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Developmental Biology

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

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in vivoイメージングでは 、ほとんどの生理的な文脈における細胞の挙動の直接可視化を提供します。ゼブラフィッシュの胚の透明性、その迅速かつ外部の開発と蛍光標識を可能にする遺伝子ツールの豊富なアレイは、すべてのキーの発達のイベントのダイナミクスを解明するためにin vivoでの顕微鏡の利用拡大に貢献しています。ゼブラフィッシュにおける神経系の発達のイメージング研究では、例えば大幅に神経前駆細胞の挙動とそれに続く遊走、分化および回路の集積1-8を含むそれらの子孫の運命の我々の知識を拡大しています。

ステージは、現在、これらの細胞の挙動の基礎となる細胞内動態を調査するために設定されています。確かに、ゼブラフィッシュは、既にin vivoでの細胞生物学のためのツールとして利用されています。ミトコンドリア9-11を可視化できるようになりました2,8,12-14を中心体、ゴルジ15、微小管4およびアクチン細胞骨格16、17エンドソームおよびin vivoでのゼブラフィッシュ胚における他の細胞内構造の中で、1,18頂端膜の構成成分の複雑な。これまでのところ、これらの細胞小器官の機能について知られていることの多くは、培養細胞中で彼らの行動を研究から来ています。 in vitro試験は、細胞生物学に多大な洞察が得られているが、培養中の細胞は、完全にin vivoでの状況の複雑さを表すものではありませんので、必ずしも生体内での細胞内小器官の機能とダイナミクスを反映するものではありません。ゼブラフィッシュの胚は、細胞内ダイナミクスを調べるためにインビボ代替中の生存を提供しています。

脊椎動物としては、ゼブラフィッシュは、哺乳動物種に見られるものと相同であり、多くの器官系( 例えば、神経網膜)を有します。さらに、ゼブラフィッシュの胚はますます人間の病気19,20をモデル化するために使用されています例えば、小頭21およびレーバー先天性黒内障22)とのミトコンドリア機能( 例えば、パーキンソン病23は 、10,24およびバルト症候群25タウオパチー)に関連するものを含む。細胞および細胞下レベルでのin vivoイメージングこれらの例では、これらの病理学的状態の根底にある細胞生物学のより良い理解を可能にします。

ここに記載された方法の全体的な目標は、 インビボでの光学顕微鏡用いゼブラフィッシュ胚における器官及び他の細胞内構造を調査するために総合的なガイドを提供することです。 in vivoでの細胞内構造を可視化し、追跡に関わる全体の作業の流れを説明する-遺伝的標識アプローチから、一時的に生成し発現させ、安定したトランスジェニック魚、そして最終的に広視野と共焦点顕微鏡を使用して画像化することに。これらのprocの各一方、eduresは、多数のゼブラフィッシュの研究室で使用されて、記載されているプロトコルは、最適化され、細胞内構造のダイナミクスを調査するための合理化されています。ここで説明する作業の2つの特定の側面は言及に値する:まず、遺伝的に複数の構成でのGal4-UAS発現系の使用は、特定の細胞型における細胞小器官にラベルを付けます。第二に、in vivoでの画像細胞内構造に広視野と共焦点顕微鏡の直接比較。

ゼブラフィッシュにおける遺伝的にラベル細胞小器官および他の細胞内構造への現在の戦略のいずれかにするプロモーター要素が直接融合タンパク質9,14,15。 インビトロ転写キャッピングされたRNAの結果での発現を駆動するキャップされたmRNA 1,4,8またはDNAに基づく構築物の使用しかし、組織特異的ではありません迅速かつ広範な表現、。キャップされたRNAは希釈または分解されるようにさらに、発現レベルは経時的に減少します。 RNAのこのように使用するベース開発の後の段階でオルガネラダイナミクスを調べるために構築する(通常は最大3日後に受精)制限されます。

これらの制限は、発現の空間的および時間的制御は、特定のプロモーターエレメントにより決定されるDNA構築物を使用することによって克服することができます。 DNAベースの構築物のGal4-UASシステムの文脈で使用される場合、導入遺伝子発現レベルに有意な改善が26,27を観察しています。レポーター遺伝子は、Gal4の結合性上流活性化配列(UAS)の下流にクローニングされている間、この二部式システムでは、細胞型特異的プロモーターエレメントは、転写活性化因子GAL4の発現を駆動します。適切なGal4のドライバとUASレポーターを組み合わせることによって、発現が異なるプロモーターの後ろに特異的な発現パターンが所望されるたびに、レポーター遺伝子をクローニングする必要性を回避し、特定の細胞型に限定することができます。また、複数のUASレポーター遺伝子の発現をすることができ単一のGal4活性化因子によって駆動されます。 Gal4-UASシステムは、このように細胞内標識化のための汎用性と柔軟な遺伝的なアプローチを提供します。

広い視野と共焦点顕微鏡は、ほとんどの研究室の主力です。広視野システムは、典型的には、光源として、アークランプを使用して、光路の端部に配置されている敏感なカメラで放射された光を検出します。アウトオブフォーカスライトは、厚い試料での合焦情報を覆い隠すように、このイメージングモダリティは、典型的には、薄いサンプルに制限されています。共焦点顕微鏡は、彼らが焦点( すなわち 、「光学切片」)28のうち、発信するものの上に焦点面からの発信信号を優先するように構築されているという点で、広視野システムとは異なります。光学セクショニングを達成するために、ピンホールは、点光源に共役な位置に排出経路に配置されます。レーザーが光源として使用され、信号は、光電子増倍管(PMT)で検出されます。具体的には、レーザービームは、試料によってポイントツーポイント及び各スポット(ピクセル)での蛍光発光は、PMTによって検出さにわたって通されます。

ここでは画像の両方顕微鏡モダリティの直接比較を提供するために、広視野および共焦点顕微鏡法の両方を使用してゼブラフィッシュ胚生体において全く同じ細胞内構造。このような比較を提供する基礎となる目的は、手元の特定の質問に最も適切な顕微鏡技術を選択するためのガイドラインを提供することです。

ここで説明する手法を用いて、我々は、ミトコンドリアと中心体ののGal4 UASベースの遺伝的標識化を実証します。これらの細胞小器官は、各撮像モダリティの適合性を実証するために広視野共焦点顕微鏡を用いて、神経系の異なる細胞型内および筋肉細胞内に結像されます。ここで説明する方法は、容易に生きたゼブラフィッシュ胚における他の細胞小器官および細胞内構造を調査するために適合させることができます。

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Protocol

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全ての動物実験は、バイエルン(ミュンヘン、ドイツ)の政府の地域の規則に従って行われました。

1.ラベリング細胞小器官およびその他の細胞内構造

注:ここで 、遺伝的レポーターは、蛍光タグの中心体、ミトコンドリアおよび細胞膜が記載されていることを構築します。

  1. 蛍光中心体とミトコンドリアを標識融合タンパク質を生成するために、従来のクローニング方法29を使用してください。このようなcetn4-YFPを生成するために、黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質2(FP)とインフレームゼブラフィッシュcentrin4(cetn4)のコード配列のクローンを作成します。このようなmitoCFP 9-11を生成するためのシアン蛍光タンパク質としてインフレームFPとシトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIIIのミトコンドリア標的配列を複製します。
  2. zebrafの特定の細胞に(cetn4-YFPまたはmitoCFP)融合タンパク質の発現を制限するには風の胚( 例えば 、ニューロンまたは筋細胞)は二部のGal4-UAS発現系26,27を使用しています。まずUASレポーター構築物を生成します。コイからのE1b基本プロモーター(Gal4の結合UASカセット(変異体は1倍から14倍UASの範囲、説明を参照)26,27,30および最小プロモーターの下流に、UAS発現ベクターに融合タンパク質をクローニングするために、従来の方法を使用します遺伝子βアクチン)、およびUAS生成:cetn4-YFPとUAS:mitoCFPを。
    注:UASレポーターを準備するには、追加の要素をクローニングする必要がある安定したトランスジェニック株の生成のための構築(下記3を参照てください)
  3. 中心体やミトコンドリアが標識された細胞の状況を可視化するために、生成UASリポーターは、細胞膜をのFPによって標識された構築物。細胞膜(memFP)31,32にそのFPを標的とするためにFPとインフレーム(パルミトイル化部位を含む)ゼブラフィッシュGAP43の最初の20アミノ酸を複製します。
  4. Obtain個のドライバの構築物またはトランスジェニック株は、細胞型特異的プロモーターエレメントは、転写活性化因子のGal4-VP16 27、Gal4FF 33またはKalTA4 30の発現を駆動します。
  5. UASリポーターが(ニューロンまたは筋細胞において、例えば )は、対象の所望の細胞型に式を制限するために適切なドライバ構築物を用いて構築組み合わせます。この共同注入Gal4ドライバーとUASレポーターは受精卵の1細胞期で構築を行うために一時的に魚を表現生成する(詳細な手順については、下記の2を参照します)。別の方法として、(詳細な手順は、以下の3を参照)UASリポーター安定したトランスジェニック系統を生成し、両方の導入遺伝子を保有する子孫を生成するために、Gal4ドライバー安定したトランスジェニック系統に渡ります。
    注:Gal4ドライバー安定したトランスジェニック系統からの受精卵にUASレポーター構築/秒を注入することも可能であるか、Gal4ドライバーがfertilizに構築UASリポーター安定したトランスジェニック系統から卵を編。
  6. A.の複数の、独立したUASのレポーター構築物( 例えば、UAS:mitoCFPとUAS:memYFPの共同のGal4-UASシステムを使用して、複数の異なる融合タンパク質を共発現するには、次のいずれかの構成でGal4ドライバーとUASレポーター/をsの使用Gal4ドライバーコンストラクトで-injected)10、単一のレポーター上のB.複数のUASカセット( 例えば、UAS:cetn4-YFP、UAS:memCerulean)12 C.双方向UASレポーター( 例えば UAS:memYFP、mitoCFP)2,10,24( 図1)。

図1
Gal4-UASシステムを使用して、図1の戦略に共発現する融合タンパク質。
複数の融合タンパク質の共発現は、様々な構成でUASレポーターカセットを使用することによって達成することができる:(a)複数の別個のUAS-駆動定数ructs、(B)は、単一の構築物または(C)単一の構築物上の双方向UASカセット上の複数のUASカセット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.魚を表現一過生成

注:以下は、以前に公開されたプロトコル34,35の適応です。基本噴射セットアップは、12倍の倍率範囲を上にして実体顕微鏡、マイクロピペットホルダーと空気圧源とマイクロマニピュレーターを含める必要があります。時間の2.1から2.5前方を準備します。

  1. 卵の微量注入チャンバーを準備するために、水中の1.5%(w / v)のアガロースの溶液を調製します。アガロースが完全に溶解するまで水と電子レンジにアガロース粉末を追加します。この溶液をシャーレ(100×15 mm)を入力します。
    1. アガロース溶液はAPPRまで冷却しますoximately 45°Cの 、溶融アガロースの表面に(6×50ミリメートル1.5ミリメートルの深さ1mm、幅で、3ミリメートル離間長い尾根で、40ミリメートルX 66ミリメートル)プラスチック製のマイクロインジェクション金型を配置することに注意しないように取る前に界面に気泡を導入します。
    2. アガロースセットした後、4 O CO / Nで保存。慎重にスパチュラを用いて金型を削除します。 4 O Cで、一度店を複数のマイクロインジェクション室を準備し、数週間にわたって繰り返し使用します。
  2. 長いシャンク36とガラス注入毛細血管を生成するために、マイクロピペットプラーを使用してください。
    注:注射キャピラリーを生成するために使用される特定の設定は、経験的に決定されるべきです。注射キャピラリーを事前に引っ張られ、使用前に保存することができます。
  3. 製造元のマニュアルに従って、分光光度計を用いてマイクロインジェクション用のプラスミドDNA(Gal4ドライバーとUASのレポーター構築物)の濃度を測定します。メジャー60; 260 nmでの吸光度の比および280nm(A260 / 280)。ヌクレアーゼフリー水で100 ngの/μlの最終濃度にDNAを希釈します。
    注:〜1.8のA260 / 280比は純粋なDNAを意味します。注射のために使用されるプラスミドDNAを精製し(シリカベースの結合行列に基づく)は、市販のキットを使用して検討。プラスミドDNAは、毒性を防止するために、高品質のものでなければなりません。
  4. 、(30X株式の0.33μl)を、Danieauのソリューション(5 ngの/μlの20の最終濃度を100ng /μlの株式の0.5〜2.5μl)をDNAを組み合わせることにより、フェノールレッド(0.25μLを10μlの注入ミックスを準備します10μlの全体積に対するオプション)およびヌクレアーゼフリー水。
    注:経験的に適切な発現をもたらすDNAの濃度を決定します。 Gal4ドライバーとUASレポータープラスミドを共注入する必要があります。 Gal4ドライバーまたはUASリポータープラスミドのみが野生型受精卵にインジェクションされた際には式が続いて起こるません。ただしトン彼は卵が1つまたはいくつかのUASレポータープラスミドで十分の注入後、Gal4ドライバーラインからのものである受精しました。逆に、UASレポーターラインにマイクロインジェクションする場合は、唯一のGal4ドライバープラスミドを注入する必要があります。フェノールレッドが大幅に注射を可視化するために助けることができるしながら最後に、それはまた、蛍光化合物そのものです。それは十分にこの時間によって希釈されないことがありますようにイメージングは​​24時間後に受精(HPF)の前に計画されている場合そのため、フェノールレッドは、可視化のFPを不明瞭でした。
  5. 注射が予定されている前の晩は、繁殖用のオスとメスのゼブラフィッシュのいくつかのペア(典型的には5〜10)を設定します。オスとメスの魚を分離するためにグリッド底を含有する挿入と取り外し可能な分周器で飼育タンクを使用してください。
    注:男性と女性のゼブラフィッシュは、一般的に自分の体の形状によって区別することができます。女性は腹側に突出した腹部を示す傾向がある一方で男性は細身になる傾向があります。男性はさらに、黄色がかった赤のcolを持っている傾向があります自分の腹側腹部領域に論理和。
  6. DNA注射の直前に、オスとメスが交尾できるようにするために仕切りを取り外します。分周器を除去した後、約15〜30分、タンクの底に卵を確認してください。新しい繁殖タンクに釣りネットを使用して成魚を転送します。
  7. ふるいに飼育槽のうち、新たに敷設受精卵を含む、水を注ぐ( 例えば、プラスチック製ティーストレーナー)。 Danieauの溶液を含むスプレーボトルを使用してふるいに卵を洗います。 (成魚の繁殖ペア当たり、通常、50〜200個の卵)ペトリ皿にふるいを反転し、すべての卵を回収するためにDanieauの溶液でスプレーボトルを使用します。
  8. microloaderピペットを用いて、DNA注入ミックスで引っ張っインジェクションキャピラリをバックフィル。 PEことができますマイクロピペットを作成するために鉗子を使用して、実体顕微鏡の視覚的な制御の下で、マイクロマニピュレータのホルダーに注入キャピラリーをマウントチップをトリムDNAの適切な量を提供することを可能としながら、絨毛膜と細胞質をnetrate。
    注:注入キャピラリーの先端がトリミングされる程度は、経験的に決定されるべきであり、卵を注入したときに最も良く判定することができます。
  9. 注射のためのDNAの量を決定するために、鉱物油への注入溶液の液滴を吐出します。キャリブレーションマイクロメーターを使用して、ドロップの半径(r)を測定し、その体積(4/3πrの3)を計算ます。射出圧力および/または各噴射パルスの持続時間を調整することにより、音量を調節します。
  10. プラスチックピペットを用いて、マイクロインジェクション室の溝の中に収集されたすべての卵(典型的には50-200、上記2.7から)を転送します。実体顕微鏡の視覚的な制御下で、細胞質(透明)と卵黄(密な、非透明)を容易に識別できるように卵を配向させるために鉗子を使用しています。
  11. ステレオの視覚的な制御の下顕微鏡は、注入量は、(1 NL 2)細胞の容積の約10%に相当することを確実にするために注意しながら、受精卵の細胞質にDNAを注入します。
    注:注入量の可視化におけるDNA溶液補助でフェノールレッド。
  12. 注入後、Danieauの溶液を含むスプレーボトルでそれらをフラッシュすることにより、射出成形金型の溝から卵を緩めます。その後プラスチックトランスファーピペットを用いて、新鮮なペトリ皿に卵を転送し、28.5°Cのインキュベーター内で維持します。
  13. 注射はマイクロピペットの浸透やDNA混合物中に持続的な物理的損傷の結果として、高い死亡率に寄与するかどうかを判断するためのコントロールとして非注入卵を維持します。
    注:注射を次の高死亡率が高すぎDNA濃度や注入体積および/ ​​またはcontaminaを有するプラスミドを含む多数の要因になり得ますNTS。低品質のDNA調​​製物からの毒性を防止するために、(シリカベースの結合行列に基づいて)市販のキットを使用することができます。
  14. 注射後、定期的に、未受精卵とデッドまたは不正な胚をスクリーニングし、これらを廃棄するために実体顕微鏡を使用しています。
    注:未受精卵のように、数時間受精後1細胞期であるように見える卵と認めます。このような妥協前後体軸として肉眼解剖学的欠陥によって不正な胚を特定します。絨毛膜内のアモルファス材料は、胚が発育段階を経て進行し、死亡しなかったことを示唆しています。マイクロインジェクションした胚は、開発の通常の過程を受けるかどうかを確認するには、解剖学的ア ​​トラス37を参照してください。
  15. 色素形成を防ぐために、10と24の間にHPF 1X 1-フェニル-2-チオ尿素(1xPTU)を含むDanieauの溶液に、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて胚を移します。 Danieauのソリューションの続きで胚を維持します実験期間中PTUをaining。
    注:メラニン保有細胞に加えて、皮膚の表面上の虹色素胞は、イメージングのために問題となる可能性があります。 PTUは、虹色素胞の形成を阻害しないが、そのようなロイ・オービソン(ロイ)のような虹色素胞の減少した番号の突然変異系統が存在し、38を使用することができます。
  16. (通常は第二または第三日目受精後、2または3 DPFに)胚の孵化後、絨毛膜を破棄し、PTUを含むDanieauのソリューションを交換します。
    注:これら手順は、胚培地の品質と健康の胚の生存性を確保することが重要です。

3.安定したトランスジェニック系統を生成します

注:安定なトランスジェニック系統を効率的Tol2のトランスポゾンシステムを用いて生成することができます。目的の導入遺伝子を含むTol2のトランスポゾンベクターは、mRNAが受精にトランスポザーゼ酵素をコードするとともに同時注入され、1細胞期でD卵。注入されたmRNA由来のトランスポザーゼタンパク質は、トランスポゾンベクターおよびゲノム39への統合から導入遺伝子カセットの切除を触媒します。

  1. 導入遺伝子レポーターカセットのクローンを作成する( 例えば、UAS:mitoCFP)Tol2の間には40を説明したように、現在、ゼブラフィッシュのコミュニティで使用されるのTol2ベクターのいずれかで逆方向末端反復を。
    注記:プロモーター要素は、関心領域に無関係の器官系におけるFPの発現を駆動する選択カセットを含むTol2のベクター( 例えば、心臓41又はレンズ42)のGal4のトランス活性化の非存在下でのUASレポータートランスジェニック系統をスクリーニングするために有用です。
  2. (シリカベースの結合行列に基づいて)市販のキットを用いて、注射のために使用されるプラスミドDNAを精製します。プラスミドDNAは、毒性を防止するために、高品質であることを確認してください。
  3. 使用してTol2のトランスポザーゼをコードするmRNAを転写このようなPCS-TP 43のような適切な転写ベクター。簡単に言えば、PCS-TPを線形化し、蓋をしてmRNAを生成し、製造業者のプロトコルに従うように、市販のキットを使用します。 (RNアーゼフリーのピペットチップやチューブを使用し、例えば )のRNaseの混入を避けるように注意してください。 C. O -80でシングルユースや店舗のために、100 ngの/μlの濃度で、RNAを等分
  4. 注射の朝、氷の上でトランスポゼースmRNAのアリコートを解凍。トランスポゾンDNAベクター(100 ngの/μlに2μl)を混合し、1中のmRNA(100 ngの/μlに2μl)をトランスポザーゼ:1の比率、および10μLする全量をRNaseフリー水の6μlを添加します。
    注:20 ngの/μlの濃度は、それぞれに推奨されますが、最適濃度は、経験的に決定されるべきです。希釈にRNaseフリー水を使用してください。 Mの劣化を防止するために、DNA-RNA注入ミックスを取り扱う際の手袋を使用して注射の全期間氷上に保ちますRNA。
  5. 上記のセクション2に詳細な手順を使用して、1細胞期で受精卵にDNA-RNA注入ミックスを注入します。実体顕微鏡の視覚的な制御下で遺伝子導入効率の最も高いレートのための1細胞期での細胞の細胞質を標的とします。導入遺伝子の発現をスクリーニングするための準備ができるまで28.5°Cので注入された胚を維持します。
    注:以前に44を説明したように、PCRはTol2のトランスポザーゼの効率を確認するために行うことができます。
  6. 蛍光解剖顕微鏡の接眼レンズを用いて、遺伝子導入のためのペトリ皿の画面胚。
    注:2または3 DPFで選択可能なカセット(心臓やレンズ内すなわち、蛍光)のFP発現を可視化するために、顕微鏡の適切なフィルターセットを使用してください。 (心臓やレンズ内)の発現によって潜在的なトランスジェニック胚を特定し、成人期にこれらの胚を上げる(F 0世代)を使用して、標準プロトコル45。また、46で説明したように、PCRによって潜在的なトランスジェニック胚を識別します。
  7. F 1世代を確立するために卵を取得する非トランスジェニック野生型魚に(詳細は2.5を参照)、それらを横断、生後3ヶ月- UASリポーターF 0魚たら2.5です。また、F 1世代を確立するために、Gal4ドライバーラインにUASリポーターF 0魚を渡ります。後者の場合には、UAS-駆動導入遺伝子を直接交雑から得られた胚で監視することができます。
  8. 導入遺伝子または選択可能なカセットの発現のためにF 1胚を選別するために、蛍光解剖顕微鏡を使用してください。
    注:発現が確認された場合、その後、導入遺伝子を生殖系列に送信されるといえます。遺伝子組換えは、F 0の段階で非メンデルです。導入遺伝子を発現する胚の数は、個々のclutcheに少数から大半に異なる場合があります秒。異なるF 0魚類のトランスポゾン統合は異なる発現パターンで、その結果、大幅に異なる場合があります。したがって、別々のサブ線のように異なるF 0創始者からF 1魚を維持します。 F 1魚におけるトランスポゾン統合が安定であり、メンデルの法則に次の世代に渡されます。
  9. 導入遺伝子のキャリアを再識別するために、別のタンク内の各F 0魚を維持します。

4.正立顕微鏡のイメージングのための胚を準備します

注:ここで説明する手順は、長作動距離水浸漬コーン目標に直立顕微鏡のイメージングのために最適化されています。

  1. 導入遺伝子発現のための胚をスクリーニングするために、蛍光解剖顕微鏡を使用してください。
    注:UASレポーター導入遺伝子の発現は、使用される特定のGal4ドライバーラインに依存します。希望のexpに基づいて、撮像実験のための胚を選択ressionパターン。
  2. 1×PTUとの1xトリカインとDanieauのバッファを含む別のペトリ皿にプラスチック製のピペットを使用して、選択した胚を転送します。
    注:標識は(器官系における唯一の少数の細胞)アガロースで胚をマウントまばらである場合(4.3参照-下記4.7)高倍率の目標と広視野顕微鏡を使用して、導入遺伝子発現のために、画面を(下記5.1を参照)。トリカインは魚をanesthetizesし​​、秒以内に有効なはずです。魚が固定化されていない場合には、トリカインが劣化している可能性があります。この分解のために考えられる理由は、47感光性であるトリカインの悪い記憶を、含まれています。
  3. 0.7%の最終濃度までDanieauのバッファに低融点アガロース粉末を溶解することにより、魚を埋め込むアガロースを準備します。アリコート(1ミリリットル)と使用する準備ができるまで40℃のヒートブロックに保ちます。
    注:高等concentrat(1.5%点で最大)アガロースのイオンも魚を埋め込むために使用することができます。
  4. 低融点アガロース1mlのアリコートにトリカインの20×ストックとPTUの50倍ストック溶液20μlを50μlを加え、チューブの側面をタップしてよく混ぜます。ヒートブロックにチューブを返します。プラスチック製トランスファーピペットを使用して、穏やかにアガロースを希釈回避するためにできるだけ少ない液体を移送、アガロース、いくつかの(1-10)麻酔胚をピペット。
  5. プラスチックピペット転送ガラスボトムシャーレにアガロース少量のすべての胚を使用。
  6. 比較的高速作業、画像化される構造に応じて、所望の向きに胚を配置するために鉗子を使用しています。
    注:自分側のオリエント胚網膜またはRohon-ビアード(RB)感覚ニューロンは、画像化されるべきか。
  7. アガロースは、少なくとも15分間固化することができます。 agaroに埋め込まれた胚をカバーするために1xPTUと1xTricaineを含むDanieauのバッファを追加します。SE。画像への準備が整うまで28.5°Cのインキュベーターにアガロース埋め込 ​​まれた胚を含む皿を置きます。

5.イメージング細胞と細胞内構造広視野または共焦点顕微鏡を用いて、

注:広視野顕微鏡とポイントスキャン共焦点顕微鏡画像に最も広く使用されている様式は、蛍光ゼブラフィッシュ胚のラベルが付いています。表1は 、両方のシステムの主な利点と欠点をまとめました。上記4に記載したように顕微鏡の両方の形態のために、胚をアガロースに搭載され、顕微鏡のステージ上の加熱室を使用して画像化実験を通して28.5 O℃に維持しました。温度変動は、z次元のドリフトを引き起こす等の撮像を開始する前に重要なことは、アガロース包埋の胚と皿を28.5°Cのに平衡化させます。長期的なイメージング実験を行う場合(Severaのオーバーリットル時間)、バッファの蒸発を減らすためにペトリ皿の上にプレキシガラスのカバーを置きます。

広視野の 点走査型共焦点
コスト 比較的安価高価(約5倍以上)
光退色 ロー高い。サンプルは、焦点面の上下にレーザー光に暴露されます。
フォト毒性 ローハイ(上記写真漂白を参照してください)
取得速度 ファストスロー
XYの分解能 アッベの法則アッベの法則は、(アプリケーションによって改善することができる40%の非常に小さなピンホールを使用して、しかし、中ほとんどの設定これは)少し実用的なアプリケーションを持っています
光学切片 貧しいですはい(ピンホールサイズによって調整することができます)
組織透過性 表面的な構造に限定される( 例えば 、Rohon-ビアード細胞や筋線維) 胚の表面から<100ミリメートルに限定

広視野の表1.一般的な比較とポイントスキャン共焦点顕微鏡

  1. 広視野顕微鏡
    注記:ここでガイドラインは長い作動距離水浸漬コーン目標と直立広視野顕微鏡を使用してゼブラフィッシュ胚を撮像するために設けられています。顕微鏡は、冷却CCDカメラを装備した、異なるフルオロフォアを可視化するためのフィルターセットは、複数のチャネルの迅速な取得のための自動化されたフィルタホイールに取り付けられています。画像取得はマイクロマネージャー、オープンソース顕微鏡ソフトウェアパッケージ48によって制御されます。 RB感覚ニューロンにおけるミトコンドリアを撮像するための具体的な例が提供されます。 RB細胞を遺伝子操作した膜を用いて標識されている(上記1.1を参照)YFPを対象とし、それらのミトコンドリアは、CFP-タグ付けされます。
    1. 低融点で彼らの側にマウント胚は、アガロース、上記4に記載されているように。
    2. 取り付けられた魚料理は撮影を開始する前に顕微鏡のステージ上で加熱室に28.5°Cのに平衡化することを可能にします。
    3. 低倍率水浸漬コーン目的を使用して、画像への胚の表面上の領域を選択するために、顕微鏡の接眼レンズに目を通します。
      注:安定したトランスジェニックMitoFishレポーターラインの場合、Tgは(UAS-のE1b:mYFP、mitoCFP)mde6、などユックなどのドライバーラインと組み合わせて使用されます。Gal4の後、ほとんどのRBニューロンが標識されている、そして緻密なMESとして表示されます胚の表面上の神経突起アーバーのH-仕事。 DNAのマイクロインジェクションは、構築した場合は(感覚例えば、MA-YFP:UASとのGal4-VP16:mitoCFPとUAS)疎ラベリング達成するために使用される二重標識細胞を同定するために、画面の胚を。
    4. 顕微鏡ソフトウェア(マイクロマネージャー1.4)を開き、カメラの設定」の下に。関心(現在例えばYFPまたはCFP)の波長のための正しいフィルタセットを定義するには、「構成設定」の下にイルミネーション ''」をクリックして「露光時間を入力します適切な画像を取得するために必要。
      注:「イルミネーション設定」は、ソフトウェアのインストール時にユーザによって予め設定されており、マイクロマネージャーを開くときにロードされます。ソフトウェアは、フィルタホイールを制御するように構成されていない場合は、手動で適切な位置にタレットにフィルターホイールを移動させます。
    5. 40-100x倍率に至るまでの長作動距離水浸漬コーン目的に変更します。選択します最も高い開口数(NA)を有し、色彩補正して対物レンズ(アポクロマート)。
    6. ビューのフィールドを選択するには、「ライブ」をクリックして:RBニューロンの場合には、幹軸索の画像ミトコンドリアの輸送を、細胞体から、または末梢アーバーに発します。
      注:胚の尾鰭倍でRBニューロンの周辺アーバは、画像に平坦であり、従って、広視野顕微鏡を備えた単一のフレームに取り込むことができる広い視野を理想的な機会を提供します。尾びれ倍はペトリ皿の底に平行になるように、きっぱりとその側にできるだけ胚をマウントすることが重要です。
    7. 視野を選択した後、ImageJのメニューで「長方形の選択」ボタンをクリックして関心領域(ROI)を定義し、マイクロマネージャーウィンドウで「ROI」をクリックしてください。イメージングのためのROIを選択した後、TAに「停止」と「保存」をクリックkeはYFPチャンネルの画像は、神経突起/秒のローカル形態を記録します。
    8. 画像ミトコンドリア輸送に上にクリックし、「マルチD ACQ。」ボタン。追加のウィンドウ(「多次元買収」)を観察し、時間ポイントの数だけでなく、このウィンドウの時点の間の間隔を選択します。 0.3から1ヘルツのフレームレートを使用してください。できるだけ多くのデータポイントを収集するために、少なくとも10分間の記録を行います。
    9. 「多次元取得」ウィンドウでは、撮像用の波長(この例では、ミトコンドリアのためのCFP)と露出の時間を追加して定義し、「チャンネル」をクリックしてください。ミトコンドリアの輸送を画像化するために400ミリ秒以下に露光時間をおいてください。
    10. 自動的に「Directoryのルート」で概説した特定のフォルダ内のファイルを保存するには、オプションの「多次元取得」ウィンドウで「画像を保存」をクリックします。ティムを開始するには右上の「獲得」をクリックします。電子タイムラプスイメージング。
    11. タイムラプス撮影は、z次元における任意のドリフトを補償するためにしながら、手動でピントを合わせ直します。
      注:RBニューロンにおけるミトコンドリアの輸送は限り4として時間画像化することができるこれらのパラメータを使用しました。
  2. 共焦点顕微鏡検査
    注:ここでのガイドラインは直立オリンパスFV1000共焦点顕微鏡と長い作動距離の水浸漬コーン目標に撮影するために設けられています。顕微鏡は、複数のレーザラインとマルチチャンネルイメージングを可能にするいくつかの検出器(従来​​のPMTとより敏感ガリウム砒素リン検出器)を備えています。具体的な基準は、オリンパスFLUOVIEWソフトウェアになされます。しかし、ここで説明した撮像パラメータは、他の共焦点システムに容易に譲渡する必要があります。
    1. 低融点上記4に記載されているように、画像化される臓器/構造のための適切な向きにアガロースでマウント胚。
    2. 28.5°Cのに平衡状態にします。
    3. 直立構成では、共焦点顕微鏡用長作動距離水浸漬コーン目標を使用します。収集できる蛍光シグナルの量を最大化し、最高の解像力を持つようにNA可能な限り高いと目的を選択してください。複数のチャネルから収集した画像は、色彩補正後の目標(アポクロマート)を選択します。
    4. 顕微鏡のソフトウェアを開いて、顕微鏡の接眼レンズを介して、関心領域を識別するために、それぞれのいずれかの送信または蛍光光を使用する「トランスランプ」または「エピランプ」をクリックしてください。
    5. 画像スタックを取得するには、以下のスキャンパラメータを設定するためのソフトウェアを使用します。
      1. 「取得の設定」ウィンドウで、イメージングのために選択された目的は、ドロップダウに表示される目的と一致していることを確認使用可能な目標のn個のメニュー。
        注:これは特定の目的( 例えば、横方向及び軸方向の分解能、共焦点絞り等のサイズ)のための任意の事前計算されたパラメータがtrue保持し、確実に使用できることを確実にするためです。
      2. 画像の特定の蛍光タンパク質(複数可)に、適切なレーザーライン/ sであり、励起および発光ダイクロイックフィルタを選択します。 「画像取得制御」画面で「染料リスト」ボタンをクリックすることでこれを行い、適切なフルオロフォア/秒を選択します。代わりに、手動でこれらのパラメータを設定するには、「光パスと染料」ボタンをクリックします。
        注:「染料リスト」ボタンオプションを選択すると、ソフトウェアは自動的に適切なレーザ線、励起および発光のダイクロイックフィルタを選択し、適切に共焦点開口部の大きさを調整します。
      3. 「取得設定」ウィンドウで、「ズーム」因子と「サイズASPを調整構造が撮像されている最高の解決に必要なピクセルサイズを得るために、スキャン画像のECT比」( すなわち 、512×512、1024×1024など)。これにより、ナイキストサンプリング基準以下、目的の約半分の理論的な解像度であることが、画素のサイズを設定します。「画像取得制御」ウィンドウ内の情報のための記号(「I」)でボタンを取得された画像のクリックのピクセルサイズを決定するために。
      4. 「取得の設定」ウィンドウで最速可能(2マイクロ秒/ピクセル)のスキャン速度を設定します。
      5. 3に2のnoise.A率を減らすために平均化カルマンライン上の「画像取得制御」画面のクリックが通常で十分では。
      6. スペクトルを重ねてフルオロフォアを撮像する場合、シーケンシャルスキャンモードを選択します。これを行うには、「画像取得制御」ウィンドウで「順次」と「ライン」をクリックしてください。
      7. 典型的には、(該当するレーザーライン/秒の電力出力を調整します5%以下)。具体的な値は、経験的に決定する必要があります。
      8. 各チャンネルの検出器の設定を調整しながら継続的に選択した領域をスキャンするために、「X4フォーカス "ボタンを" XYがリピート」または「フォーカス×2」またはをクリックしてください。 「HV」、「ゲイン」を調整し、グレー値の最も高いダイナミックレンジを有する画像を取得するために、各チャネルは、「オフセット」。
        注:これらの設定のための具体的な値は、経験的に決定する必要があります。 「HV」は、その感度を変更する「オフセ​​ット」する検出器の電圧を調整する検出器の出力信号を調整し、「ゲイン」は定数係数で、検出器の出力信号を乗算します。
      9. 下飽和識別するルックアップテーブル(ヒロ)を介して取得した画像を可視化(青く見える)と、一般的には避けるべきである、どちらも過飽和ピクセル(赤表示されます)、するCtrlキーを押しながらH。関連するレーザー林のパワー出力を再評価しますE / Sと検出器の設定。
        注:高いレーザパワーと検出器の「HV」の高レベルを使用して複数の信号をもたらします。高いレーザーパワーは、しかし、増加した漂白および光毒性につながります。 「HV」を大きくすると、ノイズの増加につながります。したがって、妥協点は、レーザパワーと光損傷を防止しつつ、ノイズの許容可能なレベルを有する画像を取得するための「HV」を設定するときに発見される必要がある( 表1参照 )。
      10. 関心領域の上限と下限に着目して定義されたボリュームから画像を収集します。 「終了セット」と「スタートセット」に「取得設定」ウィンドウをクリックで画像化するボリュームの上限と下限でzスタックウィンドウのボタンが表示されます。与えられた目的のためのz解像度の半分であるステップサイズを選択し( 例えば 、zの解像度が2μmが1μmを選択した場合)。 objectivのz解像度を決定するために、e」の画像取得制御」ウィンドウ内の情報のための記号(「I」)でボタンをクリックします。
      11. 画像化される細胞内構造のダイナミクスに適した時間周波数でのzスタックを収集するために、時系列を設定します。 「TimeScan「サブウィンドウでのzスタックが取得すべき頻度を入力します(「間隔」 ')と回数のイメージ(「民」)を取得する必要があります。
      12. zスタックおよび時系列が取得されることを確認するために、「画像取得制御」ウィンドウの「深さ」と「時間」のボタンをクリックします。最後に、タイムラプス画像の収集を開始するために「XYZT」ボタンをクリックします。
      13. 画像取得が完了した後、ソフトウェアのインターフェイス上で「完了シリーズ」を観察します。それをクリックすると、それらに関連する画像やメタデータを記録するために「OIB」形式で画像を保存します。
        注:上で得られた画像広視野顕微鏡及び共焦点顕微鏡は、可視化などフィジー、フリーパブリックドメイン画像処理プログラムなどのソフトウェアを用いて分析することができます。

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Representative Results

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ここでは、広い視野と画像ミトコンドリアおよびゼブラフィッシュの胚を生きている中で中心体への共焦点顕微鏡の使用は、直接比較と対照的です。オルガネラダイナミクスが検討されるべき細胞の位置および特定の細胞内イベントの固有振動数に応じて、一般的に広視野または共焦点顕微鏡のいずれかがより良い選択です。我々は、胚の表面上に配置さRBニューロンに深く位置する網膜細胞内小器官を画像化しました。一緒に彼らの2次元形状を有するRBニューロンの表面的な場所は、それら広視野と共焦点顕微鏡( 2)の両方で撮像されるための良い候補となります。共焦点顕微鏡を用いて取得した画像は、しかし、かなり遅く、特定の細胞内イベント(ミトコンドリアの例えば、運動、 2C、Dのダイナミクスの過小評価につながることができます図3)。

細胞小器官と細胞膜の同時可視化を可能にするために、我々は3つの異なる構成でのGal4-UASシステムを使用していました。まず、UAS MitoFishレポーターラインのTg(UAS-のE1b:mYFP、mitoCFP)mde6を使用しました。ここでは、双方向のUASはYFPの標的ミトコンドリアを標的とCFPと膜の同時発現を可能にします。適切なGal4ドライバー株との組み合わせで、MitoFishは、CFPとYFP rのRB感覚ニューロン( 2A-C)又は網膜細胞 3A、B)のミトコンドリアと細胞膜を標識 espectively。一過性の注射で7:Gal4ドライバー構築物(Gal4の-VP16、膵島-1遺伝子からの感覚ニューロン特異的エンハンサーエレメント感覚)と一緒にした第二に、2 UASは(::mitoCFPとUAS MA-YFP UAS)を構築します。一般的にこれらの注入から得られるモザイク式は、日( 図2E)上で個々の細胞の追跡を可能にしました。第三のアプローチは、それぞれが単一の連続構造物上に、異なる融合タンパク質の発現を駆動する二UASカセットの使用を用います。 centrin4-YFP融合は、中心体にラベルを付けるとセルリアンが細胞膜に標的化されたTUM1、この戦略は、CentrinFishのTg(MA-セルリアン:cetn4-YFP、UAS UAS)を生成するために使用されました。特定のGal4ドライバー株との組み合わせで中心体と網膜細胞( 3C、D)、または筋線維 図4)の細胞膜は、標識されています。

1 ">:"キープtogether.within-ページ= FO "ENT 図2
図2: 胚ゼブラフィッシュのRB感覚ニューロンの in vivoでの イメージングミトコンドリア
MitoFish DPF 2のフィン倍の尾の部分でRB感覚ニューロンは、0.80のNAのアポクロマート40倍の水に浸漬コーン目的、広視野(A)によって、または共焦点(B)顕微鏡のいずれかを使用して画像化しました。地域MitoFish DPF 2におけるRBニューロンの末梢東屋の関心の小領域の概説。C広視野タイムラプス画像の右のショーの細部へのパネル。単一ミトコンドリアの動き( '' 0の矢印)が100秒かけて追跡しました。 6時間のポイントが表示されます。前の時点でのミトコンドリアの位置はマゼンタに概説されている。D Cでの移動ミトコンドリアの位置E共焦点画像を2と3 DPFで。個々のRB細胞およびそれらのミトコンドリアの標識をすることによって達成された共同注入感覚ニューロン特異的Gal4ドライバーが2 UASレポーターコンストラクト、UASと一緒に構築:1細胞期で、MA-YFPおよび単離された二ためのスクリーニング:mitoCFPとUAS標識細胞。画像は、コントラスト反転して、個々のミトコンドリアがマゼンタドットとして概略的に示されています。スケールバーA、B20μm、C 2ミクロン、E50μmです。ミトコンドリアは、CFP(mitoCFP)をターゲットに、膜標的とYFP(MA-YFP)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: 胚ゼブラフィッシュ網膜における in vivoでの 画像の小器官への広視野と共焦点顕微鏡の比較
OTX2プロモーターエレメントは、ゼブラフィッシュ胚DPF 2の網膜における細胞膜(C及びD)における中心体とセルリアンにおける細胞膜(A及びB)又はYFPにおけるミトコンドリアおよびYFPにCFPの発現を駆動します。この標識パターンを達成するために、OTX2:Gal4のトランスジェニック魚は、いずれのO MitoFish(AB)に交配させましたR CentrinFish(CおよびD)。 40倍の水浸漬コーンアポクロマート対物レンズ(NA 0.80)は、広視野(A、C)および共焦点(B、D)顕微鏡を用いてそれぞれの網膜における同じ領域の画像を取得するために使用されました。 Aでのインセットと内側核層の領域のBショーの詳細は、CおよびDでの挿入図は、M期における細胞を示します。スケールバーは20μm。ミトコンドリアCFP(mitoCFP)ターゲットに、膜標的とYFP(MA-YFP)、centrin4-YFP(cetn4-YFP)、膜標的にセルリアン(MA-セルリアン)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:広視野と共焦点microscの比較in vivoでの画像中心体にOPY。
蛍光を有する単一の筋線維は、細胞膜及び中心体(OTX2:のGal4; CentrinFish)でタグ付けされた広視野(A)および共焦点(B)顕微鏡を用いて画像化しました。両方の場合において40倍の水浸漬コーンアポクロマート対物レンズ(NA 0.80)を使用しました。スケールバーは10μm。 Centrin4-YFP(cetn4-YFP)は、膜は、セルリアン(MA-セルリアン)が対象となる。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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ここでは、蛍光タグミトコンドリア、中心体とゼブラフィッシュ胚のin vivoで特定細胞型の細胞膜へのGal4-UAS発現系の汎用性を実証します。他の細胞小器官または細胞内構造を標識する多数の蛍光融合タンパク質は、公表された文献に見出すことができ、それぞれの実験室、商業的供給源または非商業的なプラスミド寄託( 例えば、Addgene)から得ることができます。新しい蛍光融合タンパク質を設計するために、いくつかのパラメータは、FPを使用すると、目的のタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端にFPを融合させるかどうかを含めて、考慮される必要があります。蛍光融合タンパク質を生成についてより徹底した議論について、読者は、被験者49-51についての詳細な記事と呼ばれています。

私たちは、UAS-駆動導入遺伝子を用いた融合タンパク質の共発現を達成するための3つの戦略を強調表示します。複数、separat電子UASレポーター構築物は異なる既存のレポーターを組み合わせることを可能にするには、追加のクローニングを必要とせずに構築します。レポーターの発現レベルはまた、独立して滴定することができます。しかしながら、共発現のより高いレベルは、複数のUASカセットまたは単一の構築物に双方向UASカセットのいずれかが使用される場合に達成されます。 FPがタグとして使用されるためには、共発現を確認することは比較的容易です。多シストロン性発現のための他の方法は、内部リボソーム侵入部位40およびウイルス2Aペプチド52,53の使用を含む、存在することに留意すべきです。 DNAベースの構築物の代替として、 インビトロで転写されたキャップ化mRNAは細胞内構造1,4,8を標識する蛍光融合タンパク質を発現するために使用することができます。このアプローチの注意点は、式が開発の最初の数日間に制限されており、細胞または組織特異的ではないされていることがあります。かかわらず、融合タンパク質を発現するように選択された方法の、それが重要です発現レベルは、非特異的標識化につながり、細胞の生理学的状態を損なわないことを確実にします。この点で、のGal4-UASシステム27に固有のレポーター遺伝子の発現の増幅は、FPが特定の細胞小器官に標的化されていても細胞質の標識として、例えば顕在、問題となり得ます。利用可能な場合、抗体は、融合タンパク質によって得られた発現パターンは、内因性の状況を反映することを確認するために使用されるべきです。いくつかの例では、(より)低いDNA濃度の注入は、融合タンパク質の誤った局在化の問題を軽減することができました。また、UAS反復の数が少ないのベクターは、導入遺伝子の発現レベル30を滴定するために役立つ可能性があります。同様に、比較的弱く発現を駆動するために報告され、したがって30,33毒性が少ないされたGal4-VP16は、改変されたバージョンが存在する活性化剤、ため。融合タンパク質の誤局在はダウを滴定するための努力にもかかわらず、解決しない場合はnは、導入遺伝子発現レベルは、のGal4-UASシステムを差し控える直接プロモーターエレメントによって発現を駆動するために必要であり得ます。

安定したトランスジェニック系統、MitoFish 10CentrinFish 12は 、我々はこの原稿に記述14xUASカセットを用いて行きました。我々は、複数のUASの反復を有するレポーターラインは54をサイレンシングする傾向があることが報告されているので、世代を超えて発現の変化を検出するために、Gal4ドライバーラインのバックグラウンドでこれらの行を維持します。我々はCentrinFishを伝播してきた3世代にわたってサイレンシングの証拠を見ていません。しかし私達はMitoFishに多彩な表情を見て、したがって、厳密に将来の世代のために伝播するために、式の、「完全な」強いレベルを持つ胚を選択しています。現在の文献は5xUASリピートを有する発現ベクターは、安定したトランスジェニック系統を生成するための代替手段であり得ることを示唆している - レポーターであります十分に高いレベル30に駆動され、非反復UASの反復は、伝えさえ少ない54感受性であるが、UASの比較的低い数は、導入遺伝子サイレンシングにそれを受けにくいことがあり繰り返されます。

タグの細胞小器官または他の細胞内構造に現在利用可能なのFPのパレットは55非常に広いです。タグとして特定のFPを選択する場合、考慮事項は、次のパラメータに与えられるべきである:まず、FPの励起および発光スペクトルは、特定のレーザラインだけでなく、その可視化に必要な励起および発光フィルターを決定します。第二に、FPの輝度及び光安定性。第三に、FPは以下の翻訳を成熟する速度。第四に、FPは融合中に凝集する傾向を持っているかどうか。最後のパラメータに関しては注意すべきであるとの対照実験は、特定の実験のために、各FPの適合性をテストするために行われる必要があります。例えば、一方の再DのFP mCherryをとのDsRedが広く使用されている、彼らは伝え特定の融合体56で凝集体を形成します。我々は、ミトコンドリアにし、細胞膜(未発表の観察)を標的としたときによく実行するためにTagRFP-T 57、TagRFPの以上の光安定変異体を発見しました。複数の細胞小器官が同時に可視化する必要がある場合、非重複スペクトルを有するのFPを使用する必要があります。我々は成功し、シアンのFP(CFPとセルリアン)とYFP( 2-4)の組み合わせを使用しています。青から近赤外のスペクトル範囲全体を利用することにより、1を大幅に同時に2を可視化することができる細胞内構造の数を拡張することができます。従来のFPに加えて、光活性化のFPは、オルガネラの動態を調べるために、例えば、FP楓の使用は個々のミトコンドリア58の運命を追跡するために特に有用です。

これは顕微鏡技術 - 広視野または共焦点 - 最もありイメージングのための適切に画像化される細胞の位置及び特定の細胞内または細胞の事象が発生することが予想される速度を含む多数の要因に依存します。広視野顕微鏡は、表面的な場所とまばらに標識された試料中の好適な様​​式です。これは、リーズナブルな価格で、高速で低光毒性およびイメージングを提供しています。撮像密標識された試料中の、ゼブラフィッシュの非表層部で実行される必要があるか、三次元情報を取得する場合は、共焦点又は光学セクショニング顕微鏡法の別の形態は、選択の方法となります。

関係なくそれらの細胞性または細胞内構造が監視されている、多くの場合、可能な限り最高の画像を取得し、生きていると繰り返しタイムラプスイメージングのための良好な生理学的状態でサンプルを維持するとの間のトレードオフがあります。フォト毒性は細胞小器官の行動の変化、細胞の異常な形態、あるいは細胞として現れることができます死。広視野および共焦点顕微鏡の両方に光退色および光毒性を低減するための鍵は、画像を取得する光の可能な限り低いレベルを使用することです。この点で、可能な限り高いNAの対物レンズを収集することができる蛍光シグナルの量を最大化する鍵です。共焦点顕微鏡観察のために、パラメータの数は、より低いレーザーパワーの使用を補償するように調整することができます。従来のPMTと比較してより高い量子効率を有する検出器、 例えば、ガリウム砒素リン検出器は、放出された光子が検出される可能性が高いことを確認するために使用することができます。代替的にまたは付加的に、より高いダイノード電圧は、検出器の感度を高めるためにPMTに適用することができます。共焦点絞り(ピンホール)が軸方向の解像度の損失はあるものの、複数の蛍光信号の収集を可能にするために開くことができます。できるだけ光にサンプルを公開するには、スキャンはそのようなの滞留時間という高速で行われる必要がありますピクセルあたりのレーザーは低いです。より低い空間分解能で走査は、走査の速度を増加させる効果を有します。イメージングは​​、それほど頻繁にそれが調査のプロセスを包括的にサンプリングを損なわない場合ただしのみ考慮されるべきで、少ない光にサンプルを暴露するという追加の利点を有しています。

別の方法として、いわゆる「共振」スキャナが装備されているスピニングディスク共焦点顕微鏡や共焦点顕微鏡は、高速スキャンのための機能を提供します。両方のモダリティは、彼らがより速く、より少ない光毒性よりも「古典的」、点走査型共焦点顕微鏡であるという利点を有します。しかし、スピニングディスク共焦点顕微鏡は、z解像度で、より限られており、点走査型共焦点顕微鏡のような組織にとして深く浸透することはできません。同様に、共振スキャナの共焦点顕微鏡の適用は、非常に短いピクセル滞留時間として制限することができる、可能性悪い画質につながります次に、サブ細胞イベント(低減された信号対雑音比で、例えば、二値画像)の検出を妨げます。

広視野と共焦点イメージングは、ここで強調表示されていながら、最後に、光学顕微鏡のような二光子59と光シート顕微鏡60の他の形態は、具体的な質問のためのより適切であるかもしれません。二光子顕微鏡は、光スペクトルの赤外領域の2つの光子の同時吸収による蛍光体の励起に基づいています。共焦点顕微鏡法と共通では、サンプルの画像を取得するポイントのスキャンを使用して、二光子励起の非直線性によって光学セクショニング機能を有しています。蛍光体励起用の長波長光の使用は、表面から深さ数百ミクロンでの撮像が可能になります。さらに小さな撮像ボリュームへの励起の制限は、焦点面の外に光退色及び光毒性を防ぐことができます。しかし、すべてのFPsが、赤のFPで特に流行している問題を高い多光子吸収断面を有します。また、同時に複数の別個のFPを励起するために、単一の赤外線波長を見つけることは、マルチチャネル画像が煩雑作ることは困難です。光シート顕微鏡は、試料を励起するレーザー光の(典型的には2から10ミクロンの範囲の厚さ)の薄い「シート」を使用して、敏感なカメラを用いた垂直角度でこの照射焦点面からの蛍光シグナルを検出します。光学切片は、一度に単一の平面を照明することによって達成されます。励起光のこの制限は、光毒性の発生を低減します。全体照らさ面からの蛍光信号が同時に収集されているので、画像取得は、ポイントスキャン共焦点および多光子顕微鏡よりも大幅に高速です。すべてのこれらの特性は、中、高時空間分解能で動的な細胞事象を画像化する光シート顕微鏡に特に適したものにしますライブサンプルの大量。実際、全体のゼブラフィッシュ胚における使用した光シート顕微鏡の細胞の運命を総合的に開発61の最初の24時間の間追跡しました。より良いイメージング浸透62,63と空間分解能64に継続的な改善と、光シート顕微鏡は、細胞でも全体ゼブラフィッシュ胚における細胞下レベルでだけでなくダイナミクスを調べるために使用されることが考えられます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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References

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13, (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191, (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56, (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138, (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52, (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15, (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45, (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32, (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33, (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11, (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11, (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70, (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30, (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240, (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142, (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122, (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163, (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3, (10), 130065 (2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20, (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74, (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119, (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99, (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80, (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108, (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341, (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184 (2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (3), prot5586 (2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42, (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263, (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55, (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21, (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. 14.20 (2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. 21.4 (2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19, (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32, (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45, (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352, (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33, (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5, (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998 (2014).
リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング
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Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

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