och MS - TIC svar baserade på anpassningen av retentionstid som visas i figur 3, eftersom kromatogrammen registrerades samtidigt. Om ett positivt svar sågs från MS-TIC detektor, var molekylmassan för den topp som noterades. Tabell 1 listar retentionstiderna för DPPH • topparna, och svaret av sådana toppar i UV-Vis och / eller MS detektor, vilket sålunda molekylmassan. Enkelheten i att matcha toppar mellan olika detekteringsprocesser tillåts för afast och effektivare form av screening och karakterisering för en komplex prov, såsom kaffe.
Figur 1. En bild av Active Flow Technology kolonn jämfört med en konventionell kolonn. Den AFT Kolonnen är utrustad med en fyra-port utlopp montering som inrymmer den ringformade frit möjliggör topp provtagning över radiellt tvärsnitt av ett prov band. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Ett exempel illustration av en multiplex HPLC arrangemang, med hjälp av en PSF-kolonn med DPPH •, UV-Vis och MS-detektorer. Varje Detecto R är ansluten till en separat utloppsöppning. I detta fall MS används för kvantifiering och är inställd på att samla in prov från den radiella centrala utloppsöppningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. De kromatogram av ett kaffeprov analyserades via en multiplexerad HPLC-system, med användning av en PSF-kolonn med DPPH •, UV-Vis och MS-detektorer (a) DPPH • 520 nm, (b) UV-Vis 280 nm, (c ) MS - TIC. Varje detektor spår är helt sammanfaller i tiden, så ingen offset justering krävs för att kompensera för dödtid mellan varje detektor.Arget = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kaffe DPPH • Peak Response och Mass | |||||
| DPPH • Peak | Retentionstid | DPPH • | UV-Vis | MS - TIC Response | Massa |
| (min) | Svar | Svar | |||
| 1 | 6,74 | Ja | Ja | Ja | 123,84 |
| 2 </ td> | 7,54 | Ja | Ja | Ja | 125,83 |
| 3 | 8,94 | Ja | Nej | Nej | - |
| 4 | 10,05 | Ja | Nej | Ja | 135,83 |
| 5 | 13,15 | Ja | Nej | Nej | - |
| 6 | 16,22 | Ja | Nej | Nej | - |
| 7 | 18,14 | Ja | Ja | Ja | 126,82 |
| 8 | 19,4 | Ja | Ja | Ja | 162,81 |
| 9 | 20,46 | Ja | Ja | Ja | 187,89 |
| 10 | 24,71 | Ja | Ja | Ja | 162,81 |
| 11 | 26,27 | Ja | Ja | Ja | 162,8 |
| 12 | 26,97 | Ja | Ja | Ja | 194,87 |
| 13 | 31,84 | Ja | Ja | Ja | 162,8 |
| 14 | 32,02 | Ja | Ja | Ja | 162,78 | 15 | 32,56 | Ja | Ja | Ja | 176,82 |
| 16 | 33,94 | Ja | Ja | Ja | 176,83 |
| 17 | 41,26 | Ja | Ja | Nej | - |
| 18 | 42,72 | Ja | Nej | Ja | 284,93 |
| 19 | 46,07 | Ja | Ja | Ja | 190,83 |
| 20 | 49,21 | Ja | Ja | Ja | 162,75 |
Bord 1. upptäckt DPPH • toppar svar på UV-Vis och MS - TIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie innebär karakterisering och profilering av kaffe med användning av HPLC med multiplex detektion som utnyttjar en parallell kolonn segmenterat flöde (PSF). Multiplexad HPLC med användning av PSF kolumner möjliggör karakterisering och identifiering av de viktigaste kemiska enheter genom att minska datakomplexitet av provet samtidigt få en högre grad av molekyl-specifik information inom en bråkdel av den tid det tar med hjälp av konventionella flerdetekteringsprocesser. PSF kolumnen medger inte bara en plattform för multiplex detektion, men också en kombination av både destruktiva och icke-destruktiva detektorer, utan ytterligare dödvolymen och slangar. DPPH •, UV-Vis och MS (TIC) har multiplexeras för analys av espressokaffe.
En 4-portars PSF kolonn användes för multiplexerade analys av kaffe med de tre olika detektorer. Den centrala porten på PSF kolonnens utlopp var anslutet till MS-detektor och två av de tre se perifera hamnar anslöts till antingen en DPPH • detektionssystem eller en UV-Vis-detektor. Den tredje tillgängliga perifera port var inte används och därför blockeras med en kolumn propp, men det kunde ha använts för insamling av provet, eller för en annan detektor. Avstämnings förfarandet enligt denna multiplex inrättas var specifik för detektorn, där mätning av segmenteflödes inträffade efter detektor för UV-Vis och DPPH • detektionssystem. Eftersom MS är en destruktiv detektor, var den procentuella flödet bestäms av skillnaden (totalt nominellt flöde minus flödet från övriga utloppsportar).
I denna studie, kaffe analys med DPPH • reagens gav 20 väl upplösta toppar, varav 13 också visade ett svar i UV-Vis och MS-detektorer. Figur 3 jämför kromatogrammen som erhålls genom varje detektor. Det finns fyra områden som har samma kromatografiska profilen inom varjekromatogram, indikeras av de röda rutorna. I dessa rutor, där UV-Vis och MS visade liten reaktion på dessa föreningar fanns en stark respons från DPPH • detektorn. Fyra komponenter som svarade på DPPH • reagens upptäcktes inte heller av UV-Vis eller MS-detektorer och tre av de komponenter som svarade på DPPH • reagens gav ingen UV-Vis eller MS svar alls. Molekylmassan för de komponenter som svarade på MS redovisas i tabell 1. Den komponent som eluerade vid 10 min hade en stark DPPH • svar, utan svar från UV-Vis-detektor och endast en mycket liten svar från MS-detektorn .
Kopplingen av en AFT kolumn i PSF läge gav möjlighet att köra flera detektorer i multiplexering, där alla detektorer oavsett HPLC-detektor krav kördes samtidigt i en enda injektion och separation av denna komplexa sample. Multi-port slut passande utformning av AFT kolumnen ger den extra fördelen att ge möjligheter för multiplexering detekteringsprocesser, vilket ger detaljerad information prov och absolut tillförlitlighet i tilldelningen av komponenter mellan varje läge upptäckt. Multiplexerad detektion med PSF kolonner gav en stor mängd prov information, tre detektorer som drivs samtidigt inom körtiden som krävs för en enda detektor. Exakt matchning av uppehållstid av toppar inom varje läge upptäckt var möjligt. Två av detektorerna användes var destruktiva detektorer.
De multiplexering funktionerna i en PSF kolumn dock begränsas av de tillgängliga HPLC instrumentella komponenter och detektering instrumentering. Tekniken kräver flera detektionsmetoder och nödvändiga tillägg för varje specifik läge för upptäckt, det vill säga, pumpar, reaktions spolar, värmare etc. Den främsta fördelen med multiplexering upptäckt med hjälp av en PSF kolumnen är reduction i analystiden med upp till fyra gånger (om 4 detektorer används), vilket minimerar prov variabilitet mellan analyser för varje enskild läge för upptäckt. Dessutom tilldela komponent relationerna inom provet detekteras från en detektor till en annan är mycket enklare, och benägna att mindre fel än om varje detektor användes separat. Detta undviker obalans i komponent uppdrag, vilket ofta är ett problem vid analys av komplexa prover.
Det är viktigt att påminna om att kvantifiering bör göras baserat på detektorn sitter på den radiella centrala utloppsöppningen eftersom separationseffektiviteten här är den högsta därmed maximal slagg effekter är minimala och kvantifiering är därmed den mest exakta. Flödessegmente har visat sig vara robust genom analyser, men trots det är det god laboratoriepraxis för att hålla regelbunden standardisering. Därför i någon kvantitativ arbete är det viktigt att köra standard som är lämpligt. Om en detektor används renly som ett sätt att förstå provet komplexiteten genom visuell skildring av provbeståndsdelar, kan kvantifiering inte krävas, vilket är fallet för antioxidant svarsdetekteringsprotokoll här.
Vi har visat här ett exempel på triple upptäckt, UV, MS och antioxidant lyhörda upptäckt. Multiplexerade detektionssystem som använder AFT kolonner kan användas i nästan alla situationer där en analytiker kräver flerdimensionell prov information och detta innebär flera protokoll upptäckt. Med hjälp av AFT kolumner kommer att kraftigt förenkla och påskynda processen av prov karakteriseringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
