Summary
Implantasjon av autologe og allogene bein grafts utgjør akseptert tilnærminger til å behandle store kraniofaciale bentap. Likevel effekten av graft sammensetning på samspillet mellom neovascularization, celledifferensiering og beindannelse er uklart. Vi presenterer en multimodal bildebehandling protokoll forsøkte å belyse angiogenese-osteogenesis gjensidig avhengighet på pode nærhet.
Abstract
En viktig parameter å bestemme suksessen til et bein pode prosedyren er vaskularisering av området rundt pode. Vi antok at implantasjon av et bein autograft ville indusere større benregenerering av frodig blodkardannelse. For å undersøke effekten av graftet i neovaskulariseringen i det defekte område, har vi utviklet en mikro-computertomografi (μCT) tilnærming til å karakterisere nylig danne blodkar, som involverer systemisk perfusjon av dyret med et polymeriserende kontrastmiddel. Denne metoden gjør det mulig detaljert vaskulær analyse av et organ i sin helhet. I tillegg ble blodperfusjon vurdert ved hjelp av fluorescens imaging (FLI) av en blodbårne fluorescerende agent. Bendannelse ble kvantifisert ved FLI bruke en hydroksyapatitt-målrettet sonde og μCT analyse. Stamcelle rekruttering ble overvåket ved bioluminescens imaging (BLI) av transgene mus som uttrykker luciferase under kontroll av osteocalcin promoteren.Her beskriver og demonstrerer fremstillingen av allograft, calvarial defekt kirurgi, μCT skanning protokoller for neovaskularisering studier og bendannelse analyse (inklusive in vivo perfusjon av kontrastmiddel), og protokollen for dataanalyse.
3D høy oppløsning analyse av vaskulaturen viste signifikant større angiogenese hos dyr med implantert autografts, særlig med hensyn til arterioler formasjonen. Følgelig blodperfusjon var signifikant høyere i autograft gruppen ved den 7. dagen etter operasjonen. Vi observerte overlegen beinmineralisering og målt større beindannelse hos dyr som fikk autografts. Autograft implantasjon indusert bosatt stamcelle rekruttering til graft-host bein sutur, der cellene differensiert i bendannende celler mellom 7. og 10. postoperative dag. Dette funnet betyr at økt beindannelse kan tilskrivesaugmented vaskulær fôring som karakteriserer autograft implantasjon. Metodene avbildet kan tjene som et optimalt verktøy for å studere benregenerering i form av tett avgrenset beindannelse og neovascularization.
Introduction
Kraniofaciale bentap på grunn av traumer, tumor reseksjon, decom kraniotomi, og medfødt defekt sjelden helbreder seg selv og presenterer et klart udekket klinisk behov. Autologe bein grafts og allogene bein grafts er mye brukt til å behandle disse forholdene 1.
Det er allment akseptert at osteogenesis er tett koblet med angiogenese 2,3. Således bør fullstendig studium av et slått terapi for benregenerering inkludere en omfattende undersøkelse av det vaskulære treet danner hele defekte område. Det er flere tilgjengelige metoder for å karakter vaskularisering i forskningsmodeller. Vaskulære treet kan undersøkes ved histologisk analyse. Siden histologi er avhengig av seksjonering vev, er det stor sannsynlighet for at det resulterende bildet vil bli forvrengt. For å løse dette problemet, kan intramikroskopi utføres til bilde intakt blodkar 4; Imidlertid er denne metodenbegrenset til en plan-imaging. μCT scanning av prøver hentet fra et dyr dynket med kontrastmiddel tillater 3D avbildning av det vaskulære nettverket som mater regenerering nettstedet fem. Denne tilnærmingen muliggjør en meget detaljert demonstrasjon av et organ vaskulatur som helhet, samt en grundig analyse av blodkarfordelingen. Videre gjør μCT differensiering mellom ulike diametre av blodkar, som karakteriserer de ulike subtyper av blodkar.
Vi antok at implantering av et calvarial autograft vil indusere neovaskularisering er større enn implantasjon av en allograft, og denne økte neovaskularisering fører i sin tur til økt bein formation.To følge denne hypotesen vi benyttet en rekke teknikker. Vi undersøkte mønstre av den nydannede vaskulær treet ved å utføre en μCT basert analyse. Vi målte blodperfusjon bruker en blod-pool fluorescerende probe. Neste, vi eslersed benvev mineralisering av FLI av hydroksyapatitt styrt sonde og μCT analyse. Til slutt overvåkes vi stamcelle rekruttering og differensiering, utføre BLI i transgene mus som luciferase er uttrykt i osteocalcin-positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene i den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité (IACUC) fra Det hebraiske universitetet i Jerusalem, Israel (Request No. MD-12-13524-4), en AAALAC godkjent anlegg, og ved Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request No. 3770). Dyrene ble behandlet i streng overholdelse NIH retningslinjer.
1. Utarbeidelse av Bone allotransplantater
- Avlive 7 til 8 uker gamle Balb / C-mus, eller en hvilken som helst stamme forskjellig fra mottakeren, ved hjelp av standard metode for CO 2 inhalering eller intraperitoneal injeksjon av 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Bekreft fraværet av et hjerteslag og utføre halshugging. Alternativt høste allografter fra skrotter som har blitt holdt i -20 ° C og tint før innhøsting.
- Barbere calvarial regionen ved hjelp av en hårklipper, bruke det mot hårets vekstretning. Desinfiser kadaveret hodet ved å bruke 70% isopropanol. Kutt hodebunnen huden ved hjelp av en nr 11 skalpell og fjerne periosteum.
- Ved hjelp av en dental drill og en 4,5-mm indre diameter trephine, ta en sirkulær fragment av calvarial bein. Overfør benfragmentet til en 100 mm plastskål inneholdende sterilt saltvann. På dette punktet, observere blod og mykt vev festet til benfragmentet (figur 1A). Skaff bein fragmenter på denne måten fra 22 givere.
- Hold ett bein fragment om gangen med buet pinsett. Vattpinne det grundig med bomull tipped applikator og fjern eventuelle hjernevev, bløtvev, og blod (figur 1B). Forsiktig skjære bort eventuelle bein chips som forblir festet til pode hjelp av gode saks slik at pode vil ha en perfekt avrundet form.
- Dypp en gang hvert graft i et 15 ml rør inneholdende 70% etanol og to ganger i 15 ml rør inneholdende fosfatbufret saltoppløsning for å vaske etanol.
- Fryse allotransplantater i en -80 ° C kjøleskap i cryotubes for atminst en uke. På dette punktet, må du kontrollere at allografter vises gjennomsiktig (figur 1C).
2. Calvarial Defect Surgery
- For mottakere bruker transgene mus som uttrykker luciferase under kontroll av promoteren osteocalcin 6.
- Sterilisere tips av kirurgiske verktøy ved hjelp av et glass perle ovn for 30 sek. Overfør verktøy til en krukke som inneholdt 70% isopropanol for å opprettholde sterile forhold. Bruk sterile hansker.
- Bedøve en 7 til 8 uker gamle hunnmus ved intraperitoneal injeksjon av en ketamine- medetomidin blanding (75 mg / kg og 1 mg / kg, henholdsvis). Knip dyret lemmer for å sikre at det er dypt bedøvet. Ikke la et dyr uten tilsyn før det gjenvant tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Barbere calvarial regionen ved hjelp av en hårklipper ved å bruke den mot hårets vekstretning. Påfør hårfjerningskrem for å fjerne eventuelle pelsrester og tørk den after ikke lenger enn 2 min hjelp tørt gasbind fulgt av saltvann gjennomvåt gasbind. Forsiktighet bør tas for å unngå å få den i øynene. Alternativt kan veterinæren øyesalve brukes før hårfjerning som et ekstra lag med beskyttelse for øynene. Det er viktig at alle spor av Hårfjerningskrem fjernes for å unngå mulig irritasjon fra overdreven eksponering for kjemiske middel. Desinfiser hodebunnen ved å bruke 5% klorhexidin (figur 1D).
- Subkutant injisere 5 mg / kg carprofen fortynnet i 200 ul saltvann. Påfør veterinær øye salve for å hindre tørrhet og holde dyret på en varmeplate til enhver tid. Plasser dyret under drifts kikkert.
- Lag en 1 cm lang oval kutt i hodebunnen huden ved hjelp av gode saks og pinsett (Figur 1E). Hold periosteum bruker buede pinsett og klippe bort hjelp av gode saks.
- Bore calvarial defekt 2 mm anterior til bakhode sutur ved hjelp av en dental drill ennd en 5-mm ytre diameter trephine (figur 1F og G). For å unngå penetrering av dura mater, bore tre fjerdedeler av veien i beinet og ta av beinfragment med en slikkepott.
- Å implantere en autograft, hente benfragmentet og vaske den i en 10 mm plastplate som inneholder 10 ml sterilt saltvann for å fjerne rusk. Ikke fjern den myke vev. Å implantere en allograft, tine på forhånd en allograft og normalisere det å RT, og deretter vaske det.
- Plasser bein pode i feilen ved hjelp av buet pinsett slik at det ikke vil berøre de defekte marginer (Figur 1 H). Lim transplantatet til verts benet ved hjelp av fibrin-gel (5 ul av 46 mg / ml fibrinogen blandet med 5 ul av 25 U / ml trombin).
- Sutur huden ved hjelp av 4-0 Vicryl sutur (Figur 1I). Påfør povidon-jod til det kirurgiske snitt. Forsiktighet bør tas for å hindre forurensning av sutur av pels. Mark musen øret og injisere 0,25 mg / kg Antisedan to reversere narkosen effekten av medetomidin.
- Hvis dyret våkner opp i 10 min, sørg for at den ligger på en oppvarmet pad. Injisere 200 ul sterilt saltvann, og om nødvendig injisere 0,1 mg / kg Antisedan. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt restituert.
- Holde dyrene i adskilte bur i en uke for å hindre dem fra å åpne suturene. Plasser musen chow dynket i vann i en petriskål på buret gulvet for et par dager post-op. Injiser subkutant 200 ul av 1 mg / ml karprofen oppløsning fortynnes i steril saltoppløsning en gang om dagen i 3 dager etter kirurgi for å behandle postoperativ smerte.
Figur 1. Calvarial Allograft Forberedelse og Calvarial Defect Surgery. Benfragmentet er isolert fra calvarial region (A). Mykt lommetrøkle, Benmarg, og blod blir penslet (B), og pode skylles i 70% etanol, etterfulgt av to vaskinger i fosfat-bufret saltvann (C, AG = allograft). Mottakeren mus er klargjort for operasjon ved barbering og desinfeksjon av hud i calvarial region (D). Et ovalt snitt dannes i hodebunnen huden, og periosteum er fjernet (E). Deretter blir calvarial defekten boret med en 5 mm diameter trephine (F). Benfragmentet er frittliggende ved hjelp av en skje formet spatel, forlater superior sagittal sinus intakt (G). Den allograft blir deretter plassert i defekten og sikret ved hjelp av fibringel (H). Til slutt blir huden sys (I). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Micro-computertomografi for Karakterisering avden Vaskulær treet
- Forbered heparinisert saltvann. Vekt 2000 U natriumheparin og plassere den i 50 ml plastrør. Tilsett 20 ml saltvann og rist godt røret. Fyll en 20-ml Luer lock sprøyte med 15 ml oppvarmet heparinisert saltvann og koble sprøyte til en 23-G hodebunn vene set. Fest sprøyten til en sprøytepumpe, og sett den til å pumpe 10 ml på 1 ml / min.
- Sedat en mus ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av 50 ^ fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Knip dyrets lemmer for å sikre at det er dypt bedøvet. Fest musen på ryggen til en fiksering bord innpakket med et absorberende underlag liner (Figur 2A). Plasser den faste mus i en avtrekkshette for å hindre eksponering av personell til røyk.
- Skjær hud fra magen til halsen hjelp av gode saks og pinsett (figur 2B). Skjær bukveggen opp til xiphoid prosessen (figur 2C). Skjær brystkassen langs lateral aspekt. Unngå å skade lungene and hjerte, og pass på at hjertet er fullt eksponert. Bruk en hemostat å trekke sternum (figur 2D).
- Sett butterfly nål 3 mm inn i venstre hjertekammer (figur 2E). Lim nålen til hjertet og brystveggen ved hjelp av tre-sec lim (figur 2F).
- Aktiver pumpen umiddelbart. Etter et minutt, dissekere inferior vena cava for å trykkavlaste blodkar (figur 2G). Vippe brettet slik at væske vil strømme bort fra hodet. Vellykket perfusjon vil resultere i å fjerne leveren og blodkar.
- Når heparinisert saltvann perfusjon er fullført, perfuse 10 ml 4% formaldehyd. Unngå penetrasjon av luftbobler inn i blodkar og unngå eksponering for formaldehyd røyk. Vellykket perfusjon formaldehyd vil føre til avstivning av halen. Skylle ut formaldehyd med 10 ml hepariniserte saltvann.
- Klargjør radioopakt kontrastmiddel i henhold til manufacturer instruksjoner. Vanligvis vil det kreve blanding av forbindelsen, fortynningsmiddel, og et herdemiddel. Bruk serologiske pipetter og blande løsningen i et 15 ml plastrør.
- Perfuse dyret med kontrastmiddelblanding med en hastighet på 1 ml / min. Observere koronar, tarm og leverblodårer og sørge for at de er å snu gult etter perfusjon av 2 - 3 ml, noe som indikerer vellykket perfusjon (figur 2 H). Ved ferdigstillelse av perfusjon, kutt butterfly nål sin tubing, få kadaveret alene og pakk den inn toalettpapir for å forhindre lekkasje av løsningen på den calvarial regionen. Tillat polymerisasjon i 4 ° CO / N.
- Dissekere calvarial regionen (figur 2I); Først bruke en skalpell til å skjære i huden som lateral som mulig, unngå å skade skallen av interesse. Finn bein pode og deretter bruke gode saks til å klippe kraniebein 10 mm fra pode.
- Skann isolert calvarial bein prøve å bruke en μCT skanner; satt synsfeltet til 20,5 mm, røntgenenergi på 55 kVp, intensitet på 145 uA, ved hjelp av fremspring 1000 pr 360 ° og integrasjonstid på 200 msek. Juster μCT parametre 7 til bilde andre bein defekt modeller.
- Observere 2D rekonstruert skiver som ble generert av μCT programvare. Sørg for å skanne regionen av interesse er riktig og finn deretter calvarial defekt. Vurdere kvaliteten av perfusjon. Etter vellykket identifikasjon av blodkar (figur 2J), fortsette og avkalk prøven ved bruk av 6% trikloreddiksyre (TCA) fortynnet i dobbelt destillert vann (DDW).
- Skanne prøven med parameterne som er angitt i § 3.10. Finn bakhode sutur i rekonstruerte 2D skiver. Definerer et sylindrisk volum av interesse (VOI) i høyde på 2 mm og 8 mm i diameter, som er tangent til suturen - dette er det anatomiske stedet for feilen.
- Segment the benvev fra mykt vev ved hjelp av en global terskling prosedyre; sette lavere terskel til 130, og bruke en begrenset 3D Gaussian filter (sigma [σ] = 2,0 og støtte = 2) til delvis undertrykke støy i volumene. Generere et 3D-rekonstruksjon og sørg for at VOI er riktig plassert (figur 2K).
- Generere en tykkelse kartet ved hjelp av IPL programvare og "dt_object_param" -funksjonen (figur 2L).
MERK: Denne funksjonen beskriver volum fartøyet for hver diameter fartøy.
Figur 2. Perfusjon ved hjelp av en radio-opak middel via hjerte tilnærmingen. Musen er festet til fikseringskortet (A), og huden er kuttet langs buken opp til halsen (B). Bukveggen er skåret langs mediale linjen opp til xiphoid process (C), og at brystkassen er skåret i sideretning (D). En sommerfugl nålen er satt inn i venstre hjertekammer, unngå innføring i høyre hjertekammer, som er merkbart mørkere (E, er den høyre ventrikkel hvor den hvite stiplet linje), og nålen er festet til hjerte og brystveggen (F) . Heparinisert saltvann (2-3 ml) pumpes inn i hjertet, og vena cava inferior dissekeres (G, indikerer hvit pil vena cava inferior). Formaldehyd (4%) ble perfusert og vasket ut; Dette er etterfulgt av en perfusjon av gul-farget radio-opak kontrastmiddel. Vellykket perfusjon vil være tydelig ved klaring av blodkar, som endrer farge til gul (H). Etter polymerisering blir calvarial regionen isolert (I, AG = allograft) og avbildes ved bruk av en skanner μCT å bekrefte riktig perfusjon (J, volum av interesse er markert med orange). DePrøven er decalcified og skannes på nytt (K), etterfulgt av generasjon av en farget tykkelse kart (L). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Fluorescens Imaging of Bone Minera og blod
- Rekonstituer prober til en konsentrasjon på 2 nmol / 100 ul PBS i et 1,5 ml rør (bruke en bisfosfonat-konjugerte fluorescerende probe for å overvåke benmineralisering og en blodbårne fluorescerende middel for å måle blod perfusjon). Pipetter forsiktig flere ganger for å sikre homogen oppløsning av proben.
- 24 timer før den utpekte bildebehandling økten ta en time-null image; bedøve 3-mus ved bruk av 2 l / min inhalering av 100% av medisinsk kvalitet oksygen supplert med 3% isofluran i en induksjonskammeret. Etter riktig anestesi er etablert, senk isofluran konsentrasjon til 1,5% - 2%.
- Påfør veterinæren øyesalve for å hindre tørrhet og sørge for at varmeputen er slått på hele tiden. Knip dyret lemmer for å sikre at det er dypt bedøvet. Ikke la et dyr uten tilsyn før det gjenvant tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Barbere calvarial regionen ved hjelp av en hårklipper bruke det mot hårets vekstretning. Fjern pelsrester som bruker hårfjerningskrem. Enhver pels rest vil forstyrre optisk imaging. Fjern sting bruker gode saks og pinsett.
- Plasser tre dyr på IVIS scenen oppvarmet til 37 ° C for hvert avbildningssesjon. Still eksponeringstiden til auto, se feltet til C, og justere filtre. F.eks for et bisfosfonat-konjugert fluorescerende probe tegnes med maksimal eksitasjon ved lys bølgelengde på 680 nm, bruke en eksitasjon filter på 675 nm og en emisjonsfilter Cy5.5 . Tilsvarende når du bruker en blodbårne fluorescerende agent med peak eksitasjon ved lys bølgelengde 750 nmbruke en eksitasjon på 710 nm filter og en emisjonsfilter på 780 nm.
- Bilde musene gjennom Levende bilde programvare ved å trykke på "Acquire" -knappen. Kontroller at calvarial regionen er helt synlig (figur 3B) For en omfattende guide råd Lim et al 2009 8.
- Tillat musene å våkne inhaling 100% oksygen.
- Injisere 2-nmol fluorescerende probe via en intravenøs hale injeksjon. På det angitte bildebehandling økten, utføre bildebehandling som beskrevet ovenfor.
5. Micro-computertomografi for Bone Regeneration
- For kvantifisering av bendannelse, bedøve mus ved inhalering av 3% isofluran, som vist i trinn 4,2 - 4,3. Overfør musen til μCT skanneren, og legg den i skanneren.
- Sett μCT skannerens røntgenrøret potensiell energi til 55 kVp og intensitet av 145 uA medium oppløsning. Ved hjelp av et synsfelt på 20,5 mm, utføreen scout (enkelt x-ray) skanne og definere et område av interesse strekker seg fra muse øyne til baksiden av skallen. Utfør en CT scan, ved hjelp av 1.000 anslag per 360 ° og integrering tid på 200 msek.
- Rekonstruere de 2D skivene ved hjelp av en nominell romlig oppløsning på 20 um. Juster defekt marginer til et standardisert posisjon ved hjelp μCT programvare 9.
- I likhet med trinn 3.20, definere en sylindrisk volum av interesse og bruke den begrensede 3D Gaussian filter (σ = 0,8 og støtte = 1) til delvis undertrykke støy i volumene. Segment benvevet fra mykt vev ved anvendelse av en global terskel prosedyre.
- Bestemme volumet av mineralisert benvev i volumet av interesse.
6. Bioluminesens Imaging av stamcelle Rekruttering og Differensiering
- Forbered musen for bildebehandling som avbildet i §§ 4,2-4,4 og våken musene ved innånding av 100% oksygen.
- Administrere en26 mg / kg beetle luciferin til hver mus via intraperitoneal injeksjon, og returnere dyret til induksjonskammeret. Etter 2 min, bedøve dyret ved bruk av 3% isofluran. Plasser mus på IVIS varmet scenen.
- Via Leve Bilde programvare, sett eksponeringstiden til "auto", og synsfeltet til C. Bilde musene 5 min etter luciferin administrasjon. Bilde dyrene som er avbildet i trinn 4.6, ved hjelp av "Bioluminesens" modalitet Definer regioner av interesse fordi transgene uttrykk varierer mellom mus. Normalisere calvarial signal til halen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neovascularization ble vurdert av μCT volumetrisk analyse og ved FLI bruker en fluorescerende blodbårne agent for å kvantifisere blodperfusjon. Syv dager etter operasjonen, viste μCT scanning et betydelig høyere volum av små og mellom diameter blodkar i mus som hadde fått autografts enn i mus som hadde fått allografter høstet fra C57BL / 6 (figur 3A). Interessant, i autograft gruppen den nydannede vaskulære tre syntes å nå hele defekte område, mens det i allograft gruppen blodkar viste seg å trenge inn i det defekte område fra de ytre kanter og utvidet innover til bare en liten grad. Den FLI støttet denne observasjonen, som viser betydelig høyere blodperfusjon i autograft-behandlede dyr (Figur 3B). Ved den 14. dag, i allograft-gruppen i det vaskulære treet nådde av graftet nærhet, men beholdervolum var signifikant lavere sammenliknetil autograft gruppe i de fleste fartøy diametre at vi undersøkte (Figur 3C). Merk: forskjeller i beholdervolum var mest fremtredende når fartøy med 0.08- til 0,1 mm diameter ble sammenlignet. Tjueåtte dager etter operasjonen blodkar volumet tilbake til baseline (Figur 3D).
Syv dager etter operasjonen, FLI utført ved hjelp av hydroksyapatitt styrt sonde viste betydelig større beinmineralisering i autograft gruppe (Figur 4A). Innen den tid, hadde bein dannet hele pode nærhet i autograft-implantert dyr. I kontrast, hadde bein i allograft-implantert mus dannes bare på feilmarginer og var preget av en ring form. Volumene av bendannelse ble kvantifisert 56 dager etter kirurgi, ved endepunktet til regenerativ prosess, ved å utføre μCT analyse (figur 4B). Benvolum var betydelig høyere (Figur 4C) og pode thickness betydelig større hos de dyrene som fikk autografts (Figur 4D). BLI ble anvendt i osteocalcin luciferase-transgene mus for å overvåke stamcelle rekruttering og differensiering mot osteoblastiske avstamning (figur 4E). Hos mus implantert med allografter, den BLI signal toppet 4 - 7 dager etter operasjonen, når signalet målt ved calvaria var 15 ganger høyere enn det som måles på halen. I autograft-implantert mus, den BLI signal toppet seg litt senere, 7 - 10 dager etter operasjonen, og var betydelig høyere, og nådde en 2 ganger høyere calvaria-til-hale ratio (Figur 4F).
Figur 3. autograft Implantasjon Forenkler Angiogenese. Calvarial defekter ble opprettet i mus. Halvparten av dyrene mottok allografter, og den andre halvparten fikk autografts. Demus ble perfusert med et polymeriserende kontrastmiddel 7 dager etter operasjonen. Den calvarial region ble isolert, og prøvene ble decalcified og avbildes ved bruk av en skanner μCT. En volumetrisk tykkelse kart ble generert ved hjelp av IPL programvare (A, n = 3, linjene representerer ± SE, og stjernene indikerer P-verdi <0,05). Mus ble injisert med en fluorescerende blodbårne sonde 6 dager etter operasjonen. 24 timer senere ble dyrene underkastet FLI og en kvantitativ analyse ble utført (B, n = 5, linjene representerer ± SE, og stjernene indikerer P-verdi <0,05). En μCT basert vaskulære analyse ble utført 14 (C) og 28 (D) dager etter operasjonen (C og D: n = 3, barer representerer ± SE, og stjernene viser P-verdi <0,05). Klikk her for å se en større version av dette tallet.
Figur 4. Implantasjon av en autograft Fremmer Mer Osteogenesis Than Implantasjon av en Allograft. Mus fikk implantater av calvarial autografts eller allografter. Musene ble senere injisert med en hydroksyapatitt-målrettet probe ved IV-injeksjon 6 dager etter operasjonen. 24 timer senere FLI og en kvalitativ analyse ble utført (A, n = 5, barer representerer ± SE, og stjernene viser P-verdi <0,05). I vivo μCT analyse ble utført 56 dager etter operasjonen, og en sylindrisk volum av interesse merket med orange ble definert (B). Benvolum (C) og pode tykkelse (D) ble kvantifisert (n = 8, linjene representerer ± SE, og stjernene indikerer P-verdi <0,05) .Transgenic mus som uttrykker luciferase driven av osteokalsin arrangøren fikk allografts eller autografts. BLI ble utført 10 dager etter operasjonen (E) så vel som i andre angitte tidspunkter. Signalet målt ved calvarial regionen var normalisert fordi uttrykket nivået varierer mellom mus (F, n = 8, barer representerer ± SE, og stjernene viser P-verdi <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med multimodale avbildningsfremgangsmåter som er beskrevet her, er å muliggjøre grundig undersøkelse av angiogenese-osteogenesis aksen i sammenheng med kraniebentransplantering. Neovascularization ble avbildes med en μCT protokollen, som tillot en nøyaktig høyoppløselig 3D-demonstrasjon av vaskulær treet fôring hele kranie defekt. μCT data lett kan analyseres ved hjelp av avanserte verktøy som IPL programvare. For eksempel kan tykkelsen analysen er vist i figur 3C viste at hovedforskjellene mellom kranie autograft og allograft er i fartøyer området fra 0,1 til 0,08 mm i diameter, som karakteriserer blod arterioler 10. Dette resultatet er i overensstemmelse med studier utført i lange ben 11 modell. Det bør bemerkes at de smaleste detekterbare fartøy av 0,02 mm diameter som ikke er fullt støpt på grunn av viskositeten av den radio-opake middel. Den største ulempe med denne metoden er det faktum at det innebæreravliving av dyret, og dermed langsgående avbildning er umulig. Flere røntgentette prober er tilgjengelig for in vivo vaskulær μCT bildebehandling; men de er ikke så radioopakt som den tette polymeriserende sonde, og bildeoppløsningen ikke oppfyller det som tilbys av ex vivo metode avbildet her 12. μCT oppløsning er begrenset, og vil ikke være nyttig å studere blodkapillærer, for eksempel. Annet enn det, hjulpet av en dyktig hånd denne metoden gir en reproduserbar teknikk for å studere bein blodkar i detalj.
Et kritisk trinn i de avbildede protokoller er bestemmelse av det defekte sted (trinn 2.7). Skade bakhode sutur vil føre til massive blødninger. Ved boring av calvarial defekt, bør man sørge for ikke å forstyrre den streke dura mater og superior sagittal sinus. Sist, innsetting av sommerfuglen nål inn i venstre hjertekammer er en delikat prosedyre (trinn 3.4). Hvis nålen er innsatsened inn i høyre hjertekammer, vil kontrastmiddelet perfuse lungene og gå videre til venene, som fører til dårlig blodgjennomstrømming i calvaria. Hvis nålen er satt inn for dypt, vil det perforere den bakre hjerteveggen; og hvis nålen ikke er satt langt nok, kan det lett rive bort fra hjertet. Ikke forsøk å re-justere nålen posisjon som du kan forstyrre perfusjon. Fremgangsmåten kan modifiseres ved hjelp av et sett av tilgjengelige fluorescerende prober; Integrin-α 3 β v -targeted sonde kan benyttes til å fremheve nydannede blodkar, mens katepsin-K-målrettet sonde kan benyttes til å kvantifisere osteoclast-aktivitet.
I tråd med vår hypotese, observerte vi at calvarial autografts har en høyere osteogent potensial enn allografter. Dette gjelder for lange knokler og 13, og kan skyldes flere faktorer. For det første inneholder den autograft bendannende celler som produserer benmatrise gjennom hele graftetoverflate, noe som gjenspeiles på minerastyrt FLI (Figur 4A); mens allotransplantater indusere knappe beindannelse bare på feilmarginer. For det andre, BLI av osteocalcin-luc mus avslørte flere osteogen aktivitet i autograft gruppe, noe som kan forklares ved tilstedeværelsen av vekstfaktorer som er fjernet i allograft fremstillingsprosessen (figur 4F). Interessant, benmineralisering var betydelig høyere på dager 6 og 7, når den hydroksyapatitt-målrettede probe ble administrert, og celledifferensiering representert ved BLI aktivitet var tydelig senere, mellom dag 7 og dag 10. Vi kan slutte av dette at mer omfattende benmineralisering kan i det minste delvis forklares ved den gunstige vaskulaturen som karakteriserer autologt bentransplantering.
Våre resultater tyder på at autograft har overlegne osteogene kapasitet; Men, må man ta i betraktning at autogen bein pode har flere drawbacks. Bone høsting er begrenset i volum og innebærer sykelighet til donor området 14-16. I tillegg, er forekomsten av ben-resorpsjon autograft ikke ubetydelig 17-19. Allotransplantater er svært tilgjengelig og presentere en off-the-sokkel løsning for klinikeren. Flere verk har vist hvordan osteo-integrasjon av hjerne allotransplantater kan forbedres ved ulike måter, alt fra belegg på allograft med BNIP2-koding adenoassosiert virus 20,21 til adjuvant terapi som periodisk parathyroid terapi 22. Til slutt, når allograft evne til å fusjonere med bein er perfeksjonert, vil allograft blitt det foretrukne pode materiale.
I lys av disse resultatene, ligger en spesiell interesse i spørsmålet hvordan å modulere neovascularization på stedet av bein regenerasjon. Direkte tilnærming av VEGF overekspresjon ble funnet ineffektiv, når formings blodkar er utett og danner ikke et funksjonelleonal netto 23,24. Interessant ble det funnet at BMP signaltransduksjon som fører til målrettet dannelsen av blodkar 25,26. Videre ble farmasøytiske midler 11 og celleterapi 27 vist seg å endre angiogenese mønstre på bein pode nærhet; begge tilnærminger presentere lovende strategier for å forbedre hjerne bendefekten healing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
