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Developmental Biology

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

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생체 내 이미징에서 가장 생리 학적 맥락에서 세포 행동의 직접 시각화를 제공합니다. 제브라 피쉬 배아, 자신의 신속하고 외부 개발 및 형광 라벨을 허용 유전 도구의 풍부한 배열의 투명성은 모든 주요 발달 이벤트의 역학을 규명하기 위해 생체 현미경의 사용 증가에 기여했다. 제브라 피쉬의 신경 시스템 개발의 이미징 연구는 예를 들어 크게 신경 전구 세포의 행동과 그 이후의 이동, 분화 및 회로 통합 1-8 포함한 자손의 운명에 대한 우리의 지식을 확장합니다.

스테이지는 이제 이러한 셀룰러 동작을 기초 세포 내 역학 조사를하도록 설정된다. 사실, 제브라 피쉬는 이미 생체 내 세포 생물학위한 도구로 악용되고있다. 골지 (15), 미토콘드리아 9-11을 시각화 할 수있게되었습니다 2,8,12-14 중심체, 미세 소관 (4)과 액틴 세포 골격 (16)은 17 엔도 좀과 생체 내에서 제브라 피쉬 배아에서 다른 세포 내 구조 중, 1,18 혀끝 멤브레인의 구성 요소가 복잡한. 지금까지 이러한 세포 소기관의 기능에 대해 알려진 내용의 대부분은 배양 된 세포에 자신의 행동을 연구에서 비롯됩니다. 시험 관내 연구는 세포 생물학에 엄청난 통찰력을 산출하고 있지만, 문화의 세포는 완전히 생체 내 상황의 복잡성을 대변하지 않습니다 때문에 반드시 기능과 생체 내에서 세포 내 소기관의 역 동성을 반영하지 않습니다. 제브라 피쉬 배아는 세포 내 역학 조사에 생체 대안의 생존을 제공합니다.

척추 동물로서, 제브라 피쉬는 포유류에서 발견되는 상동 많은 기관계 (예, 신경 망막)을 갖는다. 또한, 피쉬 배아 점점 인간 질환 (19, 20)을 모델링하는데 사용되는 (예를 들어, 소두증 (21)과 Leber 씨의 선천성 흑암 22)와에 미토콘드리아 기능 (예, 파킨슨 병 23, 10, 24 및 바르트 증후군 25 퇴행성 신경)과 관련이있는 책임을 포함. 세포와 세포 내 수준에서 생체 내 이미징 이러한 경우 이러한 병리 적 상태의 기초가되는 세포 생물학의 더 나은 이해를 허용 할 것이다.

여기에 설명 된 방법의 전체 목표는 생체 광학 현미경에 사용 제브라 피쉬 배아 세포 내 소기관 및 기타 구조를 조사하기 위해 포괄적 인 가이드를 제공하는 것이다. 생체 내에서 세포 내 구조를 시각화 및 추적에 관련된 전체 작업 흐름을 설명한다 - 유전자 표지 접근 방식에서 일시적으로 발생 표현하고 안정적인 형질 전환 어류, 그리고 마지막으로 넓은 필드와 공 초점 현미경을 사용하여 영상화하기에. 이러한 시저의 각 동안edures이 많은 제브라 피쉬 실험실에서 사용되는 설명 프로토콜 최적화 및 세포 내 구조의 역학을 조사하기위한 간소화된다. 여기에 설명 된 일의 두 가지 특정 양태 언급 보증 먼저, 특정 세포 타입에서 유전자 라벨 소기관 여러 구성에서 GAL4-UAS 발현 시스템의 용도. 둘째, 생체 내에서 이미지 세포 내 구조에 넓은 필드와 공 초점 현미경의 직접적인 비교.

제브라 피쉬의 유전 라벨 세포 기관 및 기타 세포 내 구조에 대한 현재 전략 중 하나를 만들 프로모터 요소를 직접 융합 단백질 9,14,15. 시험 관내 전사 출장 RNA 결과의 발현을 유도 출장 mRNA의 -1,4,8- 또는 DNA 기반 구조의 사용 신속하고 폭 넓은 표현, 즉 그러나 조직 특이하지 않다. 캡핑 RNA 희석 또는 열화로 또한 발현 수준은 시간이 지남에 따라 감소. RNA의 따라서 사용을 기반으로(포스트 수정을 일반적으로 최대 3 일) 개발의 나중 단계에서 세포 기관의 역학 제한을 검토 구성한다.

이러한 제한은 표현의 공간 및 시간 제어가 특이 적 프로모터 요소에 의해 결정되는 DNA 작 제물을 사용하여 극복 될 수있다. DNA 기반 구조는 유전자 발현 수준에 GAL4-UAS 시스템에 상당한 개선의 맥락에서 사용되는 경우 (26, 27)을 관찰한다. 리포터 유전자는 GAL4 결합 상류 활성화 서열 (UAS)의 하류에 클로닝하는 동안이 분형 발현 시스템에서, 세포 유형 특이 적 프로모터 요소는 GAL4 전사 활성의 발현을 구동한다. 적절한 GAL4 드라이버와 UAS 리포터 조합하여, 발현은 다른 프로모터 뒤에 특이 적 발현 패턴이 요구 될 때마다 리포터 유전자를 복제 할 필요를 회피, 특정 세포 유형에 한정된다. 또한, 다수의 UAS 리포터 유전자의 발현 할 수있다하나의 GAL4 활성화에 의해 구동. GAL4-UAS 시스템은 따라서 세포 내 라벨에 대한 다양하고 유연한 유전 적 접근 방식을 제공합니다.

넓은 필드와 공 초점 현미경은 대부분 실험실의 일꾼입니다. 와이드 필드 시스템은 일반적으로 광원으로서 아크 램프를 사용하여 광 통로의 단부에 배치 된 카메라로 민감한 발광을 검출한다. 아웃 오브 포커스 빛이 두꺼운 샘플에 초점 정보를 가린다로이 영상 양상은 일반적으로 얇은 샘플로 제한됩니다. 공 초점 현미경은 초점 (즉, "광학 절편") (28)에서 발생한 것들 위에 초점면에서 발생한 신호를 선호하는 내장되어 있다는 점에서 넓은 필드 시스템 다르다. 광학 절편을 달성하기 위해 핀홀은 점 광원에 대​​한 공액 위치에 배출 경로에 배치된다. 레이저가 광원으로 사용되며, 신호는 광전자 증 배관 튜브 (PMT가)로 검출된다. 실제로, 레이저빔을 시료 위에 포인트 별 각 스폿 (화소)에서의 형광 방출 PMT를 검출되어 와이프된다.

여기 이미지 모두 현미경 양식의 직접적인 비교를 제공하는 넓은 필드와 공 초점 현미경을 모두 사용하여 제브라 피쉬 배아 생활에 매우 동일한 세포 내 구조. 이러한 비교를 제공하는 기본 목적은 손의 특정 질문에 가장 적합한 현미경 기술 선택을위한 가이드 라인을 제공하는 것입니다.

우리는 미토콘드리아와 중심체의 GAL4-UAS 기반 유전 라벨을 보여 여기에 설명 된 방법을 사용. 이러한 소기관 각 영상 기법의 적합성을 입증 넓은 필드와 공 촛점 현미경을 사용하여 신경계와 근육 세포가 다른 세포 유형에 이미징된다. 여기에 설명 된 방법을 용이하게 살아있는 배아 제브라 다른 세포 내 소기관 및 구조를 조사하도록 구성 할 수있다.

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Protocol

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모든 동물 실험은 위 바바리아 (독일 뮌헨)의 정부의 지역 규정에 따라 수행되었다.

1. 레이블 소기관 및 기타하는 세포 구조

참고 : 여기에 유전 기자는 찬란 태그 중심체, 미토콘드리아와 세포 막에 설명되어 구성한다.

  1. 형광 중심체와 미토콘드리아 레이블을 융합 단백질을 생성하기 위해 기존의 복제 방법 (29)를 사용합니다. 이러한 cetn4-YFP를 생성하는 노란색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 2 (FP)과의 프레임 제브라 피쉬 centrin4 (cetn4)의 코딩 서열을 복제. 이러한 mitoCFP 9-11를 생성하는 시안 형광 단백질로 프레임 FP와 시토크롬 C 산화 효소의 서브 유닛 VIII의 미토콘드리아 타겟팅 순서를 복제.
  2. zebraf 특정 셀 (cetn4-YFP 또는 mitoCFP) 융합 단백질의 발현을 제한틱 배아 (예를 들어 신경 세포 나 근육 세포)는 양자 GAL4-UAS 발현 시스템 (26, 27)를 사용한다. 먼저 UAS 리포터 구조를 생성합니다. GAL4 결합 UAS 카세트의 하류 UAS 발현 벡터의 융합 단백질을 복제하는 통상적 인 방법을 사용하여 잉어에서 26,27,30과 최소한의 프로모터 (E1B 기저 프로모터 (변형이 14 배 UAS에 1 배 범위, 토론 참조) cetn4-YFP와 UAS : ​​유전자 βactin), 그리고 UAS을 생성 mitoCFP합니다.
    참고 : UAS 기자를 준비하려면 추가 요소를 복제 할 필요가 안정적인 유전자 변형 라인 생성을 위해 구축 (아래 3 참조)
  3. 중심체 또는 미토콘드리아가 표시되는 휴대 컨텍스트를 시각화하기 위해, UAS 기자가있는 세포막이 FPS로 표시되어 구축 생성합니다. 대상의 프레임와 FP (팔미 부위를 포함) 지브라 피쉬 Gap43의 제 스물 아미노산을 복제하는 FP 세포막 (memFP) 31, 32이다.
  4. ObtaiN 드라이버 구조 또는 트랜스 제닉 라인은 세포 형 특이 적 프로모터 요소들은 전사 활성 GAL4-VP16 27 Gal4FF 33 KalTA4 30의 발현을 구동한다.
  5. 에이전트 서버의 기자 (신경 세포 나 근육 세포에서, 예를 들어) 관심의 원하는 세포 유형의 표현을 제한하는 적절한 드라이버 구조와 구축 결합합니다. 이하려면 GAL4 드라이버를 공동-주입하고 (자세한 내용은 아래의 2 참조)에 물고기를 표현 일시적으로 생성하는 UAS 기자 수정란의 한 세포 단계에서 구성한다. 또한, (자세한 내용은 아래의 3 참조 용) UAS 기자 안정적인 유전자 변형 라인을 생성하고 두 유전자 베어링 자손을 생성하는 GAL4 드라이버 안정적인 유전자 변형 라인에 교차.
    참고 : 그것은 GAL4 드라이버 안정적인 형질 전환 라인 또는 GAL4 드라이버 fertiliz로 구성에서 수정란에 UAS 리포터 구조 / S를 주입하는 것도 가능하다UAS 기자 안정적인 유전자 변형 라인에서 에드 계란입니다.
  6. A. 배로 별도 UAS 리포터 작 제물 (예 : UAS : mitoCFP와 UAS : memYFP 공동 GAL4-UAS 시스템을 이용하여 다수의 고유 한 융합 단백질을 공동 발현하려면, 다음과 같은 구성 중 하나에서 GAL4 드라이버와 UAS 리포터 /를 S 사용 GAL4 드라이버 구조와 주사 하였을) (10), 단일 기자에 B. 여러 UAS 카세트 (예를 들어, UAS : cetn4-YFP, UAS : memCerulean) 12 C. 양방향 UAS 기자 (예를 들어 UAS : memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (그림 1).

그림 1
GAL4-UAS 시스템을 사용하여 융합 단백질-Express를 공동 1. 전략을줍니다.
(A) 다수의 분리 된 UAS 구동을 const : 다중 융합 단백질의 공동 발현은 다양한 구성 UAS 리포터 카세트를 사용함으로써 달성 될 수있다ructs, (B)는 단일 구조 또는 (C) 단일 구조의 양방향 UAS 카세트에 여러 UAS 카세트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 생선을 표현 일시적으로 생성

주 : 다음은 이전에 게시 된 프로토콜 (34, 35)의 적응이다. 기본 주입 설정은 12 배까지 배율 범위 위로 실체 현미경, 마이크로 피펫 홀더와 미세 조작기 및 공기 압력의 소스를 포함해야한다. 시간의 2.1-2.5 미리 준비 :

  1. 계란 미세 주입 챔버를 준비하려면 물에 1.5 %의 용액 (w / v) 아가로 오스를 준비합니다. 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 물과 전자 레인지에 아가로 오스 분말을 추가합니다. 이 솔루션 페트리 접시 (100 × 15mm)를 입력합니다.
    1. 아가로 오스 솔루션은 appr으로 냉각 허용oximately 45 O C 용융 아가의 표면 (6X 50mm 1.5 mm 1 mm 깊고 넓은 3 mm 이격 긴 릿지로 40 mm X 66mm) 플라스틱 마이크로 인젝션 몰드 배치 처리하지 복용 전 인터페이스에 거품을 소개합니다.
    2. 아가로 오스 세트 후, 4 CO / N에 상점. 조심스럽게 주걱을 사용하여 곰팡이를 제거합니다. 4 ℃로 한 번에 가게를 여러 미세 주입 챔버를 준비하고 몇 주에 걸쳐 반복적으로 사용합니다.
  2. 긴 생크 (36) 유리 주입 모세 혈관을 생성하는 마이크로 피펫 풀러를 사용합니다.
    주 : 주입 모세관을 생성하는 데 사용 된 특정 설정을 경험적으로 결정되어야한다. 주입 모세관 미리 뽑아 사용 전에 저장 될 수있다.
  3. 제조자의 설명서에 따라, 분광 광도계를 사용한 마이크로 인젝션 용 플라스미드 DNA (GAL4 드라이버와 UAS 리포터 작 제물)의 농도를 측정한다. 법안60 260 nm 내지 280 nm의 (가 A260 / 280)에서의 흡광도의 비율. 클레아없는 물 100 NG / μL의 최종 농도로 희석 DNA.
    참고 : ~ 1.8의 A260 / 280 비율은 순수한 DNA를 의미한다. 주사에 사용되는 플라스미드 DNA를 정제 (실리카 계 결합 행렬에 기초하여) 상업용 키트를 사용하여 고려한다. 플라스미드 DNA는 독성을 방지하기 위해 고품질이어야한다.
  4. , (30X 재고 0.33 μL) Danieau의 용액 (5 NG / μL 내지 20의 최종 농도 100 NG / μL 재고 0.5 ~ 2.5 μL) DNA를 결합하여 페놀 레드 (0.25 μl를 10 μl를 주입 믹스 준비 10 μl의 총 볼륨 선택 사항) 및 뉴 클레아없는 물.
    주 : 경험적 적당한 표현을 산출 DNA의 농도를 결정한다. GAL4 드라이버와 UAS 리포터 플라스미드를 공동으로 주입 할 필요가있다. 만 GAL4 드라이버 또는 UAS 리포터 플라스미드는 야생형 수정란에 주입 할 때 어떤 표현이 계속 일어날하지 않습니다. t 그러나 경우그는 계란 하나 또는 여러 개의 UAS 리포터 플라스미드가 충분 주입 후 GAL4 드라이버 라인 출신 수정 된. UAS 리포터 라인에 마이크로 인젝션 반대로, 단지 GAL4 드라이버 플라스미드를 주입​​ 할 필요가있다. 페놀 레드 크게 주사를 가시화하는 데 도움이 될 수있는 동안 마지막으로, 또한 형광 화합물 자체이다. 그것은 충분히이 시간에 의해 희석되지 않을 수 있습니다으로 영상이 24 시간 후 수정 (HPF) 전에 계획하는 경우 따라서, 페놀 레드 시각화 FPS를 모호하게 할 수있다.
  5. 주사 전에 저녁은 계획 남성과 번식을위한 여성 제브라 피쉬의 (일반적으로 5 ~ 10) 여러 쌍을 설정합니다. 그리드 화 바닥과 남성과 여성의 물고기를 분리하는 이동식 칸막이를 포함하는 인서트 사육 탱크를 사용합니다.
    참고 : 남성과 여성의 제브라 피쉬는 일반적으로 자신의 몸 모양에 의해 구별 될 수있다. 여성은 복부 돌출 복부를 나타내는 경향이있는 동안 수컷은 날씬한 경향이있다. 남성은 추가로 황색 - 적색 COL을 갖는 경향이자신의 복부 복부 영역 or 연산.
  6. DNA 주사 직전에, 남성과 여성은 짝짓기를 할 수 있도록 칸막이를 제거합니다. 약 15 분주기를 제거한 후 30 분, 탱크의 바닥에 달걀을 확인. 새로운 사육 탱크에 낚시 그물을 사용하여 성인 물고기를 전송합니다.
  7. (예를 들면, 플라스틱 차 스트레이너) 체에 사육 탱크 중 새로 마련 수정란을 포함, 물을 붓는다. Danieau의 솔루션을 포함하는 스프레이 병을 사용하여 체에 계란을 씻으십시오. 배양 접시에 체 전환하고 모든 계란 (성인 물고기의 일반적으로 50 ~ 200 계란 번식 당 쌍)를 복구 Danieau의 용액을 스프레이 병을 사용합니다.
  8. microloader 피펫을 사용하여, DNA 주입 믹스와 함께 뽑아 주입 모세관을 다시 채우기. 퍼가기 할 수있는 마이크로 피펫을 만들 집게를 사용하여, 실체 현미경의 시각 제어하는​​ 미세 조작기의 홀더에 주입 모세관을 마운트하고 끝을 잘라netrate는 융모막 세포의 세포질은 DNA의 적절한 볼륨을 제공 할 수있는 동안.
    주 : 주입 모세관의 선단이 경험적으로 결정되어야 트리밍 계란을 주입 할 때 가장 잘 판단 할 수있다하는 정도.
  9. 주사 DNA의 양을 결정하기 위해 미네랄 오일에 주입 용액의 방울을 토출. 교정 마이크로 미터를 이용하여 드롭의 반경 (R)을 측정하고, 부피 (4/3 π 연구 3)을 계산한다. 분사 압력 및 / 또는 각각의 분사 펄스의 지속 시간을 조절하여 음량을 변조한다.
  10. 플라스틱 피펫을 사용하여, 마이크로 인젝션 챔버의 트렌치에 수집 된 모든 계란 (상기 2.7 전형적 50-200 등)를 옮긴다. 실체의 시각 제어하에, 세포질 (투명) 및 난황 (고밀도 불투명)을 용이하게 식별 할 수 있도록 계란 방향을 겸자를 사용한다.
  11. 스테레오의 시각 제어하에현미경, 주입 용적 (1 NL 2) 셀의 부피의 약 10 %에 해당하도록주의하면서 수정란의 세포질 내로 DNA를 주입.
    주 : 주입 부피의 시각화에 DNA 용액 조제 페놀 레드.
  12. 주입 후, Danieau의 용액을 함유하는 분무 병을 세척하여 사출 금형의 트렌치에서 계란을 풀어. 그 후 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 신선한 페트리 접시에 달걀을 전송하고 28.5 O를 C 배양기에서 유지한다.
  13. 주사는 마이크로 피펫 침투 또는 DNA 믹스 동안 지속 물리적 손상의 결과로 하나, 높은 사망률에 기여 여부를 결정하기 위해 컨트롤 등의 취소 주입 계란을 유지한다.
    참고 : 높은 사망률은 다음 주사로 인해 contamina와 과도하게 높은 DNA 농도 또는 사출 볼륨 및 / 또는 플라스미드 등 다양한 요인에 수국세청. 낮은 품질의 DNA로 준비에서 독성을 방지하기 위해 (실리카 계 결합 행렬에 기초하여) 상업용 키트를 사용할 수있다.
  14. 주사 다음 일정한 간격으로, 미 수정 계란과 죽은 또는 조작 된 배아을 선별하고 이들을 폐기 실체 현미경을 사용합니다.
    참고 : 미 수정으로, 수정 후 하나의 세포 단계 몇 시간에있는 것으로 나타 계란을하다고. 이러한 손상된 전후방 몸 축으로 총 해부학 적 결함에 의해 조작 된 배아를 식별합니다. 융모막 내에서 비​​정질 재료는 배아 발달 단계를 진행하고 사망하지 않았다는 것을 의미한다. 미세 주입 된 배아 발달의 정상적인 과정은 해부학 적지도 책 (37)와 상담 받아야하는 경우 확인합니다.
  15. 색소 형성을 방지하기 위해 10에서 24 사이에 HPF (1X) 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (1xPTU)를 함유 Danieau의 용액에 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 배아를 옮긴다. Danieau의 솔루션 계속에서 배아를 유지실험 기간 동안 PTU를 aining.
    참고 melanophores뿐만 아니라, 피부의 표면에 iridophores 이미징에 대해 문제가 될 수있다. PTU는 iridophore 형성을 억제하지 않지만, 예컨대 로이 오비슨 (로이) 등 iridophores 줄인 숫자 돌연변이 라인이 존재하고 (38)를 사용할 수있다.
  16. 배아 부화 후, chorions을 취소하고 Danieau의 솔루션 PTU를 포함하는 교환 (일반적으로 두 번째 또는 세 번째 일 후 수정, 2 또는 3 DPF에).
    참고 :이 단계는 배아 매체의 품질과 건강한 태아의 생존을 보장하기 위해 중요하다.

3. 안정적인 형질 전환 라인을 생성

주 : 안정 트랜스 제닉 라인 효율적 TOL2 트랜스포존 시스템을 사용하여 생성 될 수있다. 관심의 유전자를 포함하는 트랜스포존 TOL2 벡터는 mRNA를 비료로 트랜스 코딩하는 효소와 함께 공동 - 주사한 세포 단계에서 D 계란입니다. 주입의 mRNA로부터 유래 된 단백질은 트랜스 게놈 39에 트랜스포존 벡터와의 통합의 유전자 카세트의 적출을 촉진한다.

  1. 트랜스 리포터 카세트를 복제 (예 : UAS : mitoCFP) 사이 TOL2 40 바와 같이 현재 제브라 커뮤니티에서 사용 TOL2 벡터의 한 말단 반복 반전.
    주 : 프로모터 요소들이 관심 영역 무관 기관계에 FP 발현을 유도하는 선택 가능한 카세트를 포함 TOL2 벡터 (예, 심장 (41) 또는 렌즈 (42))이 GAL4의 전이 활성화의 부재 UAS 리포터 트랜스 제닉 라인들을 스크리닝하는데 유용하다.
  2. (실리카 계 결합 행렬에 기초하여) 상업용 키트를 사용하여 주입에 사용되는 플라스미드 DNA를 정제. 플라스미드 DNA가 독성을 방지하기 위해 높은 품질의 있는지 확인하십시오.
  3. 를 사용하여 TOL2의 트랜스 코딩의 mRNA를 전사이러한 PCS-TP (43) 적절하게 전사 벡터입니다. 요약하면, PCS-TP를 선형화 및 출장의 mRNA를 생성하고 제조 업체의 프로토콜을 따라 상업 키트를 사용합니다. RNases와 오염을 방지하기 위해주의 (예를 들면, 피펫 팁 및 튜브의 RNA 분해 효소 무료 사용). C. O를 -80에서 단일 사용 및 저장을 위해 100 NG / μL의 농도에서의 RNA를 나누어지는
  4. 주사의 아침, 얼음에 트랜스 mRNA의의 나누어지는을 녹여. 트랜스포존 DNA 벡터 (100 NG / μL 2 μL)를 혼합하고 1의 mRNA (100 NG / μL의 2 μl를) 트랜스 : 1의 비율로하고, 10μL하는 전체 볼륨을 가져다의 RNA 분해 효소가없는 물을 6 μl를 추가합니다.
    참고 : 20 NG의 농도는 / μL 각을 권장하지만, 최적의 농도는 경험적으로 결정되어야한다. 희석의 RNA 분해 효소가없는 물을 사용합니다. RNA-DNA를 주입 혼합 처리 장갑을 사용하여 m의 열화를 방지하는 주사의 전체 기간 동안 얼음에 보관RNA.
  5. 상기 (2)에서 자세히 설명하여, 사람 세포 단계에서 수정란 내로 DNA-RNA 주입 혼합 주사. 실체의 시각 제어하에 형질 전환 효율이 가장 높은 비율을위한 한 세포 단계에서 세포질 타겟팅. 유전자의 발현을 선별 할 준비가 될 때까지 28.5 O를 C에서 주입 된 배아를 유지한다.
    주 : PCR 이전 44 바와 같이 TOL2의 트랜스의 효율을 확인하기 위해 수행 될 수있다.
  6. 형광 해부 현미경의 접안을 사용하여 형질 전환을위한 배양 접시에서 화면 배아.
    참고 : 선택 카세트의 FP 식을 시각화하는 현미경의 적절한 필터 세트를 사용하여 (즉, 심장이나 렌즈의 형광) 2 또는 3 DPF에서. (심장이나 렌즈) 식으로 잠재적 인 유전자 변형 배아를 확인하고 성인이 이러한 배아를 인상 (F 0 세대)를 사용하여 표준프로토콜 45. (46)에 설명 된대로 또는 PCR에 의해 잠재적 인 유전자 변형 배아를 식별합니다.
  7. 에이전트 서버 리포터 F되면 0 물고기가 2.5이다 - 세 3 개월,은 F 1 세대를 구축하는 알을 얻기 위해 비 형질 전환 야생 형 물고기로 (자세한 내용은 2.5 참조) 교차합니다. 또는, F (1) 생성을 확립하는 GAL4 드라이버 라인에 UAS 리포터 F 0 생선 교차. 후자의 경우, UAS 구동 트랜스 직접 가교로부터 얻어진 배아에서 모니터링 될 수있다.
  8. 형질 전환 유전자 또는 선택 카세트의 표현 F 1 배아를 선별 형광 해부 현미경을 사용합니다.
    주 : 식이어서 확인되면 유전자는 배아 송신이라고 할 수있다. 형질 전환은 F 0 단계에서 비 멘델이다. 형질 전환 유전자를 발현하는 배아의 수는 개인 clutche의 대부분을 소수 다를 수 있습니다에스. 다른 F 0 물고기 트랜스포존 통합은 서로 다른 발현 패턴의 결과로 크게 다를 수 있습니다. 따라서 별도의 서브 라인 등 다양한 F 0 창시자에서 F (1) 물고기를 유지한다. F 1 물고기 트랜스포존 통합은 안정과 멘델 방식으로 다음 세대에 전달됩니다.
  9. 유전자 캐리어를 다시 확인하는 별도의 탱크의 각 F 0 물고기를 유지한다.

4. 똑바로 현미경에 이미지에 대한 배아를 준비합니다

참고 : 여기에 설명 된 절차는 긴 작동 거리를 물에 침지 콘 목표와 수직 현미경에 영상에 최적화되어있다.

  1. 형질 전환 유전자 발현에 대한 배아를 선별 형광 해부 현미경을 사용합니다.
    참고 : UAS 리포터 유전자의 발현이 사용되는 특정 GAL4 드라이버 라인에 따라 달라집니다. 원하는 특급에 기반 이미징 실험을위한 선택 배아ression 패턴입니다.
  2. 1 배 PTU와 1 배 Tricaine와 Danieau의 버퍼를 포함하는 별도의 배양 접시에 플라스틱 피펫을 사용하여 선택된 배아를 전송합니다.
    주 : 라벨이 (기관 시스템에서 몇 세포) 아가로 오스의 배아를 탑재 부족한 경우 (4.3 참조 - 아래 4.7) 높은 배율의 목표와 넓은 필드 현미경을 사용하여 유전자 발현과 화면 (아래 5.1 참조). Tricaine는 물고기를 마취하고 초 이내에 유효합니다. 물고기가 고정되지 않은 경우는 Tricaine이 저하 것으로 예상된다. 이 분해 가능한 이유는 47 빛에 민감한입니다 Tricaine의 가난한 저장을 포함한다.
  3. 0.7 %의 최종 농도로 Danieau의 버퍼에 저 융점 아가로 오스 분말을 용해하여 생선을 포함하는 아가로 오스를 준비한다. 부분 표본 (1 mL) 및 사용하기 전까지 40 ° C로 가열 블록에 계속.
    참고 : 높은 정광아가로 오스의 이온 (1.5 % 개까지) 또한 물고기를 포함 할 수 있습니다.
  4. 의 1 ml의 분취에 Tricaine의 20 배 주식의 50 μL와 PTU의 50 배 원액 20 μl를 추가 저 융점 아가로 오스와 튜브의 측면을 활용하여 잘 섞는다. 열 블록에 튜브를 돌려줍니다. 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 조심스럽게 아가 희석 피하기 위해 가능한 한 작은 액체가 전사, 아가로 소수 (1-10) 마취 배아 피펫.
  5. 플라스틱 피펫 전송 바닥이 유리 페트리 접시에 아가로 오스 소량의 모든 배아를 사용.
  6. 상대적으로 빠른 작업, 촬상되는 구조에 따라, 원하는 방향으로 배아를 위치 집게를 사용한다.
    참고 : 그들의 편에서 동양 배아 망막 또는 Rohon-수염 (RB) 감각 뉴런은 몇 군데해야합니다.
  7. 아가로 오스는 적어도 15 분 동안 응고하도록 허용합니다. 아가에 포함 된 배아를 충당하기 위해 1xPTU 및 1xTricaine를 포함 Danieau의 버퍼를 추가그 자체. 이미지에 대한 준비가 될 때까지 28.5 O를 C에서 인큐베이터에서 아가로 오스 - 임베디드 배아가 들어있는 접시를 놓습니다.

5. 이미징 세포와 세포 이하 구조 넓은 필드 또는 공 촛점 현미경을 사용하여

주 : 와이드 필드 현미경과 점 주사 촛점 현미경 이미지 형광 표지 피쉬 배아에 가장 널리 사용되는 양상 표 1 주요 장점과 단점을 모두 시스템을 요약 한 것이다.. 현미경의 스테이지에 가열 챔버를 사용하여 실험 내내 촬상 28.5 O C에서 상기 4에 기재된 유지 현미경으로 두 형태의 배아 아가 로스에 장착된다. 중요한 것은, 아가 매립 배아와 접시 온도 변화는 Z-치수 편차의 원인으로 촬상이 시작되기 전에 28.5 O를 C로 평형화시킨다. severa 위에 (장기 이미징 실험을 수행 할 때리터의 시간), 버퍼의 증발을 줄이기 위해 페트리 접시 위에 플렉시 유리 커버를 놓습니다.

와이드 필드 점 스캔 공 초점
비용 상대적으로 저렴 비싼 (약. 5 배 이상)
사진 표백 낮은 높은. 샘플은 초점면의 상하에, 레이저 광에 노출된다.
사진 독성 낮은 고 (위 사진 표백 참조)
취득 속도 빠른 느린
XY의 해상도 아베의 법칙 아베 법은 (APP함으로써 개선 될 수의 40 %는 매우 작은 핀홀을 사용함;. 그러나대부분의 설정이) 약간의 실용적인 응용 프로그램을 가지고
광학 절편 가난한 예 (핀홀 크기에 의해 조절 될 수있다)
조직 침투 표면 구조에 제한 (예를 들어, Rohon - 수염 세포 나 근육 섬유) 배아의 표면에서 100mm <로 제한

넓은 필드와 포인트 스캐닝 공 초점 현미경 표 1. 일반 비교

  1. 와이드 필드 현미경
    주 : 다음 지침은 긴 작동 거리를 물에 침지 콘 목표와 수직 넓은 필드 현미경을 사용하여 제브라 피쉬 배아 이미징 제공됩니다. 현미경은 냉각 된 CCD 카메라를 구비하고, 다른 형광을 시각화 필터 세트는 다중 채널을 신속하게 획득하기위한 자동화 필터 휠에 장착된다.이미지 인수는 μManager, 오픈 소스 현미경 소프트웨어 패키지 (48)에 의해 제어된다. RB 감각 뉴런의 미토콘드리아 이미징 구체적인 예를 제공한다. RB 세포는 유전자 YFP 대상으로 막을 사용하여 표시하고 자신의 미토콘드리아 (위 1.1 참조) CFP-태그입니다.
    1. 저 융점에서 그들의 편에서 마운트의 배아는 아가로 오스 위의 4에 설명 된대로.
    2. 장착 생선 요리가 영상을 시작하기 전에 현미경의 무대에 가열 챔버에서 28.5 O를 C 평형 수 있습니다.
    3. 낮은 배율 물 침지 콘 목표를 사용하여 이미지 배아의 표면에 영역을 선택 현미경의 접안을 찾습니다.
      안정적인 형질 전환 MitoFish 기자 라인, Tg는 (UAS-E1B : mYFP, mitoCFP) 경우 mde6이 같은 HUC 등의 드라이버 라인과 함께 사용됩니다 참고 GAL4는 가장 RB 뉴런 표시하고, 조밀 한 행으로 표시된다배아의 표면에 신경 돌기 아버의 시간 - 작업. DNA의 마이크로 인젝션이 성긴 라벨링을 달성하기 위해 사용되는 경우 구축 (예를 들어, 감각 : mitoCFP와 UAS : UAS로 GAL4-VP16 MA-YFP)는 스크린 배아 이중 표지 된 세포의 동정을 행 하였다.
    4. 현미경 소프트웨어 (μManager 1.4)을 열고 카메라 설정 "에서.이자 (현재 예를 들어 YFP 또는 CFP)의 파장에 대한 올바른 필터 세트를 정의하는"구성 설정 "에서 조명 ''"를 클릭 "노출 시간을 입력 적절한 이미지를 획득해야합니다.
      참고 : "조명 설정"사전 설정 소프트웨어의 설치시 사용자가이고 μManager을 열 때로드됩니다. 소프트웨어는 필터 휠을 제어하도록 구성되어 있지 않으면, 수동으로 적절한 위치로 터릿의 필터 휠을 이동.
    5. 40-100x 확대에 이르기까지 긴 작동 거리 물에 침지 콘 목표로 변경합니다. 고르다높은 개구 수 (NA)를 가지며, 색도 보정 대물 (고차 색지움).
    6. 시야를 선택하는 "라이브"를 클릭 스템 축삭에서 RB 뉴런 화상 미토콘드리아 전송의 경우에, 전지 본체로부터 또는 주변 아버 발산.
      참고 : 배아의 꼬리 지느러미 배에서 RB 뉴런의 주변 아버 이미지에 이상적인 기회 평평하기 때문에 넓은 필드 현미경으로 단일 프레임에 캡처 ​​할 수있는 넓은 시야를 제공합니다. 이 꼬리 지느러미 배는 배양 접시의 바닥에 평행하도록, 그 평탄면에 가능한 한 배아를 탑재하는 것이 중요하다.
    7. 시야를 선택한 후는 ImageJ에 메뉴에서 "사각형 선택"버튼을 클릭이자 (ROI)의 영역을 정의하고 μManager 창에 "ROI"를 클릭합니다. 영상에 대한 ROI를 선택한 후, "정지"버튼을 클릭 따에 "저장"KE는 YFP 채널의 이미지가 돌기 / s의 로컬 형태를 기록한다.
    8. 이미지 미토콘드리아 전송로를 클릭 "다중 D ACQ." 단추. 부가 윈도우 ( "다차원 취득")를 관찰하고 시간 점의 수뿐만 아니라,이 창에서 시간 점 사이의 간격을 선택한다. 0.3 Hz에서의 프레임 속도를 사용합니다. 가능한 데이터 포인트만큼을 수집하기 위해 적어도 10 분 동안 녹음을 실시하고 있습니다.
    9. 은 "다차원 취득"창에서, 노출 시간 (이 예에서는 미토콘드리아에 대한 CFP)를, "채널"을 클릭 추가 및 이미징의 파장을 정의합니다. 미토콘드리아 전송 이미징 400 밀리 초 이하로 노출 시간을 유지합니다.
    10. 자동으로 '디렉토리 루트'에 설명 된 특정 폴더에 파일을 저장하려면 옵션 "다차원 취득"창에서 "이미지 저장"을 클릭합니다. 팀을 시작하려면 오른쪽 상단에있는 "획득"을 클릭합니다전자 경과 영상.
    11. 시간 경과 기록은 z 차원에서 어떤 드리프트를 보상하면서 수동으로 초점을 재조정.
      참고 : RB 신경 세포의 미토콘드리아 전송만큼 4와 같은 시간 동안 몇 군데 할 수 이러한 매개 변수를 사용하여.
  2. 공 초점 현미경
    참고 : 여기에 가이드 라인은 직립 올림푸스 FV1000 공 초점 현미경과 긴 작동 거리 물에 침지 콘 목표와 영상 제공됩니다. 현미경은 다중 채널 이미징 있도록 여러 레이저 선과 여러 검출기 (종래의 PMT 더 민감한 갈륨 비소 인화물 탐지기)를 구비한다. 구체적인 기준은 올림푸스 Fluoview 소프트웨어로 이루어집니다. 그러나, 여기에 설명 된 촬상 파라미터는 다른 촛점 시스템에 쉽게 양도해야한다.
    1. 위의 4에 설명 된대로 아가로 오스 기관 / 구조에 대한 적절한 오리엔테이션에서 저 융점 마운트의 배아, 이미징합니다.
    2. O를 C로 평형을 허용합니다.
    3. 수직 구성에 공 초점 현미경 긴 작동 거리 물에 침지 콘 목표를 사용합니다. 수집되는 형광 신호의 양을 최대화하고 최고의 해상력을 갖는 가장 높은 NA와 목표를 선택. 여러 채널에서 수집 된 이미지는 색채 수정 목표 (고차 색지움)을 선택합니다.
    4. 현미경 소프트웨어를 열고 현미경의 접안를 통해 관심 영역을 식별하기 위해 각각 하나 전송 또는 형광 빛을 사용하는 "트랜스 램프"또는 "에피 램프"를 클릭합니다.
    5. 이미지 스택을 얻기 위해 다음 검색 매개 변수를 설정하기 위해 소프트웨어를 사용하여
      1. 은 "취득 설정"창에서 이미지를 위해 선택한 목적은 드롭 다우에 표시되는 목표를 일치하는지 확인가능한 목표의 n 개의 메뉴를 선택합니다.
        주 :이 특정 목적에 대한 미리 계산 된 매개 변수 (예를 들어, 횡 방향 및 축 해상도, 공 초점 조리개 등의 크기)이 성립하고 신뢰성있게 사용될 수 있도록하는 것이다.
      2. 이미지 특정 형광 단백질 (들)에 대한 적절한 레이저 라인 / s의, 그리고 여기 및 방출 다이크로 익 필터를 선택합니다. '이미지 수집 제어 "창에서"염료 목록 "버튼을 클릭하여이 작업을 수행하고 적절한 형광 / S를 선택합니다. 또한, 수동으로 매개 변수를 설정하려면 "빛의 경로 및 염료"버튼을 클릭합니다.
        주 : "염료 목록"버튼 옵션이 선택 될 때, 소프트웨어는 자동으로 적절한 레이저 선, 여기 및 발광 다이크로 익 필터를 선택하고, 적절히 촛점 개구의 크기를 조절한다.
      3. 은 "취득 설정"창에서 "줌"요소와 "크기 ASP를 조정필요한 픽셀 크기를 얻기 위해 스캔 된 이미지의 요법 비율 "(즉, 512 × 512, 1024 × 1024 등) 베스트. 이미지화되는 구조를 해결함으로써, 나이 퀴 스트 샘플링 기준에 따르는 목표의 절반 이론적 해상도로 화소 크기를 설정할 . '이미지 수집 제어 "창에서 정보 기호 ("I ")와 버튼을 획득 한 이미지 클릭의 픽셀 크기를 결정합니다.
      4. 은 "취득 설정"창에서 가장 빠른 (2 μS / 픽셀)의 스캔 속도를 설정합니다.
      5. 2 ~ 3 일반적으로 충분의 칼만 라인 평균의 "이미지 인식 제어"창 클릭으로 noise.A 요소를 줄일 수 있습니다.
      6. 스펙트럼을 중복으로 형광 이미징 때 연속 스캔 모드를 선택합니다. 이렇게하려면 "이미지 수집 제어"창에서 "연속"과 "선"을 클릭합니다.
      7. 일반적으로 (해당 레이저 라인 / s의 출력을 조정5 % 이하). 특정 값은 경험적으로 결정해야합니다.
      8. 각 채널에 대한 검출기 설정을 조절하면서 지속적으로 선택한 영역을 스캔 "X4 초점"버튼을 "XY가 반복"또는 "초점 × 2"또는을 클릭합니다. "HV", "이득"을 조정 그레이 값의 높은 동적 범위가 이미지를 획득하기 위해 각각의 채널에 "오프셋".
        주 : 이러한 설정에 대한 특정 값은 경험적으로 결정해야합니다. "HV"는, 그것의 감도를 변경 "오프셋"을 검출기에 전압을 조정 검출기의 출력 신호를 조절하고 "게인"일정한 비율로 상기 검출기의 출력 신호를 승산한다.
      9. Ctrl 키 + H 아래에 포화 식별하는 룩업 테이블 (힐로)를 통해 획득 된 영상을 시각화 (파란색 표시) 일반적으로 피해야한다 둘 이상의 포화 픽셀 (빨간색 표시). 해당 레이저 LIN의 출력을 재평가E / S 및 검출기 설정.
        참고 : 높은 레이저 파워와 검출기의 "HV"높은 수준의 사용은 더 신호로 이어질 것입니다. 높은 레이저 파워 그러나 증가 표백 및 사진 독성으로 이어질 것입니다. 은 "HV"을 늘리면 노이즈 증가로 이어질 것입니다. 따라서 절충안이 레이저 전력 및 광 손상을 방지하면서 잡음의 허용 가능한 레벨의 이미지를 획득하는 "HV"를 설정하는 경우 발견해야 (또한하기 표 1 참조).
      10. 관심 영역의 상한 및 하한에 집중함으로써 정의 볼륨 이미지를 수집한다. 볼륨의 상한과 하한의 Z-스택 윈도우의 "종료 설정"및 "시작 설정"설정 버튼의 "취득 설정"창 클릭으로 이미지화한다. 주어진 목표에 대한 Z 해상도의 절반 스텝 크기를 선택합니다 (Z 해상도 인 경우 예를 들어,., 2 μm의 1 μm의 선택). objectiv의 z 해상도를 결정전자 "영상 수집 제어"창에서 정보 기호 ( "I")로 버튼을 클릭합니다.
      11. 몇 군데되는 세포 내 구조의 역학에 적합한 시간 주파수에서 Z - 스택을 수집하는 시계열을 설정합니다. 은 "TimeScan"서브 창에서 Z - 스택 ( "간격" ') 획득되어야하는 주파수와 이미지 ( "민")를 취득 할 횟수를 입력합니다.
      12. A ~ Z 스택 및 시계열 취득됩니다 확인하기 위해 "이미지 수집 제어"창에서 "깊이"와 "시간"버튼을 클릭합니다. 마지막으로 시간 경과 이미지를 획득 시작합니다 "XYZT"버튼을 클릭합니다.
      13. 화상 취득이 완료되면, 소프트웨어 인터페이스에 "완료 시리즈"를 관찰한다. 그것을 클릭하고 그들과 관련된 이미지와 메타 데이터를 기록하는 "OIB"형식으로 이미지를 저장합니다.
        참고 : 이미지는에 얻어넓은 필드 현미경 및 공 초점 레이저 주사 현미경은 시각 및 피지, 무료 공개 도메인의 화상 처리 프로그램과 같은 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수있다.

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Representative Results

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여기에 넓은 필드와 이미지 미토콘드리아와 제브라 피쉬 배아 생활의 중심체에 공 초점 현미경의 사용을 직접 비교하고 대조된다. 피검 소기관 동성이있는 셀들의 위치 및 특정 세포 내 사건의 고유 주파수에 따라 일반적으로 넓은 필드 또는 공 초점 현미경 하나가 더 좋은 선택이다. 우리는 배아의 표면 상에 위치 RB 뉴런 깊은 위치 망막 세포 소기관을 묘화. 자신의 두 차원 형상과 함께 RB 신경 세포의 표면 위치는 넓은 필드와 공 초점 현미경 (그림 2) 모두에 의해 촬영되고 그들에게 좋은 후보를합니다. 공 초점 현미경을 사용하여 획득 이미지는하지만 상당히 느리다 특정 세포 내 이벤트 (미토콘드리아의 예를 들면, 운동, 그림 2C, D의 역학의 과소 평가로 이어질 수 (도 3).

세포 기관 및 세포막의 동시 시각화를 사용하려면 우리는 세 가지 다른 구성에서 GAL4-UAS 시스템을 사용했다. 우선, UAS MitoFish 리포터 라인의 Tg (UAS-E1B : mYFP는 mitoCFP) mde6 사용 하였다. 여기서, 양방향 UAS는 YFP 대상으로 미토콘드리아 타겟 CFP 및 멤브레인의 수반 표현을 허용한다. 적절한 GAL4 드라이버 라인과 함께, MitoFish (그림 3A, B) CFP와 YFP의 연구와 미토콘드리아와 세포 RB 감각 뉴런의 막 (그림 2A-C) 또는 망막 세포를 라벨 espectively. 둘째, 두 UAS는 (: mitoCFP와 UAS : UAS MA-YFP) 구축합니다 GAL4 드라이버 구조와 결합 된을 (감각 : GAL4-VP16의 섬-1 유전자에서 감각 신경 세포 특이 적 인핸서 요소) 과도 주사 7. 일반적으로 이러한 주사의 결과 모자이크 식을 일한다 (그림 2E)를 통해 개별 세포의 추적을 허용. 세 번째 방법은 각각 하나의 연속적인 구조에서 다른 융합 단백질의 발현을 구동 두 UAS 카세트의 사용을 채용. centrin4-YFP 융합이 중심체 레이블 및 세룰 리안은 세포막을 대상으로하는 tum1,이 전략은 CentrinFish의 Tg (MA-세룰 리안 : cetn4-YFP, UAS UAS)를 생성하는 데 사용되었다. 특정 GAL4 드라이버 라인 조합의 중심체 망막 세포 (그림 3C, D) 또는 근육 섬유 (그림 4)의 세포막이 표시되어 있습니다.

1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "천만에 그림 2
그림 2 : 배아 제브라 피쉬의 RB 감각 뉴런의 생체 내에서 미토콘드리아 이미징.
넓은 필드 (A) 또는 공 초점 (B) 현미경에 의해 하나 MitoFish가 0.80의 NA와 함께 고차 색지움에게 40 배 물 침지 콘 목표를 사용하여 몇 군데 있었다 DPF (2)의 핀 배의 꼬리 부분에 RB 감각 뉴런. 지역 MitoFish DPF 2의 RB 신경 세포의 주변 아버에 대한 관심의 작은 영역의 설명. C 와이드 필드 시간 경과 이미지의 오른쪽에 표시 세부 사항 패널. 단일 미토콘드리아의 이동 ( ''0 화살표)을 100 초 이상 추적 하였다 여섯 시간 포인트가 표시됩니다. 이전 시간 지점에서 미토콘드리아의 위치는 마젠타에 설명되어있다. D C에서 이동하는 미토콘드리아의 위치 E 공 촛점 이미지를 2, 3 DPF에서. 개별 RB 세포 및 미토콘드리아의 라벨에 의해 달성되었다 공동 주입 감각 신경 세포의 특정 GAL4 드라이버가 두 UAS 리포터 구조, UAS와 함께 구성 : 하나의 세포 단계에서, MA-YFP에 고립 된 두 선별 : mitoCFP와 UAS 라벨이 지정된 셀. 이미지는 명암 반전과 개인의 미토콘드리아가 마젠타 점으로 개략적으로 도시되어있다. 스케일 바 A, B 20 μm의, C 2 μm의,E 50 μm의. 미토콘드리아는 CFP (mitoCFP)을 대상으로, 막 대상 YFP (MA-YFP). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 배아 zebrafish의 망막에 생체 내에서 이미지 소기관에 넓은 필드와 공 초점 현미경의 비교.
프로모터의 Otx2 요소 제브라 피쉬 배아 DPF (2)의 망막 세포막 (CD)의 중심체와 세룰 리안의 세포막 (AB) 또는 YFP의 미토콘드리아 YFP으로 CFP의 발현을 구동한다. 이 라벨 패턴의 Otx2을 달성하기 : GAL4 형질 전환 물고기 중 하나 MitoFish (A와 B)에 교차했다 오R CentrinFish (C와 D). 40 배의 물에 침지 콘 고차 색지움 대물 렌즈 (NA 0.80)를 와이드 필드 (A, C) 및 촛점 (B, D) 현미경을 사용하여 각 망막 동일한 영역의 이미지를 수집 하였다. A의 세트와 내부 핵 층의 영역의 B 쇼 세부 사항, CD의 세트는 M-단계에서 셀을 보여줍니다. 스케일 바 20 μm의. 미토콘드리아 CFP (mitoCFP) 대상, 막 대상 YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), 막 대상 세룰 리안 (MA-세룰 리안). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 넓은 필드와 공 초점 microsc의 비교생체 내에서 이미지 중심체에 opy.
와이드 필드 (A)과 공 초점 (B) 현미경을 사용하여 영상화 하였다 : 형광 함께 단일 근섬유 세포막과 중심체 (CentrinFish GAL4의 Otx2)를 태그. 두 경우 모두에서, 40 배의 물에 침지 콘 고차 색지움 대물 렌즈 (NA 0.80)를 사용 하였다. 스케일 바 10 μm의. Centrin4-YFP (cetn4-YFP)를 막을 세룰 리안 (MA-세룰 리안)를 대상으로 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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여기, 우리는 찬란 태그 미토콘드리아, 중심체와 제브라 피쉬 배아에서 생체 내에서 특정 세포 유형의 세포막에 GAL4-UAS 발현 시스템의 다양성을 보여줍니다. 다른 세포 내 소기관 또는 구조 라벨 많은 형광 융합 단백질은 공개 된 문헌에서 발견 될 수 있고, 각각의 실험실 상업적 소스 또는 비상업적 플라스미드 기탁 (예 Addgene)로부터 얻을 수있다. 새로운 형광 융합 단백질을 디자인하는 몇몇 파라미터 FP 사용되는 관심있는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 FP 융합 여부를 포함하여 고려 될 필요가있다. 형광 융합 단백질을 생성에 대한보다 철저한 설명은 독자가 주제 49-51에 대한 심층적 인 기사라고합니다.

우리는 UAS 기반의 유전자를 사용하여 융합 단백질의 공동 발현을 달성하기위한 세 가지 전략을 강조 표시합니다. 여러 해부E UAS 리포터 작 제물은 다른 기존 리포터 조합 있도록 추가적인 클로닝 필요없이 구성한다. 리포터 발현 수준은 독립적으로 적정 할 수있다. 여러 UAS 카세트 또는 단일 구조물의 양방향 UAS 카세트 중 하나가 사용되는 경우에는, 공동 발현의 높은 수준이 달성된다. FPS 태그로서 사용하기 때문에 이는 공동 발현을 확인하기가 비교적 쉽다. 이는 다중 cistronic 표현하는 다른 방법은 또한 내부 리보솜 진입 사이트 (40)와 바이러스 2A 펩티드 (52, 53)의 사용을 포함하여, 존재하는 것을 주목해야한다. 시험 관내 출장 전사의 DNA 기반 구조에 대한 대안으로의 mRNA는 세포 내 구조 -1,4,8- 레이블을 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방식의 경고는 식 개발 처음 며칠 제한되며 특정 세포 또는 조직하지 않은 것 그러나이다. 무관 융합 단백질을 발현하기 위해 선택에있어서, 그것은 중요발현 수준은 비 - 특정 표시로 이어질 세포의 생리 학적 상태를 손상시키지 않도록한다. 이와 관련하여, GAL4-UAS 시스템 (27)에 내재 된 리포터 유전자 발현의 증폭은 FP가 특정 소기관 타겟팅에도 세포질 표시 예를 들어 낸 문제가 될 수있다. 가능한 경우, 항체 융합 단백질에 의해 얻어진 발현 패턴이 내생 상황을 반영하는지 확인하는 데 사용되어야한다. 어떤 경우에는, 낮은 (ER) DNA의 농도의 주입은 융합 단백질의 미스 지역화의 문제를 완화 할 수있다. 또한, UAS 반복의 수가 적은 벡터는 유전자 발현 수준 (30)을 적정하는 데 도움 수 있습니다. 마찬가지로, 비교적 약하게 발현을 유도하는 것으로보고 따라서 30,33 적은 독성이있다 GAL4-VP16가 수정 된 버전이 존재 활성화를위한. 융합 단백질의 잘못 현지화 다우 적정 노력에도 불구하고 지속되는 경우N 유전자 발현 수준은, 상기 GAL4-UAS 시스템을 포기하고 직접 프로모터 요소에 의해 발현을 유도 할 필요가있다.

안정적인 형질 전환 라인은 MitoFish 10 CentrinFish (12), 우리는 14xUAS 카세트를 사용하여 만들어진이 원고에 대해 설명합니다. 우리는 여러 UAS 반복과 기자 라인이 54 침묵하는 경향 것으로보고 되었기 때문에, 세대를 통해 발현에 변화를 감지하는 GAL4 드라이버 라인의 배경이 라인을 유지한다. 우리는 우리가 CentrinFish을 전파 한 3 세대에 걸쳐 침묵의 증거를 보지 못했다. 우리는 그러나 MitoFish에 잡색의 표현을 볼 수 있으므로 엄격하게 미래 세대를 위해 전파하는 식의 '전체'강한 수준의 배아를 선택했다. 현재 문헌 5xUAS 반복을 가진 발현 벡터는 안정한 트랜스 제닉 라인을 생성하기위한 대안이 될 수 있음을 시사 - 리포터 인충분히 높은 수준 (30)에 구동 및 비 반복적 인 UAS 반복 보도 더 적은 54 취약하지만 UAS의 비교적 낮은 수는 유전자 침묵에 덜 경향이 만들 수 있습니다 반복합니다.

태그 소기관이나 세포 내 구조에 현재 사용 가능한 FPS의 팔레트 (55) 매우 광범위하다. 태그로서 특정 FP를 선택할 때 고려 사항은 다음과 같은 파라미터에 제공한다 : 첫째, FP의 여기 및 발광 스펙트럼은 특정 레이저 라인뿐만 아니라 시각화에 필요한 여기 및 방사 필터를 결정한다. 둘째, 밝기와 FP의 광 안정성. 셋째, 어떤 속도로 FP는 다음 번역 성숙. 넷째, FP는 융합체에 응집하는 경향이 있는지 여부. 마지막 매개 변수에 대해주의를 기울여야한다 제어 실험은 특정 실험을 위해 각 FP의 적합성을 테스트하기 위해 수행해야합니다. 예를 들어, 다시 잠시D FPS mCherry 및을 DsRed 널리 그들이 전하는 바에 의하면 특정 융합 (56)의 집계를 형성, 사용된다. 우리는 미토콘드리아와 세포막 (게시되지 않은 관찰)을 대상으로 할 때 잘 수행 할 수 TagRFP-T 57, TagRFP의 더 많은 사진을 안정 변종을 발견했다. 여러 세포 기관이 부수적으로 겹치지 않는 스펙트럼과 FPS, 시각화 할 필요가있을 때 사용되어야한다. 우리는 성공적으로 시안 FPS (CFP 및 세룰 리안)와 YFP (그림 2-4)의 조합을 사용하고 있습니다. 청색으로부터 근적외선의 전체 스펙트럼 범위를 이용하여, 하나는 크게 2 동시에 가시화 될 수 아세포 구조의 수를 늘릴 수있다. 종래 FPS 외에도 광 활성화 가능한 FPS는 소기관 동력학을 검사하기 위해 예를 들어, FP에 데 사용 개별 미토콘드리아 (58)의 거동을 추적하는 데 특히 유용하다.

어떤 현미경 기술 - 넓은 필드 또는 공 촛점 - 가장입니다촬상 적합한는 묘화 될 셀의 위치와 특정 세포 내 또는 셀룰러 이벤트가 발생하는 예상되는 속도 등과 같은 다양한 요인에 의존한다. 와이드 필드 현미경은 표면의 위치와 드문 드문 표시된 샘플에서 선호하는 양상이다. 그것은 합리적인 가격에 높은 속도로 낮은 사진 독성과 영상을 제공합니다. 촬상 조밀 표지 된 샘플에서, 제브라 피쉬의 비 표면 부분에서 수행 될 또는 3 차원 정보, 공 초점 또는 광학 단면 현미경의 또 다른 형태를 획득해야하는 경우에는 선택하는 방식이된다.

에 관계없이 어느 세포 또는 세포 내 구조가 모니터링되고, 종종 최상의 이미지를 획득하고 살아 반복 시간 경과 이미징을위한 좋은 생리적 상태에서 샘플을 유지 사이의 트레이드 오프가있다. 포토 독성은 세포 소기관의 행동 변화, 비정상적 세포 형태 또는 세포 수로 나타내죽음. 넓은 필드와 공 촛점 현미경을 모두 광 표백 광 독성을 감소시키는 핵심 이미지를 획득 할 빛의 최저 레벨을 사용하는 것이다. 이와 관련하여, 가능한 가장 높은 NA와 목표 수집 될 수 형광 신호의 양을 최대화하는 것이 핵심이다. 공 초점 현미경, 다수의 파라미터가 낮은 레이저 파워의 사용을 보상하도록 조정될 수있다. 높은 양자 효율은 종래의 PMT 검출기, 예를 들면, 갈륨 비소 인화물 탐지기에 비해, 그 방출 된 광자가 검출 될 가능성을 보장하기 위해 사용될 수있다. 대안 적으로 또는 부가 적으로, 높은 다이 노드 전압 검출기의 감도를 증가시키기 위해 PMT에 적용될 수있다. (핀홀) 공 초점 조리개는 축 방향 해상도의 손실이기는하지만, 더 형광 신호의 수집을 허용하도록 열 수 있습니다. 가능한 한 적은 광에 샘플을 노출, 주사 등의 체류 시간이 있음을 고속으로 수행되어야픽셀 당 레이저는 낮다. 낮은 공간 해상도에서의 스캐닝은 스캐닝 속도를 증가시키는 효과를 갖는다. 영상은 자주는 조사 과정의 포괄적 인 샘플링을 손상하지 않는 경우에만 고려되어야, 적은 빛에 샘플을 노출의 추가 혜택이 있습니다.

대안으로서, 소위 '공진'스캐너가 장착되어 회전하는 디스크를 공 초점 현미경 및 공 초점 현미경은 고속 주사를위한 능력을 제공한다. 두 양식은 빠르고 적은 사진 독성보다 '클래식', 포인트 스캐닝 공 초점 현미경있는 장점이있다. 그러나, 회전하는 디스크 공 초점 현미경은 Z-해상도가 더 제한하고 포인트 스캐닝 공 초점 현미경으로 조직으로 같은 깊이 침투 할 수 없습니다. 마찬가지로, 공진 스캐너 공 초점 현미경의 응용 프로그램이 수 가난한 화질로 이어질 것입니다 매우 짧은 픽셀 체류 시간으로 제한 될 수있다,차례로, 서브 셀룰러 이벤트 (감소 된 신호 대 잡음 예, 이진 화상)의 검출을 방해.

넓은 필드와 공 촛점 영상이 여기에 강조하는 동안 마지막으로, 광학 현미경과 같은 두 광자 (59)와 빛 시트 현미경 (60)의 다른 형태는 특정 질문에 더 적합 할 수 있습니다. 이광자 현미경은 광 스펙트럼의 적외선 영역에서 두 개의 광자의 동시 흡수에 의한 형광 물질의 여기에 기초한다. 공 초점 현미경에 대해 공통적으로, 상기 샘플의 이미지를 획득하는 스캐닝 포인트를 사용 이광자 여기의 비선형 성으로 인하여 단면에 의한 광학적 성능을 갖는다. 형광 여기 긴 파장 광을 이용 수백 미크론 표면으로부터 깊이 이미징을 허용한다. 또한 작은 이미지 볼륨 여기의 제한은 초점면의 외부 사진 표백 및 사진 독성을 방지 할 수 있습니다. 그러나, 모든 FPS 빨간색 FPS 특히 유행 문제 높은 광자 흡수 횡단면을 갖는다. 또한, 동시에 다수의 별개의 FPS를 자극 할 수있는 단일의 적외선 파장을 찾는 것은 멀티 채널 영상이 번잡하기 어렵다. 밝은 장 현미경은 시료를 여기하는 레이저 광 (전형적으로 2 내지 10 ㎛의 범위의 두께), 얇은 '용지'를 사용하여 고감도 카메라로 수직 각도이 조명 초점면에서의 형광 신호를 검출한다. 광학 단면은 한 번에 하나의면을 조사함으로써 달성된다. 여기 광이 제한 광 독성의 발생을 감소시킨다. 전체 조명면에서 형광 신호가 동시에 수집되기 때문에, 화상 취득 포인트 스캔 공 초점 및 다 광자 현미경보다 훨씬 빠르다. 이러한 모든 특성은 높은 시공간 해상도와 동적 셀룰러 이벤트를 이미징 할 빛 시트 현미경 특히 적합하다실제 샘플들의 대량. 실제로, 전체 제브라 피쉬 배아에서 사용하는 빛 시트 현미경 세포의 운명은 포괄적 개발 (61)의 첫 24 시간 동안 추적했다. 더 나은 영상 침투 (62, 63) 및 공간 분해능 (64)에 대한 지속적인 개선, 빛 시트 현미경은 세포에서뿐만 아니라 전체 제브라 피쉬 배아에서 세포 내 수준에서뿐만 아니라 역학을 조사하기 위해 사용됩니다 생각할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징
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Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

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