Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Published: February 8, 2016 doi: 10.3791/53453
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

Summary

Geliştirmek dönüşümü, yönetmek ve probiyotik maya Saccharomyces boulardii heterolog protein ifadesini test etmek için kullanılabilecek tekniklerin birleşik bir açıklama burada sunulmuştur.

Introduction

Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar etkili ve ekonomik gastrointestinal heterolog proteinlerin teslim ilginç bir potansiyel araçlardır. Bu organizmalar, henüz 1 kolonize olmayan sindirim kanalından geçişini kalan kontrollü doz sağlayan ve uyuşturucu dile maruz kalma sınırlama yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, kolay büyük ölçekte heterolog protein üretmek için bu organizmaların mühendislik becerisi olanağına sentetik dağıtım parçacıkları ekonomik bir alternatif oluşturur. En son 2 boulardii'nin probiyotik maya Saccharomyces Okzotrofik suşu kullanılarak ortaya Ancak, böyle bir yaklaşım geliştirilmesi, maya ve moleküler biyoloji hayvanlara yönelik teknikler ve immünolojik yöntemler kadar geleneksel olarak, belirli bir çalışma içinde birleştirilmemiş laboratuvar teknikleri, bilgi gerektirir. Burada tarif edilen bireysel işlemler kendilerini yeni değildir Böylece rağmenLaboratuar protokolleri, bu yazının amacı sıçangil gastrointestinal ilaç verme araçları olarak probiyotik maya deneysel test için gerekli tekniklere birleşik giriş sunmaktır. Sağlanan için gerekli protokollerin bir derleme: kolayca genetik manipüle edilebilir maya auxotrophic mutant suşlar 1) nesil; maya kültürlerinin 2) dönüşümü, heterolog proteini ifade etmek üzere; oral gavaj yoluyla bağırsak rekombinant maya 3) uygulama; onların heterolog protein ifade kemirgen bağırsak ve değerlendirme gelen canlı rekombinant probiyotik maya ve 4) kurtarma.

Çok sayıda pozitif ve negatif seçim yöntemleri maya türleri manipülasyonu için mevcut olmakla beraber İlk olarak, bu tür Okzotrofik işaretleyiciler kullanılarak negatif seçim etkinliği ve maya dönüştürülmüş ve seçilebilir kolaylığına artırmaktadır. co antibiyotik kullanan transformantların pozitif seçimi,ntrast önemli ölçüde maya manipülasyon maliyetini arttırır. Ayrıca, antibiyotik içeren katı ortam üzerinde maya seçimi üzerinden sentetik damla katı ortam (yayınlanmamış gözlemler) hakkında oksotropik maya seçimine göre dönüştürülmemiş arka kolonilerin artan büyümesi için izin verir. Okzotrofik maya temel amino asitler ya da urasil sentezi için önemli enzimler eksikliği olan suşlarıdır. maya temel metaboliti yoksun medya üzerinden sentetik damla üzerine kaplama olduğunda böylece negatif seçim sağlayarak, eksik metaboliti veya metabolik geni ile takviye Böyle maya sadece büyüyebilir. Bir çok yaygın olarak kullanılan Saccharomyces cerevisiae laboratuar soyları önce aslında oksotropik mutantları 3 bulunmaktadır. Endüstriyel, klinik ve probiyotik maya suşları, ancak, tipik olarak tüm gerekli besinleri sentez yeteneği ile prototropik bulunmaktadır. Bu tür maya daha etkili genetik olarak işlenmesine olanak sağlamak için, oksotrofik genler seçici hedeflenebilirantibiyotiksiz seçilebilir suşlarını meydana getirmek üzere. 6 - okzotrofik işaretleyici gen spesifik hedefleme CRISPR / Cas9 4 hedefleme ile daha yakın homolog rekombinasyon veya dayanarak PCR aracılı gen bozulması ile elde edilebilir. Alternatif olarak, UV mutagenez hızla hatta 7 teknik olarak zordur birden fazla plazmid ile hangi dönüşüm için maya suşları auxotrophic mutantlar üretebilir. PCR hedefleme ve CRISPR / Cas9 başka yerlerde tarif edilmiş olmakla beraber, bu yazının bir negatif seçim yerine Maya transformantlarının pozitif antibiyotik seçimi için sağlayacak oksotropik türleri oluşturmak için, UV mutagenez yaklaşımı anlatan detaylı bir protokoldür bölümünde sunulmuştur.

Heterolog bir proteinin oral yoldan uygulanması için böyle bir oksotrofik suşların kullanımı aşağıdaki gerekli bir aşama plazmid DNA ile maya dönüşümdür. evetler ilk başarılı dönüşümü yana1978 8 Saccharomyces cerevisiae için bildirilen t sferoplastlar, çok sayıda değişiklik verimliliğini artırmak ve maya genetik olarak modifiye edilebilir kolaylığına karakterize edilmiştir. S. DNA'nın başarılı transformasyonu için elektroporasyon kullanımı cerevisiae 1985 9'da tarif edilmiştir ve o zamandan beri ozmotik destek hücreleri 10-1 M sorbitol kuluçkalama eklenerek geliştirilmiştir. Elektroporasyon verimi, ayrıca maya türleri ve şekil, hücre sayısı ve büyüme fazı elektroporasyon hacmi, alan şiddeti, ve spesifik tamponlar 11 bağlıdır gösterilmiştir. Özel bir ekipman gerektirir esas olarak Ito ve ark., 12 tarafından tarif edilen lityum asetat (LiOAc) dönüşümü, en yaygın olarak kullanılan transformasyon protokolleri arasında yer almaktadır. İlave analizler, hücreler mid-log fazında toplandığı zaman LiOAc maya dönüşüm verimliliği büyük ölçüde arttırdığını göstermiştirbüyüme ve ısı 42 ° C ve 12 polietilen glikol (PEG) ve DNA'nın mevcudiyetinde şok. PEG ile bütün dokunulmamış maya inkübasyonu muhtemelen hücre membranına DNA eki geliştirerek ve zar 13 diğer etkileri ile, etkin bir dönüşüm için gereklidir. Lityum kendisi de sağlam hücreler 14 geçirgenliğini arttırır. En laboratuvar S. rağmen cerevisiae suşları kolay LiOAc dönüşüm 3 kullanılarak transforme edilebilir, diğer maya türleri daha etkili bir şekilde bir alternatif protokoller kullanılarak transforme edilebilir. Pichia pastoris, örneğin, en verimli şekilde dönüştürülmüş yerine LiOAc dönüşüm 13 kıyasla- elektroporasyon üzerinden gerçekleştirilir. Bu önemlidir, bu nedenle, çok sayıda test genetik bir uncharacterized maya suşu değiştirmeye çalışırken ve dönüşüm yöntemleri kuluçka dönemleri ve reaktif konsantrasyonları optimize etmek. Bu el yazması, böylece LiOAc tr hem açıklaroksotropik mutan ve vahşi tipli S. transformasyonu için teknikleri ansformation ve elektroporasyon boulardii. İlgilenen okuyucular maya dönüşüm, alternatif protokoller ve eylem 13,15 olası mekanizmaların daha tartışmaların evrim kapsamlı açıklamaları için son değerlendirme yönlendirilir. Plazmid kolaylıkla fark edilebilir bir proteini kodlayan maya transformasyonu uygun bir ifade ile heterolog protein işlevini sağlamak üzere alt test için, ayrıca gereklidir. Sayısız farklı proteinler terapötik çalışma nihai amaç ve immunoblotting, ELISA ve diğer teknikler ile protein tespiti için kullanılabilir antikorlar olarak seçilebilir. Bu teknikler için protokoller iyice başka 16,17 tarif edilmiştir, ve standart eğri ile karşılaştırma ile dönüştürülmüş maya heterolog protein üretimi seviyesini tespit etmek için kullanılabilir. amaçlarla gösteri ve göstermek içinMaya biyolojide çok yaygın olarak kullanılan protein başarılı üretim bu Eser floresan mikroskobu kullanılarak takip eden şekilde tespit eder plazmid kodlayan yeşil floresan proteini (GFP) ile dönüşüm gösterir.

Üçüncü ve dördüncü de tarif edildiği gibi bir heterolog protein, uygun bir şekilde yönetilmesini ve gastrointestinal dokularda bu mikroorganizmaların tespit edilmesi, ifade probiyotik organizmalar üretimine kadar önemli bir. Oral gavaj yoluyla rekombinant maya uygulanması doğrudan C57BL / 6 fareleri, doğal olarak 18 kusma aciz olan mide içine maya kontrollü miktarların verilmesi için izin verir. Ancak, yanlış bir hayvan taşıma ve sonda özofagus hasarı ve perforasyon, mide delinmesi, trakea idaresi ve aspirasyon pnömonisi 19,20 yol açabilir. Kötü tekniği ve deneyimsizliği ayrıca fare bağışıklık tepkilerinin ve deneysel resu değişkenliği artırabiliroral sonda 21,22 üzerine hayvan strese atfedilen lt. Uygun teknikle Uygulama böylece sadece hayvan rahatsızlık zayıflatabilir, ama aynı zamanda deneysel sonuçların doğruluğunu artırabilir. Bu yazıda tarif ve rekombinant maya kontrollü dozlarda tatbikat için hayvanlara yönelik ve bir mide sondası gösterir.

Son olarak, maya ve heterolog proteinin varlığı için lenfoid dokular analiz ederek yeniden birleştirici maya başarılı bir şekilde iletilmesini teyit etmek için hayati önem taşımaktadır. En kolay ve tahmin maya varlığı için incelenebilir mide-immün doku Peyer yamaları. Peyer yamaları mukozal immün yanıt indüksiyon 23 anahtar siteleri ince bağırsakta boyunca ikincil lenfoid organlardır. lümenden antijenler microfold yoluyla transcellularly epitelde (M) hücre aktarılır ve içine maruz bırakılması ve böylece, Peyer yamaları salınırsunan hücrelerin D antijen lümen içeriği intestinal. Bağırsak epiteli üzerinde parçacık alımı da goblet hücreleri tarafından elde edilebilir, ancak bu hücrelerin yalnızca sürebilir parçacıkların çapı 24 daha az 0.02 um gösterilmiştir. Transepithelial dendritler CD103 + dendritik hücrelerin (DC) de 25 lümen intestinal küçük parçacıkları almak uzanan; Ancak, CD103 + DC'ler bakteri daha büyük parçacıkları sürebilir gösteren herhangi bir rapor bulunamamıştır. Böylece bütün probiyotik maya, çapı 3-6 mm arasında ortalama boyutu, E hücreleri tarafından alınır ve Peyer yamaları aktarılacak muhtemeldir. Burada tarif edilen bu prosedür, aynı zamanda kolayca probiyotik bakteri alımını değerlendirmek için adapte edilebilir, ancak, toplama ve uygun bir yeniden birleştirici maya için Peyer yamaları elenmesi için bir protokoldür.

Özet olarak, verilmesi için rekombinant probiyotik maya değerlendirmekbağırsak tetkik, tedavi proteinler, hayvan taşıma ve immünoloji moleküler biyoloji kapsayan laboratuvar teknikleri ustalığı gerektirir. 1 burada sunulmuştur protokolleri) kolay olumsuz antibiyotiksiz seçilebilir üretimi ve oksotropik maya suşunun taranması, 2), alternatif protokoller maya dönüşümü ve heterolog protein ekspresyonunu sağlamak için, 3), uygun hayvansal işleme teknikleri ve oral gavaj gösteriler rekombinant maya mide teslimat ve Peyer diseksiyon için 4) protokolleri ve yaşayabilir rekombinant maya ve fonksiyonel heterolog protein için tarama. Birlikte, bu protokoller üretimi ve mide bağırsak heterolog terapötik proteini sunma yeteneğine sahip bir probiyotik maya suşunun denemeden geçirilmesine izin verecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. UV Mutajenezis auxotrophic Maya düzensizliğin oluşturmak için

  1. UV ışınlama gerekli dozlarının belirlenmesi için hayatta kalma eğrileri oluşturmak
    1. Standart prosedürlere 26 uyarınca YPD (Maya Ekstresi Pepton Dekstroz) ortam ve Tablo 1 'de listelenen diğer reaktifler hazırlamak ve YPD ortamı 5-10 ml tek koloniler inoküle. en az 8 saat boyunca doyurma, 30 ° de CO / N oranında bir silindir tamburu üzerinde kültürleri inkübe edin.
    2. Bir plastik küvet içine su içinde hücreler 1:10 seyreltilmesiyle bir spektrofotometre kullanılarak göre O / N kültürlerinin hücre konsantrasyonunu belirleyin. 20 ml steril damıtılmış su içinde 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar hücrelere seyreltilir.
    3. kapak kaldırılmış ile, UV ampul altında plaka 14 cm koyun, steril plastik Petri kabı içine seyreltilmiş hücreleri dökün ve.
    4. Her bir artış öyle ki alttaki hücrelerin, 500 ul ekstre seri 5000 μJ hücreleri ve UV ışınlama 10,000 μJ dozlarda ortaya çıkarma, hücrelerin0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ ve 50.000 μJ UV radyasyona maruz kaldıktan sonra örneklenir. Aktarım çıkarılan hücre örnekleri 1.5 ml tüpler steril ve seri steril su 01:10 artışlarla sulandırmak için.
    5. 1 dakika için 16,000 x g'de bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile her seyreltme hücreleri Pelet. maya hücreleri kaplama için steril su uygun bir 100 ul hacminde aspire supernatant ve tekrar süspansiyon. YPD katı medya içeren plakalar üzerine yeniden süspanse hücrelerin tam hacmini Pipet ve eşit her plaka üzerinde hücrelerin dağıtmak için steril bir serpme kullanın.
    6. foto-reaktivasyonu ve UV kaynaklı mutasyonların onarımı önlemek için alüminyum folyo ile medya ve kapak plakaları kurumasını önlemek için Parafilm plaka kenarları sarın. Canlı maya kolonileri (Şekil 1) büyümesine olanak sağlamak için baş aşağı, 30 ° C de 2-4 gün süreyle inkübe edin.
    7. numbe Sayısıisteğe bağlı olarak sayılan koloniler kapalı işaretlemek için bir kalem yardımıyla, bir el elektronik sayaç kalem, ya da bir sayaç ile kolonilerin r büyütme ile stand. UV ışınlaması her μJ dozunda, toplam kaplama hücrelerinin yüzdesi olarak Konu ışınlanmış maya (Şekil 2) için hayatta kalma eğrisi oluşturmak için.
      Not: Haploid maya suşlan aynı oranda hayatta kalma ulaşmak diploid suşlara UV ışıması nisbetle daha düşük dozlara ihtiyaç beklenebilir. Böyle rad1 S. gibi fonksiyonel DNA onarım enzimleri eksik maya suşu cerevisiae mutantı çok düşük dozlarda UV ışınlaması varlığını göstermek için bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir.
    8. UV mutagenez dozunun belirlenmesi 1.1.7 kurulan hayatta kalma eğrisi başvurarak tarama için kullanılır. y 50 eşit yaşam eğrisi boyunca noktanın x değeri maya% 50 hayatta hangi UV ışınlama dozdur. Bu düşük yüzde hayatta kalma mutantlar Tarama bir neden olabilirÖzellikle diploit maya için başarılı bir şekilde mutasyona uğramış suşlar daha yüksek verimle. WT S.% 50 sağkalım dozu Şekil 2'de gösterildiği gibi boulardii'nin, yaklaşık 18,000 μJ olup.
      NOT: Bu yüksek UV doz ilgi oksotropik işaretleyici gen dışında hücresel yolların genlerinin mutasyonlarının riskini artırır, ancak bu dezavantajı oksotropik marker geninin iki kopyasının mutasyonlar indükleme ihtiyacına karşı dengelenmesi gereklidir. örneğin% 90 gibi daha yüksek bir hayatta kalma yüzdesi de tarama tek gen kopya olarak mutasyonlu olmalıdır ki haploid suşları için ek mutasyonlar riskini azaltır ve yine oksotropik mutantların yeterli oluşturulmasına izin verir.
  2. okzotrofik maya suşları için UV mutagenez ve tarama
    1. adımda 1.1.1-1.1.3 tarif edildiği gibi maya hazırlayın.
    2. 1.1.8 saptandığı gibi,% 50 hayatta kalma tekabül eden, UV ışınlama dozu maya Açığa. WT S. boulardii'nin, bu doz, WAyaklaşık 18.000 μJ (Şekil 2) olduğu belirlenen s.
    3. UV 1 mi hacim 1 dakika için 16,000 x g'de bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile maya ve pelet ışımaya toplayın. 100 ul steril su içinde aspire supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri.
      1. mutantlarının seçimi
        1. Örneğin URA3 gibi seçimi kullanılıyorsa - oksotrofik mutantlar, levha fonksiyonel Ura3 enzimi eksik hücreleri seçmek için 5-fluoroorotik asit (5-FOA) ihtiva eden ortam üzerinde maya ışınlanmış.
          NOT: URA3 işlevsel kopyalarını içeren herhangi bir maya hücre ölümüne yol açan ve URA3 kolay seçimi için izin toksin 5-fluorourasil 5-FOA dönüştürür - fonksiyonel URA3 27 yoksun koloniler. TRP1;, α-aminoadipik asit 28 içeren medyayı kullanarak ve MET2 ve MET15 belirteçleri benzer seçme yaklaşımları LYS2 ve LYS5 için mümkündür; 5-floroantranilik asit 29; sırası ile ve metil cıva 30,31.
        2. 5-FOA içeren minimal ortama yeniden süspanse hücrelerin 100 ul pipet ve steril bir dağıtıcısı için eşit kat plakası kullanın. Parafilm plakalar sarın ve canlı maya koloni büyümesine izin vermek için ters 30 ° C'de 2-4 gün süreyle inkübe edilir.
        3. YPD, urasil üzerine çizmek suretiyle ekilerek 5-FOA plakaları üzerinde yer alan herhangi bir koloninin fenotip - - URA3 onaylamak ve 5-FOA plakaları (Şekil 3). Tek bir koloni kısmını toplamak için steril bir kürdan ucu kullanın ve nazikçe taze YPD, urasil genelinde hücreler sürükle - ve 5-FOA plakaları. Yine baş aşağı 30 ° C'de 2-4 gün boyunca sarılmış plakaları kuluçkaya yatmaktadır.
          NOT: kabaca dairesel büyümeler kaldırdı olmayan canlı hücreler sadece herhangi yükseltilmiş büyümeleri (Şekil 3) olmadan bir opak smear olarak gözükecektir Canlı koloniler görünecektir.
      2. scrMutantların Eening
        1. seçim yöntemleri mevcut değildir kendisi için bir okzotrofik mutant üreten varsa, kaplamaz eşit şekilde plaka steril dağıtıcısı kullanarak, UV seri 01:10 çözücüler steril suda maya hücreleri ışınlanmış hazırlamak ve YPD medya üzerine dilüsyonları pipetle.
        2. Parafilm tabak sarın ve baş aşağı 30 ° C'de 2-4 gün inkübe edin. kolayca birbirinden plaka başına genellikle en fazla 100, yaklaşık fazla koloniler ayırt edilebilir bireysel koloniler büyümesi için izin verilmiş olan seyreltme belirler.
        3. Bu kararlı seyreltme de 1.2.1-1.2.3 ve plaka hücreleri tarif edildiği gibi maya örneklerinin tekrarlayın UV mutagenez. , YPD ortamına seyreltilmiş maya Pipet hücreleri dağıtmak için steril bir serpme kullanmak ve baş aşağı 30 ° C'de 2-4 gün boyunca sarılmış plakaları kuluçkaya yatmaktadır.
        4. ilgi metaboliti eksik seçici ortama replika plaka ile oksotrofları için ekran. İlk olarak, bir tabak standın üzerine steril bir kadife yastık emniyeteve plaka yönünü işaretleme, kadife üzerine UV ışınlanmış kolonileri ile plaka ters çevirin.
        5. Sonra, plaka kadife hücreleri aktarmak için bastırın hafifçe kadife üzerine ilgi metaboliti eksik taze bir tabak ters ve. 4 ° C'de orijinal plakası saklayın. Sarın ve baş aşağı 30 ° C'de 2-4 gün için yeni plaka kuluçkaya yatmaktadır.
        6. seçici ortama YPD re-streaking koloniler tarafından çoğaltma kaplama, ekran mutantlar bir alternatif olarak. tek bir koloni kısmını toplamak ve yavaşça taze YPD plaka ve ilgi metaboliti eksik bir plaka üzerinde hücreleri sürüklemek için steril kürdan ucu kullanın. Yine baş aşağı 30 ° C'de 2-4 gün boyunca sarılmış plakaları kuluçkaya yatmaktadır.
          NOT: Bakım gerçek auxotrophic hücrelerin homojen bir nüfusa onaylamak için tek koloniler ve çizgi dışarı koloniler birden çok kez seçmek için alınmalıdır.
    4. Dahası inoculat tarafından ışınlanmış hücrelerin fenotipi teyit(mutant - - bir URA3 için ortam, örneğin urasil olarak) YDP ve uygun metaboliti eksik medya hem 5-10 ml tek koloniler ing. metabolitin yokluğunda YPD medyada hücrelerinin büyümesini değil, onaylamak için 30 ° CO / N bir silindir tambur üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
      NOT: Katı ortam üzerinde büyüme desenleri açıkça maya auxotrophic durumunu gösterir gerektiği halde bazı maya stresini tolere ve katı ortam üzerinde küçük, yavaş büyüyen koloniler oluştururlar ancak henüz sıvı ortam (yayınlanmamış gözlemler) aynı şartları tahammül için, bu mümkün. Sıvı kültürleri aşılama, böylece iyice UV ışınlanmış mutantların büyüme modelleri doğrulamak için gerçekleştirilmelidir.
    5. teyit okzotrofik mutantların uzun süreli depolama için, 10 mi YPD içinde inoküle hücreler tarafından gliserol stokları hazırlama ve 30 ° C 'de bir silindir tambur O / N ile inkübe. 2500 xg ve aspire medya 3 dakika boyunca santrifüj Pelet hücreleri. % 50 yeniden süspanse hücreleriFiltre edilmiş steril gliserol, -80 ° C de meydana gelmekteydi ve saklamak için aktarın.
      NOT: UV mutajenize maya potansiyel ilgi auxotrophic işaretleyici dışında birden genlerinde mutasyon içermektedir. Başka 2 açıklandığı gibi belirlenmiş oksotropik mutantlarının kullanımı ile devam etmeden önce, bu suşların ayrıca gen sıralamada ve pH safra asidi gerilimlere direnç değerlendirmesi ve probiyotik suşları ile ilgili diğer özellikleri ile analiz edilmelidir. 6 - Ayrıca, pcr homoloji veya CRISPR kullanımı / Cas9 daha seçici UV mutagenez 4 alternatif olarak düşünülmelidir auxotrophic işaretçileri mutasyona hedefleyen.

2. Maya Dönüşümü

  1. Maya LiOAc Dönüşüm
    1. YPD medya 5-10 ml tek maya kolonileri aşılamak ve 30 ° CO / N bir silindir tambur üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
    2. De log fazı büyümesini teşvik ve plazmid alımına verimini arttırmakBir spektrofotometre kullanılarak termine hücre konsantrasyonu, bir plastik küvet içinde, steril su içinde bir hücre 1:10 seyreltme ölçülür. Taze sıcak YPD, 50 ml - (2.5 x 10 6 hücre / ml, yaklaşık 2 x 10 6) ve kültür kadar 200 rpm'de ayarlanmış bir yörüngesel bir platform çalkalayıcıda hücreleri inkübe bir OD 0.16-0.2 600 O / N kültürleri seyreltin yaklaşık olarak 1 x 10 7 hücre / ml, genellikle yaklaşık 4 saat ulaşır.
      Not: dönüşüm etkinliği plazmid DNA mikrogram ortalama başarıyla dönüştürülmüş maya koloni oluşturan birim (CFU) sayısının bir fonksiyonu olarak ölçülebilir. plazmid DNA mikrogram başına dönüştürülmüş koloniler halinde verimlilik sonuçları artmıştır. Log fazı büyümesi esnasında maya hücreleri ve toplama alt kültür transformasyon etkinliğini arttırır 12 bir faktördür.
    3. 3 dakika boyunca 2500 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
    4. pell resuspending 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süpernatant ve transfer hücreleri aspire1 ml steril su içinde ve çal.
    5. santrifüj ile pelet hücreleri mikrosantrifüj içinde 1 dakika için 16,000 x g'de, süpernatan aspire ve 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon hücreleri yıkayın.
    6. 2 x 10 9 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar TE / LiOAc tamponu içinde santrifüjleme ve tekrar süspansiyon hücreleri tekrarlayın.
    7. Aşağıdakilerden her biri ile dönüşümü karışımları hazırlayın: TE / LiOAc tamponunda hazırlanmış maya 50 ul, taşıyıcı DNA (10 ug / ml) 5 ul ve plazmid DNA (1 ug) 1 ul. Plazmid DNA mikrogram veya transformasyon veriminde bir artış ile 32 neden olabilir veya olmayabilir DNA artan miktarlarda olarak titre edilebilir
      NOT: Bir okzotrofik işaretleyici içermeyen bir mutant maya suşu için, işaretleyici kodlayan tek bir plazmid numune başına transforme edilebilir. Bundan başka, GFP gibi kolayca fark edilebilir bir proteini kodlayan bir plazmid kullanımı uygun katlanma ve heterolog pr ifade etkin belirlenmesi için sağlayacakdönüşüm daha sonra maya suşu tarafından otein.
    8. Her hazırlanması, iyice PEG / LiOAc / TE ve vorteks 300 ul ekleyin. PEG ile sağlam hücreler inkübasyonu etkin dönüşüm 13 için gereklidir.
    9. 200 rpm'de bir orbital çalkalama platformunda üzerine yerleştirilir, bir beher içinde mikrosantrifüj tüpleri yerleştirerek çalkalama ile 30 dakika boyunca 30 ° C 'de preparatları inkübe edin.
    10. 42 ° C su banyosu içinde 15 dakika boyunca, her reaksiyon ve ısı şoku hücrelere DMSO 35 ul ekle. DMSO 33 yararı raporları çakışan olmasına rağmen, sağlam maya hücrelerinin ısı şoku ölçüde transformasyon etkinliğini geliştirmek için 12 gösterilmiştir.
    11. steril su, 2.1.5 gibi santrifüj ile pelet aspire ya süpernatant pipetleme ve 1 ml içinde yeniden süspanse edilerek hücreler yıkanır. Yavaşça hücre pelet kırmak için aşağı yukarı pipet ve.
      NOT: iyice medya kullanımı nedeniyle süpernatant kaldırmak için kritik öneme sahiptirYetkili hücrelerin üretilmesi d maya büyüme ve koloni oluşumunu engelleyebilir.
    12. 2.1.5 gibi tekrarlayın hücre peletleme, süpernatant aspire ve 100 ul steril su hücreleri tekrar süspansiyon. selektif plaka üzerine tam hacmini Pipet ve steril dağıtıcısı için eşit kat dönüştürülmüş maya ile plaka kullanın.
    13. ortam kurumasını önlemek ve dönüştürülen maya hücrelerinin büyümesine izin vermek için ters 30 ° C 'de 2 gün boyunca inkübe Parafilm kaplı plakaların kenarlarını sarın. Verim başka türlerden (Şekil 4) çok daha düşük olmasına rağmen başarılı, etkili bir dönüştürme ve Saccharomyces cerevisiae'nin oksotropik seçimi, transformasyon hazırlık başına koloni yüksek sayısını verir.
    14. Kısa vadede (genellikle 1-3 hafta) baş aşağı ve 4 ° C'de kapalı Store maya plakaları. Uzun süreli depolama için 1.2.5 tarif edildiği gibi transforme maya gliserol stokları hazırlayın.
      NOT: Diğer çalışmalar test dönüştürülmüş CFU plazmid stabilitesini tespit heterolog proteinin doğru ekspresyonunu değerlendirmek için gereklidir. Plazmid stabilitesi 34, immunoblotting kullanım Ayrıntılı açıklamalar hücre örneklerinin 17 elde denatüre proteinler tespit etmek için, enzim, uygun bir şekilde, üç boyutlu proteinler 16 ve 35 başka bir yerde kullanılabilir maya çalışmalarında GFP kullanımı katlanmış tespit etmek için immünosorban tahlili (ELISA) bağlandı. Şekil 6 dönüştürülmüş S. başarılı GFP ifade temsili bir görüntüsünü gösterir dönüştürülmemiş hücrelere cerevisiae göre. Bir floresan protein kullanılması etkin bir şekilde başarılı bir heterolog protein üretimi belirlemenin bir araçtır.
  2. Maya elektroporasyon
    1. YPD medya 5-10 ml tek maya kolonileri aşılamak ve 30 ° CO / N bir silindir tambur üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
    2. steril su içinde bir hücre 1:10 seyreltme ölçmek için bir spektrofotometre kullanılarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. diYaklaşık 0.3 bir OD 600 eşdeğerine 100 ml taze sıcak YPD medya ud O / N kültürleri. Genellikle, yaklaşık 1.6, 4-5 saat bir OD 600 ulaşana kadar 200 rpm'ye orbital bir platform çalkalayıcısı grubu 30 ° C 'de alt kültür inkübe edin. Her 100 ml'lik altkültür iki dönüşüm reaksiyonları için yeterli klimalı hücreleri oluşturur.
    3. 3 dakika boyunca 2500 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatant aspire ve 50 ml buz soğukluğunda steril su içinde yeniden süspanse edilerek hücrelerin yıkanması. Hücreleri peletleme süpernatant aspire ve taze 50 ml buz gibi soğuk steril su içinde resuspending yıkama tekrarlayın.
    4. Yine hücreler pellet ve 50 ml buz soğukluğunda elektroporasyon tamponu (1 M sorbitol, 1 mM CaCl2) içinde tekrar süspansiyon.
    5. 20 tekrarlayın 2.2.3 gibi spin, aspirat süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri ml 0.1 M LiOAc / 10 mM DTT. 30 dakika boyunca 30 ° C 'de bir silindir tamburu üzerinde bir hücre süspansiyonu inkübe edin. LiOAc ve DTT hücrelerin önceden bekletme sinerjistik artarelektroporasyon 36 verimlilik.
    6. , 2.2.3 gibi hücreler topak süpernatantı kaldırmak ve 50 ml buz soğukluğunda elektroporasyon tamponunda yeniden süspanse yıkayın. 1 ml'lik bir son hacme kadar buz elektroporasyon tamponu içinde santrifüjleme ve tekrar süspansiyon hücreleri tekrarlayın.
    7. durumunu, maya hücreleri, steril elektroporasyon küveti ve plazmid DNA: Buz üzerine hazırlayın. Hemen 1 mi elektroporasyon tamponu içinde durumunu hücrelerinin, son yeniden süspansiyonun ardından yaklaşık olarak 1 ug plasmid DNA ile 400 ul şartlandırılmış maya hücreleri birleştirmek ve buz gibi soğuk bir 0.2 mikron elektroporasyon küvetine ilave edin. DNA artan miktarlarda kullanılması biraz dönüşüm verimliliği 11 artırabilir. daha sonra 2.5 kV ve 25 uF ile Electroporator seti ile elektroporasyona, 5 dakika boyunca buz üzerinde reaksiyon inkübe edin.
      Not: 2.1.7 tarif edildiği gibi, tek bir okzotrofik işaretleyici içermeyen bir mutant maya suşu tek plazmid numune başına mutasyon geçirmiş işaretleyici kodlayan ile transforme edilebilir. Ayrıca kullanılarakGFP gibi kolayca fark edilebilir bir proteini kodlayan bir plazmid uygun katlanma ve dönüşüm sonrasında heterolog protein ifade etkin belirlenmesine izin verir.
    8. YPD: 1'lik bir karışımı: Transfer 1 8 ml hücreleri elektropore 1 M sorbitol ve hücreler, 60 dakika süre ile 30 ° C 'de bir silindir tamburu üzerinde inkübe edin.
    9. Pelet 2.2.3 gibi hücreler ve 100 ul 1 tekrar süspansiyon: 1 YDP: 1 M sorbitol. , 1 M sorbitol ihtiva eden seçici ortama hacmini Plate Parafilm levha kenarları kaydırmak ve transforme maya hücrelerinin büyümesi için izin vermek için ters 30 ° C'de 2-5 gün süreyle inkübe edin.
      NOT: 2.1.14 ve 2.2.7'de tarif edildiği gibi, heterolog proteinin doğru ekspresyonunu değerlendirmek için deney dönüştürülmüş maya için çok önemlidir.

Dönüştürülmüş Maya ile Fare 3. Sözlü Gavaj

  1. Laboratuvar An Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre tüm hayvan bakımı ve taşıma prosedürleri uygulayınimals ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onayı.
  2. seçici medya 5-10 ml dönüştü auxotrophic maya tek koloniler aşılayarak O / N maya kültürleri hazırlayın. doyana kadar 30 ° C 'de bir silindir tamburu üzerinde en az 8 saat boyunca O / N kültürleri inkübe edin.
    Not: 4.7 de tarif edildiği gibi GFP gibi plazmid kodlayan Test proteinlerinin kullanımı, zorla ağız yolundan verilmiştir mayada proteinin ekspresyonu test kolaylığı sağlar.
  3. Protein ekspresyonu maksimum indüksiyon için ve O'dan alt kültürleri hazırlamak log fazı büyümesini teşvik etmek için / 2.1.2'de tarif edildiği gibi uygun bir ortam, yaklaşık 0,16-0,2 50 ml'lik bir OD 600 eşdeğer seyreltilerek K Kültürleri.
  4. 1.1.2 gibi alt kültür hücreleri konsantrasyonunu belirlemek ve / ml 10 9 hücrelerine ayarlayın. doğruluğunu geliştirmek ve örnek yükleme kolaylığı grup başına birkaç yüz ul ekstra hacim ile, her fare için 100 ul dozu hazırlayın.
  5. 2.500 xg santrifüj Pelet hücreleri3 dakika ya da 1 dakika süre ile 16,000 x g'de bir mikrosantrifüj. steril su eşit miktarda eklenmesi ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme Süpernatant aspire ve tekrar süspansiyon hücreleri.
  6. 100 ul artışına herhangi kabarcıklar ve set pistonu ortadan kaldırmak için emin olmak, 1 ml steril enjektör ve yük maya numune üzerine uygun bir göstergesi gavaj iğne (15-20 gr fareler için 22 G) sabitleyin. sonda kontrol farelerine steril su ile ek bir şırınga yükleyin ve herhangi bir kirletici mayanın olmadığını kontrol edin.
  7. Sıkıca boyun (Şekil 6A) çevresindeki deri kavrama işaret parmağı ve başparmak ile, non-dominant el kullanılarak zorla ağız yolundan verilmiştir edilecek fareyi Pick up. alt gövde hareketini önlemek için küçük parmağın altında kuyruk sokmak. kavrama güvenli ve sonda sırasında iç dokulara zarar görmesini önlemek için başını hareket fare yasaklar emin olun.
    NOT: böyle fare karşı iğne tutarak sonda iğne eklenmesi gereken ne kadar tahminAmpul bile sternum kılıç şeklinde bir süreç ile. iğne bu uzunluğu takma genellikle sonda iğne ampul mide girmek için izin verecektir.
  8. Dominant eli kullanarak, yavaşça, ağız ve boğaz arka çatı boyunca iğne olta merkezinin hafifçe sola tutarak fare yemek borusuna sonda iğne takın. Fare iğne ampulü yutmak ve iğne 3,7 (Şekil 6B) tahmini noktaya biraz daha inmeye izin bekleyin. Bir direnç sonda iğne yerleştirilmesi sırasında veya herhangi bir zamanda fare gasp başlarsa hissedilir, yavaşça iğneyi çıkarın ve tekrar yemek borusu bulmaya çalışın.
  9. Fare sonda iğne ampul yuttu sonra, yavaşça doğrudan fare mideye maya 100 ul (10 8 CFU) yönetmek için şırınga pistonu bastırın.
    NOT: Fareler idaresi 18,19 sonra zorla ağız yolundan verilmiştir herhangi bir çözüm kusma mümkün olmakla birlikte 21,37 sırasında meydana gelmesi için destek> mümkündür. Uygun gavaj iğne yerleştirilmesi, hem de çözeltinin hacmini ve viskozitesini ayarlama gibi, reflü sınırlamak ve doğru doz sağlamak için yardımcı olabilir.
  10. Dikkatle fare mide ve yemek borusu gelen sonda iğne kaldırmak ve kafes fare dönün. Fare nefes ve sonda iğne düzgün işlem boyunca ve hiçbir çözüm aspire edildiği takıldı emin olmak için sonda sonra normal hareket olup olmadığını kontrol edin.

Canlı Maya Sömürgeler Hasat Fare Peyer Yamalar 4. ve İzolasyonu

  1. Uygun zaman noktası sonrası sonda anda, genellikle 4 saat, IACUC kullanarak kurban fareler yöntemleri onayladı. Bir ayak tutam aşağıdaki tepki olmaması için kontrol edin ve fare kurban gibi servikal dislokasyon gibi ikincil bir tedbir kullanın. Çok sayıda çalışmalar verimlilik ve yukarı zamanlaması gösterdiği gibi ek zaman noktaları da, test edilebilirepitel boyunca almak parçacık 38,39 bağlıdır.
  2. Tamamen açık karın ile fare Lay ve% 70 EtOH ile püskürtülerek karın alan sterilize. herhangi bir iç dokulara zarar vermemek için dikkatli olmak, makas ile kürk ve deri yoluyla enine bir kesi yapmak. El ile kesi periton, karın organları kaplayan ince serozal astar ortaya çıkarmak için daha fazla açmak gözetlemek. Yavaşça periton kaldırın ve bağırsakları ortaya çıkarmak için bir enine bir kesi yapmak.
  3. Dikkatle uzak mezenterik arterler, yağ ve diğer dokulardan ince bağırsağa kızdırmak için künt forseps kullanabilir. Kalın bağırsak başlangıcında, çekuma fare karın üst sol kadran, mide bağırsak dokusu büyük bir cep ince bağırsak açığa.
  4. 1-3 mm ince bağırsakta boyunca opak dokusunun kabaca dairesel yamalar (Şekil 7) bakarak Peyer yamaları izole edin. Kavisli diseksiyon SCIS kullanmasors, çevredeki lamina propria hiçbiri toplanan olduğundan emin olmak için kenar boşluklarını bırakarak, Peyer yama kubbeyi kesip.
    NOT: Çoğu fareler 4-8 kolayca görülebilir Peyer arasında var. Doğrudan üstten aydınlatma ile bir alanda işlemi gerçekleştirmeden Peyer yamaları görüntülenmiştir kolaylığını artırır.
  5. Tam Iscove'un değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) içinde Peyer yamalarını parçalara toplayın.
    NOT: maya plakaları gastrointestinal bakteri bulaşmasını önlemek için toplama medyada antibiyotik steril tekniği kullanmak ve dahil etmek önemlidir.
  6. 40 mikron hücre süzgecinden suşu Peyer yamaları toplama ortamını ortadan kaldırmak için. 50 ml'lik bir tüp üzerinde taze tam IMDM ile yıkayın Peyer yamaları ve yavaşça Peyer yamaları kırmak için 1 ml şırınga bir dalgıç kullanın. 7 dakika için 1800 rpm'de santrifüjleme ile gergin pelet hücreleri. Süpernatant aspire ve tekrar süspansiyon hücreleriYaklaşık 100 ul'lik bir son hacim.
  7. seçici maya medya üzerine gergin hücreleri uygulayın ve eşit hücreleri dağıtmak için bir tabak serpme kullanın. Parafilm levha kenarları sarın ve sıçangil Peyer yamaları elde herhangi bir canlı maya büyüme sağlamak için baş aşağı, 30 ° C 'de 2 gün boyunca inkübe edin.
    NOT: Peyer 'yamalar gelen maya kurtarma sonra daha ileri çalışmalar suşları bu bağışıklık dokulara düzgün katlanmış heterolog protein teslim edebiliyoruz onaylamak için gereklidir. 2.1.14 tarif edildiği gibi, bu gibi yöntemler gibi GFP 2,40 gibi floresan proteinleri tespit etmek için immunoblotting, ELISA ya da floresan mikroskobu içerebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UV ışınlaması, aşağıdaki hayatta kalma eğrisi oluşturacak şekilde farklı koloni oluşturan birim (CFU) oluşturabildiği şekilde seyreltildi maya hücrelerinin kaplama gerektirir. Yukarıda açıklandığı gibi toplanan her 500 ul numune yaklaşık 5 x 10 6 hücre ihtiva eder; Bununla birlikte, plaka başına 100'den büyük koloniler doğru ayırt etmek zordur. Seyreltilmemiş örnek yanı sıra ışınlanmış hücrelerin seri 01:10 dilüsyonları böylece Şekil 1'de gösterildiği gibi CFU, her UV dozunda numaralandırılan edilebilmesini sağlar Kaplama. CFU sayımı, seyreltme faktörü ile çarpılır, ardından toplam sayısına bölünür her bir dozda yüzde hayatta kalma tespit etmek için, her 500 ul numune orijinal ışınlanmış hücreleri. Şekil 2 diploid vahşi tipli S. hesaplanan yüzdesini gösterir boulardii'nin hücreler 0 μJ, 5000 μJ 10.000 μJ, 15.000 μJ 20.000 μJ, 22.500 μJ, 25.000 hayatta kalabilirμJ, 35.000 μJ ve 50.000 μJ. Bu veriler,% 50 hayatta kalma karşılık gelen dozu bulmak için kullanılabilir açık bir eğri oluşturmaktadır.

UV dozu ve maya hücrelerinin ışınlama seçilmesinden sonra, bu fonksiyonel oksotropik marker geninin olmaması onaylamak ekran mutant koloniler için kritiktir. Bir seçim yönteminin kullanımı, 1.2.3.1 açıklanmıştır ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, önemli ölçüde fenotipi teyit etkinliğini arttırır. Sağlam URA3 toksin 5-FU 5-FOA dönüştürülmesi yararlanır URA3 seçme bir örnek gösterilmektedir. TRP1;, benzer yaklaşımlar LYS2 ve LYS5 için kullanılabilir ve MET2 ve MET15, bu mutasyonlar için seçim etkinliğini artırmaktadır. Bakım tarama sırasında bireysel koloniler seçmek için alınmalıdır. YDP ve 5-FOA değil urasil üzerinde mutant kolonilerinin istikrarlı büyüme - plakalar işaret değerleriauxotrophic fenotip es.

Şekil 4 vahşi tip S. dönüşüm verimliliğini gösterir Yaygın olarak kullanılan bir laboratuvar S'ye boulardii (Sb) göreli LiOAc (LiOAc) ve elektroporasyon (Elektro) tekniklerini birlikte kullanarak cerevisiae suşu (Sc). LiOAc dönüşümü S. için çok verimli olmasına rağmen cerevisiae, S. dönüşüm verimliliği boulardii ölçüde. elektroporasyon kullanılarak geliştirilmiş dönüştürülmüş maya uygun protein ifadesini analiz bir örnek yöntemi olarak floresan mikroskopi 5 gösterileri kullanımını Şekil edilir. Aydınlık (A) ve flöresanlı (B) görüntüleri S. gösterilmektedir cerevisiae dönüştürülmüş maya heterolog proteinin işlevsel ifadesini gösteren bir URA3 plazmid kodlayan GFP ile transforme edildi. Hücreler daha iyi görselleştirme (kaplamaz 2 5 ul konkanavalin A kaplı lamelleri kullanarak hareketsiz olabilirmg / her 22 x 22 mm lamel ve kuru hava üzerine suda ml stok çözelti).

Şekil 6A, oral gavaj hemen önce gerçekleştirilen bir C57BL / 6 fare gösterir. El fare herhangi bir yönde kafa taşımak mümkün olmadığı sıkıca böyle fare sırt ve boyun kavrıyor. Bu tutma gavaj iğnesi doğru yerleştirilmesini ve fare gavaj iğnesi yutar sonra doku hasarının azalma riski. Şekil 6B, tutulan gavaj iğnesi gösterir sağlar. Şekil 7'de gösterildiği gibi, kuluçka süresinin ardından, kurban fare ince bağırsak dikkatle çevre dokulardan ayrı alay gerekmektedir. Bu durum, manipülasyon çevreleyen bir toplama olmadan Peyer yamaları ve yamalar temiz diseksiyon kolay saptanmasına olanak lamina propria. Son olarak, Şekil 8, Peyer yamaları canlı maya CFU tipik bir iyileşme olduğunu gösterir. Çözümler Maya Medya ve Tabaklar dönüşüm Reaktifler Polietilen glikol (PEG)% 50: YPD: TE / LiOAc: 250 g PEG 3350 20 g pepton 50 mi 10x TE 500 ml steril su 20 g dekstroz 50 mi 10x (1 M) LiOAc filtre sterilize 10 g maya özütü 400 ml steril su 1 L su filtre sterilize Otoklav TE 10x: YPD plakalar: PEG / TE / LiOAc: 100 mM Tris 20 g pepton 400 ml% 50 PEG 10 mM EDTA 20 g dekstroz 50 mi 10x TE 7.5 ve filtre ile sterilize pH 20 gr ağar 50 mi 10x (1 M) LiOAc 10 g maya özütü 1 L su Otoklav % 20 glükoz: Urasil - seçici medya Taşıyıcı DNA (SS DNA): 200 g dekstroz urasil yoksun 2 g, amino asit karışımı -20 ° C'de saklayın ve ipliklerini eritmek için 100 ° C'de 1-2 dakika boyunca ısı kullanımı ve buz üzerinde saklamak için önceden 1 L su amino asitler içermeyen 6.7 g maya azot baz filtre sterilize 1 L su <tr> otoklav veya steril filtreleme ile sterilize Kullanmadan önce% 20 glikoz 01:10 ekle % 50 gliserol: Urasil - plakaları: Elektroporasyon tampon maddesi: 500 ml gliserol 250 ml'lik bir şişe içinde: 1 M sorbitol 500 ml su urasil yoksun 2 g, amino asit karışımı 1 mM CaCl2 Otoklav amino asitler içermeyen 6.7 g maya azot baz damıtılmış su ile doldurun 150 ml su 4 ° C'de otoklav ve mağaza 2 L'lik bir şişede: 20 gr ağar 750 ml su Otoklav şişeler ayrıca, daha sonra 100 ml% 20 glukoz ile karıştırın tam IMDM 5-FOA + plakaları: LiOAc / DTT 500 mi Iscove Modifiye Dulbecco Ortam 2 L'lik bir şişede Otoklav: 0.1 M LiOAc 5 ml penisilin streptomisin glutamin 100x 20 gr ağar 10 mM DTT 500 ul 2-merkaptoetanol 750 ml su % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu mix: 2.5 ml sodyum piruvat, 100 mM amino asitler içermeyen 6.7 g maya azot baz urasil olmayan 2g amino asit karışımı 150 ml ılık su Soğuyunca ekleyin: 0.05 gr urasil tozu 1 g 5-FOA Karıştırın ve filtre sterilize otoklavlanmış agar çözeltisi ekle 100 ml% 20 glukoz ile karıştırın

Tablo 1. Reaktifler listesi. Açıklanan bu yazının protokoller için kullanılan çözümlerin, maya medya ve plakalar ve dönüşüm tamponların her yapım için gerekli reaktif vardır.

Şekil 1
Şekil 1. Maya kolonileri YPD ortamına yetiştirilen. Örnek YPD plaka p birim (CFU) oluşturan canlı koloni gösterenUV ışınlaması sonrası robiotic maya. Hücreler seri bireysel CFU ayırt ve sayılabilir şekilde sulandırıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Diploit probiyotik maya için Şekil 2. sağkalım eğrisi. Yaşayabilir S. Sayısı Toplam kaplama hücrelerinin yüzdesi olarak boulardii'nin CFU UV ışıması (düz çizgi), her doz için μJ çizilmiştir. dikey kırmızı çizgi bu maya suşu% 50 hayatta kalma karşılık gelen doz μJ UV gösterir. UV mutasyon gelen hasarı onarmak edemez bir rad1 S. cerevisiae mutant, bir kontrol (kesikli çizgi). Olarak gösterilen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ A>

Şekil 3,
Şekil URA3 3. Onay - UV fenotipi YDP, urasil üzerinde hücreleri ışınlanmış - ve 5-FOA plakaları tek tek UV mutant koloniler hücreler steril bir kürdan ucu kullanılarak toplanan ve yavaşça YPD, urasil karşısında çizikler vardı -., Ve 5. -FOA plakalar. Hücreler ilk önce, yeni bir kürdan ikinci hat üzerinden geçecek ve tek tek hücreler ayrılana kadar hücreleri yaymaya devam etmek için kullanıldı, iki dik kesişme hatları sıyrılmıştır. Gerçek bir URA3 - mutantı (MUT), ancak urasil yokluğunda, YPD ortamı ve 5-FOA mevcudiyetinde artmaktadır. Kontrol ura3 - S. cerevisiae (URA3 -) ve URA3 + sup> S. boulardii (URA3 +) karşılaştırma için gösterilmiştir ve. maya medya doğru hazırlanması onaylamak için bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Saccharomyces suşları Şekil 4. Dönüşüm Verimliliği. Yabani tip S. boulardii'nin (SB) ve laboratuar S. cerevisiae suşu (Sc) tarif LiOAc (LiOAc) ve elektroporasyon (Elektro) protokollerini kullanarak dönüştürülmüştür. ortalama CFU bir kanamisin direnç işaretçiyi kodlayan plazmidin ug başına elde edilen sonuçlar çizilir. Çubukları, ortalamanın standart hatasını gösteren hata çubukları ile yinelenen deneylerin ortalama göstermektedir.es / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Dönüştürülmüş Maya tarafından 5. Fonksiyonel Protein İfade Şekil. S. boş plazmid (A) ve plazmid kodlayan GFP (B) ile transforme cerevisiae floresan mikroskop kullanılarak analiz edilmiştir. GFP plazmid ile dönüştürülen maya hücrelerinin floresan fonksiyonel GFP başarılı üretimini gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Oral sonda bir C57BL / 6 fare Şekil 6. Uygun kullanım. Fare düzenlenen tightl olduğunuo kadar küçük parmağın altında sıkışmış kuyruk ile baskın olmayan el y hiçbir hareket (A) mümkündür. sonda iğne ağız çatı boyunca yutak içine sokulur. Fare piston (B) depresif olduğu gibi Daha sonra çözelti. Mide girmek için izin gavaj iğne ampulü yutmak için izin verilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Peyer yamaları Şekil 7. hazırlanması ve diseksiyon. Ince bağırsak oklar Peyer yamaları birkaç işaret ile, diğer iç organlar ve doku uzak disseke olarak gösterilmiştir. Daha büyük bir versi görmek için buraya tıklayınızbu rakamın üzerinde.

Şekil 8,
Şekil 8. Peyer Yamalar gelen Maya Kurtarma. S. zorla ağız yolundan verilmiştir bir fare canlı diseksiyon, homojenizasyon sonra tespit CFU ve toplam Peyer hücrelerinin kaplama bir örnek boulardii. Hücreler, YPD maya ortamı üzerine ekildi ve 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edilmiştir. Fare başına kazanılan CFU tipik verim az 10'dur bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birlikte, protokoller burada bağırsak heterolog terapötik protein teslimat için geliştirilmesi ve okzotrofik probiyotik maya suşları testi için gerekli temel adımları açıklar. Bu manipülasyon ve rekombinant probiyotik maya testi herhangi bir bireysel laboratuvar şu anda aşina olmayabilir hangi ile teknikleri ve kaynakları gerektirir. Çok sayıda daha önceki çalışmalar çok maya fare türü için de, yukarıda protokolleri açıklanmasına rağmen Böylece, bu yöntemler, yazarların bilgisi detaylı, birleşik bir şekilde sunulmamıştır gerekir. Ayrıca, bu el yazması daha az yaygın olarak kullanılan laboratuvar maya suşları daha karakterizedir probiyotik maya genetik manipülasyon için geçerli standart protokoller adapte önem vermektedir. ve dönüşüm (Bölüm 2) (Bölüm 1 tartışılan) hem de mutasyon için birçok adım gibi diploid manipülasyon, probiyotik maya isolat için optimize edilmiş olmalıdıres. Bu makale ayrıca, hayvan taşıma (bölüm 3) ve ince bağırsak Peyer bağışıklık dokularda (bölüm 4) diseksiyonu ile ilişkili potansiyel tuzaklar anlatılır.

Birçok endüstriyel ve klinik olarak anlamlı maya kökleri, büyük ölçekli genetik manipülasyon hemen adapte değildir gibi, tür pahalı antibiyotiksiz büyütüldü ve seçilebilir oksotropik mutantlar olarak suşlarını meydana getirmek üzere gerekli olmaktadır. UV mutagenez auxotrophic genlerin 7,41 hızlı nonspesifik mutasyon sağlar böyle bir yaklaşımdır. Hayatta kalma eğrileri kolay mutantların taranması için uygun dozu belirlemek için (Şekil 1 ve 2) üretilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, büyüme ya da maya suşu için diğer özelliklerini etkileyebilir, hedef mutasyonlar dışı uyarma riskini taşımaktadır. Hedefli tırnakları yerine PCR yapıları veya CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak elde edilebilir. Daha sonraki tarama veya seçimMutantların (Şekil 3) oksotrofık ​​maya tanımlanmasına izin verir. 5-FOA ortamına kaplama ile seçim kullanımı olup, örneğin, hala fonksiyonel bir URA3 okzotrofik genini içeren bir maya hızlı elimine eder. Mümkün olduğunda, bu seçim yaklaşımı oluşturulan tüm kolonilerin analizi gerektiren bir ekrana, tercih olabilir. seçimi veya tarama biriyle, ancak auxotrophic durumunu onaylamak için seçici ortama bireysel maya kolonilerinin tekrarlanan çizgiler gerçekleştirmek için çok önemlidir.

Oluşturulan mutantların Dönüşüm farklı protokoller yoluyla gerçekleştirilebilir. Her ne kadar LiOAc dönüşüm özellikle, en sık kullanılan laboratuar S., birçok maya suşunun transformasyonu etkilidir cerevisiae suşları, örneğin elektroporasyon gibi alternatif protokoller diğer maya daha verimli (Şekil 4) ile birlikte izole dönüşebilir. Her yeni suş USI test edilmelidirBirden fazla protokol ng dönüşüm için uygun koşulları belirlemek için. Inkübasyon süreleri ve DNA konsantrasyonu değiştirilmesi, örneğin, genel olarak dönüşüm etkinliğini etkileyebilir ve her bir suş 33 için test edilmiş ve optimize edilmesi gerekmektedir.

Ağızdan sonda ile doğrudan bağışıklık dokular daha sonra maya ve heterolog protein için analiz edilebilir sıçangil gastrointestinal sistem, bu rekombinant maya olarak kontrollü dozlarda sağlamaya imkan verir. Uygun ağızdan sonda tekniği (Şekil 6) hayvan rahatsızlığı en aza indirmek ve deneysel hassasiyetini arttırmak için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, Peyer yamaları bağırsaktan rekombinant maya alımını değerlendirmek için temel alanlardır. immün doku Bu kümeler, antijen örnekleme ve mukozal bağışıklık tepkilerinin önemli yerlerdir. çapı maya 3-6 mikron dahil olmak üzere büyük antijenler, ga geçmek için Peyer M hücreleri tarafından ele alınması büyük olasılıklastrointestinal epitel ve bağışıklık hücreleri ile etkileşime girer. Yama yerine bağırsak lümeni veya lamina propriya toplanır daha (Şekil 7) içinden sadece hücreler sağlamak için Peyer yamaları diseksiyon dikkat edilmelidir. Bundan başka adımlar da geri maya (Şekil 8) uygun bir ifade heterolog proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için diseksiyon aşağıdaki alınmalıdır. bira mayası parçalarının ve immunoblotting toplam proteinin hazırlanması protein ifadesini değerlendirmek için, bir standart bir yöntemdir; Ancak, bu yaklaşım protein katlanması ve işlevi ile ilgili bilgi vermemektedir. Protein fonksiyonunu değerlendirmek için, maya plazmid kodlayan GFP ile transforme edilmiş ve fonksiyonel GFP (Şekil 5) değerlendirmek için Peyer yamaları sona ermesinden sonra bir flüoresan mikroskop altında analiz edilebilir.

Özetle, bu yazının sağa sola adımları kapsayan detaylı deneysel protokollerin birleşik bir dizi sunuyorfare bağırsaklardan probiyotik maya kurtarma auxotrophic mutantların nesil m. geleneksel uzmanlık tek bir alanda girmemektedir protokolleri derleyerek, bu açıklamaları ağızdan ilaç dağıtım vektörleri olarak tasarlanmış probiyotik maya immünolojik tepkiler test ileri çalışmalar kolaylaştıracaktır. Yazarlar bu çalışmada roman, probiyotik tabanlı rekombinant tedavilerin geliştirilmesi için en etkili yaklaşımların önünü tartışmayı teşvik ve test edilen her maya suşu için deneysel yöntemlerin optimizasyonu teşvik umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar Tracey J. Lamb verilen İmmünoloji ve Aşılar ve NIH Yeni Yenilikçisi Ödülü (1DP2AI112242-01) için Çocuk Merkezi aracılığıyla finansman kabul. Yazarlar ayrıca rad1 S. cömert katkılarından dolayı Natalya P. Degtyareva teşekkür cerevisiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14 (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13 (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).

Tags

İmmünoloji Sayı 108, Peyer gavaj heterolog protein GFP UV mutagenez probiyotik
Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hudson, L. E., Stewart, T. P.,… More

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter