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Developmental Biology

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

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Imaging in vivo fornisce la visualizzazione diretta dei comportamenti cellulari nel contesto più fisiologico. La trasparenza di embrioni di zebrafish, il loro sviluppo rapido ed esterna e una ricca gamma di strumenti genetici che consentono l'etichettatura fluorescente hanno contribuito al crescente utilizzo della microscopia in vivo per chiarire la dinamica degli eventi chiave dello sviluppo. Studi di imaging di sviluppo del sistema nervoso in zebrafish hanno ad esempio notevolmente ampliato la nostra conoscenza del comportamento delle cellule progenitrici neurali e il destino della loro progenie compreso il loro successiva migrazione, differenziazione e integrazione del circuito 1-8.

Il palcoscenico è ora impostata per indagare le dinamiche subcellulari alla base di tali comportamenti cellulari. Infatti, zebrafish sono già sfruttate come strumenti per in vivo biologia cellulare. Ora è possibile visualizzare i mitocondri 9-11, centrosomi 2,8,12-14, Golgi 15, Il citoscheletro microtubuli 4 e actina 16, endosomi 17 e componenti della membrana apicale complesso 1,18, tra le altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish in vivo. Finora, gran parte di ciò che si conosce la funzione di questi organelli viene da studiare il loro comportamento in cellule in coltura. Mentre gli studi in vitro hanno dato un enorme comprensione della biologia delle cellule, cellule in coltura non rappresentano appieno la complessità della situazione in vivo e quindi non riflettono necessariamente la funzione e le dinamiche di organelli subcellulari in vivo. Embrioni di zebrafish offrono una valida alternativa in vivo per esaminare le dinamiche subcellulari.

Come vertebrati, zebrafish possiede molti organi (ad esempio, retina neurale) che sono omologhi a quelli trovati in specie di mammiferi. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono sempre più utilizzati per modellare malattie umane 19,20 (ad esempio, microcefalia 21 e amaurosi 22 congenita di Leber) e per la funzione mitocondriale (ad esempio, il morbo di Parkinson 23, tauopatie 10,24 e sindrome di Barth 25). In vivo l'imaging a livello cellulare e subcellulare in questi casi consenta una migliore comprensione della biologia cellulare alla base di questi stati patologici.

L'obiettivo generale dei metodi descritti qui è quello di fornire una guida completa per indagare organelli e altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish utilizzando in microscopia ottica vivo. L'intero flusso di lavoro coinvolti nella visualizzazione e il monitoraggio delle strutture subcellulari in vivo è descritto - da approcci genetici di etichettatura, a generare transitoriamente esprimere e pesce transgenico stabile, e, infine, per l'imaging con grande campo e microscopia confocale. Mentre ciascuno di questi procedures è utilizzato da numerosi laboratori di zebrafish, i protocolli descritti sono ottimizzati e semplificato per indagare le dinamiche di strutture subcellulari. Due aspetti specifici del lavoro descritto qui meritano menzione: In primo luogo, l'uso del sistema di espressione GAL4-UAS in più configurazioni per geneticamente organelli etichette in specifici tipi di cellule. In secondo luogo, un confronto diretto di tutto il campo e microscopia confocale a strutture subcellulari di immagini in vivo.

Le attuali strategie geneticamente organelli etichette e altre strutture subcellulari in zebrafish o fare uso di capped mRNA 1,4,8 o costrutti di DNA a base dove elementi promotori di auto direttamente l'espressione di proteine ​​di fusione 9,14,15. Trascritto in vitro ricoperto risultati di RNA a rapida e ampia espressione, che non è tessuto-specifica però. Inoltre, i livelli di espressione diminuiscono nel tempo come RNA capped viene diluito o degradato. Pertanto, l'uso di RNA basatocostruisce per esaminare le dinamiche organelli in fasi successive di sviluppo è limitata (in genere fino a 3 giorni dopo la fecondazione).

Queste limitazioni possono essere superate usando costrutti di DNA, dove il controllo spaziale e temporale di espressione è determinato da elementi promotori specifici. Quando costrutti di DNA a base sono utilizzati nel contesto del sistema GAL4-UAS significativi miglioramenti a livello di espressione del transgene si osservano 26,27. In questo sistema di espressione bilaterale, di tipo a cella specifici elementi promotori guidano l'espressione di un attivatore trascrizionale GAL4, mentre geni reporter vengono clonati a valle della sequenza attivante a monte GAL4-binding (UAS). Combinando UAS giornalisti con opportuni driver GAL4, espressione può essere limitata a specifici tipi di cellule, eludendo la necessità di clonare geni reporter dietro vari promotori ogni volta che un pattern di espressione specifici si desidera. Inoltre, l'espressione di geni multipli UAS giornalista può essereguidato da un unico attivatore GAL4. Il sistema GAL4-UAS fornisce quindi un approccio genetico versatile e flessibile per l'etichettatura subcellulare.

Wide-field e microscopi confocale sono i cavalli di lavoro della maggior parte dei laboratori. sistemi a grande campo tipicamente utilizzano una lampada ad arco come sorgente luminosa e rilevare la luce emessa con una camera sensibile che è posto al termine del percorso della luce. Questa modalità di imaging è in genere limitata a campioni sottili come fuori-di luce fuoco oscura informazioni di messa a fuoco in campioni più spessi. Microscopi confocali differiscono dai sistemi largo campo dal fatto che essi sono costruiti per favorire segnali provenienti dal piano focale rispetto a quelli che hanno origine fuori fuoco (cioè, "sezionamento ottico") 28. Per ottenere sezionamento ottico un foro è inserito nel percorso di emissione in grado coniugato alla sorgente di luce puntiforme. I laser sono utilizzati come sorgenti di luce ed i segnali vengono rilevati con tubi fotomoltiplicatori (PMT). In pratica, un laserfascio viene strisciato sul campione punto per punto e l'emissione di fluorescenza ad ogni punto (pixel) viene rilevata dal PMT.

Qui immagine le stesse strutture subcellulari in embrioni di zebrafish vivere utilizzando sia a livello di campo e di microscopia confocale per fornire un confronto diretto di entrambe le modalità di microscopia. L'obiettivo di fondo di fornire tali confronti è quello di offrire le linee guida per la scelta della tecnica di microscopia più appropriata per la questione specifica a portata di mano.

Utilizzando gli approcci descritti qui dimostriamo GAL4-UAS basato etichettatura genetica dei mitocondri e dei centrosomi. Questi organelli vengono esposte in diversi tipi di cellule del sistema nervoso e in cellule muscolari con largo campo e microscopia confocale a dimostrare l'idoneità di ogni modalità di imaging. I metodi descritti qui possono essere facilmente adattate per indagare altri organelli e strutture subcellulari nell'embrione zebrafish vivente.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla normativa vigente del governo della Baviera (Monaco di Baviera, Germania).

1. Etichettatura organelli e altre strutture subcellulari

NOTA: Qui giornalista genetica costrutti che centrosomi tag fluorescenza, i mitocondri e le membrane cellulari sono descritti.

  1. Utilizzare metodi di clonazione convenzionali 29 per generare proteine ​​di fusione che etichetta fluorescente centrosomi e mitocondri. Clonare la sequenza codificante di centrin4 zebrafish (cetn4) in-frame con una proteina fluorescente 2 (FP) come proteina fluorescente gialla per generare cetn4-YFP. Clonare la sequenza di targeting mitocondriale di subunità VIII della citocromo c ossidasi in-frame con un FP come proteina fluorescente Ciano per generare mitoCFP 9-11.
  2. Per limitare l'espressione delle proteine ​​di fusione (cetn4-YFP o mitoCFP) alle cellule specifiche del zebrafISH embrione (ad esempio i neuroni o cellule muscolari) utilizzare il sistema di espressione bipartito GAL4-UAS 26,27. In primo luogo generare un giornalista costrutto UAS. Utilizzare i metodi convenzionali per clonare la proteina di fusione in un vettore di espressione UAS, a valle della cassetta UAS GAL4-binding (varianti vanno da 1x a 14x UAS, vedi Discussione) 26,27,30 e un promotore minimo (E1b promotore basale da carpa βactin gene), e generare UAS: cetn4-YFP e UAS: mitoCFP.
    NOTA: Per preparare UAS giornalista costrutti per stabile generazione linea transgenica elementi aggiuntivi devono essere clonato (vedere 3 di seguito)
  3. Per visualizzare il contesto cellulare in cui centrosomi o mitocondri sono etichettati, generare UAS giornalista costrutti in cui le membrane cellulari sono etichettati dai PQ. Clone primi venti amminoacidi di zebrafish GAP43 (contenenti siti palmitoylation) in-frame con FP target che FP alla membrana cellulare (memFP) 31,32.
  4. otten costrutti driver o linee transgeniche in quale cella di tipo specifici elementi promotori guidare l'espressione dell'attivatore trascrizionale GAL4-VP16 27, 33 o Gal4FF KalTA4 30.
  5. Unire il giornalista UAS costruisce con un costrutto driver appropriato per limitare l'espressione alla cellula-tipo desiderato di interesse (ad esempio, nei neuroni o cellule muscolari). Per fare questo co-iniettare conducente GAL4 UAS e giornalista costruisce allo stadio unicellulare di uova fecondate (per le istruzioni dettagliate vedere 2 sotto) per generare transitoriamente esprimere pesce. In alternativa, generare una stabile linea transgenica UAS giornalista (per le istruzioni dettagliate vedere 3 di seguito) e attraversare a una linea transgenica stabile conducente GAL4 di generare prole tenendo entrambi i transgeni.
    NOTA: E 'anche possibile iniettare UAS giornalista costruirà / s in uova fecondate da una stabile linea transgenica conducente GAL4 o un driver di GAL4 costruire in fertilizUova Ed da una linea transgenica stabile UAS giornalista.
  6. Per co-esprimere più proteine ​​di fusione distinta utilizzando il sistema GAL4-UAS, utilizzare un driver GAL4 UAS e reporter / s in una delle seguenti configurazioni: A. multipla, costrutti UAS giornalista separate (ad esempio, UAS: mitoCFP e UAS: memYFP co -injected con un driver costrutto GAL4) 10, B. più cassette UAS su un singolo giornalista (per esempio, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Bidirezionale giornalista UAS (ad esempio UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Figura 1).

Figura 1
Figura 1. Le strategie di co-espresse proteine ​​di fusione che utilizzano il sistema GAL4-UAS.
Co-espressione di più proteine ​​di fusione può essere ottenuto utilizzando UAS cassette giornalista in diverse configurazioni: (A) multipla, const UAS-driven separataructs, (B) più cassette UAS su un unico costrutto o (C) un UAS cassetta bidirezionale su un unico costrutto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Generare Transientemente Esprimendo Pesce

NOTA: Il seguente è un adattamento dei protocolli precedentemente pubblicati 34,35. Una configurazione di iniezione base dovrebbe includere uno stereomicroscopio con una gamma di ingrandimento fino a 12x, un micromanipolatore con un supporto micropipetta e una fonte di pressione d'aria. Preparare 2,1-2,5 prima del tempo:

  1. Per preparare uova camere microiniezione, preparare una soluzione di 1,5% (w / v) di agarosio in acqua. Aggiungere la polvere di agarosio all'acqua e forno a microonde fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Riempire una capsula di Petri (100 x 15 mm) con questa soluzione.
    1. Lasciare che la soluzione di agarosio raffreddare a approximately 45 o C prima di effettuare una plastica stampo microiniezione (40 mm x 66 mm, con 6x 50 millimetri lunghe creste che sono 1,5 mm di larghezza, 1 mm di profondità e distanziate 3 mm tra i) sulla superficie del agarosio fuso, facendo attenzione a non introdurre bolle all'interfaccia.
    2. Dopo i set di agarosio, conservare a 4 o CO / N. Rimuovere con attenzione lo stampo con una spatola. Preparare camere multiple microiniezione alla volta, conservare a 4 ° C e usare ripetutamente per diverse settimane.
  2. Utilizzare un estrattore micropipetta per generare capillari di iniezione di vetro con un lungo gambo 36.
    NOTA: Le impostazioni specifiche utilizzate per generare capillari di iniezione deve essere determinato empiricamente. capillari di iniezione può essere tirato in anticipo e memorizzati prima dell'uso.
  3. Misurare la concentrazione di DNA plasmide (conducente GAL4 e costrutti reporter UAS) per microiniezione utilizzando uno spettrofotometro in base al manuale del costruttore. Misurare60; il rapporto di assorbanza a 260 nm e 280 nm (A260 / 280). Diluire il DNA ad una concentrazione finale di 100 ng / ml in acqua priva di nucleasi.
    NOTA: A / rapporto A260 280 del ~ 1.8 significa DNA puro. Considerare l'utilizzo di un kit commerciale (basato su matrice legante a base di silice) per purificare il DNA plasmidico da utilizzare per l'iniezione. Plasmid DNA deve essere di alta qualità per prevenire la tossicità.
  4. Preparare 10 ml di iniezione-mix mediante la combinazione di DNA (da 0,5 a 2,5 ml di una / magazzino ml 100 ng per una concentrazione finale di 5 a 20 ng / ml), la soluzione di Danieau (0,33 ml di 30x magazzino), rosso fenolo (0,25 ml, acqua opzionale) e priva di nucleasi per un volume totale 10 ml.
    NOTA: empiricamente determinare la concentrazione di DNA che produce espressione adatto. conducente GAL4 e plasmidi reporter UAS devono essere co-iniettato. Nessuna espressione risulterà quando solo il conducente GAL4 UAS o giornalista plasmide viene iniettato nella wild-type uova fecondate. Se invece tha fecondato le uova sono da una linea conducente GAL4 poi l'iniezione di uno o più plasmidi UAS giornalista sufficiente rilevare. Viceversa, se microinjecting in una linea giornalista UAS, solo il driver plasmide GAL4 deve essere iniettato. Infine, mentre rosso fenolo può aiutare molto a visualizzare iniezioni, è anche un composto fluorescente stessa. Pertanto, fenolo rosso potrebbe oscurare PQ visualizzando se l'imaging è previsto prima di 24 ore dopo la fecondazione (HPF), in quanto non può essere sufficientemente diluito da questo momento.
  5. La sera prima iniezioni sono in programma, istituito diverse paia (in genere da 5 a 10), di sesso maschile e femminile zebrafish per la riproduzione. Utilizzare vasche di allevamento con un inserto contenente un fondo a griglia ed un partitore rimovibile per separare il maschio e pesce femmina.
    NOTA: maschio e femmina zebrafish possono generalmente essere distinguono per la loro forma del corpo. I maschi tendono ad essere magro mentre le femmine tendono a mostrare un addome ventrale sporgente. I maschi inoltre tendono ad avere una col giallo-rossooring sulla loro zona addominale ventrale.
  6. Immediatamente prima iniezioni DNA, rimuovere i divisori per consentire il maschio e femmina per accoppiarsi. Circa 15 a 30 minuti dopo aver rimosso il divisore, controllare le uova sul fondo del serbatoio. Trasferire il pesce adulto utilizzando una rete da pesca di un nuovo serbatoio di allevamento.
  7. Versare l'acqua, contenente le uova fecondate appena stabilite, fuori dalla vasca di riproduzione in un setaccio (ad esempio, una plastica tè colino). Lavare le uova nel setaccio utilizzando uno spray contenente la soluzione di Danieau. Invertire il setaccio su una capsula di Petri e utilizzare un flacone spray con una soluzione di Danieau di recuperare tutte le uova (in genere da 50 a 200 uova per allevamento coppia di pesci adulti).
  8. Usando una pipetta microloader, back-riempire una capillare iniezione tirato con il DNA di iniezione-mix. Montare la capillare iniezione nel supporto di un micromanipolatore e tagliare la punta, sotto il controllo visivo di uno stereomicroscopio, con pinze per creare una micropipetta che può penetrate il corion e citoplasma cellulare pur essendo in grado di fornire un adeguato volume di DNA.
    NOTA: Il grado in cui viene tagliata la punta del capillare di iniezione deve essere determinato empiricamente e può essere meglio giudicato quando si inietta le uova.
  9. Per determinare il volume di DNA iniettabile, scaricare una goccia della soluzione iniettabile in olio minerale. Misurare il raggio (r) della goccia con un micrometro calibrazione e calcolare il volume (4/3 π R 3). Modulare il volume regolando la pressione di iniezione e / o la durata di ciascun impulso di iniezione.
  10. Usando una pipetta di plastica, trasferire tutti gli uova raccolte (tipicamente 50-200, dal 2,7 al di sopra) nelle trincee di una camera di microiniezione. Sotto il controllo visivo di uno stereomicroscopio, usare il forcipe per orientare le uova in modo che il citoplasma della cellula (trasparente) e tuorlo (denso, non trasparente) possono essere facilmente identificati.
  11. Sotto il controllo visivo di un impianto stereomicroscopio, iniettare DNA nel citoplasma delle cellule dell'uovo fecondato, avendo cura di assicurare che il volume iniettato (da 1 a 2 nl) corrisponde a circa il 10% del volume della cella.
    NOTA: rosso fenolo nei aiuti soluzione DNA nella visualizzazione del volume iniettato.
  12. Dopo l'iniezione, allentare le uova da trincee dello stampo ad iniezione da vampate di calore con un flacone spray contenente la soluzione di Danieau. Successivamente trasferire le uova in una capsula di Petri fresco con una pipetta di trasferimento di plastica e mantenere in un incubatore a 28.5 o.
  13. Mantenere le uova non-iniettato come controlli per determinare se le iniezioni contribuiscono ad alti tassi di mortalità, sia a causa di danni fisici subiti durante la penetrazione micropipetta o il mix di DNA.
    NOTA: Gli alti tassi di mortalità dopo iniezioni potrebbe essere a causa di numerosi fattori, tra cui i volumi di concentramento o di iniezione eccessivamente alto DNA e / o plasmidi con contaminazionenti. Per prevenire la tossicità da preparazioni di DNA di bassa qualità, kit commerciale (basato su matrice legante a base di silice) possono essere utilizzati.
  14. A intervalli regolari seguenti iniezioni, usare uno stereomicroscopio per lo screening per le uova non fecondate ed embrioni morti o malformati e scartare questi.
    NOTA: ritengono le uova che sembrano essere in fase di una cella parecchie ore dopo la fecondazione, come non fecondato. Identificare embrioni malformati di difetti anatomici lordi come un compromesso assi antero-posteriore del corpo. materiale amorfo all'interno di un chorion suggerisce che l'embrione non ha proceduto attraverso fasi di sviluppo ed è morto. Per accertare se gli embrioni che sono stati microiniezione subiscono un normale corso di sviluppo consultare atlanti anatomici 37.
  15. Trasferire gli embrioni utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica per la soluzione di Danieau contenente 1x 1-fenil 2-tiourea (1xPTU) tra 10 e 24 HPF per prevenire la formazione del pigmento. Mantenere gli embrioni in soluzione continua di Danieauaining PTU per la durata dell'esperimento.
    NOTA: Oltre a melanofore, iridofore sulla superficie della pelle può essere problematico per l'imaging. Mentre PTU non inibisce iridophore formazione, esistono linee mutanti con un numero ridotto di iridofore come Roy Orbison (roy) e possono essere utilizzati 38.
  16. Dopo botola embrioni (di solito il secondo o terzo giorno dopo la fecondazione, 2 o 3 DPF), eliminare le chorions e scambiare la soluzione del Danieau contenente PTU.
    NOTA: Questi passaggi sono importanti per garantire la qualità del mezzo embrione e la vitalità degli embrioni sani.

3. Generare stabili linee transgeniche

NOTA: Stabile linee transgeniche possono essere generati in modo efficiente utilizzando il sistema di trasposoni Tol2. Un Tol2 trasposoni vettore contenente il transgene di interesse è co-iniettata con mRNA che codifica per l'enzima trasposasi in fertilizzared uova in fase di una cella. Proteine ​​trasposasi derivato dal mRNA iniettato catalizza la escissione della cassetta transgene dal vettore trasposone e la sua integrazione nel genoma 39.

  1. Clonare il reporter cassetta transgene (ad esempio, UAS: mitoCFP) tra Tol2 invertito ripetizioni terminali in uno dei vettori Tol2 attualmente in uso nella comunità zebrafish come descritto 40.
    NOTA: vettori Tol2 contenenti una cassetta selezionabile in cui elementi promotori guidano espressione FP in organi estranei alla zona di interesse (ad esempio, il cuore 41 o lente 42) sono utili per lo screening linee transgeniche UAS giornalista in assenza di GAL4 transattivazione.
  2. Utilizzando un kit commerciale (basato su matrice legante a base di silice), purificare il DNA plasmidico da utilizzare per l'iniezione. Assicurarsi che il DNA plasmide è di alta qualità per prevenire la tossicità.
  3. Trascrivere Tol2 mRNA trasposasi-codifica usando unappropriata vettore di trascrizione come PC-TP 43. In breve, linearizzare PCS-TP e utilizzare un kit commerciale per generare capped mRNA e seguire il protocollo del produttore. Fare attenzione ad evitare la contaminazione con RNasi (ad esempio, utilizzare RNase-free puntali e tubi). Aliquotare l'RNA, ad una concentrazione di 100 ng / ml, monouso e conservare a -80 ° C.
  4. La mattina delle iniezioni, scongelare un'aliquota di trasposasi mRNA sul ghiaccio. Mescolare il vettore trasposone DNA (2 ml di 100 ng / ml) e trasposasi mRNA (2 ml di 100 ng / ml) in un rapporto 1: 1, e aggiungere 6 ml di acqua RNase-free per portare il volume totale a 10μl.
    NOTA: Una concentrazione di 20 ng / ml è raccomandato per ciascuno ma la concentrazione ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente. Utilizzare acqua RNasi-free per la diluizione. Utilizzare guanti durante la manipolazione del mix di iniezione di DNA-RNA e tenerlo in ghiaccio per tutto il periodo di iniezioni per prevenire il degrado del mRNA.
  5. Utilizzando le istruzioni dettagliate al precedente punto 2, iniettare il mix di iniezione di DNA-RNA in uova fecondate allo stadio unicellulare. Sotto il controllo visivo di uno stereomicroscopio bersaglio il citoplasma della cellula allo stadio unicellulare per i più alti tassi di efficienza transgenesi. Mantenere gli embrioni iniettati a 28,5 ° C fino al momento di screening di espressione del transgene.
    NOTA: PCR può essere fatto per verificare l'efficienza del trasposasi Tol2 come descritto in precedenza 44.
  6. embrioni schermo in una capsula di Petri per transgenesi usando gli oculari di un microscopio a fluorescenza dissezione.
    NOTA: Utilizzare i set di filtri appropriati del microscopio di visualizzare FP espressione della cassetta selezionabile (vale a dire, la fluorescenza nel cuore o l'obiettivo) a 2 o 3 dpf. Identificare i potenziali embrioni transgenici con espressione (nel cuore o l'obiettivo) e sollevare questi embrioni fino all'età adulta (F 0 generazione) utilizzando le normaliprotocolli 45. In alternativa, identificare potenziali embrioni transgenici mediante PCR come descritto in 46.
  7. Una volta che il giornalista F UAS 0 pesci sono 2,5 - 3 mesi di età, li (vedi 2.5 per i dettagli) attraversare wild-type pesci non transgenici per acquisire le uova per stabilire una generazione F 1. In alternativa, attraversare il UAS giornalista F 0 pesce ad una linea conducente GAL4 di stabilire una generazione F 1. In quest'ultimo caso, il transgene UAS-driven può essere monitorato direttamente negli embrioni ottenuti dalla croce.
  8. Utilizzare una a fluorescenza dissezione microscopio per lo screening F 1 embrioni per l'espressione del transgene o cassetta selezionabile.
    NOTA: quando l'espressione viene confermato poi il transgene si può dire di essere trasmessa linea germinale. Transgenesi è non-mendeliana nella fase F 0. Il numero di embrioni che esprimono il transgene può variare da un piccolo numero alla stragrande maggioranza in clutche individualeS. Integrazione trasposoni in diversi F 0 pesce può variare notevolmente, con conseguente diversi pattern di espressione. Quindi mantenere la F 1 pesci provenienti da diverse F 0 fondatori come sub-linee separate. Integrazioni trasposoni in F 1 pesci sono stabili e sono passati alle generazioni successive in modo mendeliana.
  9. Mantenere ogni F 0 pesci in serbatoi separati di ri-identificare i portatori transgene.

4. Preparare embrioni per l'imaging su un microscopio verticale

NOTA: Le procedure descritte qui sono stati ottimizzati per l'imaging su microscopi in posizione verticale con lungo lavoro obiettivi a distanza acqua-immersione-cono.

  1. Utilizzare una a fluorescenza dissezione microscopio per lo screening degli embrioni per l'espressione del transgene.
    NOTA: Espressione di un reporter transgene UAS dipenderà dalla specifica linea conducente GAL4 utilizzata. Selezionare gli embrioni per esperimenti di imaging basate su exp desideratomodello ression.
  2. Trasferire gli embrioni selezionati con una pipetta di plastica per una capsula di Petri separata contenente tampone di Danieau con 1x PTU e 1x Tricaine.
    NOTA: quando l'etichettatura è scarsa (solo poche cellule in un sistema di organo) montare gli embrioni in agarosio (vedi 4,3-4,7 sotto) e schermo per l'espressione del transgene utilizzando un microscopio a livello di campo con obiettivi ad alto ingrandimento (vedi 5.1 sotto). Tricaine anestetizza il pesce e dovrebbe essere efficace in pochi secondi. Se il pesce non sono immobilizzati è probabile che il Tricaine ha degradato. Possibili cause di questo degrado sono la cattiva conservazione dei Tricaine, che è sensibile alla luce 47.
  3. Preparare la agarosio per incorporare il pesce sciogliendo bassofondente polvere agarosio in tampone di Danieau ad una concentrazione finale dello 0,7%. Aliquota (1 ml) e tenere in un calore blocco a 40 ° C fino al momento dell'uso.
    NOTA: Higher concentrationi di agarosio (fino a 1,5%) può anche essere utilizzato per incorporare i pesci.
  4. Aggiungere 50 ml di un 20x magazzino di Tricaine e 20 ml di una soluzione 50x magazzino di PTU al 1 ml aliquota di basso punto di fusione agarosio e mescolare bene toccando il lato del tubo. Ritorna il tubo al calore-blocco. Usando una pipetta di trasferimento di plastica, Pipetta delicatamente un paio di (1-10) embrioni anestetizzati in agarosio, trasferendo il meno liquido possibile per evitare di diluire l'agarosio.
  5. Usando una pipetta di trasferimento di plastica tutti gli embrioni con una piccola quantità di agarosio ad un fondo di vetro piatto di petri.
  6. Lavorando relativamente veloce, utilizzare pinze per posizionare gli embrioni nell'orientamento desiderato, a seconda della struttura da acquisire.
    NOTA: gli embrioni Orient dalla loro parte se la retina o ROHON-Barba (RB) neuroni sensoriali dovrebbero essere ripreso.
  7. Lasciare che il agarosio solidificare per almeno 15 minuti. Aggiungere tampone di Danieau contenente 1xPTU e 1xTricaine per coprire gli embrioni incorporati in AgaroSE. Porre la capsula contenente gli embrioni di agarosio-embedded in un incubatore a 28,5 ° C fino al momento di immagine.

5. imaging cellulare e subcellulare strutture usando Wide-field o Microscopia confocale

NOTA: Wide-field microscopia e punto-a scansione microscopia confocale sono le modalità più utilizzate per l'immagine embrioni di zebrafish fluorescente La tabella 1 riassume i principali vantaggi e svantaggi di entrambi i sistemi.. Per entrambe le forme di microscopia, embrioni sono montati in agarosio come descritto nel precedente punto 4, e mantenuta a 28,5 ° C per tutto l'esperimento di imaging utilizzando una camera di riscaldamento sul palco del microscopio. È importante sottolineare che il piatto con embrioni di agarosio-embedded è lasciato equilibrare al 28,5 ° C prima di imaging inizia come variazioni di temperatura provocano la deriva nella Z-dimensione. Nel condurre esperimenti di imaging a lungo termine (oltre Several ore), posizionare un coperchio in plexiglas sulla piastra di Petri per ridurre l'evaporazione del buffer.

Ampio campo Point-confocale a scansione
Costo Relativamente poco caro Costoso (circa. 5x più)
Photo-candeggio Basso Alto. Il campione è esposto alla luce laser sopra e sotto il piano focale.
Photo-tossicità Basso Alta (vedi foto-sbiancamento sopra)
velocità di acquisizione Veloce Lento
Risoluzione in xy La legge di Abbe legge di Abbe (può essere migliorata app 40% utilizzando un piccolo foro di spillo,. tuttavia,la maggior parte delle impostazioni di questo ha poco applicazione pratica)
sezionamento ottico Povero Sì (può essere regolata in base alle dimensioni pinhole)
penetrazione nel tessuto Limitato a strutture superficiali (ad esempio, ROHON-Barba cellule o fibre muscolari) Limitatamente alle <100 mm dalla superficie dell'embrione

Tabella 1. confronto generale di tutto il settore e il punto di scansione microscopia confocale

  1. Microscopia Wide-field
    NOTA: Qui linee guida sono previste per l'imaging embrioni di zebrafish utilizzando un montante del microscopio a livello di campo con lunga lavorazione obiettivi a distanza acqua-immersione-cono. Il microscopio è dotato di una camera CCD raffreddata, e set di filtri per la visualizzazione differenti fluorofori montato su una ruota filtro automatico per una rapida acquisizione di più canali.Acquisizione delle immagini è controllata da μManager, un pacchetto software open microscopia fonte 48. Un esempio specifico per l'imaging mitocondri nei neuroni sensoriali RB è fornito. Cellule RB sono geneticamente etichettati utilizzando membrana mirati YFP ed i loro mitocondri sono CFP-targhetta (vedi punto 1.1).
    1. Embrioni Mount dalla loro parte in basso punto di fusione agarosio come descritto in 4 di cui sopra.
    2. Lasciare che il piatto con il pesce montato equilibrare a 28,5 ° C in una camera di riscaldamento sul palco del microscopio prima di iniziare l'imaging.
    3. Utilizzare un obiettivo di acqua-immersione-cono basso ingrandimento e guardare attraverso gli oculari del microscopio a scegliere una zona sulla superficie dell'embrione all'immagine.
      NOTA: Se la linea transgenica MitoFish giornalista stabile, Tg (UAS-E1b: PFP, mitoCFP) mde6, viene utilizzato in combinazione con una linea pilota come HuC: GAL4 poi i neuroni più RB sono etichettati, e appaiono come una fitta mesh-lavoro di gazebo neuriti sulla superficie dell'embrione. Se la microiniezione di DNA costrutti viene utilizzato per ottenere l'etichettatura sparse (ad esempio, sensoriale: GAL4-VP16 con UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP), embrioni schermo per identificare le cellule doppio marcato.
    4. Aprire il software microscopio (μManager 1.4) e cliccare su "Illuminazione '' in" Impostazioni di configurazione "per definire il set di filtri corretti per la lunghezza d'onda di interesse (YFP o CFP per l'esempio corrente). In" Impostazioni della fotocamera "inserire il tempo di esposizione richiesto per acquisire un'immagine adatta.
      NOTA: Le "Impostazioni Illuminazione" è pre-impostato dall'utente al momento dell'installazione del software e viene caricato durante l'apertura μManager. Se il software non è configurato per controllare la ruota del filtro, spostare manualmente la ruota del filtro nella torretta nella posizione appropriata.
    5. Passare a un obiettivo di acqua-immersione-cono distanza lungo lavoro che vanno da 40-100x ingrandimento. sceglierel'obiettivo che ha la più alta apertura numerica (NA) e viene cromaticamente corretto (apochromat).
    6. Clicca su "live" scegliere il campo visivo: Nel caso del neurone RB, immagine Trasporto mitocondriale al assone stelo, emana dal corpo cellulare, o nel mozzo periferico.
      NOTA: I mandrini periferici dei neuroni RB in piega pinna caudale dell'embrione forniscono un'opportunità ideale per un'immagine di grande campo di vista che è piatta e può dunque essere catturato su un singolo fotogramma con un microscopio a grande campo. È quindi importante montare l'embrione come categoricamente possibile su un lato, in modo che la piega caudale è parallela al fondo della capsula di Petri.
    7. Dopo aver scelto un campo di vista, fare clic sul pulsante "selezione rettangolare" nel menu ImageJ, definire una regione di interesse (ROI) e cliccare su "ROI" nella finestra μManager. Dopo aver selezionato il ROI per l'imaging, fai clic su "Stop" e "Salva" per take un'immagine del canale YFP per registrare la morfologia locale del neurite / s.
    8. Per un'immagine di trasporto mitocondriale cliccare su "Multi-D Acq." pulsante. Osservare una finestra aggiuntiva ( "Multi-dimensional Acquisizione") e selezionare il numero di punti temporali e l'intervallo tra punti temporali in questa finestra. Utilizzare frame rate di 0,3-1 Hz. Effettuare le registrazioni per almeno 10 minuti per raccogliere il maggior numero punti di dati possibile.
    9. Nella finestra "multi-dimensionale di acquisizione", cliccare su "Canali", aggiungere e definire la lunghezza d'onda per l'imaging (PCP per mitocondri in questo esempio) e il tempo di esposizione. Mantenere tempi di esposizione al di sotto di 400 msec per l'imaging del trasporto mitocondriale.
    10. Fare clic sull'opzione "Save Images" nella finestra "multi-dimensionale di acquisizione", per salvare automaticamente i file in una cartella specifica indicato nella 'root directory'. Clicca su "Acquisisci" nell'angolo in alto a destra per iniziare timl'imaging e-lapse.
    11. regolare manualmente la messa a fuoco durante la registrazione time-lapse per compensare qualsiasi deriva nella dimensione z.
      NOTA: L'utilizzo di questi parametri trasporto mitocondriale nei neuroni RB possono essere esposte per tutto il tempo di 4 ore.
  2. microscopia confocale
    NOTA: Qui vengono fornite linee guida per l'imaging con un montante Olympus FV1000 microscopio confocale e gli obiettivi di acqua-immersione-cono a distanza lungo lavoro. Il microscopio è dotato di più linee laser e più rivelatori (PMT convenzionali e rilevatori di arseniuro di gallio fosfuro più sensibili) che permettono per l'imaging multicanale. si fa riferimento specifico al software Olympus Fluoview. Tuttavia, i parametri di imaging qui descritte dovrebbero essere facilmente trasferibile ad altri sistemi confocale.
    1. Montare embrioni in bassofondente agarosio in un orientamento appropriato per l'organo / struttura da essere ripreso, come descritto sopra 4.
    2. ° C in una camera di riscaldamento sul palco del microscopio prima di iniziare l'imaging.
    3. Utilizzare distanza lungo lavoro obiettivi acqua-immersione-cono per microscopi confocale in una configurazione verticale. Scegliere obiettivi con il più alto possibile NA per massimizzare la quantità di segnali fluorescenti che possono essere raccolti e il potere migliore risoluzione. Quando si raccolgono le immagini provenienti da più canali di scegliere obiettivi cromaticamente corrette (Apocromatici).
    4. Aprire il software del microscopio e clicca su "Trans lampada" o "Epi lampada" per utilizzare la luce trasmessa o fluorescenza, rispettivamente, per identificare la regione di interesse attraverso gli oculari del microscopio.
    5. Utilizzare il software per impostare i seguenti parametri di scansione per acquisire pile di immagini:
      1. Nella finestra "Acquisition Setting" verificare che l'obiettivo prescelto per l'imaging corrisponde l'obiettivo che appare sul drop-Dowmenù n degli obiettivi disponibili.
        NOTA: Questo è quello di garantire che tutti i parametri pre-calcolato per un particolare obiettivo (e la risoluzione assiale ad esempio, laterali, dimensione del confocale dell'apertura etc.) valgono e possono essere utilizzati in modo affidabile.
      2. Selezionare i filtri appropriati linea laser / s, e di eccitazione e dicroiche emissione di immagine proteina fluorescente specifico (s). A tale scopo, fare clic sul pulsante "lista Dye" nella finestra "Image Acquisition Control" e scegliere l'appropriata fluoroforo / s. In alternativa, cliccare sul pulsante "percorso chiaro e coloranti" per impostare manualmente questi parametri.
        NOTA: Quando l'opzione tasto "Dye List" viene scelto, il software seleziona automaticamente i filtri dicroici linee laser, eccitazione e di emissione appropriati e regola la dimensione dell'apertura confocale appropriato.
      3. Nella finestra "Acquisizione Setting", regolare il fattore di "zoom" e "Formato aspect rapporto "(vale a dire, 512x512, 1024x1024 etc.) dell'immagine acquisita per ottenere la dimensione dei pixel necessaria per risolvere al meglio le strutture viene esposta. Impostare la dimensione dei pixel di essere circa la metà della risoluzione teorica dell'obiettivo, quindi secondo criteri di campionamento di Nyquist . per determinare la dimensione in pixel dell'immagine acquisita Fare clic sul pulsante con il simbolo di informazioni ( "i") nella finestra "acquisizione di immagini di controllo".
      4. Impostare la velocità di scansione per il più veloce possibile (2 ms / pixel) nella finestra "Acquisizione Setting".
      5. Nel "Acquisizione di immagini di controllo" finestra clicca su Kalman linea media per ridurre il fattore noise.A di 2 a 3 di solito sufficiente.
      6. Selezionare una modalità di scansione sequenziale in cui l'imaging fluorofori con sovrapposizione spettri. Per fare ciò, clicca su "sequenziale" e "Line" nella finestra "Acquisizione di immagini di controllo".
      7. Regolare la potenza delle pertinenti linea laser / s (tipicamentesotto del 5%). I valori specifici devono essere determinati empiricamente.
      8. Fare clic sul pulsante "XY Ripeti" o la "Focus x2" o "Focus x4" per eseguire la scansione continuamente la regione selezionata durante la regolazione delle impostazioni del rivelatore per ogni canale. Regolare "HV", "Gain" e "Offset" per ogni canale di acquisire immagini che hanno la più alta gamma dinamica di valori di grigio.
        NOTA: I valori specifici per queste impostazioni devono essere determinati empiricamente. "HV" regola la tensione sul rivelatore di cambiare la sua sensibilità, "offset" regola il segnale di uscita del rivelatore e "Gain 'moltiplica il segnale di uscita del rivelatore per un fattore costante.
      9. Premere Ctrl + H per visualizzare le immagini acquisite tramite una tabella di look-up (Hilo) che identifica in-saturi (appaiono blu) e oltre saturi pixel (appare rosso), entrambi i quali deve essere generalmente evitato. Rivalutare la potenza del laser rilevante line / s e le impostazioni del rivelatore.
        NOTA: L'utilizzo ad alta potenza del laser e un alto livello di "HV" del rivelatore porterà a più segnali. Maggiore potenza del laser sarà comunque portare ad un aumento candeggio e foto-tossicità. L'aumento del "HV" porterà ad un aumento del rumore. Pertanto, un compromesso deve essere trovato quando si imposta la potenza del laser e "HV" per acquisire le immagini con livelli accettabili di rumore evitando foto-danni (vedi anche tabella 1).
      10. Raccogliere immagini da un volume definito concentrandosi sui limiti superiore e inferiore della zona di interesse. Nella "Acquisizione Impostazione" finestra clicca sui pulsanti "Fine Set" e "Start Set" insieme di finestra z-stack ai limiti superiore ed inferiore del volume da acquisire. Selezionare una dimensione passo che è la metà della Z-risoluzione per il dato oggettivo (ad es., Se la risoluzione z è 2 micron scegliere 1 micron). Per determinare la z risoluzione del d'obbiettivoe fare clic sul pulsante con il simbolo di informazioni ( "i") nella finestra "Acquisizione di immagini di controllo".
      11. Impostare una serie tempo per raccogliere z-stack a una frequenza temporale che è appropriato per la dinamica della struttura subcellulare di essere ripreso. Nella sotto-finestra "TimeScan" inserire la frequenza con cui z-stack devono essere acquisiti ( "Intervallo" ') e il numero di volte che le immagini dovrebbero essere acquisite ( "Numeri").
      12. Fare clic sui pulsanti "Time" "profondità" e nella finestra "Acquisizione di immagini di controllo" per confermare che un z-stack e time-series saranno acquisite. Infine, fare clic sul pulsante "XYZT" per iniziare l'acquisizione di immagini time-lapse.
      13. Dopo il completamento di acquisizione delle immagini, osservare "Serie Fatto" sull'interfaccia del software. Fare clic su di esso e salvare le immagini in formato "OIB" per registrare le immagini ei metadati ad essi associati.
        Nota: le immagini ottenute sullain tutto il campo ottico e microscopio confocale possono essere visualizzati e analizzati utilizzando software come FIJI, un pubblico dominio programma di elaborazione di immagini gratuito.

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Representative Results

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Qui l'uso di tutto il campo e microscopia confocale a mitocondri immagini e centrosomi in embrioni di zebrafish vivente è direttamente confrontato e contrapposto. A seconda della posizione delle cellule in cui dinamiche organelli devono essere esaminate e la frequenza intrinseca degli specifici eventi subcellulari, generalmente o grande campo o la microscopia confocale è la scelta migliore. Abbiamo ripreso organelli nei neuroni RB situati sulla superficie dell'embrione e in cellule retiniche situate più profondo. La posizione superficiale dei neuroni RB insieme ai loro due geometria bidimensionale li rende buoni candidati per essere ripreso sia a livello di campo e di microscopia confocale (Figura 2). Acquisizione immagini utilizzando la microscopia confocale è comunque significativamente più lento e può portare a una sottostima delle dinamiche di eventi subcellulari specifici (ad esempio, il movimento dei mitocondri, Figura 2C, D (Figura 3).

Per consentire la visualizzazione simultanea di organelli e delle membrane cellulari abbiamo usato il sistema GAL4-UAS in tre diverse configurazioni. In primo luogo, la linea giornalista UAS MitoFish Tg (UAS-E1b: PFP, mitoCFP) è stato utilizzato mde6. Qui, un UAS bidirezionale permette l'espressione contemporanea di CFP mitocondri mirati e membrana mirata YFP. In combinazione con adeguate linee conducente GAL4, MitoFish etichettare i mitocondri delle cellule e membrane dei neuroni sensoriali RB (Figura 2A-C) o cellule della retina (Figura 3A, B) con CFP e YFP r espectively. In secondo luogo, due SUP costruisce (UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP) sono stati combinati con un driver costrutto GAL4 (sensoriale: GAL4-VP16, sensoriali specifici neuroni elementi enhancer dal isolotto-1 gene) 7 in iniezioni transitori. L'espressione mosaico che in genere il risultato di queste iniezioni consentita la tracciabilità delle singole cellule nel corso del giorno (Figura 2E). Un terzo approccio impiegato l'uso di due cassette UAS, ogni guida l'espressione di una proteina di fusione differenti, su un singolo costrutto contigua. Questa strategia è stata utilizzata per generare CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) tum1, in cui una fusione centrin4-YFP etichette centrosomi e Cerulean si rivolge a membrane cellulari. In combinazione con specifiche linee conducente GAL4 i centrosomi e le membrane cellulari delle cellule della retina (Figura 3C, D) o fibre muscolari (Figura 4) sono etichettati.

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Figura 2: Imaging mitocondri in vivo nei neuroni sensoriali RB di zebrafish embrionale.
Neuroni sensoriali RB nella parte caudale della piega pinna di 2 DPF MitoFish sono stati ripresi utilizzando un apocromatico obiettivo 40x acqua-immersione-cono con un NA di 0,80, sia per tutto il campo (A) o la microscopia confocale (B). I pannelli a destra spettacolo particolare della regione delineato. C Wide-field immagini time-lapse di una piccola regione di interesse nel pergolato periferica di un neurone RB in 2 DPF MitoFish. Il movimento di un singolo mitocondrio (freccia in 0 '') è stato monitorato oltre 100 sec; Vengono visualizzati sei punti temporali. La posizione del mitocondrio nel time-point precedente è descritto in magenta. D La posizione del mitocondrio muoversi in C E le immagini confocale di un neurone sensitivo RB a 2 e 3 dpf. Labeling di cellule individuali RB e loro mitocondri è stato ottenuto mediante co-iniezione di un driver GAL4 sensoriale neurone-specifica costruire insieme a due costrutti reporter UAS, UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP, allo stadio unicellulare e screening di isolati doppia cellule -labeled. L'immagine è invertita contrasto e singoli mitocondri sono raffigurati schematicamente come punti magenta. Scala grafica A, B 20 micron, C 2 micron,E 50 micron. Mitocondrialmente mirata CFP (mitoCFP), membrana mirata YFP (MA-YFP). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Confronto tra largo campo e microscopia confocale a organelli immagine in vivo nella retina zebrafish embrionale.
Otx2 elementi promotori guidare l'espressione di PCP nei mitocondri e YFP nelle membrane cellulari (A e B) o YFP in centrosomi e Cerulean nelle membrane cellulari (C e D) nella retina di 2 dpf zebrafish embrioni. Per realizzare questo modello di etichettatura, Otx2: pesci transgenici GAL4 erano o incrociate per MitoFish (A e B) or CentrinFish (C e D). Un obiettivo apochromat 40x acqua-immersione-cono (NA 0,80) è stato utilizzato per acquisire immagini della stessa regione in ciascuna retina utilizzando largo campo (A, C) e confocale (B, D) microscopia. Inserti in A e B mostrano dettaglio di una regione dello strato nucleare interno, inserti in C e D mostrano una cella in fase M. barra della scala 20 micron. Mitocondri mirati CFP (mitoCFP), membrana mirata YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), membrana mirata Cerulean (MA-Cerulean). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Confronto tra largo campo e microsc confocaleopy di centrosomi immagine in vivo.
Una singola fibra muscolare con fluorescente contrassegnati membrane cellulari e centrosomi (Otx2: GAL4; CentrinFish) è stato ripreso con largo campo (A) e la microscopia confocale (B). In entrambi i casi è stato utilizzato un obiettivo apochromat 40x acqua-immersione-cono (NA 0,80). barra della scala 10 micron. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), membrana mirata Cerulean (MA-Cerulean) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Qui, dimostriamo la versatilità del sistema di espressione GAL4-UAS ai mitocondri tag fluorescenza, centrosomi e le membrane cellulari del specifici tipi di cellule in vivo in embrioni di zebrafish. Molte proteine ​​di fusione fluorescenti che etichettano altri organelli o strutture subcellulari si possono trovare nella letteratura pubblicata e possono essere ottenuti dal rispettivo laboratorio, fonti commerciali o depositari plasmide non commerciali (ad esempio, Addgene). Per progettare una nuova proteina di fusione fluorescente, diversi parametri devono essere considerati, compresi che FP utilizzare e se fondere PF al ammino o carbossi terminale della proteina di interesse. Per una discussione più approfondita sulla generazione di proteine ​​di fusione fluorescenti, si rimanda agli articoli di approfondimento sul tema 49-51.

Evidenziamo tre strategie per il raggiungimento di co-espressione di proteine ​​di fusione con transgeni UAS-driven. Multipla, separate UAS costrutti reporter permettono di combinare diversi giornalista esistente costruisce senza la necessità di clonazione aggiuntivo. livelli di espressione Reporter possono essere titolati in modo indipendente. Tuttavia, i livelli più elevati di co-espressione si ottengono quando si utilizzano sia più cassette UAS o una cassetta UAS bidirezionale su un unico costrutto. Poiché PQ sono usati come tag è relativamente facile verificare co-espressione. Va notato che esistono anche altri metodi per l'espressione multi-cistronic, compreso l'uso di siti di entrata ribosomali interne 40 e peptidi virali 2A 52,53. In alternativa alla costrutti basati DNA, trascritto in vitro capped mRNA può essere usato per esprimere proteine ​​di fusione fluorescenti di etichettare strutture subcellulari 1,4,8. L'avvertimento di questo approccio è tuttavia che l'espressione è limitata ai primi giorni di sviluppo e non è cellula o tessuto specifico. Indipendentemente dal metodo scelto per esprimere proteine ​​di fusione, è fondamentaleper assicurare che i livelli di espressione non portano a marcatura non specifica e compromettono lo stato fisiologico delle cellule. A questo proposito, l'amplificazione di espressione del gene reporter inerente al sistema GAL4 UAS-27 può essere problematico, manifesta per esempio come etichettatura citosolica anche quando la FP si rivolge ad un organello specifico. Quando disponibili, gli anticorpi dovrebbero essere usati per verificare che i pattern di espressione ottenuti da proteine ​​di fusione riflettono la situazione endogena. In alcuni casi, l'iniezione di concentrazioni (er) DNA bassi possa attenuare il problema di mis-localizzazione della proteina di fusione. In alternativa, vettori con un basso numero di ripetizioni SUP potrebbe aiutare per titolare i livelli di espressione del transgene 30. Allo stesso modo, per l'attivatore GAL4-VP16, esistono versioni modificate, che sono segnalato per guidare l'espressione relativamente debole e sono quindi meno tossici 30,33. Se mis-localizzazione della proteina di fusione persiste nonostante gli sforzi per titolare Down livelli di espressione del transgene, può essere necessario rinunciare al sistema di GAL4-UAS e guidare l'espressione da elementi promotori direttamente.

Le linee transgeniche stabili, MitoFish 10 e CentrinFish 12, si descrivono in questo manoscritto sono state fatte utilizzando cassette 14xUAS. Manteniamo queste linee sullo sfondo di linee conducente GAL4 per rilevare le alterazioni nell'espressione di generazione in generazione, dal momento che le linee giornalista con più ripetizioni UAS sono stati segnalati per essere incline a tacere 54. Non abbiamo visto prove di mettere a tacere nel corso dei 3 generazioni abbiamo propagate il CentrinFish. Abbiamo però visto l'espressione variegata in MitoFish e quindi rigorosamente selezionare gli embrioni con 'pieni', forti livelli di espressione di propagarsi per le generazioni future. La letteratura corrente suggerisce che vettori di espressione con repliche 5xUAS potrebbe essere un'alternativa per la generazione di linee transgeniche stabili - il giornalista èspinto a livelli abbastanza alti 30 e il numero relativamente basso di UAS ripete può rendere meno soggetto a transgene silenziamento, anche se ripete UAS non ripetitive sono riferito ancora meno sensibili 54.

La tavolozza dei PQ attualmente disponibile per organelli tag o altre strutture subcellulari è molto ampia 55. Quando si sceglie un particolare FP come tag, occorre tenere in considerazione i seguenti parametri: in primo luogo, l'eccitazione ed emissione spettri della FP per determinare la linea laser specifico, nonché i filtri di eccitazione ed emissione necessarie per la sua visualizzazione. In secondo luogo, la luminosità e la foto-stabilità della FP. In terzo luogo, la velocità con cui la FP matura definizione seguente. In quarto luogo, se la FP ha la tendenza ad aggregarsi in fusioni. Per quanto riguarda l'ultimo parametro, la cura dovrebbe essere esercitata ed esperimenti di controllo dovrebbe essere fatto per testare l'idoneità di ogni FP per esperimenti specifici. Ad esempio, mentre il red PQ mCherry e DsRed sono ampiamente utilizzati, hanno riferito formano aggregati in alcune fusioni 56. Abbiamo trovato TagRFP-T 57, un altro foto-stabile variante di TagRFP, per svolgere bene quando mirato ai mitocondri e le membrane cellulari (osservazioni non pubblicate). Quando più organelli devono essere contemporaneamente visualizzati, PQ con gli spettri non sovrapposizione dovrebbe essere usato. Abbiamo usato con successo combinazioni di ciano PQ (PCP e cerulea) e YFP (figure 2-4). Sfruttando l'intera gamma spettrale dal blu al vicino infrarosso, si può ampliare notevolmente il numero di strutture subcellulari che possono essere contemporaneamente visualizzabili 2. Oltre al convenzionale PQ, PQ foto-attivabili sono particolarmente utili per sondare le dinamiche organelli, ad esempio, l'uso della FP Kaede per monitorare il destino dei mitocondri individuale 58.

Quale tecnica di microscopia - a livello di campo o confocale - è il piùappropriata per l'imaging dipende da una serie di fattori, tra cui la posizione delle celle da acquisire e la velocità con cui si prevede eventi subcellulare o cellulari specifici a verificarsi. Wide-microscopia a campo è la modalità preferita in luoghi superficiali e campioni scarsamente etichettati. Offre bassa foto-tossicità e l'imaging ad alta velocità ad un prezzo ragionevole. Tuttavia, se l'imaging deve essere eseguita in parti non superficiali della zebrafish, in campioni densamente etichettati o per ottenere informazioni tridimensionali, confocale o un'altra forma di microscopia sezionamento ottico diventa il metodo di scelta.

Indipendentemente da quale struttura cellulare o subcellulare viene monitorato, vi è spesso un compromesso tra acquisire la migliore immagine possibile e mantenere vivo e in buone condizioni fisiologiche per l'imaging time-lapse ripetuto il campione. Photo-tossicità può manifestarsi come cambiamenti nel comportamento degli organelli, morfologia aberrante di cellule o addirittura cellularemorte. Chiave per ridurre fotometabolismo e foto-tossicità sia a livello di campo e di microscopia confocale è quello di utilizzare i più bassi livelli possibili di luce per acquisire le immagini. A questo proposito, obiettivi con il più alto possibile NA sono fondamentali per massimizzare la quantità di segnale fluorescente che possono essere raccolti. Per la microscopia confocale, un certo numero di parametri può essere regolato per compensare l'uso di potenza del laser inferiore. Rilevatori con maggiore efficienza quantica rispetto ai PMT convenzionali, per esempio, rilevatori di fosfuro di arseniuro di gallio, può essere utilizzato per garantire che i fotoni emessi sono più probabilità di essere rilevato. In alternativa o in aggiunta, tensioni dinodi superiori possono essere applicati nella PMT per aumentare la sensibilità dei rivelatori. L'apertura confocale (foro di spillo) può essere aperto per consentire la raccolta del segnale di fluorescenza più, anche se con una perdita di risoluzione assiale. Per esporre i campioni meno luce possibile, l'acquisizione va eseguita a velocità tale che il tempo di permanenzail laser per pixel è basso. La scansione a risoluzione spaziale inferiore ha anche l'effetto di aumentare la velocità di scansione. Imaging ha meno frequentemente l'ulteriore vantaggio di esporre il campione meno luce, invece, va considerato solo se non compromette il campionamento completa dei processi studiati.

In alternativa, disco filatura microscopio confocale, microscopi confocali che sono dotati di un cosiddetto scanner 'risonante' offrono la possibilità per la scansione veloce. Entrambe le modalità hanno il vantaggio che essi sono più veloci e meno foto-tossico di microscopi confocali, point-scansione "classica '. Tuttavia, a disco filatura microscopio confocale sono più limitate a z-risoluzione e non possono penetrare più profondamente nel tessuto come microscopi punto-confocale a scansione. Analogamente, l'applicazione di risonanza dello scanner confocale può essere limitato il tempo di permanenza molto breve pixel porterà a deterioramento della qualità dell'immagine che potrebbe,a sua volta, preclude la rilevazione di eventi sub-cellulare (per esempio, immagini binarie con ridotta segnale-rumore).

Infine, mentre a grande campo e confocale sono evidenziate qui, altre forme di microscopia ottica come due fotoni 59 e leggero fogli microscopia 60 potrebbe essere più appropriato per domande specifiche. microscopia a due fotoni è basata sull'eccitazione di un fluoroforo dall'assorbimento simultaneo di due fotoni nell'infrarosso dello spettro luminoso. In comune con la microscopia confocale, utilizza scansione punto di acquisire immagini dal campione ed ha possibilità di sezionamento ottico in virtù della non-linearità della eccitazione a due fotoni. L'uso di luce lunga lunghezza d'onda per fluoroforo di eccitazione consente di imaging a profondità diverse centinaia di micron dalla superficie. Inoltre, la limitazione di eccitazione ad un piccolo volume di rilevamento impedisce fotometabolismo e fototossicità di fuori del piano focale. Tuttavia, non tutti FPs hanno elevato assorbimento multiphoton sezioni, un problema che è particolarmente diffusa in rosso PQ. Inoltre, trovare una singola lunghezza d'onda infrarossa per eccitare simultaneamente più PQ distinta è difficile, rendendo l'imaging multi-canale ingombrante. Luce fogli microscopia utilizza un sottile 'foglio' (tipicamente spessore variabile da 2 a 10 micron) di luce laser per eccitare il campione e rileva i segnali di fluorescenza di questo piano focale illuminato ad un angolo perpendicolare utilizzando una macchina fotografica sensibile. sezionamento ottico si ottiene illuminando un unico piano per volta. Questa restrizione della luce di eccitazione riduce il verificarsi di fototossicità. Dal momento che i segnali di fluorescenza da tutto il piano illuminato vengono raccolti simultaneamente, l'acquisizione delle immagini è significativamente più veloce di punto confocale a scansione e microscopi multiphoton. Tutte queste caratteristiche fanno luce fogli microscopio particolarmente adatto per l'imaging eventi cellulari dinamiche con alta risoluzione spazio-temporale ingrandi volumi di campioni vivi. Infatti, utilizzando la luce fogli destino della cellula al microscopio in tutta la zebrafish è stato ampiamente monitorata durante le prime 24 ore di sviluppo 61. Con continui miglioramenti al meglio 62,63 penetrazione delle immagini e risoluzione spaziale 64, è ipotizzabile che la luce della scheda microscopio verrà impiegato per sondare le dinamiche non solo al cellulare, ma anche a livello subcellulare in tutto embrioni di zebrafish.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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References

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Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish
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