Summary
Implantatie van autologe en allogene bottransplantaten, vormen aanvaarde benaderingen tot grote craniofaciale botverlies te behandelen. Toch is het effect van transplantaat samenstelling op de interactie tussen neovascularisatie, celdifferentiatie en botvorming is onduidelijk. We presenteren een multimodale beeldvorming protocol gericht op de angiogenese-osteogenese afhankelijkheid van het transplantaat nabijheid helderen.
Abstract
Een belangrijke parameter voor het succes van een bot-enten procedure vascularisatie van de omgeving van het implantaat. Onze hypothese was dat de implantatie van een bot autograft zou meer bot regeneratie door overvloedige vorming van bloedvaten veroorzaken. Om het effect van het transplantaat neovascularisatie op de defectlocatie onderzoeken hebben we een micro-computertomografie (μCT) aanpak nieuw karakteriseren vormen bloedvaten, die systemische perfusie van de dieren met een polymeriserende contrastmiddel omvat. Deze werkwijze levert hen vasculaire analyse van een orgaan in zijn geheel. Daarnaast werd doorbloeding beoordeeld met behulp van fluorescentie beeldvorming (FLI) van een bloed-gedragen fluorescerend middel. Botvorming werd gekwantificeerd met behulp van een FLI-hydroxyapatiet gerichte probe en μCT analyse. Stamcelrekrutering werd gevolgd door bioluminescentie (BLI) van transgene muizen die luciferase tot expressie onder de controle van de osteocalcine-promoter.Hier beschrijven en demonstreren voorbereiding van de allograft, calvarial defect chirurgie wij μCT scannen protocollen voor de neovascularisatie studie en botvorming analyse (met inbegrip van de in vivo perfusie van contrastmiddel), en het protocol voor data-analyse.
De 3D hoge resolutie analyse van vasculatuur significant grotere angiogenese bij dieren met geïmplanteerde autografts, vooral met betrekking tot arteriole formatie. Dienovereenkomstig doorbloeding was de autotransplantaatgroep significant hoger bij de 7e dag na de operatie. We waargenomen superieure botmineralisatie en gemeten grotere botvorming bij dieren die autografts ontvangen. Autograft implantatie geïnduceerde inwoner stamcellen rekrutering van de graft-gastheer bot hechtdraad, waarbij de cellen gedifferentieerd in botvormende cellen tussen de 7 e en de 10 e dag na de operatie. Deze vondst betekent dat verbeterde botvorming kan worden toegeschreven aanaugmented vasculaire voeden dat autograft implantatie kenmerkt. De methoden afgeschilderd kan als een optimaal instrument om botregeneratie studeren in termen van goed begrensd vorming en de vorming van nieuwe bloedvaten bot dienen.
Introduction
Craniofaciale botverlies als gevolg van trauma, tumor resectie, decompressie craniotomie en aangeboren afwijking zelden geneest vanzelf en presenteert een duidelijke onvervulde klinische behoefte. Autologe bottransplantaten en allogene bottransplantaten worden op grote schaal gebruikt om deze aandoeningen te behandelen 1.
Het is algemeen aanvaard dat osteogenesis strak gekoppeld aan angiogenese 2,3. Daarom moet de volledige studie van een beoogde therapie voor botherstel omvatten een uitgebreid onderzoek van de vasculaire boom vormt het gehele defectlocatie. Er zijn verschillende beschikbare methoden om vascularization karakteriseren onderzoeksmodellen. De endotheelcellen kan worden onderzocht door histologische analyse. Aangezien histologie voert snijden weefsel, is er een grote kans dat het resulterende beeld wordt vervormd. Om dit probleem aan te pakken, kan opklaren worden uitgevoerd om het intacte bloedvaten 4; deze wijze isbeperkt tot één vlak imaging. μCT doorzoeken van specimens afkomstig van een dier geperfuseerd met contrastmiddel maakt 3D beeldvorming van het vasculaire netwerk dat de regeneratieplaats 5 voedt. Deze benadering maakt een zeer gedetailleerde demonstratie van de vasculatuur een orgaan als geheel, evenals een zorgvuldige analyse van de distributie bloedvat. Bovendien μCT maakt onderscheid tussen de verschillende diameters van de bloedvaten die de verschillende subtypes van bloedvaten te karakteriseren.
Onze hypothese was dat implantatie van een calvarial autograft groter zal zijn dan neovascularisatie implantatie van een allograft te induceren, en deze verhoogde neovascularisatie leidt op zijn beurt tot een verhoogde bot formation.To hypothese gebruikten we verschillende technieken oefenen. We onderzochten patronen van de nieuw gevormde vasculaire boom door het uitvoeren van een μCT-gebaseerde analyse. We gemeten doorbloeding met behulp van een bloed-zwembad fluorescente probe. Vervolgens hebben we ezelssed botweefsel mineralisatie door FLI van een hydroxyapatiet gericht sonde en μCT analyse. Ten slotte hebben we gecontroleerd stam werving en differentiatie cel, het uitvoeren van BLI in transgene muizen die luciferase wordt uitgedrukt in osteocalcine-positieve cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de institutionele dierlijke zorg en gebruik Comite (IACUC) van de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem, Israël (Request No. MD-12-13524-4), een AAALAC goedgekeurde faciliteit, en door het Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request No. 3770). De dieren werden behandeld in strikte naleving van de NIH richtlijnen.
1. Bereiding van Bone Allografts
- Euthanize 7- tot 8-weken oude Balb / C-muizen, of stam verschillend van de ontvanger met behulp van de standaardmethode van CO2 inhalatie of intraperitoneale injectie van 50 pl fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Bevestigt de afwezigheid van een hartslag en voeren cervicale dislocatie. Alternatief oogst van de allograften van karkassen die zijn gehouden in -20 ° C en ontdooid voor de oogst.
- Scheer de calvarial regio met een tondeuse, het toepassen van het tegen de richting van de haargroei. Ontsmet het karkas hoofd door het toepassen van 70% isopropanol. Snijd de hoofdhuid met behulp van een nummer 11 scalpel en verwijder het periost.
- Met behulp van een tandheelkundige boor en een 4,5-mm inwendige diameter trephine, los een cirkelvormige fragment van calvarial bot. Breng het botfragment een 100-mm plastic schaaltje met steriele zoutoplossing. Op dit moment acht bloed en zacht weefsel bevestigd aan het bot fragment (figuur 1A). Verkrijgen botfragmenten deze manier van 22 donors.
- Houd één been fragment tegelijk met gebogen pincet. Zwabberen het grondig met wattenstaafje en verwijder alle hersenweefsel, zacht weefsel en bloed (Figuur 1B). Voorzichtig weggesneden elk bot chips die gehecht blijven aan het transplantaat met behulp van fijne schaar, zodat het transplantaat een perfecte ronde vorm zal hebben.
- Dip elke ent eenmaal in een 15 ml buisje met 70% ethanol en tweemaal in 15 ml buisjes met fosfaat gebufferde zoutoplossing om de ethanol te wassen.
- Bevries de allografts in een -80 ° C in de koelkast cryobuizen tenminste 1 week. Op dit punt, zorg ervoor dat de allografts verschijnen transparante (figuur 1C).
2. calvarial Defect Surgery
- Voor ontvangers gebruiken transgene muizen die luciferase tot expressie onder de controle van de osteocalcine-promoter 6.
- Steriliseer de uiteinden van de chirurgische instrumenten via een glasparel verwarming voor 30 sec. Breng de tools om een pot met 70% isopropanol steriele omstandigheden te handhaven. Gebruik steriele handschoenen.
- Anesthetize een 7- tot 8-weken oude vrouwelijke muizen door intraperitoneale injectie van een ketamine- medetomidine mengsel (75 mg / kg en 1 mg / kg, respectievelijk). Knijp het dier ledemaat om zeker te zijn is diep verdoofd. Heeft een dier niet onbeheerd achter totdat hij weer voldoende bewustzijn borstligging handhaven.
- Scheer de calvarial regio met een tondeuse door het toepassen van het tegen de richting van de haargroei. Apply-Hair verwijderen Cream aan een bont resten te verwijderen en veeg het after niet langer dan 2 minuten met behulp van droge gaas, gevolgd door zoutoplossing gedrenkt gaas. Zorg moeten worden genomen om te voorkomen dat het in de ogen. Als alternatief kan de dierenarts oogzalf worden toegepast voorafgaand aan ontharing als een extra laag van bescherming voor de ogen. Het is noodzakelijk dat alle sporen van de ontharingscrème om mogelijke irritatie van overmatige blootstelling aan het chemische middel te voorkomen verwijderd. Ontsmet de hoofdhuid door het aanbrengen van 5% chloorhexidine (figuur 1D).
- Injecteer subcutaan 5 mg / kg carprofen verdund in 200 pl zoutoplossing. Breng vet oogzalf tot droog voorkomen en houdt het dier op een thermische pad te allen tijde. Plaats het dier onder de operationele verrekijker.
- Maak een 1 cm lange ovaal geslepen in de hoofdhuid met behulp van fijne schaar en pincet (Figuur 1E). Houd het periost met gebogen pincet en weggesneden met behulp van fijne schaar.
- Boor de calvarial defect 2 mm juist voor de lambdoïde hechtdraad met behulp van een tandheelkundige boor eennd een 5-mm uitwendige diameter trephine (Figuur 1F en G). De penetratie van de dura mater te vermijden, boor driekwart van de weg in het bot en verwijder het bot fragment met een spatel.
- Om een autograft implanteren, halen het bot fragment en was het in een 10 mm kunststof plaat met 10 ml steriele zoutoplossing om vuil te verwijderen. Laat de zachte weefsels niet verwijderen. Om een allograft, dooi implanteren van tevoren een allograft en normaliseren het aan RT, en dan was het.
- Plaats de bottransplantaat in het defect met gebogen pincet dus het zal niet het defect marges (figuur 1H) raken. Lijm de graft aan het gastheerbot via fibrine-gel (5 ui 46 mg / ml fibrinogeen gemengd met 5 ul van 25 U / ml trombine).
- Hechtdraad de huid met behulp van 4-0 Vicryl hechtdraad (Figuur 1I). Breng povidonjood op de chirurgische snede. Zorg moet worden genomen om de verontreiniging van het hechtmateriaal te voorkomen door bont. Markeer de muis oor en injecteer 0,25 mg / kg Antisedan to achteruit de verdoving effect van medetomidine.
- Als het dier niet wakker in 10 min, zorg ervoor dat het is gelegen op een verwarmde pad. Injecteer 200 ul steriele zoutoplossing en zonodig injecteren 0,1 mg / kg Antisedan. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
- Bewaar de dieren gescheiden kooien voor een week om te voorkomen dat het openen van de hechtingen. Plaats muis chow geweekt in water in een petrischaal op de kooivloer enkele dagen na de operatie. Injecteer subcutaan 200 ui 1 mg / ml Carprofen verdund in steriele zoutoplossing eenmaal daags gedurende 3 dagen na de operatie om postoperatieve pijn.
Figuur 1. calvarial Allograft Voorbereiding en calvarial Defect Chirurgie. Het bot is fragment geïsoleerd uit de calvarial regio (A). Zacht weefsel, Beenmerg en bloed worden afgestreken (B), en het transplantaat wordt gespoeld in 70% ethanol gevolgd door twee wassingen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (C, AG = allograft). De ontvanger muis is voorbereid voor operatie door scheren en desinfectie van de huid in de calvarial gebied (D). Een ovaal geslepen wordt gemaakt in de hoofdhuid en het periosteum wordt verwijderd (E). Vervolgens wordt de calvarial defect geboord met een 5 mm diameter trephine (F). Het bot fragment wordt losgemaakt met een lepelvormige spatel, waardoor de superieure sagittale sinus intact (G). De allograft wordt dan geplaatst in het defect en vastgezet met fibrine-gel (H). Ten slotte wordt de huid gehecht (I). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Micro-Computed Tomography voor de karakterisering vande Vasculaire Boom
- Bereid gehepariniseerde zoutoplossing. Gewicht 2000 U natriumheparine en plaats het in 50 ml plastic buis. Voeg 20 ml zoutoplossing en goed schudden de buis. Vul een 20-ml Luer lock spuit met 15 ml warm gehepariniseerde zoutoplossing en sluit de spuit aan een 23-G hoofdhuid ader set. Bevestig de spuit om een spuit pomp, en zet deze op 10 ml pomp bij 1 ml / min.
- Sedate een muis met behulp van een intraperitoneale injectie van 50 pl fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Knijp de ledematen van het dier te zorgen dat het is diep verdoofd. Zet de muis op zijn rug naar een fixatie board omwikkeld met een absorberend oppervlak liner (Figuur 2A). Plaats de vaste muis in een zuurkast om personeel blootstelling aan rook te voorkomen.
- Snijd de huid van de buik naar de hals met behulp van fijne schaar en pincet (Figuur 2B). Snijd de buikwand tot aan de processus xiphoideus (figuur 2C). Snijd de ribbenkast langs de laterale zijde. Niet verwondt de longen eend hart, en zorg ervoor dat het hart is volledig blootgesteld. Gebruik een hemostaat het sternum (figuur 2D) te trekken.
- Steek de vlinder naald 3 mm in de linker ventrikel (figuur 2E). Lijm de naald naar het hart en de borst muur met behulp van 3-seconden lijm (figuur 2F).
- Activeer de pomp onmiddellijk. Na een minuut, ontleden de inferior vena cava teneinde het vaatstelsel (figuur 2G) drukloos. Kantel het bord zodat vloeistoffen uit de buurt van het hoofd zal stromen. Succesvolle perfusie resulteert in de lever en bloedvaten wissen.
- Wanneer de gehepariniseerde zoutoplossing perfusie is voltooid, perfuseren 10 ml van 4% formaldehyde. Vermijd binnendringen van luchtbellen in het vaatstelsel en blootstelling aan formaldehyde dampen te voorkomen. Succesvolle formaldehyde perfusie leidt tot verstijving van de staart. Spoelen van de formaldehyde met 10 ml gehepariniseerde zoutoplossing.
- Bereid de radiopaak contrastmiddel volgens vervaardurer instructies. Doorgaans zal het mengen van de verbinding, verdunningsmiddel, en een uithardingsmiddel vereist. Gebruik serologische pipetten en meng de oplossing in een 15 ml plastic buis.
- Perfuseren het dier met het contrastmiddel mengsel bij een snelheid van 1 ml / min. De coronaire, darm- en lever bloedvaten observeren en zorg ervoor dat ze de gele draaien na perfusie van 2-3 ml, wat aangeeft succesvolle perfusie (figuur 2H). Na voltooiing van de perfusie, snijd tubing de vlinder naald, alleen verkrijgen van het karkas en wikkel het met wc-papier om lekkage van de oplossing voor de calvarial regio te voorkomen. Laat polymerisatie in 4 ° CO / N.
- Ontleden de calvarial regio (figuur 2I); Gebruik eerst een scalpel om de huid zo lateraal mogelijk te snijden, het vermijden van schade aan de craniale regio van belang. Zoek het bottransplantaat en vervolgens fijne schaar om het schedelbot 10 mm van het transplantaat snijden.
- Scan de geïsoleerde Calvarial bot monster met behulp van een scanner μCT; set zichthoek 20,5 mm, röntgenenergie van 55 kVp, intensiteit van 145 uA via uitsteeksels 1000 per 360 ° integratietijd van 200 msec. Pas μCT parameters 7 tot en met het andere been defect modellen.
- Let op de 2D gereconstrueerd schijfjes die werden gegenereerd door de μCT software. Zorg ervoor dat het scannen van de regio van belang is goed en zoek de calvarial defect. Beoordeelt de kwaliteit van de doorbloeding. Na een succesvolle identificatie van de bloedvaten (Figuur 2J), voort te zetten en ontkalken het monster met behulp van 6% trichloorazijnzuur (TCA) verdund in dubbel gedestilleerd water (DDW).
- Scannen van het monster met behulp van de in paragraaf 3.10 parameters. Zoek de lambdoïde hechtdraad in de gereconstrueerde 2D plakjes. Definieer een cilindrisch volume van belang (VOI) in hoogte van 2 mm en 8 mm diameter, dat raakt aan de hechtdraad - dit is de anatomische plaats van defect.
- Segment the botweefsel van zacht weefsel een integrale drempelwaarde procedure; zet de lagere drempel tot 130, en een beperkte 3D Gauss-filter (sigma [σ] = 2.0 en ondersteuning = 2) gedeeltelijk ruis te onderdrukken in de volumes toe te passen. Genereren van een 3D-reconstructie en zorg ervoor dat de VOI goed is gepositioneerd (figuur 2K).
- Genereer een dikte map met de IPL software en de functie "dt_object_param" (Figuur 2L).
LET OP: Deze functie beschrijft de volume schip voor elke diameter schip.
Figuur 2. Perfusie met een radiopaak middel via de cardiale benadering. De muis is aangebracht op het bevestigingsorgaan board (A), en de huid wordt gesneden langs de buik naar de hals (B). De buikwand wordt gesneden langs de mediale lijn tot de zwaardvormig process (C) en de ribbenkast zijdelings (D) gesneden. Een vlinder naald wordt ingebracht in de linker ventrikel, het vermijden inbrengen in het rechter ventrikel, hetgeen aanmerkelijk donkerder (E, wordt de rechterkamer aangegeven door de witte stippellijn), en de naald is bevestigd aan het hart en de borstwand (F) . Gehepariniseerd zout (2-3 ml) wordt gepompt in het hart en de inferior vena cava wordt ontleed (G, witte pijl geeft de inferior vena cava). Formaldehyde (4%) is doorbloed en uitgewassen; Dit wordt gevolgd door een perfusie van geel gekleurd radiopaak contrastmiddel. Succesvolle perfusie zal duidelijk zijn door de goedkeuring van de bloedvaten, welke kleur geel (H) te wijzigen. Na de polymerisatie wordt het calvarial regio geïsoleerd (I, AG = allotransplantaat) en afgebeeld met een μCT scanner om een goede perfusie (J, volume van belang is gemarkeerd met oranje) bevestigen. Demonster is ontkalkt en opnieuw gescand (K), gevolgd door de generatie van een gekleurde dikte kaart (L). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Fluorescentie Imaging van botmineralisatie en doorbloeding
- Reconstitueren probes tot een concentratie van 2 nmol / 100 ul PBS in een 1,5 ml buis (gebruik een bisfosfonaat geconjugeerde fluorescente probe te controleren botmineralisatie en bloed overgedragen fluorescerend middel om bloed perfusie te meten). Pipet enkele malen zachtjes homogene oplossing van de probe te verzekeren.
- 24 uur voordat de aangewezen opnamesessie nemen afbeelding van een time-nul; verdoven 3 muizen met 2 L / min inademing van 100% medische kwaliteit zuurstof aangevuld met 3% isofluraan in een inductie kamer. Na een goede verdoving is vastgesteld, verlaag de isofluraan concentratie tot 1,5% - 2%.
- Breng vet oogzalf tot droog voorkomen en zorgen thermische pad ingeschakeld allen tijde. Knijp het dier ledemaat om zeker te zijn is diep verdoofd. Heeft een dier niet onbeheerd achter totdat hij weer voldoende bewustzijn borstligging handhaven.
- Scheer de calvarial regio met een tondeuse toepassing van het tegen de richting van de haargroei. Verwijder bont restanten met haardroger verwijderen room. Elke bont overblijfsel zal interfereren met optische beeldvorming. Verwijderen hechtingen met behulp van fijne schaar en pincet.
- Leg drie dieren op het podium IVIS verwarmd tot 37 ° C voor elke opnamesessie. Stel blootstelling tijd om auto, bekijken veld C, en de filters aan te passen. Bijvoorbeeld voor een bisfosfonaat-geconjugeerde fluorescente probe gekenmerkt met maximale excitatie op licht golflengte van 680 nm, gebruik dan een excitatiefilter van 675 nm en een emissie filter van Cy5.5 . Evenzo, wanneer een door bloed overgedragen fluorescerende stof met een piek excitatie bij 750 nm lichtgolflengteGebruik een excitatie filter van 710 nm en een emissiegolflengte van 780 nm filter.
- Afbeelding de muizen door middel van Living Image software door op de "Acquire" knop. Zorg ervoor dat de calvarial regio volledig zichtbaar is (Figuur 3B) Voor een uitgebreide gids advies Lim et al 2009 8.
- Laat de muizen te ontwaken inademen van 100% zuurstof.
- Injecteer de 2-nmol fluorescente probe via een intraveneuze injectie staart. Op de aangegeven opnamesessie, voeren beeldvorming zoals hierboven beschreven.
5. Micro-Computed Tomography voor botregeneratie
- Voor kwantificering van botvorming, verdoven de muis door inademing van 3% isofluraan, zoals weergegeven in stap 4,2 - 4,3. Breng de muis naar de μCT scanner bed, en plaats het in de scanner.
- Stel de μCT scanner röntgenbuis potentiële energie op 55 kVp en intensiteit van 145 uA gemiddelde resolutie. Met een gezichtsveld van 20,5 mm, voereneen verkenner (één x-ray) scannen en bepalen een van belang uitstrekt van de ogen van de muis naar de achterkant van de schedel. Het uitvoeren van een CT-scan, met behulp van 1000 projecties per 360 ° en de integratie van 200 msec.
- Reconstrueren 2D plakjes met een nominale ruimtelijke resolutie van 20 micrometer. Lijn de marges gebrek aan een gestandaardiseerde positie met behulp μCT software 9.
- Vergelijkbaar met stap 3,20, een cilindrisch volume van belang te definiëren en de beperkte 3D Gauss-filter toe te passen (σ = 0,8 en ondersteuning = 1) gedeeltelijk geluid in de volumes te onderdrukken. Segment van het botweefsel van zachte weefsels met behulp van een wereldwijde drempelen procedure.
- Bepaal het volume van gemineraliseerd botweefsel in het volume van belang.
6. Bioluminescentie beeldvorming van Stem Cell Recruitment en differentiatie
- Bereid de muis voor de beeldvorming zoals weergegeven in de secties 4,2-4,4 en wakker de muizen door inademing van 100% zuurstof.
- Dien 126 mg / kg kever luciferine aan elke muis via intraperitoneale injectie, en de terugkeer van de dieren naar de inductie kamer. Na 2 min, verdoven van het dier met behulp 3% isofluraan. Plaats de muizen op de IVIS verwarmd fase.
- Via Living Afbeelding software, stelt u de belichtingstijd op "auto", en het gezichtsveld naar C. Afbeelding de muizen 5 minuten na luciferine administratie. Afbeelding dieren zoals weergegeven in stap 4,6, met de "bioluminescentie" modaliteit definiëren gebieden van belang omdat transgenexpressie varieert tussen muizen. Normaliseren van de calvarial signaal naar de staart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neovascularisatie werd bepaald door μCT volumetrische analyse en door het FLI met een fluorescerende bloed overgedragen agent om doorbloeding te kwantificeren. Zeven dagen na de operatie, μCT scan toonde een significant hoger volume van kleine of middelgrote diameter bloedvaten in muizen die autologe hadden gekregen dan bij muizen die allografts geoogst uit C57BL / 6 (figuur 3A) hadden ontvangen. Interessant is dat in de autotransplantaatgroep de nieuw gevormde vasculaire structuur bleek de gehele defect gebied te bereiken, terwijl in de allograft groep bloedvaten bleek de defectlocatie vanaf de rand naar binnen dringen en uitgebreid slechts in beperkte mate. De FLI ondersteunde deze waarneming blijkt significant hogere doorbloeding in autograft behandelde dieren (Figuur 3B). Door de 14 e dag, in de allograft groep het vaatstelsel bereikt alle nabijheid van de transplantaat, maar tankvolume significant lager vergelekenaan de autograft groep in de meeste vat diameters dat we onderzocht (Figuur 3C). Opmerking: de verschillen in volume vat waren het meest prominent bij schepen met 0.08- tot 0,1 mm diameter werden vergeleken. Achtentwintig dagen na de operatie het vaatstelsel volume terug naar de basislijn (Figuur 3D).
Zeven dagen na de operatie, FLI uitgevoerd met de hydroxyapatiet gerichte probe significant grotere botmineralisatie in de autotransplantaatgroep (Figuur 4A). Tegen die tijd was het bot gedurende het transplantaat nabijheid in de autograft geïmplanteerde dieren gevormd. Daarentegen had been in de allograft-geïmplanteerde muizen Pas bij het defect randen gevormd en werd gekenmerkt door een ringvorm. Volumes van botvorming gekwantificeerd 56 dagen na de operatie, op het eindpunt van het regeneratieve proces, door het uitvoeren μCT analyse (Figuur 4B). Bot volume was significant hoger (Figuur 4C) en graft thickness significant groter in dieren die autologe (figuur 4D) ontvangen. BLI werd gebruikt in osteocalcine-luciferase transgene muizen stamcellen celrecrutering en differentiatie in de richting van de osteoblastische lijn (figuur 4E) controleren. Bij muizen geïmplanteerd met allografts, het BLI-signaal piek 4 - 7 dagen na de operatie, wanneer het signaal gemeten aan het schedeldak was 15 maal hoger dan die gemeten op de staart. In-autograft geïmplanteerde muizen, de BLI signaal piekte een beetje later, 7-10 dagen na de operatie, en was significant hoger, het bereiken van een 2-voudig hogere calvaria-staart verhouding (Figuur 4F).
Figuur 3. Autograft Implantatie Vergemakkelijkt Angiogenese. Calvarial defecten werden gecreëerd in muizen. De helft van de dieren kreeg allografts en de andere helft ontving autografts. Demuizen geperfuseerd met een polymeriserende contrastmiddel 7 dagen na de operatie. De calvarial gebied werd geïsoleerd en de monsters werden ontkalkt en afgebeeld met een μCT scanner. Een volumetrische dikte map werd gegenereerd met IPL software (A, n = 3, staven geven ± SE en sterretjes geven p waarde <0,05). Muizen werden geïnjecteerd met een fluorescent bloed overgedragen probe 6 dagen na de operatie. 24 uur later werden de dieren onderworpen aan FLI en een kwantitatieve analyse werd uitgevoerd (B, n = 5, staven geven ± SE en sterretjes geven p waarde <0,05). Een μCT-gebaseerde vasculaire analyse werd uitgevoerd 14 (C) en 28 (D) dagen na de operatie (C en D: n = 3, bars vertegenwoordigt ± SE, en sterretjes geven P-waarde <0,05). Klik hier voor een grotere weergave version van dit cijfer.
Figuur 4. Implantatie van een Autograft Bevordert Meer Osteogenesis dan Implantatie van een Allograft. De muizen kregen implantaten van calvarial autografts of allogene. De muizen werden later geïnjecteerd met een hydroxyapatiet gerichte probe door IV injectie 6 dagen na de operatie. 24 uur later werden FLI en een kwalitatieve analyse uitgevoerd (A, n = 5, staven geven ± SE en sterretjes geven p waarde <0,05). In vivo μCT analyse werd uitgevoerd 56 dagen na de operatie, en een cilindrisch volume van belang gemerkt met Oranje werd gedefinieerd (B). Botvolume (C) en graft dikte (D) werden gekwantificeerd (n = 8, staven geven ± SE en sterretjes geven p waarde <0,05) .Transgenic muizen die luciferase driven door de osteocalcine promotor kregen allogene of autografts. BLI werd uitgevoerd 10 dagen na de operatie (E) alsook op andere aangegeven tijdstippen. De gemeten op het calvarial regio signaal was genormaliseerd, omdat de expressie niveau varieert tussen muizen (F, n = 8, bars vertegenwoordigt ± SE, en sterretjes geven P-waarde <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doel van multimodale beeldvormingstechnieken hier beschreven nauwgezet onderzoek naar de angiogenese-osteogenese as in de context van craniale bottransplantatie mogelijk. Neovascularisatie werd in beeld gebracht met behulp van een μCT protocol, dat een nauwkeurige hoge-resolutie 3D-demonstratie van de vasculaire boom liet het voeden van de hele craniale defect. μCT gegevens kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van geavanceerde tools zoals IPL-software. Bijvoorbeeld, de dikte analyse getoond in figuur 3C is gebleken dat de voornaamste verschillen tussen craniale autograft en allograft in vaten van 0,1 tot 0,08 mm in diameter, waarbij bloed arteriolen 10 kenmerkt. Dit resultaat is consistent met studies in pijpbeen model 11. Opgemerkt wordt dat het smalste detecteerbare vaten van 0,02 mm diameter niet volledig gegoten vanwege de viscositeit van de radiopaak middel. Het belangrijkste nadeel van deze methode is dat het met zich meebrengteuthanasie van het dier en daarmee longitudinale imaging onmogelijk. Verschillende radio-opaak sondes zijn beschikbaar voor in vivo vasculaire μCT beeldvorming; ze zijn echter niet radio-opaak als dichte polymeriserende probe en de beeldresolutie niet aan die waarin de ex vivo methode hier 12 weergegeven. μCT resolutie is beperkt en niet zinvol te bestuderen bloedvaten, bijvoorbeeld. Anders dan dat, geholpen door een bekwame de hand van deze methode biedt een reproduceerbare techniek bot vaatstelsel in detail te bestuderen.
Een kritische stap in de afgebeelde protocollen bepalen van het defect locatie (stap 2,7). Letsel aan de lambdoïde hechtdraad zal leiden tot massale bloeden. Bij het boren van de calvarial defect, dient men de ondergeschikte dura mater en de superieure sagittale sinus niet te verstoren. Laatste, het inbrengen van de vlinder naald in de linker ventrikel is een delicate procedure (stap 3.4). Als de naald is inserted in de rechter ventrikel, zal het contrastmiddel de longen perfuseren en ga naar de aderen, wat leidt tot een slechte doorbloeding van het schedeldak. Als de naald te diep wordt geplaatst, zal het achterste hartwand perforeren; en als de naald niet ver genoeg is geplaatst, kan het gemakkelijk scheuren weg van het hart. Niet proberen om opnieuw aan te passen van de naald positie als je kunnen interfereren met de perfusie. De werkwijze kan worden gewijzigd met behulp van een set beschikbare fluorescente probes; Integrine α 3 β v -targeted probe kan worden gebruikt om nieuw gevormde bloedvaten te benadrukken, terwijl cathepsine-K-gerichte probe kan worden gebruikt om osteoclast activiteit te kwantificeren.
Conform onze hypothese waargenomen dat calvarial autografts een hogere osteogeen potentieel dan allografts. Dit geldt voor de lange beenderen en 13 en kunnen worden toegeschreven aan verschillende factoren. Ten eerste, de autograft bevat botvormende cellen, die botmatrix produceren hele transplantaatoppervlakte, zoals blijkt op mineralisatie gerichte FLI (figuur 4A); terwijl allotransplantaten alleen aan het gebrek marges schaarse botvorming induceren. Ten tweede, BLI van osteocalcine-luc muizen lieten meer osteogene activiteit in de autotransplantaatgroep, wat kan worden verklaard door de aanwezigheid van groeifactoren die worden verwijderd in de allograft voorbereidingsproces (Figuur 4F). Interessant botmineralisatie was significant hoger bij dagen 6 en 7, wanneer de hydroxyapatiet gerichte probe werd toegediend en de celdifferentiatie vertegenwoordigers BLI activiteit bleek later, tussen dag 7 en dag 10. Wij kunnen hieruit afleiden dat hoe uitgebreider botmineralisatie kan ten minste gedeeltelijk worden verklaard door de gunstige vasculatuur die autologe bottransplantatie kenmerkt.
Onze resultaten geven aan dat de autograft heeft superieure osteogene vermogen; echter, moet men rekening mee houden dat autogeen bot enten heeft verschillende drawbacks. Bot oogsten is beperkt in omvang en houdt morbiditeit naar de donor plaats 14-16. Bovendien was de incidentie van bot resorptie autograft niet verwaarloosbaar 17-19. Allografts zijn hoge beschikbaarheid en presenteren een off-the-shelf oplossing voor de arts. Verschillende werken die aangetoond hebben dat de osteo-integratie van craniale allografts kan worden verbeterd door andere middelen, van het bekleden van de allograft met BMP2-coderend adeno- geassocieerd virus 20,21 adjuvante therapieën zoals parathyroïde intermitterende therapie 22. Op het einde, wanneer het vermogen van de allograft's om te fuseren met het bot wordt geperfectioneerd, de allograft zal de geprefereerde enten materiaal.
Gezien deze resultaten een bijzondere interesse ligt in de vraag hoe moduleren neovascularisatie op de plaats van botregeneratie. Directe benadering van VEGF over-expressie werd gevonden inefficiënt, omdat de vorming van bloedvaten lek en geen functi vormen geenonale netto 23,24. Interessant genoeg werd gevonden dat BMP signaaltransductie leidt tot gerichte vorming van bloedvaten 25,26. Bovendien farmaceutische middelen 11 en celtherapie 27 werd aangetoond dat angiogenese patronen bij bottransplantatie nabijheid veranderen; beide benaderingen huidige veelbelovende strategieën om schedelbot defect genezing te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
