Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In vivo imaging giver direkte visualisering af cellulære adfærd på den mest fysiologiske sammenhæng. Gennemsigtigheden af zebrafisk embryoner, deres hurtige og ekstern udvikling og et rigt udvalg af genetiske værktøjer, der tillader fluorescerende mærkning har alle bidraget til den stigende brug af in vivo mikroskopi at belyse dynamikken i vigtige udviklingsmæssige begivenheder. Imaging undersøgelser af nervesystemet udvikling i zebrafisk har for eksempel stærkt udvidet vores viden om opførslen af neurale stamceller og skæbne deres afkom, herunder deres efterfølgende migration, differentiering og kredsløb integration 1-8.

Scenen er nu sat til at undersøge de subcellulære dynamik bag disse cellulære adfærd. Faktisk zebrafisk allerede udnyttes som redskaber til in vivo cellebiologi. Det er nu muligt at visualisere mitokondrier 9-11, centrosomer 2,8,12-14, Golgi 15, Mikrotubuli 4 og actin 16 cytoskelettet, endosomer 17 og komponenterne i den apikale membran kompleks 1,18, blandt andre subcellulære strukturer i zebrafisk embryoer in vivo. Hidtil meget af hvad man ved om funktionen af ​​disse organeller kommer fra at studere deres adfærd i dyrkede celler. Mens in vitro-undersøgelser har givet enorm indsigt i cellebiologi, behøver celler i kultur ikke fuldt ud repræsentere kompleksiteten af in vivo situationen og derfor ikke nødvendigvis afspejler funktion og dynamik subcellulære organeller in vivo. Zebrafisk embryoner tilbyder et levedygtigt in vivo alternativ at undersøge subcellulære dynamik.

Som hvirveldyr, zebrafisk besidder mange organsystemer (f.eks neurale nethinde), som er homologe med de fundet i pattedyr. Derudover er zebrafisk embryoner stigende grad til at modellere humane sygdomme 19,20 (f.eks microcephaly 21 og Lebers medfødt amaurose 22) og til mitokondrie funktion (f.eks, Parkinsons sygdom 23, tauopathier 10,24 og Barth syndrom 25). In vivo imaging på det cellulære og subcellulære niveau i disse tilfælde vil tillade en bedre forståelse af cellebiologi bag disse patologiske tilstande.

Det overordnede mål med de metoder, der er beskrevet her, er at give en omfattende guide til at undersøge organeller og andre subcellulære strukturer i zebrafisk embryoner hjælp in vivo lysmikroskopi. Hele work-flow er involveret i at visualisere og spore subcellulære strukturer in vivo er beskrevet - fra genetiske tilgange mærkning, at generere forbigående udtrykke og stabil transgene fisk, og endelig at billeddannelse ved hjælp af bredt felt og konfokal mikroskopi. Mens hver af disse procedures bruges af mange zebrafisk laboratorier, er de beskrevne protokoller optimeret og strømlinet for at undersøge dynamikken i subcellulære strukturer. To specifikke aspekter af arbejdet beskrevet her, garanterer omtale: For det første brugen af ​​Gal4-UAS ekspressionssystem i flere konfigurationer til genetisk label organeller i specifikke celletyper. For det andet, en direkte sammenligning af wide-field og konfokal mikroskopi til billedet subcellulære strukturer in vivo.

Aktuelle strategier til genetisk label organeller og andre subcellulære strukturer i zebrafisk enten gøre brug af udjævnede mRNA 1,4,8 eller DNA baserede konstruktioner, hvor promotorelementer direkte drive ekspressionen af fusionsproteiner 9,14,15. In vitro transskriberede udjævnede RNA resultater i hurtig og bred udtryk, som ikke er vævsspecifikke dog. Derudover ekspressionsniveauerne falde med tiden, da den udjævnede RNA fortyndes eller nedbrydes. Således anvendelsen af ​​RNA baseretkonstruerer at undersøge organel dynamik på senere stadier i udviklingen er begrænset (normalt op til 3 dage efter befrugtningen).

Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af DNA-konstruktioner, hvor rumlig og tidsmæssig kontrol af ekspression bestemmes af specifikke promotorelementer. Når der anvendes DNA baserede konstruktioner i forbindelse med de Gal4-UAS systemet betydelige forbedringer til transgen ekspressionsniveauer iagttages 26,27. I denne todelte ekspressionssystem, celletypespecifikke promotorelementer drive ekspressionen af ​​en transskriptionel aktivator Gal4, mens reportergener klones nedstrøms for Gal4-bindende opstrøms aktiverende sekvens (UAS). Ved at kombinere UAS reportere med passende Gal4 drivere, kan udtryk begrænses til bestemte celletyper, omgå behovet for at klone reportergener bag forskellige promotorer, hver gang et særligt udtryk mønster ønskes. Endvidere kan ekspressionen af ​​multiple UAS reportergener væredrevet af en enkelt Gal4 aktivator. Gal4-UAS systemet tilvejebringer således en alsidig og fleksibel genetiske fremgangsmåde for subcellulær mærkning.

Wide-field og konfokale mikroskoper er arbejdsheste fleste laboratorier. Wide-field systemer anvender typisk en bue lampe som lyskilde og detektere det emitterede lys med et følsomt kamera, der er placeret for enden af ​​lysbanen. Denne billedbehandling modalitet typisk begrænset til tynde prøver som ud-af fokus lys tilslører i fokus oplysninger i tykkere prøver. Konfokale mikroskoper adskiller sig fra wide-field systemer, at de er bygget til at favorisere signaler, der kommer fra fokusplanet i forhold til dem, der stammer ude af fokus (dvs. "optisk sektionering") 28. For at opnå optisk sektionering et lille hul er placeret i emissionen sti i et konjugat position til det punkt lyskilden. Lasere anvendes som lyskilder og signaler detekteres med fotomultiplikatorrør (PTM'er). I praksis en laserstrålen swiped over prøven punkt for punkt og fluorescensemissionen ved hver plet (pixel) detekteres af PMT.

Her har vi billedet de selvsamme subcellulære strukturer i levende zebrafisk embryoner ved hjælp af både bredt felt og konfokal mikroskopi til at give en direkte sammenligning af de to mikroskopi modaliteter. Den underliggende formål at tilvejebringe sådanne sammenligninger er at tilbyde retningslinjer for at vælge den mest hensigtsmæssige mikroskopi teknik til det konkrete spørgsmål ved hånden.

Under anvendelse af de fremgangsmåder, der beskrives her viser vi Gal4-UAS baseret genetisk mærkning af mitokondrier og centrosomer. Disse organeller afbildes i forskellige celletyper i nervesystemet og i muskelceller ved hjælp wide-field og konfokal mikroskopi for at demonstrere egnetheden af ​​hvert afbildningsmodalitet. De her beskrevne metoder kan let tilpasses til undersøgelse andre organeller og subcellulære strukturer i levende zebrafisk embryo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de lokale forskrifter i regeringen i Oberbayern (München, Tyskland).

1. Mærkning organeller og andre Subcellulære Structures

BEMÆRK: Her genetisk reporter-konstruktioner, at fluorescens tag centrosomer, mitokondrier og cellemembraner er beskrevet.

  1. Brug konventionelle kloningsmetoder 29 til at generere fusionsproteiner der fluorescens navngive centrosomer og mitokondrier. Klon den kodende sekvens af zebrafisk centrin4 (cetn4) i ramme med et fluorescerende protein 2 (FP), såsom gult fluorescerende protein til at generere cetn4-YFP. Klone mitokondriel målretning sekvensen af subunit VIII af cytochrom c-oxidase i ramme med en FP såsom Cyan fluorescerende protein til at generere mitoCFP 9-11.
  2. For at begrænse ekspressionen af ​​fusionsproteinerne (cetn4-YFP eller mitoCFP) til specifikke celler i zebrafish embryo (f.eks neuroner eller muskelceller) bruge todelte Gal4-UAS ekspressionssystem 26,27. Først generere en UAS reporterkonstruktion. Anvende traditionelle metoder til at klone fusionsproteinet i en UAS ekspressionsvektor nedstrøms for Gal4-bindende UAS kassette (varianter spænder fra 1x til 14x UAS, se diskussionen) 26,27,30 og en minimal promotor (E1b basal promotor fra karper βactin gen), og generere UAS: cetn4-YFP og UAS: mitoCFP.
    BEMÆRK: For at forberede UAS reporter konstruerer for stabil transgene linje generation yderligere elementer skal klones (se 3 nedenfor)
  3. For at visualisere den cellulære kontekst, som centrosomer eller mitokondrier er mærket, generere UAS reporter konstruerer hvor cellemembraner er mærket af rammeprogrammerne. Klon de første tyve aminosyrer af zebrafisk Gap43 (indeholdende palmitoylering sites) i-ramme med en FP til at målrette, at FP til cellemembranen (memFP) 31,32.
  4. obtain driver konstruktioner eller transgene linjer i hvilken celle-typespecifikke promotorelementer drive ekspressionen af den transkriptionelle aktivator Gal4-VP16 27, Gal4FF 33 eller KalTA4 30.
  5. Kombiner UAS reporter konstruerer med en passende driver konstruktion for at begrænse udtryk for den ønskede celletype af interesse (fx i neuroner eller muskelceller). For at gøre dette co-injicere Gal4 driver og UAS reporter konstruerer i én-celle etape af befrugtede æg (for detaljerede instruktioner se 2 nedenfor) til at generere forbigående udtrykke fisk. Alternativt, generere en UAS reporter stabil transgene linje (for detaljerede instruktioner se 3 nedenfor) og krydse til en Gal4 driver stabil transgene linje for at generere afkom bærer begge transgener.
    BEMÆRK: Det er også muligt at injicere UAS reporterkonstruktion / s i befrugtede æg fra en Gal4 driver stabil transgen linje eller et Gal4 driver konstruktion i gødning, plantebeskyttelse oged æg fra en UAS reporter stabil transgene linje.
  6. At co-udtrykke multiple distinkte fusionsproteiner ved hjælp af Gal4-UAS-systemet, ved en Gal4 driver og UAS reporter / s i en af følgende konfigurationer: A. Multiple, separate UAS reporterkonstruktioner (f.eks UAS: mitoCFP og UAS: memYFP co -injiceret med en Gal4 driver konstruktion) 10, B. Flere UAS kassetter på en enkelt reporter (f.eks UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Tovejs UAS reporter (f.eks UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (figur 1).

figur 1
Figur 1. Strategier til at co-express fusionsproteiner ved hjælp af Gal4-UAS systemet.
Co-ekspression af multiple fusionsproteiner kan opnås ved anvendelse af UAS reporter kassetter i forskellige konfigurationer: (A) multipel, separat UAS-drevet constructs, (B) flere UAS kassetter på en enkelt konstruktion eller (C) en tovejs UAS kassette på en enkelt konstruktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Generer vedvarende udtrykker fisk

BEMÆRK: Følgende er en tilpasning af tidligere offentliggjorte protokoller 34,35. En grundlæggende injektion setup bør omfatte et stereomikroskop med en forstørrelse rækkevidde op til 12x, en mikromanipulator med en mikropipette holder og en trykluftkilde. Forbered 2,1-2,5 før tid:

  1. Til fremstilling egg mikroinjektion kamre, fremstille en opløsning af 1,5% (vægt / volumen) agarose i vand. Tilføj agarose pulver til vand og mikrobølgeovn indtil agarosen er fuldstændigt opløst. Fyld en petriskål (100 x 15 mm) med denne opløsning.
    1. Tillad agarose Opløsningen afkøles til ca.oximately 45 ° C før placere en plast mikroinjektion støbeform (40 mm x 66 mm, forsynet med 6x 50 mm lange kamme, der er 1,5 mm bred, 1 mm dyb og afstand 3 mm fra hinanden) på overfladen af det smeltede agarose, pas på ikke at indføre bobler ved grænsefladen.
    2. Efter agarose sæt, opbevares ved 4 o CO / N. Fjern forsigtigt formen under anvendelse af en spatel. Forbered flere mikroinjektion kamre ad gangen, opbevares ved 4 ° C og bruge gentagne gange over flere uger.
  2. Brug en mikropipette aftrækker til at generere glas injektion kapillærer med en lang skaft 36.
    BEMÆRK: De specifikke indstillinger, der bruges til at generere injektion kapillærer bør bestemmes empirisk. Injektion kapillærer kan trækkes forvejen og opbevares forud for anvendelse.
  3. Måle koncentrationen af ​​plasmid-DNA (Gal4 driver og UAS reporterkonstruktioner) til mikroinjektion anvendelse af et spektrofotometer ifølge producentens manual. Måle60; forholdet mellem absorbans ved 260 nm og 280 nm (A260 / 280). Fortynd DNA til en slutkoncentration på 100 ng / pl i nuklease-frit vand.
    BEMÆRK: En A260 / 280-forhold på ~ 1,8 betyder rent DNA. Overvej at bruge et kommercielt kit (baseret på silica-baserede bindende matrix) at oprense plasmid DNA, der skal anvendes til injektion. Plasmid-DNA bør være af høj kvalitet for at forhindre toksicitet.
  4. Forbered 10 pi injektion-mix ved at kombinere DNA (0,5 til 2,5 pi af en 100 ng / pl lager til en endelig koncentration på 5 til 20 ng / pl), Danieau opløsning (0,33 pi 30x stamopløsning), phenolrødt (0,25 pi, ekstraudstyr) og nuklease-frit vand til en 10 pi totalvolumen.
    BEMÆRK: Empirisk bestemme koncentrationen af DNA, der giver passende udtryk. Gal4 driver og UAS reporterplasmider skal co-injiceret. Ingen ekspression vil opstå, når kun Gal4 driver eller UAS reporterplasmidet injiceres i vildtype-befrugtede æg. Hvis der imidlertid than befrugtede æg er fra en Gal4 driver linje derefter indsprøjtning af én eller flere UAS reporterplasmider tilstrækkeligt. Omvendt, hvis mikroinjektion ind i en UAS reporter linje, kun Gal4 driver plasmidet skal injiceres. Endelig mens phenolrødt i høj grad kan bidrage til at visualisere injektioner, er det også en fluorescerende forbindelse selv. Derfor kunne Phenol Red tilsløre visualisere rammeprogrammer hvis billedbehandling er planlagt før 24 timer efter befrugtningen (HPF), da det ikke kan være tilstrækkeligt udvandet af denne gang.
  5. Aftenen før injektioner er planlagt, oprette flere par (typisk 5 til 10) af mandlige og kvindelige zebrafisk til avl. Brug avl tanke med et insert, der indeholder en gitret bund og en rumdeler at adskille han- og hunfisk.
    BEMÆRK: Mandlige og kvindelige zebrafisk kan generelt adskiller sig ved deres kropsform. Mænd har tendens til at være slank mens hunner tendens til at udvise en ventralt fremspringende maven. Hannerne derudover tendens til at have en gullig-rød coloring på deres ventrale abdominale område.
  6. Umiddelbart før DNA injektioner, fjerne dividers at tillade den mandlige og kvindelige at parre. Ca. 15 til 30 min efter fjernelse af deleren, kontrollere for æg i bunden af ​​tanken. Overfør voksne fisk ved hjælp af et fiskenet til en ny avl tank.
  7. Hæld vandet indeholdende de nyligt fastsatte befrugtede æg, ud af akvariet i en sigte (fx en plastisk tesi). Vask æggene i sigten ved anvendelse af en spray flaske indeholdende Danieau opløsning. Vend sien på en petriskål og bruge en spray flaske med Danieau løsning til at inddrive alle de æg (typisk 50 til 200 æg pr avl par af voksne fisk).
  8. Ved hjælp af en microloader pipette, back-fylde et trukket indsprøjtning kapillar med DNA-injektion-mix. Monter injektion kapillar ind i holderen af ​​en mikromanipulator og trim spidsen under visuel kontrol af et stereomikroskop, med pincet for at skabe en mikropipette, der kan penetrate chorion og cellecytoplasmaet samtidig være i stand til at levere en passende mængde af DNA'et.
    BEMÆRK: I hvilken grad spidsen af injektionen kapillar trimmes bør bestemmes empirisk og kan bedst bedømmes ved injektion æg.
  9. For at bestemme mængden af ​​DNA til injektion, udlede en dråbe af injektionsopløsningen ind mineralolie. Mål radius (R) af dråben hjælp af en kalibreringskurve mikrometer og beregne dens volumen (4/3 π R3). Modulere lydstyrken ved at justere indsprøjtning tryk og / eller varigheden af ​​hver injektion puls.
  10. Ved hjælp af en plastik pipette, overføre alle de indsamlede æg (typisk 50-200, fra 2.7 ovenfor) i skyttegravene i en mikroinjektion kammer. Under den visuelle kontrol af et stereomikroskop med pincet for orientere æggene således at cellen cytoplasma (gennemsigtig) og æggeblomme (tæt, ikke-transparent) kan let identificeres.
  11. Under den visuelle kontrol af en stereomikroskop, injicere DNA i cellen cytoplasma af det befrugtede æg, idet det sikres, at den injicerede volumen (1 til 2 nl) svarer til ca. 10% af cellens volumen.
    BEMÆRK: Phenolrødt i DNA-opløsningen hjælper til visualiseringen af injicerede volumen.
  12. Efter injektion, løsne æg fra skyttegravene i sprøjtestøbeformen ved at skylle dem med en spray flaske indeholdende Danieau løsning. Efterfølgende overføre æg i en frisk petriskål ved anvendelse af en plast transfer pipette og opretholde en 28,5 ° C inkubator.
  13. Oprethold un-injicerede æg som kontrol for at afgøre, om injektioner bidrage til høje dødelighed, enten som følge af fysisk skade under mikropipette penetration eller DNA mix.
    BEMÆRK: Høje dødelighed efter indsprøjtninger kan skyldes en lang række faktorer, herunder for høj DNA-koncentration eller injektionsvolumener og / eller plasmider med kontaminaNTS. For at forhindre toksicitet fra lav kvalitet DNA preps, kan kommercielle kits (baseret på silica-baserede bindende matrix) anvendes.
  14. Med jævne mellemrum efter indsprøjtninger, skal du bruge et stereomikroskop at screene for ubefrugtede æg og døde eller misdannede fostre og kassér dem.
    BEMÆRK: Anser æggene, der synes at være på den ene-celle stadie flere timer efter befrugtningen, som ubefrugtede. Identificer misdannede fostre ved grov anatomiske defekter såsom en kompromitteret anterior-posterior krop akser. Amorft materiale inden for en chorion tyder på, at fosteret ikke fortsætte gennem udviklingsstadier og døde. For at konstatere, om embryoner, der blev mikroinjiceret gennemgå en normal udvikling konsultere anatomiske atlas 37.
  15. Overfør embryoner under anvendelse af en plast overførselspipetten til Danieau opløsning indeholdende 1 X 1-phenyl-2-thiourinstof (1xPTU) mellem 10 og 24 HPF at forhindre pigment formation. Vedligehold embryoner i Danieau løsning containing PTU for varigheden af ​​forsøget.
    BEMÆRK: Ud over melanoforer, kan iridophores på overfladen af huden være problematisk for billeddannelse. Mens PTU ikke hæmmer iridophore dannelse, mutante linjer med reducerede antal iridophores såsom Roy Orbison (roy) findes og kan anvendes 38.
  16. Efter embryoner luge (som regel på den anden eller tredje dag efter befrugtningen, 2 eller 3 dpf), kassere chorions og udveksle Danieau løsning indeholdende PTU.
    BEMÆRK: Disse trin er vigtigt at sikre kvaliteten af embryoet medium og levedygtigheden af de sunde fostre.

3. Generer Stabile transgene linier

BEMÆRK: Stabil transgene linjer kan effektivt genereres ved hjælp af Tol2 transposon systemet. En Tol2 transposon vektor indeholdende transgenet af interesse er co-injiceret sammen med mRNA, der koder for transposasen enzymet i befrugted æg ved den ene-celle stadium. Transposasen protein fra den injicerede mRNA katalyserer excision af transgenet kassetten fra transposon vektor og dets integration i genomet 39.

  1. Klone transgen reporter kassette (f.eks UAS: mitoCFP) mellem Tol2 inverterede terminale gentagelser i en af Tol2 vektorer for tiden anvendes i zebrafisk samfund som beskrevet 40.
    BEMÆRK: Tol2 vektorer indeholdende en valgbar kassette, hvor promotorelementer driver FP udtryk i organsystemer relateret til området af interesse (f.eks hjerte 41 eller linse 42) er nyttige til screening af UAS reporter transgene linjer i fravær af Gal4 transaktivering.
  2. Anvendelse af et kommercielt kit (baseret på silica-baserede bindende matrix), oprense plasmid-DNA'et, der skal anvendes til injektion. Sikre, at plasmid-DNA'et er af høj kvalitet for at forhindre toksicitet.
  3. Transskribere Tol2 transposasesekvenser-kodende mRNA under anvendelse af etpassende transskription vektor såsom PCS-TP 43. Kort fortalt linearisere PCS-TP og bruge en kommerciel kit til at generere loft mRNA og følg producentens protokol. Sørg for at undgå kontaminering med RNaser (f.eks bruge RNAse-fri pipettespidser og rør). Alikvot RNA, i en koncentration på 100 ng / pl, til engangsbrug og opbevares ved -80 ° C.
  4. Om morgenen af ​​injektionerne, tø en portion af transposasen mRNA på is. Bland transposon DNA-vektoren (2 pi 100 ng / pl) og transposase mRNA (2 pi 100 ng / pl) i en 1: 1-forhold, og der tilsættes 6 pi RNAse-frit vand til at bringe det totale volumen til 10 pi.
    BEMÆRK: En koncentration på 20 ng / pl anbefales til hver, men den optimale koncentration skal bestemmes empirisk. Brug RNAse-frit vand til fortynding. Brug handsker ved håndtering af DNA-RNA-injektion mix og holde det på is for hele perioden af ​​injektioner for at forhindre nedbrydning af mRNA.
  5. Brug de detaljerede instruktioner i afsnit 2 ovenfor, injicere DNA-RNA-injektion blandes ind befrugtede æg i én-celle stadie. Under visuel kontrol af et stereomikroskop målrette cellen cytoplasma i en celle scene for de højeste satser for transgenese effektivitet. Bevar de injicerede embryoner ved 28,5 ° C indtil den er klar til at screene for transgen ekspression.
    BEMÆRK: PCR kan gøres for at kontrollere for effektiviteten af Tol2 transposasen som tidligere beskrevet 44.
  6. Screen embryoner i en petriskål til transgenese under anvendelse okularerne af en fluorescens dissektionsmikroskop.
    BEMÆRK: Brug de relevante filter sæt af mikroskop for at visualisere FP udtryk for den valgbare kassette (dvs. fluorescens i hjertet eller objektiv) på 2 eller 3 dpf. Identificer potentielle transgene embryoner ved ekspression (i hjerte eller objektiv) og rejse disse embryoner til voksenalderen (F 0 generation) ved hjælp af standardprotokoller 45. Alternativt, identificere potentielle transgene embryoner ved PCR som beskrevet i 46.
  7. Når UAS reporter F 0 fisk er 2,5 - 3 måneder, krydse dem (se 2.5 for detaljer) til ikke-transgene vildtype fisk at erhverve æg at etablere en F 1 generation. Alternativt, krydse UAS reporter F 0 fisk til en Gal4 driver linje til at etablere en F 1 generation. I sidstnævnte tilfælde kan UAS-drevne transgen monitoreres direkte i embryoner fra korset.
  8. Brug en fluorescens dissektionsmikroskop at screene F 1 embryoner til ekspression af transgenet eller selekterbare kassette.
    BEMÆRK: Når udtryk bekræftes derefter transgenet kan siges at være germline transmitteres. Transgenese er ikke-Mendelsk på F 0 fase. Antallet af fostre, der udtrykker transgenet kan variere fra et lille antal til det store flertal i de enkelte clutches. Transposon integration i forskellige F 0 fisk kan variere meget, hvilket resulterer i forskellige ekspressionsmønstre. Derfor vedligeholde F 1 fisk fra forskellige F 0 stiftere som separate sub-linjer. Transposon integrationer i F 1 fisk er stabile og er gået ind på de efterfølgende generationer i en Mendelsk måde.
  9. Vedligehold hver F 0 fisk i separate beholdere til at re-identificere transgene luftfartsselskaber.

4. Forbered Embryoner for Imaging på en opretstående mikroskop

BEMÆRK: De her beskrevne procedurer er blevet optimeret til billedbehandling på opretstående mikroskoper med målene lange arbejdstid distance vand-dyppe-kegle.

  1. Brug en fluorescens dissektionsmikroskop at screene embryoner til transgen ekspression.
    BEMÆRK: Ekspression af en UAS reporter transgen vil afhænge af den specifikke Gal4 transmissionsledningen bruges. Vælg embryoner til billeddannelse eksperimenter baseret på ønsket expression mønster.
  2. Overfør de valgte embryoner ved hjælp af en plastik pipette til en separat petriskål indeholdende Danieau buffer med 1x PTU og 1x tricaine.
    BEMÆRK: Når mærkning er sparsom (kun nogle få celler i et organsystem) montere embryoner i agarose (se 4.3 - 4.7 nedenfor) og skærm til transgen ekspression hjælp af en bred-felt mikroskop med høj forstørrelse mål (se 5.1 nedenfor). Tricaine anesthetizes fisk og bør være effektive inden for sekunder. Hvis fisken ikke immobiliseres, er det sandsynligt, at tricaine har degraderet. Mulige årsager til denne nedbrydning omfatter dårlig opbevaring af tricaine, som er lysfølsomt 47.
  3. Forbered agarose at indlejre fisken ved opløsning lavtsmeltende agarose pulver i Danieau puffer til en slutkoncentration på 0,7%. Portion (1 ml) og holde i en varme-blok ved 40 ° C, indtil klar til brug.
    BEMÆRK: Højere koncentrationer af agarose (op 1,5%) kan også anvendes til at indlejre fisk.
  4. Der tilsættes 50 ul af en 20x bestand af tricaine og 20 pi 50x stamopløsning af PTU til 1 ml prøve af lavtsmeltende agarose og bland godt ved at trykke på siden af ​​røret. Retur røret til varmen-blokken. Ved hjælp af en plastik overførsel pipette forsigtigt pipette et par (1-10) bedøvede embryoner i agarose, overføre så lidt væske som muligt for at undgå at fortynde agarose.
  5. Ved hjælp af en plastik pipette transfer alle fostre med en lille mængde agarose til et glas bund petriskål.
  6. Arbejder relativt hurtigt pincet til at placere de embryoner i den ønskede orientering, afhængig af strukturen, der skal afbildes.
    BEMÆRK: Orient embryoer på deres side, hvis nethinden eller Rohon-Beard (RB) sensoriske neuroner bør afbildes.
  7. Tillad agarose at størkne i mindst 15 minutter. Tilføj Danieau buffer indeholdende 1xPTU og 1xTricaine at dække embryoner indlejret i AgaroSE. Skålen indeholder agarose-embedded embryoner i en inkubator ved 28,5 ° C indtil den er klar til billede.

5. Imaging Cellular og Subcellulære Strukturer bruger Wide-felt eller konfokalmikroskopi

BEMÆRK: Wide-field mikroskopi og point-scanning konfokalmikroskopi er de mest udbredte metoder til billedet fluorescensmærkede zebrafisk embryoner Tabel 1 opsummerer de vigtigste fordele og ulemper ved begge systemer.. For begge former for mikroskopi, er embryoner monteret i agarose som beskrevet i 4 ovenfor, og holdt ved 28,5 ° C under hele afbildningseksperiment ved hjælp et varmekammer på scenen af mikroskopet. Vigtigere, er fadet med agarose-embedded embryoner lov til at ækvilibrere til 28,5 ° C før billedbehandling begynder som temperatursvingninger forårsager drift i z-dimension. Ved udførelse af langsigtede imaging eksperimenter (over several timer), anbringes en plexiglas låg over petriskål at reducere fordampning af bufferen.

Wide-field Punkt-scanning konfokal
Koste relativt billige Dyrt (cirka. 5x mere)
Foto-blegning Lav Høj. Prøven udsættes for laserlys over og under det fokale plan.
Foto-toksicitet Lav Høj (se foto-blegning ovenfor)
erhvervelse hastighed Hurtig Langsom
Beslutning i xy Abbe lov Abbe lov (kan forbedres ved app 40% ved anvendelse af en meget lille pinhole,. Men ide fleste indstillinger dette har ringe praktisk anvendelse)
Optisk sektionering Dårlig Ja (kan justeres ved pinhole størrelse)
penetration tissue Begrænset til overfladiske strukturer (f.eks Rohon-Beard celler eller muskelfibre) Begrænset til <100 mm fra overfladen af ​​embryoet

Tabel 1. Generel sammenligning af wide-field og point-scanning konfokal mikroskopi

  1. Wide-field mikroskopi
    BEMÆRK: Her retningslinjer findes til billeddannelse zebrafisk embryoner ved hjælp af en opretstående wide-field mikroskop med målene lange arbejdstid distance vand-dyppe-kegle. Mikroskopet er udstyret med et afkølet CCD-kamera, og filtersæt til visualisering forskellige fluorophorer monteret på en automatiseret filterhjul til hurtig erhvervelse af flere kanaler.Billede erhvervelse styres af μManager, et open source mikroskopi softwarepakke 48. Et specifikt eksempel til billeddannelse af mitokondrier i RB sensoriske neuroner er tilvejebragt. RB celler er genetisk mærket ved hjælp membran målrettet YFP og deres mitokondrier er CFP-mærket (se 1.1 ovenfor).
    1. Mount embryoner på deres side i lavtsmeltende agarose som beskrevet i 4 ovenfor.
    2. Skålen med monterede fisk at ækvilibrere til 28,5 ° C i et varmekammer på scenen af mikroskopet før påbegyndelse billeddannelse.
    3. Brug en lav forstørrelse vand-dypning-kegle objektiv og se gennem okularerne i mikroskop for at vælge et område på overfladen af ​​embryoet til billede.
      BEMÆRK: Hvis den stabile transgene MitoFish reporter linje, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, anvendes sammen med en chauffør line som Huc: Gal4 derefter mest RB neuroner er mærket, og fremstå som en tæt mesh-arbejde af neurit dorne på overfladen af ​​embryoet. Hvis mikroinjektion af DNA-konstruktioner anvendes til at opnå sparse mærkning (f.eks, Sensory: Gal4-VP16 med UAS: mitoCFP og UAS: MA-YFP), skærm embryoner til at identificere dobbelt-mærkede celler.
    4. Åbn mikroskop software (μManager 1.4) og klik på "Illumination '' under" Konfigurationsindstillinger "for at definere de korrekte filtersæt for bølgelængden af ​​interesse (YFP eller FFP for den aktuelle eksempel). Under" Kameraindstillinger "indtaste eksponeringstid der kræves for at erhverve en passende billede.
      BEMÆRK: "Illumination Settings" er forudindstillet af brugeren ved installation af software og er fyldt, når du åbner μManager. Hvis programmet ikke er konfigureret til at styre filterhjulet, manuelt bevæge filterhjulet i tårnet til den passende position.
    5. Skift til en lang arbejdsafstand vand-dyppe-kegle mål spænder fra 40-100x forstørrelse. Vælgedet mål, der har den højeste numeriske apertur (NA) og kromatisk korrigeret (Apochromat).
    6. Klik på "Live" for at vælge synsfeltet: I tilfælde af RB neuron, billede mitokondriel transport ved forstavnen axon, der udgår fra cellelegemet, eller i det perifere arbor.
      BEMÆRK: De perifere dorne af RB neuroner i halefinnen fold af embryoet giver en ideel mulighed for at billedet et stort synsfelt, der er flad og kan derfor fanget på en enkelt ramme med et bredt felt mikroskop. Det er derfor vigtigt at montere embryoet som fladt som muligt på sin side, således at halefinnen fold er parallel med bunden af ​​petriskålen.
    7. Når du har valgt et synsfelt, skal du klikke på "rektangulær markering" -knappen i menuen ImageJ, definere et område af interesse (ROI) og klik på "ROI" i vinduet μManager. Efter valg af ROI for billedbehandling, skal du klikke på "Stop" og "Gem" for at take et billede af YFP kanal til at optage den lokale morfologi neurit / s.
    8. Til billedet mitokondrie transport klikke på "Multi-D Acq." knap. Overhold et ekstra vindue ( "Multi-dimensional Acquisition"), og vælg antallet af tidspunkter samt intervallet mellem tidspunkter på dette vindue. Brug frame rates af 0,3-1 Hz. Udfør optagelser i mindst 10 minutter til at samle så mange data-point som muligt.
    9. I "Multi-dimensional Acquisition" vinduet, klik på "Kanaler", tilføje og definere bølgelængde for imaging (CFP for mitokondrier i dette eksempel), og tidspunktet for eksponering. Hold eksponeringstider til under 400 msek til afbildning mitokondriel transport.
    10. Klik på muligheden "Gem billeder" i vinduet "Multi-dimensional Acquisition", for automatisk at gemme filerne i en bestemt mappe skitseret i "Register rod«. Klik på "Hent" i øverste højre hjørne for at starte time-lapse billeddannelse.
    11. Manuelt justere fokus, mens tidsforskudt optagelse for at kompensere for enhver tendens i z dimension.
      BEMÆRK: Ved hjælp af disse parametre mitochondrial transport i RB neuroner kan afbildes så længe som 4 timer.
  2. konfokal mikroskopi
    BEMÆRK: Her retningslinier er fastsat billeddannelse med en opretstående Olympus FV1000 konfokal mikroskop og vand-dypning-kegle mål lange arbejdsafstand. Mikroskopet er udstyret med flere laserlinjer og flere detektorer (konventionelle PMT'er og mere følsomme galliumarsenidphosphid detektorer), der giver mulighed for multikanal billeddannelse. Der henvises specifikt til Olympus FluoView software. de billeddannende parametre her beskrevne, bør imidlertid være let overføres til andre konfokale systemer.
    1. Mount embryoner i lavtsmeltende agarose i en orientering passende for organet / struktur, der skal afbildes, som beskrevet i 4 ovenfor.
    2. ° C i en varme kammer på scenen af mikroskopet, før de påbegynder billeddannelse.
    3. Brug vand-dyppe-kegle mål lange arbejdsafstand til konfokale mikroskoper i opretstående konfiguration. Vælg mål med den højest mulige NA at maksimere mængden af ​​fluorescerende signaler, der kan indsamles og har den bedste opløsningsevne. Når indsamle billeder fra flere kanaler at vælge kromatisk korrigerede mål (Apochromat).
    4. Åbn mikroskop software og klik på "Trans Lamp" eller "Epi Lamp" for at bruge henholdsvis enten transmitteret eller fluorescens lys til at identificere området af interesse via okularerne i mikroskopet.
    5. Brug softwaren til at oprette følgende scanning parametre til at erhverve billedstakke:
      1. I "Acquisition indstilling" vinduet kontrollere, at valgt til billedbehandling målsætning matcher målsætningen, der vises på drop-down menu med tilgængelige mål.
        BEMÆRK: Dette er for at sikre, at eventuelle forudberegnede parametre for et bestemt mål (f.eks lateral og aksial opløsning, størrelsen af den konfokale blænde osv) holder stik, og kan bruges som pålideligt.
      2. Vælg de relevante laser linje / s, og excitation og emission dichroic filtre til billedet specifik fluorescerende protein (er). Gør dette ved at klikke på "Dye listen" knappen i "Image Acquisition Control" vinduet og vælg den relevante fluorophor / s. Alternativt kan du klikke på "Light sti og farvestoffer" knappen for at indstille disse parametre manuelt.
        BEMÆRK: Når "Dye List" -knappen løsning der vælges, softwaren vælger automatisk de passende laser linjer, excitation og emission dichroic filtre og justerer størrelsen af konfokal blænde korrekt.
      3. I vinduet "Acquisition Setting", justere "Zoom" faktor og "Størrelse aspect ratio "(dvs., 512x512, 1024x1024 etc.) for det scannede billede for at opnå den pixelstørrelse nødvendigt bedst løse de strukturer, der afbildes. Indstil pixel størrelse til at være omkring halvdelen af den teoretiske opløsning af målet, og dermed efter Nyquist kriterier prøveudtagning . for at bestemme pixelstørrelsen for den erhvervede billede klik på knappen med symbolet for information ( "i") i "Image Acquisition Control" vinduet.
      4. Indstil scanningen hastighed til den hurtigst mulige (2 mikrosekunder / pixel) i "Acquisition indstilling" vinduet.
      5. I "Image Acquisition Control" vinduet klik på Kalman line gennemsnit at reducere noise.A faktor 2 til 3 normalt tilstrækkeligt.
      6. Vælg en sekventiel scanning tilstand, når billeddannelse fluoroforer med overlappende spektre. For at gøre dette, skal du klikke på "Sequential" og "Line" i "Image Acquisition Control" vinduet.
      7. Juster effekt af de relevante laser linje / s (typiskunder 5%). De specifikke værdier skal bestemmes empirisk.
      8. Klik på knappen "XY Repeat" eller "Focus x2" eller "Fokus x4" til løbende at scanne det valgte område, mens justering af indstillingerne detektor for hver kanal. Juster "HV", "Gain" og "Offset" for hver kanal til at erhverve billeder, der har den højeste dynamiske område af grå værdier.
        BEMÆRK: De specifikke værdier for disse indstillinger skal bestemmes empirisk. "HV" justerer spændingen på detektoren for at ændre dens følsomhed, "Offset" justerer udgangssignalet fra detektoren og "Gain" multiplicerer udgangssignalet fra detektoren med en konstant faktor.
      9. Tryk på Ctrl + H for at visualisere de erhvervede billeder via en look-up tabel (HiLo), der identificerer under-mættet (vises blå) og over-mættede pixels (se røde), som begge bør generelt undgås. Revurdere effekt af den pågældende laser line / s og indstillingerne detektor.
        BEMÆRK: Brug af høj lasereffekt og høje niveauer af det "HV" af detektoren vil føre til mere signal. Højere laser magt vil dog føre til øget blegning og foto-toksicitet. Forøgelse af "HV" vil føre til øget støj. Derfor skal der findes ved indstilling laser magt og "HV" at optage billeder med acceptable støjniveauer samtidig forhindre foto-skade et kompromis (se også tabel 1).
      10. Saml billeder fra et defineret volumen ved at fokusere på de øvre og nedre grænser for det område af interesse. I "Acquisition indstilling" vindue klik på "End Set" og "Start Set" sæt knapperne på z-stack vindue på de øvre og nedre grænser for den mængde, der skal afbildes. Vælg en trinstørrelse, der er halvdelen af z-opløsning for givet mål (f.eks., Hvis z opløsning er 2 um vælge 1 um). For at bestemme z opløsning af objective klikke på knappen med symbolet for information ( "i") i "Image Acquisition Control" vinduet.
      11. Opsæt en tidsserie for at indsamle z-stakke på en tidsmæssig frekvens, der er passende for dynamikken i den subcellulære struktur, der afbildes. I "TimeScan" sub-vindue indtaste den frekvens, hvor z-stakke skal erhverves ( "Interval" ") og det antal gange billederne skal erhverves (" Num ").
      12. Klik på "Depth" og "Time" knapper i "Image Acquisition Control" vinduet for at bekræfte, at en z-stak og tidsserier vil blive erhvervet. Klik til sidst på "XYZT" knappen for at starte erhverve time-lapse billeder.
      13. Efter afslutningen af ​​købet billede, observere "serie Done" på software interface. Klik på den og gemme billederne i "OIB" format til at optage billeder og metadata forbundet med dem.
        BEMÆRK: Billeder opnået påwide-field mikroskop og konfokal mikroskop kan visualiseres og analyseres ved hjælp af software som FIJI, en gratis public domain billedbehandling program.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her brugen af ​​wide-field og konfokal mikroskopi til billedet mitokondrier og centrosomer i levende zebrafisk embryoner er direkte sammenlignes og kontrasteres. Afhængigt af placeringen af ​​de celler, hvor organel dynamik, der skal undersøges, og den iboende frekvens af de specifikke subcellulære begivenheder, generelt enten bredt felt eller konfokal mikroskopi er det bedste valg. Vi afbildes organeller i RB neuroner lokaliseret på overfladen af ​​embryoet og i retinale celler placeret dybere. Den overfladiske placering RB neuroner sammen med deres to dimensional geometri gør dem gode kandidater til at blive afbildet af både bredt felt og konfokal mikroskopi (figur 2). Erhvervelse billeder ved hjælp af konfokal mikroskopi er dog betydeligt langsommere og kan føre til en undervurdering af dynamikken i specifikke subcellulære hændelser (f.eks, flytning af mitokondrier, figur 2C, D (figur 3).

For at muliggøre samtidig visualisering af organeller og cellulære membraner brugte vi Gal4-UAS-system i tre forskellige konfigurationer. For det første UAS MitoFish reporter linje Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) blev mde6 brugt. Her et tovejs UAS muliggør samtidig udtryk for mitokondrier målrettet fælles fiskeripolitik og membran målrettet YFP. I kombination med passende Gal4 driver linjer, MitoFish mærke mitokondrierne og cellemembranerne i RB sensoriske neuroner (Figur 2A-C) eller retinale celler (figur 3A, B) med FFP og YFP r espectively. Sekund, to UAS-konstruktioner (UAS: mitoCFP og UAS: MA-YFP) blev kombineret med en Gal4 driver konstrukt (Sensory: Gal4-VP16, sensoriske neuron-specifikke enhancerelementer fra islet-1-genet) 7 i forbigående injektioner. Mosaikken udtryk, der generelt resulterer fra disse injektioner tilladt sporing af individuelle celler i løbet af dagen (Figur 2E). En tredje fremgangsmåde anvendte anvendelsen af ​​to UAS kassetter, hver driver ekspressionen af ​​et andet fusionsprotein, på en enkelt sammenhængende konstruktion. Denne strategi blev anvendt til at generere CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) tum1, hvori en centrin4-YFP fusion etiketter centrosomer og Cerulean er målrettet til cellemembraner. I kombination med specifikke Gal4 driver linjer mellem centrosomer og cellemembranerne i retinale celler (figur 3C, D) eller muskelfibre (figur 4) er mærket.

ent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 2: Billedbehandling mitokondrier in vivo i RB sensoriske neuroner i embryonale zebrafisk.
RB sensoriske neuroner i caudale del af finnen fold af 2 dpf MitoFish blev afbildet ved anvendelse af et Apochromat 40x vand-dypning-kegle mål med en NA på 0,80, enten ved wide-field (A) eller konfokal (B) mikroskopi. Paneler til højre viser detaljer af regionen skitseret. C Wide-field time-lapse billeder af en lille region af interesse i det perifere løvhytte af en RB neuron i 2 dpf MitoFish. Bevægelsen af ​​en enkelt mitokondrie (pil i 0 '') blev sporet over 100 sek; vises seks tidspunkter. Positionen af mitochondriet i tidligere tid-punkt er skitseret i magenta. D positionen af bevægelige mitochondriet i C E Konfokal billeder af en RB sensorisk neuron ved 2 og 3 dpf. Mærkning af individuelle RB celler og deres mitochondrier blev opnået ved co-injektion af en sensorisk neuron-specifik Gal4 driver konstruere sammen med to UAS reporterkonstruktioner, UAS: mitoCFP og UAS: MA-YFP, ved et-celle stadiet og screening for isolerede dobbelt -mærkede celler. Billedet er kontrasten inverteret og individuelle mitokondrier er afbildet skematisk som magenta prikker. Scale bar A, B 20 um, C 2 um,E 50 um. Mitokondrier målrettet fælles fiskeripolitik (mitoCFP), membran målrettet YFP (MA-YFP). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Sammenligning af wide-field og konfokal mikroskopi til at afbilde organeller in vivo i den embryoniske zebrafisk nethinden.
Otx2 promotorelementer drive ekspressionen af FFP i mitokondrier og YFP i cellemembraner (A og B) eller YFP i centrosomer og Cerulean i cellemembraner (C og D) i nethinden af 2 dpf zebrafisk embryoner. For at opnå dette mærkning mønster, Otx2: Gal4 transgene fisk blev enten krydset til MitoFish (A og B) or CentrinFish (C og D). En 40x vand-dypning-kegle Apochromat mål (NA 0,80) blev anvendt til at erhverve billeder af samme region i hvert nethinden Brug Wide-felt (A, C) og konfokal (B, D) mikroskopi. Mellemværker i A og B viser detaljer for en region i det indre nukleare lag, sten indlæg i C og D viser en celle i M-fasen. Scale bar 20 pm. Mitokondrier målrettet fælles fiskeripolitik (mitoCFP), membran målrettet YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), membran målrettet Cerulean (MA-Cerulean). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Sammenligning af wide-field og konfokal MicroscKopier til billedet centrosomer in vivo.
En enkelt muskelfiber med fluorescens-mærkede cellemembraner og centrosomer (Otx2: Gal4; CentrinFish) blev filmede med wide-felt (A) og konfokal (B) mikroskopi. I begge tilfælde blev der anvendt en 40x vand-dypning-kegle Apochromat mål (NA 0,80). Scale bar 10 pm. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), membran målrettet Cerulean (MA-Cerulean) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her udviser vi alsidigheden af Gal4-UAS ekspressionssystem til fluorescens tag mitokondrier, centrosomer og de ​​cellulære membraner i specifikke celletyper in vivo i zebrafisk embryoner. Mange fluorescerende fusionsproteiner, som mærker andre organeller eller subcellulære strukturer kan findes i den publicerede litteratur og kan fås fra det pågældende laboratorium, kommercielle kilder eller ikke-kommercielle plasmid depoter (f.eks Addgene). At designe en ny fluorescerende fusionsprotein, skal overvejes, herunder hvilke FP at bruge, og om at fusionere FP ved amino- eller carboxyterminalen af ​​proteinet af interesse adskillige parametre. For en mere grundig diskussion om at skabe fluorescerende fusionsproteiner, er læserne henvises til dybdegående artikler om emnet 49-51.

Vi fremhæver tre strategier for at opnå co-ekspression af fusionsproteiner hjælp UAS-drevne transgener. Multiple, separatelye UAS reporterkonstruktioner tillader sammensætning forskellig eksisterende reporter-konstruktioner uden behov for yderligere kloning. Reporter ekspressionsniveauer kan også titreres uafhængigt. højere niveauer af co-ekspression, er imidlertid opnås, når der anvendes enten multiple UAS kassetter eller en tovejs UAS kassetten på en enkelt konstruktion. Eftersom rammeprogrammerne anvendes som mærker er det relativt nemt at verificere co-ekspression. Det skal bemærkes, at andre fremgangsmåder til multi-cistronisk ekspression også findes, herunder anvendelse af interne ribosomale indgangssteder 40 og virale 2A peptider 52,53. Som et alternativ til DNA baserede konstruktioner, in vitro-transkriberet udjævnede mRNA kan anvendes til at udtrykke fluorescerende fusionsproteiner til at mærke subcellulære strukturer 1,4,8. Det forbehold ved denne fremgangsmåde er imidlertid, at ekspression er begrænset til de første par dage af udvikling og ikke er celle eller vævsspecifik. Uanset det valgte at udtrykke fusionsproteiner metode, er det afgørendeat sikre, at ekspressionsniveauer ikke fører til ikke-specifik mærkning og kompromittere den fysiologiske tilstand af cellerne. I denne henseende kan amplificeringen af reportergenekspression iboende i Gal4-UAS systemet 27 være problematisk, manifesterer fx som cytosolisk mærkning selv når FP er målrettet til et specifikt organel. Når tilgængelig, bør antistoffer anvendes til at kontrollere, at de ekspressionsmønstre opnået ved fusionsproteiner afspejler den endogene situation. I nogle tilfælde kunne injektion af lavt (lavere) DNA-koncentrationer afbøde problemet med mis-lokalisering af fusionsproteinet. Alternativt kan vektorer med et lavt antal UAS gentagelser med til at titrere ned transgen ekspressionsniveauer 30. Tilsvarende for den aktivator Gal4-VP16, findes ændrede versioner, der er rapporteret til at drive ekspression forholdsvis svagt og er derfor mindre giftige 30,33. Hvis mis-lokalisering af fusionsproteinet fortsætter trods bestræbelser på at titrere down transgen ekspressionsniveauer, kan det være nødvendigt at give afkald på Gal4-UAS systemet og drive ekspression af promotorelementer direkte.

De stabile transgene linier, MitoFish 10 og CentrinFish 12 beskriver vi i dette manuskript blev foretaget ved anvendelse 14xUAS kassetter. Vi opretholder disse linjer i baggrunden af Gal4 driver linjer til at detektere ændringer i ekspression over generationer, da reporter linier med flere UAS gentagelser er blevet rapporteret at være tilbøjelige til silencing 54. Vi har ikke set beviser på lyddæmpning over de 3 generationer har vi opformeret den CentrinFish. Vi har dog set brogede udtryk i MitoFish og derfor vælger stringent embryoner med "fuld", stærke niveauer af ekspression at udbrede for fremtidige generationer. Den nuværende litteratur tyder på, at ekspressionsvektorer med 5xUAS gentagelser kunne være et alternativ til at generere stabile transgene linjer - reporteren erdrevet til tilstrækkeligt høje niveauer 30 og den forholdsvis lave antal UAS gentager kan gøre det mindre udsat for transgen lyddæmpning, selvom ikke-repetitive UAS gentagelser er angiveligt endnu mindre modtagelige 54.

Paletten af rammeprogrammerne øjeblikket tilgængelig for tag organeller eller andre subcellulære strukturer er meget bred 55. Når du vælger en bestemt FP som et tag, bør det overvejes til følgende parametre: For det første at excitation og emission spektre af FP bestemme den specifikke laserlinje samt excitation og emission filtre er nødvendige for dens visualisering. For det andet, lysstyrke og foto-stabilitet i FP. For det tredje, den hastighed, hvormed FP modner følgende oversættelse. Fjerde, hvorvidt FP har en tendens til at aggregere i fusionerne. Med hensyn til den sidste parameter, skal der udvises forsigtighed og kontrol eksperimenter bør gøres for at teste egnetheden af ​​hvert FP til specifikke eksperimenter. For eksempel, mens red rammeprogrammer mCherry og DsRed er meget udbredt, er de efter sigende danne aggregater i visse fusioner 56. Vi har fundet TagRFP-T 57, et mere tilgængeligt-stabile variant af TagRFP, at klare sig godt, når den rettes til mitokondrier og cellulære membraner (ikke offentliggjorte observationer). Når flere organeller skal samtidigt visualiseres, FP'er med ikke-overlappende spektre bør anvendes. Vi har med succes brugt kombinationer af cyan rammeprogrammer (FFP og Cerulean) og YFP (figur 2-4). Ved at udnytte hele spektralområde fra blå til nær infrarødt, kan man i høj grad udvide antallet af subcellulære strukturer, der kan samtidigt visualiseret 2. Ud over den konventionelle rammeprogrammerne, foto-aktiverbare rammeprogrammerne er særligt nyttige til at probe organel dynamik, f.eks anvendelsen af FP Kaede spore skæbne individuelle mitokondrier 58.

Hvilket mikroskopi teknik - wide-felt eller konfokal - er den mestpassende til billedbehandling afhænger af en række faktorer, herunder placeringen af ​​cellerne, der skal afbildes, og den hastighed, hvormed forventes at forekomme specifikke subcellulære eller cellulære begivenheder. Wide-field mikroskopi er den foretrukne modalitet i overfladiske steder og tyndt mærkede prøver. Det tilbyder lav foto-toksicitet og billedbehandling ved høj hastighed til en rimelig pris. Men hvis billeddannelse skal udføres i ikke-overfladiske dele af zebrafisk, i tæt mærkede prøver eller for at opnå tredimensionelle informationer, konfokal eller en anden form for optisk sektionering mikroskopi bliver, den foretrukne metode.

Uanset hvilken overvåges cellulær eller subcellulær struktur, er der ofte en afvejning mellem at erhverve den bedst mulige billede og holde prøven i live og i god fysiologisk tilstand til gentagen time-lapse billeddannelse. Foto-toksicitet kan manifestere sig som ændringer i adfærd organeller, afvigende morfologi af celler eller endda celledød. Nøglen til at reducere foto-blegning og foto-toksicitet for både bredt felt og konfokal mikroskopi er at bruge det lavest mulige niveau af lys til at erhverve billeder. I denne henseende mål med den højest mulige NA er nøglen til at maksimere mængden af ​​fluorescerende signal, der kan opsamles. For konfokal mikroskopi, kan en række parametre justeres til at kompensere for anvendelsen af ​​lavere lasereffekten. Detektorer med højere kvante effektivitet sammenlignet med konventionelle PMT'er, fx, galliumarsenidphosphid detektorer, kan anvendes til at sikre, at udsendte fotoner er mere tilbøjelige til at blive detekteret. Alternativt eller yderligere kan højere dynode spændinger anvendes i PMT at øge følsomheden af ​​detektorer. Det konfokale åbning (pinhole) kan åbnes for at muliggøre samling af mere fluorescerende signal, omend med et tab af aksial opløsning. At udsætte prøverne for så lidt lys som muligt, bør scanning ske ved høje hastigheder, således at opholdstiden forlaseren per pixel er lav. Scanning ved lavere rumlig opløsning har også den virkning at øge hastigheden af ​​scanning. Imaging mindre hyppigt har den yderligere fordel at udsætte prøven til mindre lys, dog bør kun overvejes, hvis den ikke hindrer omfattende prøvetagning af de undersøgte processer.

Som et alternativ, rotationsskive konfokale mikroskoper og konfokale mikroskoper, der er udstyret med en såkaldt "resonant" scanner tilbyder muligheden for hurtig scanning. Begge modaliteter har den fordel, at de er hurtigere og mindre foto-toksiske end "klassiske", punkt-scanning konfokale mikroskoper. Imidlertid rotationsskive konfokale mikroskoper er mere begrænsede i z-opløsning og kan ikke trænge så dybt ind i væv som punkt-konfokalt mikroskoper. Tilsvarende kan anvendelsen af ​​resonante-scanner konfokale mikroskoper begrænses som den meget korte pixel dvæletid vil føre til dårligere billedkvalitet, som kunne,til gengæld hinder påvisning af sub-cellulær hændelser (f.eks binære billeder med reduceret signal-til-støj).

Endelig mens bredt felt og konfokal billedbehandling er fremhævet her, kan andre former for lysmikroskopi såsom to-foton 59 og lys ark mikroskopi 60 være mere passende for specifikke spørgsmål. To-foton mikroskopi er baseret på excitation af en fluorofor ved den samtidige absorption af to fotoner i det infrarøde område af lysspektret. I lighed med konfokal mikroskopi, det bruger punkt scanning til at erhverve billeder fra prøven og har optiske sektionsopdelingen kapaciteter i kraft af den ikke-linearitet af to-foton excitation. Anvendelsen af ​​lang bølgelængde lys for fluorofor excitation tillader billeddannelse på dybder flere hundrede mikrometer fra overfladen. Desuden forhindrer begrænsningen af ​​excitation til et lille imaging volumen foto-blegning og foto-toksicitet uden for fokusplanet. Men ikke alle FPs har høj multifoton absorption tværsnit, et problem, der er særligt udbredt i rød rammeprogrammer. Endvidere, at finde en enkelt infrarød bølgelængde til samtidig at excitere flere særskilte RP'er er vanskeligt, hvilket gør flerkanals billeddannelse besværlig. Lys ark mikroskopi anvender en tynd 'ark' (typisk tykkelse i området fra 2 til 10 um) af laserlys til at excitere prøven og detekterer fluorescenssignaler fra denne belyste brændplanet ved en ret vinkel ved anvendelse af en følsom kamera. Optisk sektionering opnås ved belysning af et enkelt plan ad gangen. Denne begrænsning af excitationslys reducerer forekomsten af ​​foto-toksicitet. Da fluorescens signaler fra hele belyst flyet indsamles samtidigt, billede erhvervelse er betydeligt hurtigere end punkt konfokalt og multifotonexcitation mikroskoper. Alle disse egenskaber gør lys ark mikroskopi særlig velegnet til billeddannelse dynamiske cellulære begivenheder med høj Spatiotemporal opløsning istore mængder af levende prøver. Faktisk blev ved hjælp af lys-ark mikroskopi celle skæbne på hele zebrafisk embryo omfattende spores i den første 24 timers udvikling 61. Med fortsatte forbedringer til bedre billedbehandling penetration 62,63 og rumlig opløsning 64, er det tænkeligt, at lys-ark mikroskopi vil blive ansat til at undersøge dynamik ikke kun på det cellulære, men også på det subcellulære niveau i hele zebrafisk embryoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13, (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191, (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56, (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138, (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52, (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15, (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45, (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32, (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33, (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11, (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11, (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70, (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30, (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240, (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142, (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122, (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163, (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3, (10), 130065 (2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20, (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74, (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119, (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99, (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80, (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108, (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341, (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184 (2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (3), prot5586 (2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42, (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263, (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55, (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21, (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. 14.20 (2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. 21.4 (2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19, (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32, (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45, (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352, (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33, (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5, (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998 (2014).
Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter