Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In vivo avbildning gir direkte visualisering av cellulære atferd i den mest fysiologisk sammenheng. Gjennomsiktigheten sebrafisk embryoer, deres raske og ekstern utvikling og et rikt utvalg av genetiske verktøy som tillater fluorescerende merking har alle bidratt til den økende bruken av in vivo mikroskop for å belyse dynamikken i viktige utviklings hendelser. Imaging studier av nervesystemet utvikling i sebrafisk har for eksempel kraftig utvidet vår kunnskap om oppførselen til nevrale stamceller og skjebnen til deres avkom inkludert deres påfølgende migrering, differensiering og krets integrering 1-8.

Scenen er nå satt til å etterforske de subcellulære dynamikken bak disse cellulære atferd. Faktisk, sebrafisk er allerede blir utnyttet som verktøy for in vivo cellebiologi. Det er nå mulig å visualisere mitokondriene 9-11, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15Den microtubule fire og aktin 16 cytoskjelettet, endosomer 17 og komponenter av den apikale membranen komplekse 1,18, blant annet subcellulære strukturer i sebrafisk embryoer in vivo. Så langt, mye av det som er kjent om funksjonen til disse organeller kommer fra å studere deres oppførsel i dyrkede celler. Mens in vitro studier har gitt enorm innsikt i cellebiologi, har celler i kultur ikke fullt ut representerer kompleksiteten i in vivo situasjon og derfor ikke nødvendigvis gjenspeiler funksjon og dynamikk subcellulære organeller in vivo. Sebrafisk embryo tilby en levedyktig in vivo alternativ til å undersøke subcellulære dynamikk.

Som virveldyr, sebrafisk har mange organsystemer (for eksempel neurale netthinnen) som er homologe med de som finnes i pattedyrarter. I tillegg er sebrafisk embryoer i økende grad brukt til å modellere menneskelige sykdommer 19,20 (f.eks Microcephaly 21 og Leber er medfødt synstap 22) og mitokondrienes funksjon (for eksempel Parkinsons sykdom 23, tauopatier 10,24 og Barth syndrom 25). In vivo avbildning på celle og subcellulære nivå i slike tilfeller vil muliggjøre en bedre forståelse av cellebiologi bak disse patologiske tilstander.

Det overordnede målet med metodene beskrevet her er for å gi en omfattende guide til å undersøke organeller og andre subcellulære strukturer i sebrafisk embryoer ved hjelp av in vivo lysmikroskopi. Hele arbeidsflyten involvert i å visualisere og sporing subcellulære strukturer in vivo er beskrevet - fra genetiske merking tilnærminger, for å generere forbigående uttrykke og stabil transgen fisk, og til slutt til bildebehandling ved hjelp av bred-feltet og konfokalmikroskopi. Selv om hver av disse procedures blir brukt av mange laboratorier sebrafisk, blir protokollen beskrevet optimalisert og strømlinjeformet for å undersøke dynamikken i subcellulære strukturer. To spesifikke aspekter av arbeidet som er beskrevet her, garanterer nevnes: For det første, anvendelse av Gal4-UAS-ekspresjonssystem i flere konfigurasjoner for å genetisk etikettorganeller i spesifikke celletyper. For det andre, en direkte sammenligning av bredt felt og konfokalmikroskopi til bilde subcellulære strukturer in vivo.

Aktuelle strategier til genetisk label organeller og andre subcellulære strukturer i sebrafisk enten gjøre bruk av avkortet mRNA 1,4,8 eller DNA-baserte konstruksjoner hvor promotorelementer direkte drive uttrykk for fusjonsproteiner 9,14,15. In vitro transkriberte avkortet RNA resultater i hurtig og bred uttrykk, er det ikke vevsspesifikt men. I tillegg uttrykk nivåer avta over tid som avkortet RNA er fortynnet eller degradert. Anvendelsen av RNA-basertekonstruerer å undersøke organelledynamikk ved senere stadier i utviklingen er begrenset (vanligvis opptil tre dager etter befruktning).

Disse begrensninger kan overvinnes ved hjelp av DNA-konstruksjoner, hvor romlig og tidsmessig kontroll av ekspresjon blir bestemt av spesifikke promotorelementer. Når DNA-baserte konstruksjoner blir brukt i sammenheng med de Gal4-UAS system betydelige forbedringer av transgenet ekspresjonsnivåer er observert 26,27. I dette todelt ekspresjonssystem, celletypespesifikke promotorelementene drive ekspresjonen av en transkripsjonen aktivator Gal4, mens rapportørgener er klonet nedstrøms for Gal4-bindende oppstrøms aktiverende sekvens (UAS). Ved å kombinere UAS reportere med passende GAL4-drivere, kan ekspresjon være begrenset til spesifikke celletyper, å omgå behovet for å klone rapportørgener bak forskjellige promotorer hver gang et bestemt mønster ekspresjon er ønsket. Videre kan ekspresjon av multiple UAS rapportørgener blidrevet av en enkelt Gal4 aktivator. Gal4-UAS system tilveiebringer således en allsidig og fleksibel genetisk metode for subcellulære merking.

Wide-field og confocal mikroskoper er arbeidshestene i de fleste laboratorier. Bred-felt-systemer bruker vanligvis en bue lampe som lyskilde, og detektere det utsendte lys med en følsom kamera som er plassert ved enden av lysbanen. Dette avbildningsfunksjonalitet er vanligvis begrenset til tynne prøver som ut-av fokus lys tilslører fokus informasjon i tykkere prøver. Confocal mikroskoper avvike fra bredt felt systemer ved at de er bygget for å favorisere signaler som kommer fra fokalplanet fremfor de som kommer ut av fokus (dvs. "optisk snitting") 28. For å oppnå optisk snitting et pinhole er plassert i emisjonsbanen i et konjugat stilling til den punktlyskilde. Lasere brukes som lyskilder og er registrert signaler med fotomultiplikatorrør (PMTs). Praktisk talt en laserbjelke dras over prøven punkt-til-punkt og fluorescensemisjonen på hvert sted (bildeelement) blir detektert av PMT.

Her har vi bilde de samme subcellulære strukturer i levende sebrafisk embryoer med både bredt felt og konfokalmikroskopi å gi en direkte sammenligning av begge mikros modaliteter. Den underliggende sikte på å gi slike sammenligninger er å tilby retningslinjer for å velge den mest hensiktsmessige mikroskopi teknikk for det spesifikke spørsmålet på hånden.

Bruke metoder som beskrives her vi demonstrere Gal4-UAS basert genetisk merking av mitokondrier og centrosomes. Disse organeller er avbildet i forskjellige celletyper i nervesystemet og i muskelceller ved hjelp av bred-felt og konfokalmikroskopi å demonstrere egnetheten av hver avbildingsmodalitet. Metodene som beskrives her kan lett tilpasses for å undersøke andre organeller og subcellulære strukturer i den levende sebrafisk embryo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til lokale forskrifter fra myndighetene i Øvre Bayern (München, Tyskland).

1. merking Organ og andre subcellulære strukturer

MERK: Her genetisk reporter konstruerer at fluorescently tag centrosomes, mitokondrier og cellemembraner er beskrevet.

  1. Bruk vanlige kloningsmetoder 29 for å generere fusjonsproteiner som fluorescerende etiketter til centrosomes og mitokondrier. Klone den kodende sekvens av sebrafisk centrin4 (cetn4) i leseramme med en fluorescerende protein 2 (FP) som gul fluorescerende protein for å generere cetn4-YFP. Klone den mitokondrielle målretting sekvensen til subenheten VIII av cytokrom c oksidase i leseramme med en FP som Cyan fluorescerende protein for å generere mitoCFP 9-11.
  2. For å begrense uttrykk for fusjonsproteiner (cetn4-YFP eller mitoCFP) til bestemte celler i zebrafish embryo (f.eks nerveceller eller muskelceller) bruke todelte Gal4-UAS uttrykk system 26,27. Først generere en UAS reporter konstruere. Bruk av konvensjonelle metoder for å klone fusjonsproteinet i en UAS ekspresjonsvektor, nedstrøms for Gal4-bindende kassett UAS (varianter varierer fra 1x til 14x UAS, se Diskusjon) 26,27,30 og en minimal promoter (E1B basal promoteren fra karpe βactin genet), og generere UAS: cetn4-YFP og UAS: mitoCFP.
    MERK: For å forberede UAS reporter konstruerer for stabil transgen linje generasjon flere elementer må være klonet (se 3 nedenfor)
  3. For å visualisere mobil konteksten som centrosomes eller mitokondriene er merket, generere UAS reporter konstruerer der cellemembraner er merket med fps. Klone de første tjue aminosyrene av sebrafisk Gap43 (inneholder palmitoylation nettsteder) i-ramme med en FP å målrette at FP til cellemembranen (memFP) 31,32.
  4. Obtain driver konstruksjoner eller transgene linjer hvori celletypespesifikke promotorelementene drive ekspresjonen av den transkripsjonelle aktivator Gal4-VP16 27, Gal4FF 33 eller KalTA4 30.
  5. Kombiner UAS reporteren konstruerer med en passende driver konstruksjon for å begrense uttrykket til den ønskede celletype av interesse (for eksempel i nerveceller eller muskelceller). For å gjøre dette samarbeidet injisere Gal4 driver og UAS reporter konstruerer på en celle stadiet av befruktede egg (for detaljerte instruksjoner se 2 nedenfor) for å generere forbigående uttrykker fisk. Alternativt generere en UAS reporter stabil transgen linje (for detaljerte instruksjoner se 3 nedenfor) og kryss til en Gal4 driver stabil transgen linje for å generere avkom bærer begge transgener.
    MERK: Det er også mulig å injisere UAS reporter konstruere / s inn befruktede egg fra en Gal4 driver stabil transgen linje eller en Gal4 driver bygge inn fertilized egg fra en UAS reporter stabil transgene linjen.
  6. Å co-express flere distinkte fusjonsproteiner ved hjelp av Gal4-UAS system, bruk en Gal4 driver og UAS reporter / s på en av følgende konfigurasjoner: A. Multiple, separate UAS reporter konstruksjoner (f.eks UAS: mitoCFP og UAS: memYFP co -injected med en Gal4 driver konstruksjon) 10, B. Flere UAS kassetter på en enkelt reporter (f.eks UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Toveis UAS reporter (f.eks UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (figur 1).

Figur 1
Figur 1. Strategier for å co-express fusjonsproteiner ved hjelp av Gal4-UAS system.
Co-ekspresjon av flere fusjonsproteiner kan oppnås ved hjelp av UAS rapportør kassetter i forskjellige konfigurasjoner: (A) multiple, separate UAS-drevet constructs, (B) flere UAS kassetter på en enkel konstruksjon eller (C) en toveis UAS kassett på en enkelt konstruksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Generer Forbigående uttrykke Fish

MERK: Følgende er en tilpasning av tidligere publiserte protokoller 34,35. En grunnleggende injeksjon oppsett bør omfatte en stereomikroskop med en forstørrelse opp til 12x, en micromanipulator med en mikropipette holder og en kilde til lufttrykket. Forbered 02.01 til 02.05 på forhånd:

  1. For å fremstille egg mikroinjeksjon kamre, fremstille en oppløsning av 1,5% (w / v) agarose i vann. Legg agarose pulver til vann og mikrobølgeovnen til agarose er fullstendig oppløst. Fyll en petriskål (100 x 15 mm) med denne løsningen.
    1. Tillat agarose oppløsningen å kjølne til ca.oximately 45 ° C før de plasseres en plastmikroinjeksjon form (40 mm x 66 mm, med 6 x 50 mm lange rygger som er 1,5 mm bred, 1 mm dyp og i avstand 3 mm fra hverandre) på overflaten av den smeltede agarose, tar seg ikke å innføre bobler ved grenseflaten.
    2. Etter agarose sett, oppbevares ved 4 o CO / N. Fjern forsiktig formen med en slikkepott. Forbered flere mikroinjeksjon kamre om gangen, oppbevares ved 4 o C og bruke gjentatte ganger over flere uker.
  2. Bruk en mikropipette avtrekker for å generere glass injeksjonskapillærer med en lang skaft 36.
    MERK: De spesifikke innstillinger som brukes til å generere injeksjonskapillærer bør bestemmes empirisk. Injeksjon kapillærer kan trekkes på forhånd og lagres før bruk.
  3. Måle konsentrasjonen av plasmid DNA (Gal4 driver og UAS reporter konstruksjoner) for mikroinjeksjon ved hjelp av et spektrofotometer henhold til produsentens manual. Måle60, er forholdet mellom absorbans ved 260 nm og 280 nm (A260 / 280). Fortynn DNA til en endelig konsentrasjon på 100 ng / mL i nuklease-fri vann.
    MERK: En A260 / 280-forhold på ~ 1,8 betyr ren DNA. Vurder å bruke et kommersielt kit (basert på silika-binde- matriks) for å rense plasmid-DNA som skal brukes for injeksjon. Plasmid DNA bør være av høy kvalitet for å forhindre toksisitet.
  4. Forbered 10 ul injeksjonsblanding ved å kombinere DNA (0,5 til 2,5 mL av en 100 ng / ul lager for en endelig konsentrasjon på 5 til 20 ng / mL), Danieau løsning (0,33 mL av 30x lager), fenolrødt (0,25 ul, valgfri) og nuklease-fritt vann til en 10 pl totalvolum.
    MERK: Empirisk bestemme konsentrasjonen av DNA som gir passende uttrykk. Gal4 driver og UAS reporter plasmider må være co-injisert. Ingen uttrykk vil følge når bare Gal4 driver eller UAS reporter plasmid injiseres i villtype befruktede egg. Hvis derimot than befruktede egg er fra en Gal4 driver linje deretter injisering av en eller flere UAS rapportør plasmider tilstrekkelig. Motsatt, hvis microinjecting inn i en UAS reporter linje, bare Gal4 føreren plasmidet må injiseres. Til slutt, mens fenolrødt kan i stor grad hjelpe til å visualisere injeksjoner, er det også en fluorescerende forbindelse i seg selv. Derfor kan Fenol Red skjule visualisere fps hvis bildebehandling er planlagt før 24 timer etter befruktning (HPF) som det ikke kan være tilstrekkelig utvannet av denne tiden.
  5. Kvelden før injeksjoner er planlagt, satt opp flere par (typisk 5-10) av mannlige og kvinnelige sebrafisk for avl. Bruk avl tanker med en innsats som inneholder en gitterbunn og en avtakbar separator for å separere hann- og hunnfisk.
    MERK: Mannlige og kvinnelige sebrafisk kan generelt være preget av sin kroppsfasong. Menn har en tendens til å være slank mens kvinner har en tendens til å vise en ventralt utstående buk. Hanner i tillegg en tendens til å ha en gul-rød coløringen på sin ventral mageområdet.
  6. Umiddelbart før DNA-injeksjoner, fjerne skillevegger slik at mannlige og kvinnelige å pare seg. Omtrent 15 til 30 minutter etter fjerning av deleren, sjekk for egg på bunnen av tanken. Overfør voksen fisk ved hjelp av en fiske-net til en ny avl tank.
  7. Hell vannet, som inneholder de nylig lagt befruktede egg, ut av avl tanken inn en sil (for eksempel en plast te-sil). Vask eggene i silen med en sprayflaske som inneholder Danieau løsning. Snu sil på en petriskål og bruke en sprayflaske med Danieau løsning for å gjenopprette alle eggene (vanligvis 50 til 200 egg per ynglende par av voksen fisk).
  8. Ved hjelp av en microloader pipette, back-fylle en trakk injeksjon kapillær med DNA-injeksjon-mix. Monter injeksjon kapillært til innehaveren av en micromanipulator og trim spissen, under visuell kontroll av en stereomikroskop, ved hjelp av pinsett til å skape en mikropipette som kan penetrate chorion og cellecytoplasmaet og være i stand til å levere et passende volum av DNA.
    MERK: Graden til hvilken tuppen av injeksjons kapillær er trimmet bør bestemmes empirisk og kan best bli dømt ved injisering egg.
  9. For å bestemme volumet av DNA for injeksjon, slippe ut en dråpe av injeksjonsoppløsningen i mineralolje. Mål radien (r) av dråpen ved hjelp av en kalibrerings mikrometer og beregne dens volum (4/3 π r 3). Modulere volumet ved å justere sprøytetrykket og / eller varigheten av hver puls injeksjon.
  10. Ved hjelp av en plast pipette overføre alle de innsamlede egg (vanligvis 50-200, fra 2,7 ovenfor) i grøfter i en mikroinjeksjon kammer. Under den visuelle kontroll av et stereomikroskop, bruker tang for å orientere egg slik at cellen cytoplasma (gjennomsiktig) og eggeplomme (tett, ikke-transparent) lett kan identifiseres.
  11. Under den visuelle kontroll av en stereomikroskop, injisere DNA i cellen cytoplasma av befruktede egg, og påse at den injiserte volum (1-2 nl) tilsvarer ca 10% av cellens volum.
    MERK: Fenol rødt i de DNA-oppløsningshjelpemidler i visualisering av volumet injisert.
  12. Etter injeksjon, løsne eggene fra skyttergravene av injeksjon mold ved å skylle dem med en sprayflaske som inneholder Danieau løsning. Deretter overføre eggene i en fersk petriskål med en plast overføringspipetten og opprettholde en 28,5 o C inkubator.
  13. Oppretthold un-injiserte egg som kontroller for å avgjøre om injeksjoner bidra til høy dødelighet, enten som følge av fysiske skader påført under mikropipette penetrering eller DNA mix.
    MERK: Høy dødelighet etter injeksjoner kan skyldes mange faktorer, blant annet for høy DNA konsentrasjon eller injeksjonsvolumer og / eller plasmider med Contaminants. For å forhindre forgiftning av lav kvalitet, DNA-preps, kan kommersielle sett (basert på silika-binde- matrise) skal brukes.
  14. Med jevne mellomrom etter injeksjonene, kan du bruke en stereomikroskop for å screene for ubefruktede egg og døde eller misdannede fostre og kast disse.
    MERK: Anser eggene som synes å være på en celle trinns flere timer etter befruktning, som ubefruktet. Identifisere ugyldige embryoer ved grove anatomiske defekter som en kompromittert anterior-posterior kroppens akser. Amorft materiale innenfor en chorion tyder på at fosteret ikke gå gjennom utviklingsstadier og døde. For å fastslå om embryoer som ble microinjected gjennomgå en normal løpet av utviklingen rådføre anatomiske atlas 37.
  15. Overfør embryoene som bruker en plast overføringspipetten til Danieau løsning som inneholder 1x 1-fenyl-2-tiourea (1xPTU) mellom 10 og 24 HPF å hindre pigment formasjonen. Opprettholde embryoene i Danieau løsning fortseller innelukker PTU for varigheten av forsøket.
    MERK: I tillegg til Melanophores kan iridophores på overflaten av huden være problematisk for avbildning. Mens PTU ikke hemmer iridophore formasjon, mutant linjer med redusert antall iridophores som roy orbison (roy) finnes og kan brukes 38.
  16. Etter embryo luke (vanligvis på den andre eller tredje dagen etter befruktning, to eller tre DPF), forkaste chorions og utveksle Danieau løsning som inneholder PTU.
    MERK: Disse trinnene er viktig for å sikre kvaliteten av embryoet medium og levedyktighet av friske fostre.

3. Generer Stabile transgene linjer

MERK: Stabil transgene linjer kan effektivt generert ved hjelp av Tol2 transposon system. En Tol2 transposon vektor som inneholder transgenet av interesse er co-injisert sammen med mRNA som koder for transposase enzymet inn Gjødsled egg ved en-cellestadiet. Transposase protein fra det injiserte mRNA katalyserer fjerning av transgenet kassetten fra transposon vektoren og dens integrasjon inn i genomet 39.

  1. Klone den transgene rapportør kassetten (som UAS: mitoCFP) mellom Tol2 inverterte terminale gjentagelser i en av de Tol2 vektorene i dag benyttes i fellesskap sebrafisk som beskrevet 40.
    MERK: Tol2 vektorer som inneholder en valgbar kassett der promotorelementer driver FP uttrykk i organsystemer som ikke er relatert til området av interesse (for eksempel hjerte 41 eller objektiv 42) er nyttige for screening UAS reporter transgene linjer i fravær av Gal4 trans.
  2. Anvendelse av et kommersielt kit (basert på silika-binde- matrix), rense plasmid-DNA som skal brukes for injeksjon. Kontroller at plasmid DNA er av høy kvalitet for å unngå toksisitet.
  3. Transkriber Tol2 transposase-koding mRNA ved hjelp av enpassende transkripsjonsvektor som PCS-TP 43. Kort, linearize PCS-TP og bruke et kommersielt kit å generere avkortet mRNA og følg produsentens protokoll. Pass på å unngå forurensning med RNases (f.eks bruke RNase-fritt pipettespisser og rør). Delmengde av RNA, i en konsentrasjon på 100 ng / ul, for engangsbruk og oppbevares ved -80 o C.
  4. Om morgenen den injeksjoner, tine en delmengde av transposase mRNA på is. Bland transposonet DNA-vektor (2 ul av 100 ng / mL) og transposase mRNA (2 ul av 100 ng / ul) i et 1: 1 forhold, og tilsett 6 ul RNase-fritt vann for å bringe det totale volumet til 10 ul.
    MERK: En konsentrasjon på 20 ng / ul anbefales for hver enkelt, men den optimale konsentrasjonen skal bestemmes empirisk. Bruk RNase-fritt vann for fortynning. Bruk hansker ved håndtering av DNA-RNA-injeksjon blanding og holde den på is for hele perioden av injeksjoner for å hindre nedbrytning av mRNA.
  5. Ved hjelp av detaljerte instruksjoner i punkt 2 ovenfor, injisere DNA-RNA injeksjon bland inn befruktede egg i en celle stadiet. Under visuell kontroll av en stereo målrette cellen cytoplasma i en celle scenen for de høyeste tallene for transgenesis effektivitet. Opprettholde de injiserte embryoer på 28,5 o C til den er klar til å screene for transgene uttrykk.
    MERK: PCR kan gjøres for å sjekke for effektivisering av Tol2 transposase som tidligere beskrevet 44.
  6. Skjerm embryo i en petriskål for transgenesis hjelp okulars av en fluorescens dissekere mikroskop.
    MERK: Bruk passende filter sett av mikroskop for å visualisere FP uttrykk for valg kassett (dvs. fluorescens i hjertet eller objektivet) på 2 eller 3 dpf. Identifisere potensielle transgene embryoer ved uttrykket (i hjerte eller objektiv) og heve disse embryoer til voksen alder (F 0 generasjon) ved hjelp av standardprotokoller 45. Alternativt identifisere potensielle transgene embryoer ved PCR som beskrevet i 46.
  7. Når UAS reporter F 0 fisk er 2,5 - 3 måneders alder, krysse dem (se 2.5 for detaljer) til ikke-transgen villtype fisk å skaffe egg til å etablere en F 1 generasjon. Alternativt krysse UAS reporter F 0 fisk til en Gal4 driver linje for å etablere en F 1 generasjon. I det sistnevnte tilfelle kan UAS-drevne transgenet bli direkte overvåket i embryoene som oppnås fra korset.
  8. Bruke et fluorescens mikroskop dissekere å screene F 1 embryoer for ekspresjon av transgenet eller valgbare kassett.
    MERK: Når uttrykket er bekreftet deretter transgenet kan sies å være germline overført. Transgenesis er ikke-mendelsk ved F 0 trinnet. Antall embryoer uttrykker transgenet kan variere fra et lite antall til de aller fleste i individuell clutches. Transposonet integrere i forskjellig F 0 fisken kan variere sterkt, noe som resulterer i forskjellige uttrykk mønstre. Derfor opprettholde F en fisk fra forskjellige F 0 gründerne som separate underlinjer. Transposon integrasjoner i F en fisk er stabil og er gått inn på senere generasjoner i en mendelsk måte.
  9. Opprettholde hver F 0 fisk i egne tanker for å re-identifisere transgene bærere.

4. Klargjør Embryoet for avbildning på en oppreist mikroskop

MERK: Prosedyrene som beskrives her er optimalisert for bildebehandling på stående mikroskoper med lang arbeidsavstand vann-dipping-cone mål.

  1. Bruk en fluorescens dissekere mikroskop for å screene embryoer for transgene uttrykk.
    MERK: Ekspresjon av et UAS reporter transgenet, vil avhenge av den spesifikke Gal4 driver linje brukt. Velg embryoer for bildebehandling eksperimenter basert på ønsket expression mønster.
  2. Overfør de valgte embryoer ved hjelp av en plast pipette til en separat petriskål som inneholder Danieau buffer med 1x PTU og 1x Tricaine.
    MERK: Når merking er sparsom (bare noen få celler i et organ system) monter embryoene i agarose (se 4.3 til 4.7 nedenfor) og skjerm for transgene uttrykk ved hjelp av et bredt felt mikroskop med høy forstørrelse mål (se 5.1 nedenfor). Tricaine anesthetizes fisk og bør være effektive i løpet av sekunder. Hvis fisken ikke er immobilisert er det sannsynlig at Tricaine er degradert. Mulige årsaker til dette nedbrytning omfatte dårlig lagring av Tricaine, som er lys-sensitive 47.
  3. Klargjør agarose for å legge fisken ved oppløsning av lavtsmeltende agarose pulver i Danieau buffer til en sluttkonsentrasjon på 0,7%. Alikvoter (1 ml) og holde i en varmeblokk ved 40 ° C inntil de er klare til bruk.
    MERK: Høyere Konsentraterioner av agarose (opp 1,5%) kan også brukes til å legge fisk.
  4. Tilsett 50 pl av en 20 x lager av Tricaine og 20 pl av en 50 x stamløsning av PTU til 1 ml alikvot av lavtsmeltende agarose og bland godt ved å peke på siden av røret. Returnere røret til varmeblokken. Ved hjelp av en plast overføring pipette, forsiktig pipette et par (1-10) bedøvet embryoer inn i agarosen, overfører så lite væske som mulig for å unngå fortynning av agarose.
  5. Ved hjelp av en plast pipette overføre alle embryoene med en liten mengde av agarose til en glassbunn petriskål.
  6. Arbeider relativt raskt ved å bruke tang for å posisjonere embryoene i den ønskede orientering, avhengig av strukturen som skal avbildes.
    MERK: Orient embryoer på sin side hvis netthinnen eller Rohon-Beard (RB) sensoriske nevroner skal avbildes.
  7. Tillat agarose for å stivne i minst 15 minutter. Legg Danieau buffer inneholder 1xPTU og 1xTricaine å dekke embryoene innebygd i Agarose. Sett fatet inneholder agarose-embedded embryo i en inkubator ved 28,5 o C til den er klar til bildet.

5. Imaging Cellular og subcellulære strukturer ved hjelp av Wide-field eller konfokalmikroskopi

MERK: Wide-field mikroskopi og punkt-scanning konfokalmikroskopi er de mest brukte modaliteter til bilde fluorescensmerkede sebrafisk embryoer Tabell 1 oppsummerer de viktigste fordeler og ulemper ved begge systemene.. For begge former for mikroskopi blir embryoer montert i agarose som beskrevet i 4 ovenfor, og opprettholdt ved 28,5 ° C gjennom hele forsøket avbildning ved hjelp av et varmekammer på scenen av mikroskopet. Viktigere er parabolen med agarose-embedded embryoer lov til å stabilisere seg til 28,5 o C før bildebehandling starter som temperatursvingninger føre til drift i z-dimensjonen. Når du driver langsiktig bildebehandling eksperimenter (i løpet av Several timer), plassere en pleksiglassdeksel over petriskål for å redusere fordampning av buffer.

Wide-field Point-skanning konfokalmikroskoper
Koste relativt billig Dyrt (ca. 5x mer)
Photo-bleking Lav Høy. Prøven blir utsatt for laserlys over og under midtplanet.
Photo-toksisitet Lav Høy (se foto-bleking ovenfor)
Oppkjøp hastighet Rask Langsom
Oppløsning i xy Abbe lov Abbe lov (kan forbedres ved appen 40% ved hjelp av et meget lite hull,. Men ide fleste innstillinger dette har liten praktisk anvendelse)
optisk seksjonering Dårlig Ja (kan reguleres ved pinhole størrelse)
vevspenetrasjon Begrenset til overfladiske strukturer (f.eks Rohon Skjegg celler eller muskelfibre) Begrenset til <100 mm fra overflaten av embryoet

Tabell 1. Generelt sammenligning av bredt felt og punkt-scanning konfokalmikroskopi

  1. Wide-field mikroskopi
    MERK: Her retningslinjer er gitt for å avbilde sebrafisk embryoer ved hjelp av en oppreist wide-feltet mikroskop med lang arbeidsavstand vann-dipping-cone mål. Mikroskopet er utstyrt med et avkjølt CCD-kamera, og filtersett for å visualisere ulike fluorophores montert på en automatisert filterhjul for rask anskaffelse av flere kanaler.Image oppkjøpet er kontrollert av μManager, en åpen kildekode mikrosprogramvarepakke 48. Et spesifikt eksempel for avbilding av mitokondrier i RB sensoriske neuroner er gitt. RB-celler er genetisk merket ved hjelp av membran målrettet YFP og deres mitokondrier er CFP-merket (se 1.1 ovenfor).
    1. Mount embryoer på sin side i lavtsmeltende agarose som beskrevet i 4 ovenfor.
    2. La tallerken med montert fisk å stabilisere seg til 28,5 o C i et varmekammer på scenen av mikroskopet før du begynner bildebehandling.
    3. Bruke en lav forstørrelse vann-dyppe-kjegle objektiv og se gjennom okularene i mikroskop for å velge et område på overflaten av embryoet av bildet.
      MERK: Hvis stabil transgen MitoFish reporter linje, Tg (UAS-E1B: mYFP, mitoCFP) mde6, brukes sammen med en sjåfør linje som høgskolen: Gal4 da mest RB nevroner er merket, og vises som en tett mesh-verk av neurite arbors på overflaten av embryoet. Hvis mikroinjeksjon av DNA-konstruksjonene blir brukt til å oppnå sparsom merking (f.eks Sensory: Gal4-VP16 med UAS: mitoCFP og UAS: MA-YFP), skjerm embryoer for å identifisere dobbel-merket celler.
    4. Åpne mikroskop programvare (μManager 1.4) og klikk på "Illumination '" under "Konfigurasjonsinnstillinger" for å definere de riktige filtersett for bølgelengden av interesse (YFP eller CFP for gjeldende eksempel). Under "Kamerainnstillinger" enter eksponeringstid som kreves for å skaffe en egnet bilde.
      MERK: "Illumination Innstillinger" er forhåndsinnstilt av brukeren ved installasjon av programvaren og er lastet når du åpner μManager. Hvis programvaren ikke er konfigurert til å styre filterhjul, manuelt flytte filterhjul i dreieskiven til riktig posisjon.
    5. Bytt til en lang arbeidsavstand vann-dipping-kjegle objektiv som strekker seg fra 40-100x forstørrelse. Velgemålet som har høyest numerisk apertur (NA) og kromatisk korrigert (apochromat).
    6. Klikk på "Live" for å velge synsfeltet: I tilfellet av RB-neuron bilde mitokondriell transport på stammen axon, som kommer fra cellelegemet, eller i det perifere Arbor.
      MERK: perifere lysthus av RB nevroner i halefinnen fold av embryo gir en ideell mulighet til bilde et stort synsfelt som er flat og kan derfor være fanget på en enkelt ramme med et bredt felt mikroskop. Det er derfor viktig å montere embryo som kategorisk som mulig på siden, slik at halefinnen fold er parallell med bunnen av petriskålen.
    7. Når du har valgt et synsfelt, klikk på "rektangulær markering" -knappen i ImageJ menyen, definere en region av interesse (ROI) og klikk på "ROI" i μManager vinduet. Når du har valgt ROI for bildebehandling, klikk på "Stop" og "Lagre" for å take et bilde av YFP kanal for å ta opp lokal morfologi av neurite / s.
    8. Å bilde mitokondrie transport klikke på "Multi-D ACQ." knapp. Observere et ekstra vindu ( "Multi-dimensjonale Acquisition") og velg antall time-punkter samt intervallet mellom tidspunktene i dette vinduet. Bruk bildefrekvens på 0,3-1 Hz. Gjennomføre opptak i minst 10 minutter for å samle så mange datapunkter som mulig.
    9. I "Multi-dimensjonale Acquisition" -vinduet, klikk på "kanaler", legge til og definere bølgelengden for bildebehandling (CFP for mitokondrier i dette eksempelet) og eksponeringstiden. Hold eksponeringstider til under 400 msek for bildebehandling mitokondrielle transport.
    10. Klikk på alternativet "Lagre bilder" i "Multi-dimensjonale Acquisition" vinduet, for å automatisk lagre filene i en bestemt mappe skissert i "katalogen root. Klikk på "Acquire" i øvre høyre hjørne for å starte time-lapse imaging.
    11. omstille manuelt fokus mens intervallopptak for å kompensere for eventuelle drift i z dimensjon.
      MERK: Ved hjelp av disse parametrene mitokondrie transport i RB nevroner kan avbildes så lenge som fire timer.
  2. konfokalmikroskopi
    MERK: Her retningslinjer er gitt for avbildning med en oppreist Olympus FV1000 confocal mikroskop og lang arbeidsavstand vann-dipping-cone mål. Mikroskopet er utstyrt med flere laserlinjer og flere detektorer (konvensjonelle PMTs og mer følsomme galliumarsenid phosphide detektorer) som gir mulighet for flerkanals bildebehandling. Spesifikk henvises til Olympus Fluoview programvare. Imidlertid bør bildeparameterne som er beskrevet her være lett overførbar til andre confocal systemer.
    1. Mount embryoene i lavtsmeltende agarose i en retning som passer for det organ / struktur som skal avbildes, slik som beskrevet i 4 over.
    2. o C i et varmekammer på scenen av mikroskopet før du begynner bildebehandling.
    3. Bruk lang arbeidsavstand vann-dipping-membran mål for confocal mikroskoper i oppreist konfigurasjon. Velg mål med høyest mulig NA å maksimere mengden av fluorescerende signaler som kan samles og har det beste oppløsningsevne. Når samle bilder fra flere kanaler å velge kromatisk korrigert mål (apochromat).
    4. Åpne mikroskop programvare og klikk på "Trans Lamp" eller "Epi Lamp" for å bruke enten sendes eller fluorescens lys henholdsvis å identifisere regionen av interesse via okulars av mikroskopet.
    5. Bruke programvaren til å sette opp følgende skanneparametre for å skaffe bildestakker:
      1. I "Acquisition Setting" vinduet bekrefte at målet valgt for bilde matcher objektiv som vises på rulle down meny med tilgjengelige mål.
        MERK: Dette er for å sikre at eventuelle forhåndsberegnede parametere for et bestemt mål (for eksempel lateral og aksial oppløsning, størrelsen på confocal blenderåpning etc.) holde til stede og kan sikkert brukes.
      2. Velg riktige laser linje / s, og eksitasjon og emisjon dikroiske filtre til bilde bestemt fluorescerende protein (er). Gjør dette ved å klikke på "Dye list" -knappen i "Image Acquisition Control" vinduet og velg riktig fluoroforen / s. Alternativt kan du klikke på "Light banen og fargestoffer" for å sette disse parametrene manuelt.
        MERK: Når "Dye List" -knappen alternativet er valgt, velger programvaren automatisk riktige laserlinjer, eksitasjon og emisjons dikroiske filtre og justerer størrelsen på confocal blenderåpning på riktig måte.
      3. I "Acquisition Setting" vinduet, justere "Zoom" faktor og "Size aspect ratio "(dvs. 512x512, 1024x1024 osv) for det skannede bildet for å få pikselstørrelsen er nødvendig for å best kan løse de strukturene som avbildes. Sett pikselstørrelsen til å være omtrent halvparten av teoretisk oppløsning på målet, og dermed følge Nyquist prøvetaking kriterier . for å bestemme pikselstørrelse på den ervervede bilde klikk på knappen med symbolet for informasjon ( "i") i "image Acquisition Control" vinduet.
      4. Sett skannehastighet for å raskest mulig (2 ps / pixel) i "Acquisition Setting" vinduet.
      5. I "Image Acquisition Control" vinduet, klikk på Kalman linjen i snitt å redusere noise.A faktor på 2-3 vanligvis tilstrekkelig.
      6. Velg en sekvensiell skanning modus når avbildning fluorophores med overlappende spektra. For å gjøre dette, klikk på "Sequential" og "Line" i "Image Acquisition Control" vinduet.
      7. Juster effekt av de relevante laser linje / s (typiskunder 5%). De spesifikke verdier må bestemmes empirisk.
      8. Klikk på "XY Repeat" eller "Fokus x2" eller "Fokus x4" for å kontinuerlig skanne det valgte området mens justering av detektor innstillinger for hver kanal. Juster "HV", "Gain" og "Offset" for hver kanal for å hente bilder som har den høyeste dynamiske området av grå verdier.
        MERK: De spesifikke verdier for disse innstillingene må bestemmes empirisk. "HV" justerer spenningen på detektoren for å endre sin følsomhet, "Offset" justerer utgangssignalet fra detektoren og "Gain" multipliserer utgangssignalet fra detektoren med en konstant faktor.
      9. Trykk Ctrl + H for å visualisere de oppkjøpte bilder via en look-up table (HiLo) som identifiserer undermettet (vises blå) og over-mettet piksler (vises rød), som begge bør generelt unngås. Re-evaluere effekt av det aktuelle laser line / s og detektor innstillinger.
        MERK: Ved hjelp av høy laser makt og høye nivåer av "HV" av detektoren vil føre til mer signal. Høyere laser makt vil imidlertid føre til økt bleking og fototoksisitet. Ved å øke "HV" vil føre til økt støy. Derfor må et kompromiss for å bli funnet når du setter laser makt og "HV" for å hente bilder med akseptable nivåer av støy samtidig hindre foto-skade (se også tabell 1).
      10. Samle bilder fra et definert volum ved å fokusere på de øvre og nedre grense for området av interesse. I "Acquisition Setting" -vinduet klikker du på "End Set" og "Start Set" faste knappene på z-stack vindu på de øvre og nedre grense for volumet som skal avbildes. Velge en trinnstørrelse som er halvparten av den z-oppløsning for den gitte objektiv (f.eks., Hvis z oppløsningen er 2 um velge en um). For å bestemme z-oppløsning av objective klikk på knappen med symbolet for informasjon ( "i") i "Image Acquisition Control" vinduet.
      11. Sett opp en tidsserie for å samle z-stabler på en tidsmessig frekvens som er egnet for dynamikken i subcellulære struktur som avbildes. I "Scan" sub-vinduet angir frekvensen som z-stabler bør være kjøpt ( "Intervall" ') og antall ganger bildene skal erverves ( "Num").
      12. Klikk på "Depth" og "Time" knappene i "Image Acquisition Control" vinduet for å bekrefte at en z-stack og tidsserier vil bli kjøpt. Til slutt klikker du på "XYZT" -knappen for å begynne å anskaffe tid-lapse bilder.
      13. Etter ferdigstillelse av bildet oppkjøpet, observere "Series Done" på programvaren grensesnittet. Klikk på den og lagre bildene i "OIB" format å spille inn bilder og metadata knyttet til dem.
        MERK: Bilder innhentet påwide-feltet mikroskop og konfokalmikroskop kan visualiseres og analyseres ved hjelp av programvare som FIJI, en gratis offentlig tilgjengelig bildebehandlingsprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her bruk av vidvinkel og konfokalmikroskopi til bilde mitokondrier og centrosomes i levende sebrafisk embryoer er direkte sammenlignet og kontrastert. Avhengig av plasseringen av cellene i hvilke organelle dynamikk skal bli undersøkt, og den iboende frekvens av de spesifikke subcellulære hendelser, vanligvis enten bred-felt eller konfokalmikroskopi er et bedre valg. Vi avbildes organeller i RB-neuroner som ligger på overflaten av embryoet og i retinale celler lokalisert dypere. Den overfladiske Plasseringen av RB-neuroner sammen med sine to-dimensjonal geometri gjør dem til gode kandidater for som avbildes av både bred-felt og konfokal mikroskopi (figur 2). Innhente bilder ved hjelp konfokalmikroskopi er imidlertid betydelig tregere og kan føre til en undervurdering av dynamikken i spesifikke subcellulære hendelser (f.eks bevegelse av mitokondrier, figur 2C, D (figur 3).

For å aktivere samtidig visualisering av organeller og cellulære membraner vi brukte Gal4-UAS system i tre forskjellige konfigurasjoner. Først den UAS MitoFish reporter linjen Tg (UAS-E1B: mYFP, mitoCFP) ble mde6 brukt. Her tillater en toveis UAS samtidig uttrykk for mitochondrially målrettede CFP og membran målrettet YFP. I kombinasjon med passende GAL4 driverlinjer, MitoFish merke mitokondrier og cellemembraner RB sensoriske nevroner (figur 2A-C) eller netthinnens celler (figur 3A, B) med CFP og YFP r espectively. For det andre, to UAS konstruerer (UAS: mitoCFP og UAS: MA-YFP) ble kombinert med en Gal4 driver konstruksjon (Sensorisk: Gal4-VP16, sensoriske nervecellen spesifikke forsterkerelementer fra holmen-1 genet) 7 i forbigående injeksjoner. Mosaikken uttrykk som generelt resulterer fra disse injeksjonene tillates sporing av individuelle celler i løpet av dager (figur 2E). En tredje metode som anvendes ved bruk av to UAS kassetter som hver driver ekspresjonen av et annet fusjonsprotein, med en enkelt, sammenhengende konstruksjon. Denne strategien ble brukt til å generere CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) Tum1, der en centrin4-YFP fusjon etiketter centrosomes og Cerulean er rettet mot cellemembraner. I kombinasjon med spesifikke GAL4 driver linjer centrosomes og cellemembraner av netthinneceller (figur 3C, D) eller muskelfibre (figur 4), er merket.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2: Imaging mitokondriene in vivo i RB sensoriske nevroner av embryonale sebrafisk.
RB sensoriske nevroner i caudal del av finnen fold av to dpf MitoFish ble fotografert ved hjelp av et apochromat 40x vann-dyppe-kjegle objektiv med et NA på 0,80, enten ved bred-felt (A) eller konfokal (B) mikroskopi. Paneler til høyre viser detalj av regionen skissert. C Wide-felt time-lapse bilder av et lite område av interesse i den perifere arbor av en RB nevron i to dpf MitoFish. Bevegelsen av en enkelt mitokondrie (pil i 0 '') ble sporet over 100 sekunder; seks tidspunkter vises. Plasseringen av mitokondrie i det foregående tids-punkt er skissert i magenta. D posisjonen til det bevegelige mitochondrion i C E Confocal bilder av en RB sensorisk neuron på 2 og 3 DPF. Merking av individuelle RB celler og deres mitokondrier ble oppnådd ved samtidig å injisere en sensorisk neuron-spesifikk Gal4 driver konstruere sammen med to UAS reporter konstruksjoner, UAS: mitoCFP og UAS: MA-YFP, på en cellestadiet og screening for isolert dobbel -merkede celler. Bildet er kontrasten invertert og individuelle mitokondrier er avbildet skjematisk som magenta prikker. Målestokk A, B 20 mikrometer, C 2 um,E 50 um. Mitochondrially målrettet CFP (mitoCFP), membran målrettet YFP (MA-YFP). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Sammenligning av bred-felt og konfokalmikroskopi å avbilde organeller in vivo i fosterhinnen sebrafisk.
Otx2 promotorelementene drive uttrykk for CFP i mitokondrier og YFP i cellemembraner (A og B) eller YFP i centrosomes og Cerulean i cellemembraner (C og D) i netthinnen av 2 dpf sebrafisk embryoer. For å oppnå dette merking mønster, Otx2: GAL4 transgene fisk ble enten krysset for å MitoFish (A og B) or CentrinFish (C og D). En 40x vann-dyppe-kjegle apochromat objektiv (NA 0,80) ble anvendt for å skaffe bilder av den samme region i hvert netthinnen ved hjelp av bred-felt (A, C) og konfokal (B, D) mikroskopi. Innfellinger i A og B viser detaljer av et område av den indre kjernesjikt, innfellinger i C og D viser en celle i M-fasen. Scale bar 20 mikrometer. Mitochondrially målrettet CFP (mitoCFP), membran målrettet YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), membran målrettet Cerulean (MA-Cerulean). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Sammenligning av bred-felt og konfokal mikroskopopier til bilde centrosomes in vivo.
En enkelt muskelfiber med fluorescerende merket cellemembraner og centrosomes (Otx2: Gal4; CentrinFish) ble fotografert ved hjelp av bredt felt (A) og confocal (B) mikroskopi. I begge tilfeller et 40x vann-dyppe-kjegle apochromat objektiv (NA 0,80) ble anvendt. Scale bar 10 mikrometer. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), membran målrettet Cerulean (MA-Cerulean) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her viser vi allsidigheten Gal4-UAS uttrykk system for å fluorescently tag mitokondriene, centrosomes og de ​​cellulære membraner av spesifikke celletyper in vivo i sebrafisk embryoer. Mange fluorescerende fusjonsproteiner denne etiketten andre organeller eller subcellulære strukturer kan finnes i den publiserte litteraturen og kan fås fra de respektive laboratoriet, kommersielle kilder eller ikke-kommersielle plasmid depositories (f.eks Addgene). Å utforme en ny fluorescerende fusjonsprotein, flere parametere må tas i betraktning, blant annet som FP å bruke, og om for å smelte FP ved amino- eller karboksy-terminale enden av proteinet av interesse. For en mer grundig diskusjon om å generere fluorescerende fusjonsproteiner, blir leserne referert til i dyptgående artikler om emnet 49-51.

Vi trekker frem tre strategier for å oppnå samspill av et fusjonsproteiner ved hjelp av UAS-drevet transgener. Multiple, separate UAS reporter konstruerer tillate for å kombinere ulike eksisterende reporter konstruerer uten behov for ytterligere kloning. Reporter uttrykk nivåer kan også titreres uavhengig. Imidlertid er høyere nivåer av ko-ekspresjon som oppnås, når enten flere UAS kassetter eller en toveis UAS kassett på en enkelt konstruksjon er brukt. Siden FPS blir brukt som koder er det relativt enkelt å kontrollere co-uttrykk. Det skal bemerkes at andre fremgangsmåter for multi-cistronisk uttrykk eksisterer også, herunder bruk av interne ribosomale inngangssider 40 og virale 2A peptider 52,53. Som et alternativ til DNA-baserte konstruksjoner ble in vitro transkribert mRNA avkortet kan brukes til å uttrykke fluorescerende fusjonsproteiner til å merke subcellulære strukturer 1,4,8. Det forbeholdet med denne tilnærmingen er imidlertid at uttrykket er begrenset til de første dagene av utvikling og er ikke celle eller vev bestemt. Uavhengig av valgt å uttrykke fusjonsproteiner metode, er det avgjørendefor å sikre at ekspresjonsnivåene ikke føre til ikke-spesifikk merking og kompromittere den fysiologiske tilstand av cellene. I denne forbindelse, kan forsterkningen av reportergenekspresjon iboende i Gal4-UAS system 27 være problematisk, som åpenbarer for eksempel som cytosolisk merking selv når FP er rettet mot en spesifikk organelle. Når tilgjengelig, bør antistoffer brukes til å verifisere at uttrykk mønstre innhentet av fusjonsproteiner gjenspeile den endogene situasjon. I noen tilfeller, kan injeksjon av lave (er) DNA-konsentrasjoner redusere problemet med feillokalisasjon av fusjonsproteinet. Alternativt vektorer med et lavt antall UAS repetisjoner kan bidra til å titrere ned transgenet uttrykk nivåer 30. Tilsvarende for aktivatoren Gal4-VP16, eksistere modifiserte versjoner som er rapportert å drive ekspresjonen forholdsvis svakt og er derfor mindre toksiske 30,33. Hvis mis-lokalisering av fusjonsproteinet vedvarer til tross for forsøk på å titrere down transgen ekspresjonsnivåer, kan det være nødvendig å gi avkall på Gal4-UAS system og drive ekspresjonen av promotorelementene direkte.

De stabile transgene linjer, MitoFish 10 og CentrinFish 12 beskriver vi i dette manuskriptet ble gjort ved hjelp 14xUAS kassetter. Vi opprettholder disse linjene i bakgrunnen av Gal4 driver linjer for å påvise endringer i uttrykk gjennom generasjoner, siden reporter linjer med flere UAS gjentar har blitt rapportert å være utsatt for silencing 54. Vi har ikke sett bevis for silencing over 3 generasjoner vi har forplantet seg til CentrinFish. Vi har imidlertid sett spraglete uttrykk i MitoFish og derfor strengt velge embryoer med "full", sterke nivåer av uttrykk for å forplante for fremtidige generasjoner. Den nåværende litteratur antyder at ekspresjonsvektorer med 5xUAS repetisjoner kan være et alternativ for å generere stabile transgene linjer - reporteren erdrives til høy nok nivå 30 og den forholdsvis lave antall av UAS gjentar kan gjøre det mindre tilbøyelig til å transgenet stanse, selv om ikke-repeterende UAS gjentar er angivelig enda mindre utsatt 54.

Paletten av FPS for tiden tilgjengelig for tag organeller eller andre subcellulære strukturer er svært bred 55. Når du velger en bestemt FP som en tag, bør det tas hensyn til følgende parametere: Først til eksitasjon og emisjonsspektra av FP bestemme den spesifikke laserlinjen samt eksitasjon og emisjonsfiltre som kreves for visualisering. For det andre, lysstyrke og foto stabiliteten i FP. For det tredje, hastigheten med hvilken FP modnes følgende oversettelse. For det fjerde, om FP har en tendens til å aggregere i fusjoner. Angående den siste parameteren, bør det utvises forsiktighet og kontroll eksperimenter bør gjøres for å teste egnetheten av hver FP for bestemte eksperimenter. For eksempel, mens den gjend FPS mCherry og DsRed er mye brukt, de angivelig danner aggregater i visse fusjoner 56. Vi har funnet TagRFP-T 57, en mer foto-stabil variant av TagRFP, for å gjøre det bra når rettet mot mitokondrier og cellulære membraner (upubliserte observasjoner). Når flere organeller må samtidig visualisert, FPS med ikke-overlappende spektra skal brukes. Vi har med hell brukt kombinasjoner av cyan FPS (CFP og Cerulean) og YFP (figur 2-4). Ved å utnytte hele spektralområdet fra blått til nær infrarød, kan man i stor grad utvide antall subcellulære strukturer som kan samtidig visualiseres to. I tillegg til den konvensjonelle fps, foto-aktiverbar fps er særlig nyttige for å sondere organelle dynamikk, f.eks, til bruk av FP Kaede følge skjebnen til individet mitokondrier 58.

Hvilke mikroskopi teknikk - wide-feltet eller confocal - er den mestegnet for avbildning, avhenger av en rekke faktorer, inklusive plasseringen av cellene som skal avbildes og den hastighet med hvilken spesifikke subcellulære eller cellulære hendelser er ventet å forekomme. Wide-field mikroskopi er den foretrukne modalitet i overfladiske steder og tynt merkede prøver. Det gir lav foto-toksisitet og bildebehandling med høy hastighet til en fornuftig pris. Imidlertid, hvis avbildning må utføres i ikke-overfladiske deler av sebrafisk, i tett-merkede prøver, eller for å oppnå tredimensjonal informasjon, konfokal eller annen form for optisk mikroskopi snitte blir metoden for valg.

Uavhengig av hvilket mobiltelefon eller subcellulære struktur blir overvåket, er det ofte en avveining mellom å anskaffe et best mulig bilde og holde prøven i live og i god fysiologisk tilstand for gjentatt time-lapse imaging. Photo-toksisitet kan manifestere seg som endringer i oppførselen til organeller, avvikende morfologi av celler eller til og med celledød. Nøkkelen til å redusere foto-bleking og fototoksisitet for både bredt felt og konfokalmikroskopi er å bruke lavest mulige nivåer av lys for å hente bilder. I denne forbindelse mål med den høyest mulige NA er nøkkelen for å maksimere mengden av fluorescerende signal som kan samles. For konfokal mikroskopi, kan en rekke parametre justeres for å kompensere for bruk av lavere lasereffekt. Detektorer med høy kvanteeffektivitet, sammenlignet med konvensjonelle PMTs, f.eks, galliumarsenid phosphide detektorer, kan brukes for å sikre at det utsendte fotoner har større sannsynlighet for å bli oppdaget. Alternativt eller i tillegg kan høyere dynode spenninger skal anvendes ved PMT for å øke følsomheten til detektorene. Det konfokale åpning (pinhole) kan åpnes for å muliggjøre innsamling av flere fluorescerende signal, om enn med et tap av aksial oppløsning. Å utsette prøvene til så lite lys som mulig, bør skanning gjøres ved høye hastigheter, slik at oppholdstiden forlaseren per piksel er lav. Skanning ved lavere romlig oppløsning har også effekten av å øke hastigheten til skanning. Imaging har sjeldnere den ekstra fordelen av å utsette prøven til mindre lys, men bør kun vurderes dersom det ikke går på kompromiss med omfattende prøvetaking av de undersøkte prosesser.

Som et alternativ, roterende disk confocal mikroskoper og confocal mikroskoper som er utstyrt med en såkalt 'resonans' scanner tilbyr muligheten for rask skanning. Begge modaliteter har den fordelen at de er raskere og mindre foto giftig enn "klassisk", pek-skanning confocal mikroskop. Men roterende disk confocal mikroskoper er mer begrenset i z-oppløsning og kan ikke trenge så dypt inn i vev som punkt-scanning confocal mikroskop. Likeledes kan anvendelse av resonans-scanner konfokale mikroskop være begrenset som den meget korte piksel holdetid vil føre til dårligere bildekvalitet som kan,i sin tur være til hinder for påvisning av sub-cellulære hendelser (f.eks binære bilder med redusert signal-til-støy).

Til slutt, mens bredt felt og confocal bildebehandling er uthevet her, kan andre former for lysmikroskopi for eksempel to-foton 59 og lys-ark mikros 60 være mer passende for bestemte spørsmål. To-foton mikroskopi er basert på eksitasjon av en fluorofor ved samtidig absorpsjon av to fotoner i det infrarøde området av lysspekteret. I likhet med konfokal mikroskopi, bruker det punkt skanning for å skaffe bilder fra prøven, og har optiske snitt egenskapene i kraft av ikke-lineariteten av to-foton-eksitasjon. Bruk av lys med lang bølgelengde for fluoroforen eksitasjon tillater avbildning på dybder flere hundre mikron fra overflaten. Videre begrensning av eksitasjon til en liten bilde volum hindrer foto-bleking og fototoksisitet utenfor fokusplanet. Men ikke alle FPs har høy multiphoton absorpsjon tverrsnitt, et problem som er særlig utbredt i rødt fps. Videre å finne en enkelt infrarød bølgelengde for samtidig å eksitere flere distinkte fps er vanskelig, noe som gjør flerkanals bilde tungvint. Lys-mikroskopi ark benytter en tynn "plate" (typisk tykkelse som varierer fra 2 til 10 um) av laserlys for å eksitere prøven og detekterer fluorescens-signaler fra denne belyses fokalplanet ved en vinkelrett vinkel ved hjelp av et følsomt kamera. Optisk snitte oppnås ved å belyse et enkelt plan på en gang. Denne begrensningen av eksitasjon lys reduserer forekomsten av foto-toksisitet. Siden fluorescens signaler fra hele opplyst planet er samlet samtidig, er image oppkjøpet betydelig raskere enn punkt scanning confocal og multiphoton mikroskoper. Alle disse egenskapene gjør lys-ark mikros spesielt egnet til bildebehandling dynamiske cellulære hendelser med høy tid og rom oppløsning istore volumer av levende prøver. Faktisk, ved hjelp av lys-ark mikros celle skjebne i hele sebrafisk embryo ble grundig spores i løpet av første 24-timers utviklings 61. Med fortsatt forbedringer bedre avbildning penetrasjon 62,63 og romlig oppløsning 64, er det tenkelig at lys-mikroskopi ark vil bli benyttet for å undersøke dynamikk ikke bare på celle men også på den subcellulære nivå i hele sebrafisk embryoer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13, (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191, (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56, (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138, (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52, (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15, (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45, (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32, (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33, (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11, (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11, (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70, (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30, (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240, (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142, (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122, (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163, (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3, (10), 130065 (2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20, (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74, (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119, (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99, (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80, (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108, (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341, (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184 (2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (3), prot5586 (2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42, (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263, (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55, (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21, (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. 14.20 (2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. 21.4 (2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19, (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32, (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45, (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352, (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33, (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5, (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998 (2014).
Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter