Introduction
Active Flow Technology Columns
Actieve stroom technologie (AFT) chromatografiekolommen werden onlangs ontwikkeld tot inefficiëntie in scheidingen in verband met stroom heterogeniteit 1-6 te overwinnen en ook multiplex detectie mogelijk te maken. In dit specifieke communicatie we detail het operationele proces van de parallelle gesegmenteerde stroom (PSF) kolom met multiplex detectie. De belangrijke functionele voordelen van de kolom PSF zijn: (1) de stroom vanaf de radiale centrale gebied van het kolombed wordt geïsoleerd van het perifeer of wandgebied van stroming, (2) het volume van de mobiele fase die moet worden verwerkt door een detectie- bron wordt verminderd, en (3) detectie bronnen kunnen worden gemultiplext om monsterinformatie uitzetten zonder wekken detectie vertraging over elke detectieproces of later noodzakelijk de splitsing van een postkolom vloeistofstroom 7,8. Het belangrijkste kenmerk van het ontwerp van de kolom PSF dat het mogelijk maakt eendvantage gemultiplexte detectie is de nieuwe outlet fitting en frit samenstel. Figuur 1 is een foto van de AFT kolom opzichte van een conventionele kolom. Het is belangrijk te begrijpen dat het splitsingsproces verkregen met evenwijdige gesegmenteerde stroom kolommen is niet hetzelfde als postkolom flows splitsen. In een postkolom vloeistofstroom gesplitst het gehele monster band van de voorste rand aan de uiteinden van de staart gelijkelijk bemonsterd (dwz axiaal) daardoor elke flows gelijk met betrekking tot de efficiëntie en gevoeligheid; de omvang van de gevoeligheid aldus gedeeld door het aantal splitsingen. In PSF, maar de splitsing proces monsters van de band radiaal, niet axiaal. Als zodanig, de centrale poort monsters de top bedraagt - het meest geconcentreerde gebied van de piek. Dus de gevoeligheid hier de hoogste piek niet wordt verdund door de diffuse staart regio. Het monster elueren uit het perifere havens is niet zo efficiënt als de central zone, maar omdat de band radiaal wordt bemonsterd in plaats van axiaal, de breedte van de piek is smaller dan het geval zou een bemonsteringsproces dat de piek verdeelt in axiale richting, dat wil zeggen een postkolom worden gesplitst. Vandaar de gevoeligheid bij een concentratie afhankelijke detector niet verminderd.
In de kolom PSF, de uitlaat fitting omvat meerdere uitlaatpoorten en aan de binnenkant van de eindfitting wordt gehuisvest een ringvormige frit. Het binnenste deel van deze ringvormige frit kanalen stromen uit de kolom via de radiale centrale uitlaat poort, terwijl de buitenste radiale gedeelte van de uitlaat frit kanalen uit de kolom stroomt via de perifere of wand regio stopcontact stroom poorten. De binnenste en buitenste gedeelten van de uitlaat frit worden gescheiden door een ondoordringbare barrière die dwarsstroom tussen deze stromingsgebieden 2 verhindert. Als gevolg van dit ontwerp de centrale radiale stroming stroom door de kolom bed wordt gescheiden van het wandgebied stroom inside de kolom. Het relatieve aandeel van stroom uit deze twee gebieden worden gevarieerd om bijna elk gewenste verhouding tot drukbeheer om verschillende functionele aspecten van de kolomtechnologie, zoals scheidingsefficiëntie of detectiegevoeligheid optimaliseren. In wezen is dit ontwerp effectief vast binnen de grotere format kolom een "virtueel kolom heeft smallere inwendige diameter, en dus de kolom functioneert als een echte wall-less kolom overwinnen zuilenbed heterogeniteit en de wandeffecten 9,10.
De belangrijkste voordelen van PSF kolommen verbetering kolomefficiëntie, minimalisering van het oplosmiddel voor het opsporen source (s) en mogelijk gemultiplexte detectie. Echter, een extra voordeel is dat aangezien de staart en fronting gebieden van elke band worden verwijderd uit de algemene elutieprofiel de opgeloste stof aan elutie of detectie aanwezig in een hogere concentratie dan anders zou worden waargenomen voor hetzelfde solute injectie en concentratie belasting van een conventionele kolom, afhankelijk van de segmentering toegepaste verhouding. Als gevolg hiervan is er vaak waargenomen een winst in signaalintensiteit voor scheidingen uitgevoerd op PSV kolommen 2. In feite, als de segmentatie verhouding wordt ingesteld dat 25% van de stroom verlaat elk van de vier uitlaatopeningen, de signaalintensiteit die wordt waargenomen onder toepassing van ultraviolet (UV) detectie toont vrijwel exact dezelfde signaalintensiteit zoals duidelijk met een gewone kolom waarin de volledige (100%) van de mobiele fase wordt geanalyseerd 7. Bovendien fijnafstelling van de uitlaat verhouding tussen de centrale en de wand stromingsgebieden kan de kolom efficiëntie te optimaliseren. De winst in kolomefficiëntie waargenomen via AFT kolommen kan niet worden gesteld aan een enkele waarde, omdat deze efficiëntie is afhankelijk van drie factoren: (1) de stroomsnelheid, (2) de segmentatie verhouding, en (3) de opgeloste stof retentiefactor . Toch winst in efficiëntie in vergelijking met conventional kolommen zijn bijna altijd waargenomen, en soms deze winsten meer dan 100% van het aantal theoretische schotels 1,2. De mogelijkheid om af te stemmen de segmentatie verhouding laat de analist effectief maat van de diameter van de "virtuele" kolom, en dit is een belangrijke factor met betrekking tot het detectieproces. Zo wordt een virtuele 2,1 mm diameter (id) kolom interne opgericht vanuit fysisch 4,6 mm id kolom wanneer de segmentatie verhouding 21% van de mobiele fase elueren van het radiale centrale uitlaatpoort. Onder deze omstandigheden is de virtuele 2,1 mm kolom id uitvoert met een efficiëntie die meer dan 70% groter is dan de gebruikelijke 2,1 mm id kolom kan, afhankelijk van de stroomsnelheid en opgeloste retentiefactor 10.
De huidige kolom PSF ontwerp dat wordt gebruikt voor gemultiplexte detectie omvat een 4-poort uitlaatfitting, maar de kolom kan worden uitgerust met een 2-port-eindstuk echter ook beperkt dit detectie to twee detectoren. De basiswerking van deze kolommen is echter hetzelfde, behalve dat vier detectoren simultaan kunnen worden gekoppeld aan de 4-port outlet column PSF een uitbreiding van het gemultiplexte detectie. Naast pre- en post-kolom verbindende buis, het enige aanvullende eisen op een kolom PSF actief is buis die kan worden aangesloten op de perifere uitlaatpoorten, en een middel waarmee de hoeveelheid van de mobiele fase die door elke buis kan worden gemeten, meestal ofwel een massa meting of een volumetrische meting. Voor het gemak van tuning wordt de inwendige diameter van uitlaatstroom buizen hetzelfde zijn. De stroomverhouding tussen de perifere en radiale centrale uitgangsopeningen wordt vervolgens gevarieerd door het gebruik van drukbeheer, simpelweg door de lengte van de buis op het perifere uitlaatfitting, of buisstuk bericht detector op de radiale centrale uitlaatpoort.
Multiplexed Detectie Met behulp van Columns PSF
Een belangrijk voordeel van PSF kolommen is dat elk van de uitlaat uitlaatpoorten direct kan worden aangesloten op een detectie-bron, waardoor gemultiplexte detectie. In een goed ontworpen detectiesysteem één analyse multiplex detectie kan essentiële informatie met betrekking tot de aard van de componenten in het monster. Belangrijk kunnen destructieve en niet-destructieve tests uitgevoerd op exact hetzelfde tijdstip, zonder detectie vertraging. Hierdoor kan de absolute toewijzing van bijvoorbeeld antioxidantia gebruikt DPPH • reagens, met componenten waargenomen elueer met UV- en / of massaspectrometrie (MS) detectie responsen 7,11. Daarom kunnen vier onafhankelijke detectors gelijktijdig worden bediend met geschikte porties stroom naar iedere detector via een van de vier afvoeropeningen. Aangezien de stroom door deze poorten gemakkelijk kunnen worden aangepast aan de hoeveelheid opgeloste stof bereiken een van de detectoren kan worden aangepast aan suitde gevoeligheid van de detector bepaalde bron. Opgemerkt zij echter dat de doeltreffendste opgeloste migratie waargenomen door het radiale centrale uitlaatpoort. Elk van de perifere poorten bieden gelijkwaardige scheidingsefficiëntie die, wanneer ingesteld op 25% door elke poort, slechts iets minder efficiënt dan een conventionele kolom. Als zodanig is het belangrijk dat de kwantitatieve detector ingesteld op monster van de radiale centrale uitlaatopening analyseren.
Bij het opzetten van een kolom PSF behoeve van multiplexen detectie zijn er een aantal overwegingen die moeten worden gedaan om efficiënte en hoogwaardige resultaten; dat buisafmetingen voor elke poort, de keuze van welke poort voor een type detector en flow adjustment.
Buis Afmetingen voor elke poort
In chromatografie lengte van postkolom buis speelt een cruciale rol in de efficiëntie en prestaties van de scheiding. Grote dead-volume als gevolg van lange of brede id slang van kolomuitlaat naar detector leidt tot een rendementsverlies, resolutie en gevoeligheid. Zo moet de juiste afmetingen slangen worden gebruikt bij het opzetten van de kolom PSF om het maximale potentieel te bereiken in het leveren van efficiënte scheiding, terwijl het verstrekken van de voordelen van multiplexing.
Poort naar Detector
Figuur 2 is een illustratie van een voorbeeld configuratie van gemultiplexte detectie (Ultra Violet-Visible (U-Vis) massaspectrometer (MS) en 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) detectie). De afbeelding toont de centrale poort naar de MS-detector bevestigd, terwijl de DPPH • en UV-Vis detectoren zijn bevestigd aan de perifere poorten. Omdat de MS is de meest gevoelige detector van de drie stromen naar deze detector is gericht van het centrale uitlaatpoort. Zoals DPPH • opsporing is selectief aan de Presence van antioxidanten, en het minst gevoelig en meest tolerant bandverbreding, stromen naar deze detector werd geleid vanuit een perifere poort. De UV-Vis was een secundaire 'generieke' detector, zodat de stroom naar deze detector werd geleid vanuit een tweede perifere poort.
Flow adjustment
Zodra aan de buis is bevestigd uit een haven detector, kan de uitgaande stroom uit elk van de detectors worden aangepast aan de gewenste hoeveelheid. Een eenvoudige manier om de hoeveelheid stroom verlaten van elke detector meten is de hoeveelheid van de mobiele fase die elueert door elke poort over een bepaalde tijdsperiode te wegen. Het percentage stroom kan dus worden bepaald, en de stroom verhoudingen kunnen worden ingesteld door hetzij verkorten of verlengen van de slang verbonden met de uitlaatleiding van de detektoren daarom aan de vereisten van de detektoren keuze passen. Verschillende detectoren hebben verschillende eisen van stroom, bijvoorbeeld de stroomcel vaneen fluorescentie detector (FLD) niet debiet beperkt, maar zorg moet worden genomen om overdruk van de stroomcel voorkomen. Vandaar de regeling van stroming door de FLD wordt gewoonlijk bereikt door het aanpassen van de drukval over de andere detectoren en de rest van de stroom gaat dan door de FLD. Een detector die gevoelig is voor de hoeveelheid stroom die geleverd is het MS. In het algemeen kan de huidige high-end massaspectrometers gemakkelijk verwerken rond 1 tot 1,5 ml / min van matig waterige mobiele fase. Boven dit debiet, kan overstroming van de bron de MS onbruikbaar te maken. Echter, gevoeligheid in de meeste massaspectrometers geprofiteerd door lagere debieten; vandaar de PSF stroom splitsing mogelijkheden zijn uiterst nuttig voor toepassingen waarbij MS detectie. Hoge kolom debiet kan worden toegepast, maar met een laag volume ladingen vervoerd naar de MS-detector. Afstemmen van de stroom naar de MS-detector, moet echter heeft plaatsgevonden door de drukval voor deMS-detector, in plaats van na de MS. Hier is het gebruik van smalle boring buis (0,1 mm id) is zeer nuttig, wanneer de druk gemakkelijk kan worden aangepast zonder toevoeging ongepast dood volume.
Afhankelijk van het type detector aanpassing van de segmentatie verhouding kan worden gedaan vóór of na detector. Wanneer een niet-destructieve detector, zoals UV-Vis wordt gebruikt, zou het percentage stroom worden gemeten en ingesteld na detector. Als een vernietigende detector wordt gebruikt in het opzetten multiplex de stroom percentage wordt bepaald door berekening weer op de andere poort stroming percentages. Als een reagens gebaseerde detector wordt gebruikt zoals DPPH • wordt de stroom gemeten percentage bericht detector zonder toevoeging van reagens; en als twee of meer destructieve detectoren worden toegepast dan de stroomverhouding wordt gemeten pre-detector. Detectie systemen die extra instrumentatie, zoals DPPH • kan eisen, zal extra druk van het systeem die de stroom kunnen veranderen hebbenpercentage eenmaal bevestigd aan het detectiesysteem. Daarom moet een zorgvuldige afweging worden besteed aan de systeemdruk van een destructieve detector, bij het aanpassen van stroom percentage pre-detector. Ongeacht de stroom verhouding die is ingesteld door middel van een van de havens, moeten kwantitatieve informatie worden verkregen door middel van passende standaardisatie. Zodra de stroom verhoudingen zijn ingesteld, maar ze zijn robuust, en ze niet veranderen, zelfs onder omstandigheden gradiëntelutie 7,
Is bedoeld de gedetailleerde video protocol bij dit manuscript te laten zien hoe te gebruiken en af te stemmen een kolom PSF functioneren in een multiplex wijze van opsporing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol bevat instructies over hoe je een column PSF te gebruiken op een HPLC-systeem in combinatie met meerdere detectoren voor multiplex detectie. Het protocol is geschreven ervan uitgaande dat de lezer heeft basiskennis en ervaring in chromatografie en diverse HPLC detectiemethoden.
Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, MSDS voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluens. Zorgen voor het juiste gebruik van de technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en dichte schoenen).
1. Instellen van HPLC Instrument
- Bereid de HPLC-instrument met ultrapuur water (bv, 100% Milli-Q-water) voor line A en 100% methanol lijn B als de mobiele fase en ontlucht de pompen volgens fabrikant eis. Als een van de detectoren gebruikte MS, als hier, voeg 0,1% mierenzuur tot mobiele fasen A en B.
- Stel de HPLC instrumentele componenten en detectoren zoals getoond in figuur 2. Dit vergt geschikte plaatsing van de detectoren ten opzichte van de kolom om het dode volume tussen de detector en de kolom te minimaliseren. Flexibiliteit in het configuratie HPLC is gewenst.
2. Instellen van UV-Vis en MS detectoren
- Stel het UV-Vis detector op de gewenste golflengte afhankelijk van het monster van belang (bijvoorbeeld 280 nm).
- Stel de MS-detector in de positieve modus voor Total Ion Count (TIC) analyse met behulp van Full Scan detectiemethode. Ook pas de volgende MS parameters dienovereenkomstig: verdamper temperatuur van 500 ° C, capillaire temperatuur van 350 ° C, schede gas ingesteld op een snelheid van 60 eenheden, extra gasstroom40 en vegen gasstroom op 5 units en sproei voltage 3,5 kV. Deze instellingen kunnen later voor specifieke behoeften van de gebruikers afhankelijk is van het monster wordt geanalyseerd worden aangepast.
3. Voorbereiding van 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl Radical (DPPH •) Reagens Setup van DPPH • Systeem Detector
- Weeg 25 mg DPPH • en los op in 250 ml methanol in een maatkolf.
- Voeg 250 ul van mierenzuur tot de DPPH • reagens. Bedek de kolf in folie om de blootstelling aan licht te voorkomen.
- Sonificeer de kolf met de DPPH • reagens gedurende 10 min.
- Spoel de DPPH • pomp met de voorbereide DPPH • reagens als per eis van de fabrikant.
- Stel het DPPH • systeem volgens figuur 2 door het aanbrengen van de pomp aan op de inlaat van een T-stuk.
- Bevestig een 100 ul reactie spoel aan The uitlaat van het T-stuk en maak het andere uiteinde van de reactiespiraal naar de detector.
- Encase de reactie spoel in een kolomverwarmer en stel de kolomverwarmer temperatuur tot 60 ° C.
- Stel de DPPH • UV-Vis-detector tot 520 nm.
4. Instellen van PSF Column
- Verbind de inlaat van de kolom PSF met de HPLC instrument.
- Sluit de centrale poort naar het MS detector, met een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang.
- Verbind een randapparaat poort aan de UV-Vis-detector met een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang.
- Sluit een ander randapparaat poort voor de T-stuk van de DPPH • detectiesysteem met een 15 cm lengte van 0,13 mm id slang.
- Blokkeer de ongebruikte perifere poort met behulp van een kolom stopper.
- Breng de stroomsnelheid van de HPLC-pomp met 1 ml min -1 bij 100% lijn B - 100% Methanol (0,1% mierenzuur).
- Equilibreren van de kolom met 100% methanol mobile phase gedurende 20 min bij 4,6 mm ID x 250 mm kolomlengte. Deze tijd wordt geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker mag gebruiken.
5. Tuning PSF Kolom voor multiplexverzending Detection
- Meet de massa van ten minste twee lege opvangbakken (een voor de poort verbonden met de UV-Vis detector en een voor de DPPH • detector) middels een analytische balans.
- Verzamel mobiele fase uit de UV-Vis en DPPH • poorten in twee afzonderlijke, vooraf gewogen verzamelvaten (5,1). Noteer de tijd voor de collectie. Vang minimaal 500 mg oplosmiddel in elk vat.
- De collectie schepen wegen en bepalen van de massa van de mobiele fase. Aangezien de dichtheid van de methanol wordt 0,791 g ml -1, bepaalt het volume van de mobiele fase vanuit elke poort.
- Door het verschil, dat wil zeggen, de nominale pomp set debiet minus het debiet door de DPPH • en UV-Vis DETECTOr stroompoorten Bepaal het debiet naar de MS-detector. Versneld iedere stroom naarmate percentage van de totale stroom.
Opmerking: het ideale geval de stroom percentages zijn: het MS 18% van het totale debiet, de UV-Vis 22%, de DPPH • detector 60%. - Zo niet, stel de stroming percentages door verandering van de tegendruk op de UV-Vis-detector. Bijvoorbeeld, als de stroom naar de UV-Vis te hoog, verlaag de hoeveelheid door toevoeging voeg 15 cm doorsnede van 0,13 mm id slang aan de uitgang van de UV-Vis-detector. Herhaal vervolgens stappen 5,1-5,5.
6. Final Setup Voorwaarden
- Stel het debiet van de DPPH • reagens pomp dezelfde stroomsnelheid de uitlaatpoort verbonden met de DPPH • detector verlaten.
Opmerking: De kolom PSF gemultiplext met UV-Vis, DPPH • en MS is nu klaar voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een gemultiplexte HPLC-analyse werd uitgevoerd met een AFT kolom PSF stand (figuur 1) en ingesteld zoals weergegeven in figuur 2. Dit type installatie kon een koffiemonster gelijktijdig worden geanalyseerd met UV-Vis, DPPH • en MS in Total Ion Count (TIC) modus. De verbindingen van de koffie monster die reageerden op DPPH • kan vervolgens eenvoudig worden aangepast aan de UV-Vis en MS - TIC antwoorden op basis van de uitlijning van de retentietijd zoals geïllustreerd in figuur 3, omdat de chromatogrammen werden tegelijkertijd opgenomen. Wanneer een positieve reactie was vanaf het MS-TIC detector, werd de molecuulmassa van de piek de retentietijd DPPH • pieken opgenomen. Tabel 1 geeft, en de respons van deze pieken in het UV-Vis en / of MS detector, die aldus van de molecuulmassa. Het gemak in bijpassende pieken tussen verschillende detectie processen toegestaan afast en efficiënte vorm van screening en karakterisering van een complex monster, zoals koffie.
Figuur 1. Een beeld van Active Flow Technology kolom in vergelijking met een conventionele kolom. De AFT kolom is uitgerust met een vier-poort uitlaat passend dat de ringvormige frit waardoor piek bemonstering over de radiale dwarsdoorsnede van een monster band herbergt. Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Figuur 2. Een voorbeeld afbeelding van een multiplex HPLC regeling, met behulp van een kolom PSF met DPPH •, UV-Vis en MS detectoren. Elk DETECTO r is een apart stopcontact poort aangesloten. In dit geval de MS wordt gebruikt voor het kwantificeren en is ingesteld om monster uit de radiale centrale uitlaatpoort verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De chromatogrammen van een koffiemonster via een multiplex HPLC-systeem geanalyseerd onder toepassing van een kolom PSF met DPPH • UV-Vis en MS detectors: (a) DPPH • 520 nm, (b) UV-Vis 280 nm, (c ) MS - TIC. Elke detector trace perfect samenvallen in de tijd, zodat er geen offset is vereist ter compensatie van de dode tijd tussen elke detector.arget = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Koffie DPPH • Peak Response and Mass | |||||
| DPPH • Peak | Retentietijd | DPPH • | UV-Vis | MS - TIC Response | Massa |
| (min) | Antwoord | Antwoord | |||
| 1 | 6.74 | Ja | Ja | Ja | 123,84 |
| 2 </ td> | 7.54 | Ja | Ja | Ja | 125,83 |
| 3 | 8.94 | Ja | Nee | Nee | - |
| 4 | 10.05 | Ja | Nee | Ja | 135,83 |
| 5 | 13,15 | Ja | Nee | Nee | - |
| 6 | 16.22 | Ja | Nee | Nee | - |
| 7 | 18.14 | Ja | Ja | Ja | 126,82 |
| 8 | 19.4 | Ja | Ja | Ja | 162,81 |
| 9 | 20,46 | Ja | Ja | Ja | 187,89 |
| 10 | 24,71 | Ja | Ja | Ja | 162,81 |
| 11 | 26.27 | Ja | Ja | Ja | 162,8 |
| 12 | 26,97 | Ja | Ja | Ja | 194,87 |
| 13 | 31,84 | Ja | Ja | Ja | 162,8 |
| 14 | 32.02 | Ja | Ja | Ja | 162,78 | 15 | 32,56 | Ja | Ja | Ja | 176,82 |
| 16 | 33,94 | Ja | Ja | Ja | 176,83 |
| 17 | 41,26 | Ja | Ja | Nee | - |
| 18 | 42,72 | Ja | Nee | Ja | 284,93 |
| 19 | 46,07 | Ja | Ja | Ja | 190,83 |
| 20 | 49,21 | Ja | Ja | Ja | 162,75 |
Tabel 1. gedetecteerd DPPH • pieken reactie op UV-Vis en MS - TIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie heeft betrekking op de karakterisering en profilering van koffie met behulp van HPLC met multiplex detectie gebruik van een parallelle gesegmenteerde stroom (PSF) kolom. Multiplexed HPLC met PSF kolommen maakt de karakterisering en identificatie van belangrijke chemische entiteiten door het verminderen van de complexiteit gegevens van het monster terwijl het verkrijgen van een grotere molecuul-specifieke informatie binnen een fractie van de tijd die met gebruikelijke multi-detectie werkwijzen. De kolom PSF maakt niet alleen een platform voor gemultiplexte detectie, maar ook de combinatie van zowel destructieve als niet-destructieve detectoren zonder extra dode volume en slangen. • DPPH, UV-Vis en MS (TIC) werden gemultiplext voor de analyse van espressokoffie.
Een 4-poorts kolom PSV werd gebruikt voor de multiplex analyse van koffie met behulp van de drie verschillende detectoren. De centrale poort van de kolom PSF uitlaat werd verbonden met het MS detector en twee three perifere poorten zijn aangesloten op een DPPH • detectiesysteem of UV-Vis detector. De derde beschikbare perifere poort werd niet gebruikt en daarom geblokkeerd met een column stop, maar dit had kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van het monster, of om een andere detector. Het stemproces van deze multiplex set-up was specifiek voor de detector, waar de meting van de segmentatie stroom voorgedaan post-detector voor UV-Vis en DPPH • detectiesystemen. Aangezien het MS een destructieve detector, werd de stroom percentage bepaald verschil (totaal nominaal debiet minus de stroom vanaf de andere afvoeropeningen).
In deze studie, de koffie analyse met DPPH • reagens resulteerde in 20 goed gescheiden pieken, waarvan 13 vertoonde ook een respons in het UV-Vis en MS detectoren. Figuur 3 vergelijkt de door elke detector chromatogrammen. Er zijn vier gebieden die dezelfde chromatografische profiel in elkchromatogram, aangegeven door de rode dozen. In deze dozen, waarbij UV-Vis en MS toonde weinig reactie op deze verbindingen, werd een sterke reactie van de DPPH • detector. Vier componenten die reageerden op de DPPH • reagens werden ook niet gedetecteerd door de UV-Vis of MS detectoren en drie van de componenten die reageerden op de DPPH • reagens gaf geen UV-Vis of MS respons helemaal. De moleculaire massa van de componenten die reageerden op de MS worden in tabel 1. Het onderdeel dat elueerde bij 10 min een sterke DPPH • reactie, zonder reactie van de UV-Vis detector en slechts een zeer klein reactie van de MS detector .
De koppeling van een AFT kolom in PSF modus heeft de mogelijkheid om meerdere melders multiplexed mode, waarbij alle melders ongeacht eisen HPLC-detector gelijktijdig werden uitgevoerd in een enkele injectie en scheiding van het complex samp werkingle. De multi-poort koppelstuk ontwerp van de AFT kolom biedt het extra voordeel van het verschaffen van mogelijkheden voor het multiplexen detectie werkwijzen, waarbij gedetailleerde monsterinformatie en absolute betrouwbaarheid van de toewijzing van componenten tussen de detectiemodus. Multiplexed detectie met PSF kolommen voorzien van een grote hoeveelheid monster informatie, drie detectors gelijktijdig worden bediend binnen de run tijd die nodig is voor een enkele detector. De exacte match van de retentietijd van de pieken in elk detectie-modus mogelijk was. Twee van de gebruikte detectors waren destructieve detectoren.
De multiplexing mogelijkheden van een kolom PSF wordt echter beperkt door het beschikbare HPLC instrumentele componenten en detectie instrumenten. De techniek vereist meerdere detectiemethoden en de nodige add-ons voor elke specifieke wijze van opsporing, dat wil zeggen, pompen, reactie spoelen, kachels etc. Het belangrijkste voordeel van multiplexing detectie met behulp van een kolom PSF is de reduction in de analyse van de tijd met maximaal vier maal (als 4 detectoren worden gebruikt), welk monster variabiliteit minimaliseert tussen de analyses voor elke afzonderlijke wijze van opsporing. Bovendien toewijzen van de component verhoudingen binnen het gedetecteerd ene detector ander monster is veel eenvoudiger en minder gevoelig voor fouten dan wanneer iedere detector afzonderlijk werden toegepast. Dit voorkomt mismatch in bestanddeel opdrachten, wat vaak een probleem in de analyse van complexe monsters.
Het is belangrijk te benadrukken dat de kwantificatie moet worden gebaseerd op de detector op het radiale centrale uitlaatpoort sinds scheidingsrendement hier de hoogste derhalve piek tailing effecten minimaal zijn en kwantificering is dus de meest nauwkeurige. De stroom segmentatie is aangetoond door middel van robuuste analyses te zijn, maar toch, het is een goede laboratoriumpraktijken regelmatig standaardisatie te behouden. Vandaar dat in geen kwantitatieve werk is het belangrijk dat de normen waar nodig uit te voeren. Als een detector pure wordt gebruiktly als middel begrijpen van de complexiteit monster door visuele afbeelding van monsterbestanddelen kan kwantificering niet nodig, zoals het geval is voor de antioxidantreactie detectie protocol.
We hebben hier een voorbeeld van een drievoudige detectie, UV, MS en antioxidant reageert detectie aangetoond. Gemultiplexte detectiesystemen gebruikt AFT kolommen kunnen worden toegepast in vrijwel elke situatie waarin een analisten nodig multidimensionale monsterinformatie en deze bestaat uit meerdere detectie protocollen. Met behulp van AFT columns aanzienlijk zal vereenvoudigen en versnellen het proces van het monster karakteriseringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
