Summary
Implantation av autologa och allogena benimplantat utgör accepterade metoder för att behandla stora kraniofaciala benförlust. Ändå effekten av transplantat komposition på samspelet mellan kärlnybildning, celldifferentiering och benbildning är oklart. Vi presenterar en multimodal imaging protokoll syftar till att belysa angiogenes osteogenesis ömsesidigt beroende på transplantatet närhet.
Abstract
En stor parameter bestämma framgången för en ben ympning förfarande är vaskularisering av området kring implantatet. Vi antog att implantation av ett ben autograft skulle få större benåterbyggnad av yppig blodkärlsbildning. För att undersöka effekten av transplantatet på neovaskularisation på skadestället, har vi utvecklat en mikro datortomografi (μCT) tillvägagångssätt för att karakterisera nybildade blodkärl, vilket innebär systemisk perfusion av djuret med en polymeriserande kontrastmedel. Denna metod möjliggör detaljerad vaskulär analys av ett organ i sin helhet. Dessutom var blodperfusion bedömdes med användning fluorescensavbildning (FLI) av en blodburen fluorescerande medlet. Benbildning kvantifierades genom FLI användning av en hydroxiapatit-riktad sond och μCT analys. Stamcell rekrytering övervakades genom bioluminescens avbildning (BLI) av transgena möss som uttrycker luciferas under kontroll av den osteokalcin promotorn.Här beskriver vi och visar framställningen av allograft, calvarial defekt kirurgi, μCT skanningsprotokoll för kärlnybildning studien och benbildning analys (inklusive perfusion av kontrastmedlet in vivo), och protokollet för dataanalys.
Den högupplösta analys av kärl 3D uppvisade signifikant större angiogenes hos djur med implanterade auto, särskilt när det gäller arteriole bildning. Följaktligen blodperfusion var signifikant högre i gruppen med autologt bentransplantat från 7: e dagen efter operationen. Vi observerade överlägsen benmineralisering och mäts större benbildning hos djur som fick auto. Autograft implantering inducerad bosatta stamcells rekrytering till transplantat-värdbenet sutur, där cellerna differentieras till benbildande celler mellan den 7: e och 10: e postoperativa dagen. Detta konstaterande innebär att förbättrad formation ben kan tillskrivasden utökade kärl utfodring som präglar autograft implantation. De metoder som avbildas kan tjäna som ett optimalt verktyg för att studera benåterbyggnad i form av tätt avgränsas benbildning och kärlnybildning.
Introduction
Kraniofaciala benförlust på grund av trauma, tumörresektion, dekompressiv kraniotomi och medfödd defekt sällan läker av sig själv och presenterar ett tydligt ouppfyllt kliniskt behov. Autologa bentransplantat och allogena bentransplantat används i stor utsträckning för att behandla dessa tillstånd 1.
Det är allmänt accepterat att osteogenes är tätt kopplade med angiogenes 2,3. Sålunda bör den fullständiga studien om en föreslagen terapi för benåterbildning innefatta en omfattande undersökning av det vaskulära trädet bildar hela defekta stället. Det finns flera tillgängliga metoder för att karakterisera vaskularisering i forskningsmodeller. Kärl träd kan undersökas genom histologisk analys. Eftersom histologi beroende av snitt vävnad, det finns en hög sannolikhet för att den resulterande bilden kommer att snedvridas. För att lösa detta problem, kan intravital mikroskopi utföras bilden intakt blodkärl 4; emellertid är denna metodbegränsad till en-plan avbildning. μCT scanning av prover som erhållits från ett djur perfusion med kontrastmedel kan 3D-avbildning av vaskulära nätverk som matar regenere webbplats 5. Detta tillvägagångssätt gör att en mycket detaljerad demonstration av ett organ kärlsystem i sin helhet, liksom en noggrann analys av distributions blodkärl. Dessutom μCT möjliggör differentiering mellan olika diametrar blodkärl, som kännetecknar de olika subtyper av blodkärl.
Vi antog att implantation av en calvarial autograft inducerar större neovaskularisation än implantering av en allograft, och denna ökade neovaskularisation kommer att leda i sin tur till ökad ben formation.To driva denna hypotes använde vi en mängd olika tekniker. Vi undersökte mönster av det nybildade vaskulära trädet genom att utföra en μCT baserad analys. Vi mätte blodperfusion med hjälp av en blod pool fluorescerande sond. Nästa, vi åsnorSED benvävnaden mineralisering av FLI av en hydroxiapatit-riktad sond och μCT analys. Slutligen, övervakas vi stamcells rekrytering och differentiering, utför BLI i transgena möss där luciferas uttrycks i osteokalcin-positiva celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna för den institutionella djuromsorg och använda kommitté (IACUC) The Hebrew University of Jerusalem, Israel (Request nr MD-12-13524-4), en AAALAC godkänd anläggning, och av Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Request nr 3770). Djuren behandlas strikt följsamhet till NIH riktlinjer.
1. Framställning av Bone Allografts
- Euthanize 7- till 8 veckor gamla Balb / C-möss, eller någon stam skiljer sig från mottagaren med hjälp av standardmetoden CO 2 inandning eller intraperitoneal injektion av 50 ul fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Bekräfta frånvaron av ett hjärtslag och utföra halsdislokation. Alternativt, skörda allo från slaktkroppar som har hållits i -20 ° C och tinade före skörd.
- Raka calvarial regionen med hjälp av en hårtrimmer, tillämpa den mot hårets växtriktning. Desinficera stommen huvudet genom att applicera 70% isopropanol. Skär hårbotten huden med en nr 11 skalpell och ta bort benhinnan.
- Med hjälp av en tandläkarborr och en trephine inre diameter 4,5 mm, lossa en cirkulär fragment av calvarial ben. Överför benfragmentet till en 100-mm plastskål innehållande steril saltlösning. Vid denna punkt, observera blod och mjuk vävnad fäst vid benfragmentet (Figur 1A). Skaffa benfragment på detta sätt från 22 donatorer.
- Håll ett benfragment i taget med hjälp böjda pincett. Tvätta den ordentligt med hjälp av bomull tippas applikatorn och ta bort eventuella hjärnvävnad, mjuk vävnad och blod (Figur 1B). Skär försiktigt bort alla benbitar som förblir knutna till transplantatet med fina sax så att transplantatet kommer att ha en perfekt rundad form.
- Doppa varje transplantat gång i en 15 ml rör innehållande 70% etanol och två gånger i 15 ml rör innehållande fosfatbuffrad saltlösning för att tvätta etanolen.
- Frysa allografter i en -80 ° C kylskåp i kryorör i åtminminst en vecka. Vid denna punkt, se till att allografter visas genomskinliga (figur 1C).
2. calvarial Defekt Kirurgi
- För mottagare använder transgena möss som uttrycker luciferas under kontroll av den osteokalcin promotorn 6.
- Sterilisera spetsarna på kirurgiska verktyg med hjälp av en glaspärla aggregat för 30 sek. Överför verktygen till en burk som innehöll 70% isopropanol för att upprätthålla sterila betingelser. Använd sterila handskar.
- Söva en 7- till 8-veckor gamla honmus genom intraperitoneal injektion av en ketamine- medetomidin blandning (75 mg / kg och 1 mg / kg, respektive). Nyp djuret lem för att se till att det är djupt sövd. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills det återfått tillräckligt medvetandet att upprätthålla sternala VILA.
- Raka calvarial regionen med hjälp av en hårtrimmer genom att tillämpa den mot hårets växtriktning. Applicera hårborttagningskräm för att avlägsna eventuella pälsrester och torka av den after inte längre än 2 minuter med hjälp av torr gasväv följt av saltlösning indränkt gasbinda. Försiktighet bör vidtas för att undvika att få det i ögonen. Alternativt kan veterinären ögonsalva appliceras före hårborttagning som ett extra lager av skydd för ögonen. Det är viktigt att alla spår av hårborttagningskräm tas bort för att undvika irritation från överdriven exponering för det kemiska medlet. Desinficera hårbotten genom att tillämpa 5% klorhexidin (Figur 1D).
- Injicera subkutant 5 mg / kg karprofen utspädd i 200 | al saltlösning. Applicera veterinär ögonsalva för att förhindra torrhet och hålla djuret på en termisk dyna vid alla tidpunkter. Placera djuret under drifts kikare.
- Gör en 1-cm lång oval snitt i hårbotten huden med fina sax och pincett (Figur 1E). Håll periostet med hjälp av böjda pincett och skär bort med hjälp av fina sax.
- Borra calvarial defekten 2 mm främre till den lambdoid suturen med en tandläkarborr ennd en trefin 5 mm ytterdiameter (Figur 1F och G). För att undvika penetration av dura mater, borra tre fjärdedelar av vägen in i benet och lossa benfragment med hjälp av en spatel.
- Att implantera en autograft, hämta benfragmentet och tvätta den i en 10 mm plastplatta innehållande 10 ml steril koksaltlösning för att ta bort skräp. Ta inte bort de mjuka vävnaderna. Att implantera en allograft, tina i förväg en allograft och normalisera den till RT, och sedan tvätta den.
- Placera bentransplantation i defekten med hjälp av böjda pincett så att den inte kommer att beröra de defekta marginalerna (figur 1H). Limma transplantatet till värdbenet med användning fibringel (5 | il av 46 mg / ml fibrinogen blandades med 5 | il av 25 U / ml trombin).
- Sutur huden med 4-0 vicryl sutur (Figur 1I). Applicera povidonjod till det kirurgiska snittet. Försiktighet bör vidtas för att förhindra kontaminering av suturen genom päls. Märk musörat och injicera 0,25 mg / kg Antisedan to vända den anestetiska effekten av medetomidin.
- Om djuret inte vakna upp i 10 minuter, se till att den ligger på en uppvärmd dyna. Injicera 200 ul steril saltlösning, och om det behövs injicera 0,1 mg / kg Antisedan. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap av andra djur tills återhämtat sig helt.
- Hålla djuren i separerade burar under en vecka för att hindra dem från att öppna suturerna. Placera musfoder indränkt i vatten i en petriskål på burgolvet för ett par dagar efter op. Injicera subkutant 200 pl 1 mg / ml Karprofen lösning utspädd i steril saltlösning en gång om dagen i 3 dagar efter operation för att behandla postoperativ smärta.
Figur 1. calvarial Allograft Framställning och calvarial Defect kirurgi. Benet fragmentet isoleras från calvarial regionen (A). Mjukvävnad, Benmärg och blod svabbas (B) och transplantatet sköljs i 70% etanol följt av två tvättningar i fosfatbuffrad saltlösning (C, AG = allotransplantat). Mottagaren musen är förberedd för kirurgi genom rakning och desinfektion av huden i calvarial regionen (D). En oval snitt skapas i hårbotten hud och benhinnan avlägsnas (E). Därefter calvarial defekten borras med användning av en trefin 5-mm-diameter (F). Benfragmentet är fristående med användning av en sked-formad spatel, lämnar sinus sagittalis superior intakt (G). Den allogena transplantatet placeras sedan i defekten och säkras med hjälp av fibringel (H). Slutligen huden sys (I). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Micro-Datortomografi för karakterisering avVascular Tree
- Förbered hepariniserad saltlösning. Vikt 2000 U natrium heparin och placera den i 50 ml plaströr. Tillsätt 20 ml koksaltlösning och skaka väl röret. Fyll en 20-ml Luerlås spruta med 15 ml uppvärmd hepariniserad koksaltlösning och anslut sprutan till en 23-G hårbotten ven set. Fäst sprutan en sprutpump, och ställ in den för att pumpa 10 ml vid 1 ml / min.
- Stillsam en mus med användning av en intraperitoneal injektion av 50 ^ fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Nyp djurets lem för att se till att det är djupt sövd. Säkra musen på rygg till en fixerings styrelse lindade med en absorberande yta liner (Figur 2A). Placera den fasta musen i ett dragskåp som hindrar att personer utsätts för rök.
- Skär huden från buken till halsen med fina sax och pincett (Figur 2B). Skär bukväggen upp till xiphoid processen (figur 2C). Skär bröstkorgen längs dess laterala. Undvik att skada lungorna end hjärta, och se till att hjärtat är fullt exponerad. Använd en hemostat för att dra in bröstbenet (figur 2D).
- För in fjärilsnål 3 mm i den vänstra ventrikeln (Figur 2E). Limma nålen till hjärtat och bröstväggen med användning av 3-sek lim (Figur 2F).
- Aktivera pumpen omedelbart. Efter en minut, dissekera den nedre hålvenen för att tryckavlasta vaskulaturen (Figur 2G). Luta brädan så att vätskor kommer att flyta bort från huvudet. Framgångsrik perfusion kommer att resultera i att rensa lever och blodkärl.
- När hepariniserad saltlösning perfusion är klar, BEGJUTA 10 ml 4% formaldehyd. Undvik penetration av luftbubblor i kärlsystemet och undvika exponering för formaldehyd rök. Framgångsrik formaldehyd perfusion kommer att resultera i förstyvning av svansen. Spola ut formaldehyd med 10 ml hepariniserade saltlösning.
- Förbered radioopakt kontrastmedlet enligt TillverkningsÅrtal urer instruktioner. Typiskt kommer det att krävas blandning av föreningen, utspädningsmedel, och en härdare. Använd serologiska pipetter och blanda lösningen i en 15 ml plaströr.
- Perfundera djuret med kontrastmedlet blandningen med en hastighet av 1 ml / min. Observera krans, intestinala och lever blodkärl och se till att de gulna efter perfusion av 2 - 3 ml, vilket indikerar lyckad perfusion (Figur 2H). Efter avslutad perfusion, skär fjärilen nålens slangar, erhålla stommen ensam och slå in den med toalettpapper för att förhindra läckage av lösningen till den calvarial regionen. Tillåt polymerisation i 4 ° CO / N.
- Dissekera calvarial regionen (fig 2i); Först använda en skalpell för att skära in i huden som i sidled som möjligt, undvika att skada hjärn regionen av intresse. Lokalisera bentransplantatet och sedan använda fin sax för att klippa skallbenet 10 mm bort från transplantatet.
- Skanna isolerade calvarial prov ben med hjälp av en μCT scanner; set synfält till 20,5 mm, X-ray energi 55 kVp, intensitet av 145 iA, med hjälp av 1000 projektioner per 360 ° och integration tid på 200 ms. Justera μCT parametrar 7 till bild andra ben defekt modeller.
- Beakta 2D rekonstruerade segment som genererades av μCT programvaran. Se till att skanna regionen av intresse är korrekt och leta upp calvarial defekten. Bedöma kvaliteten på perfusion. Efter en lyckad identifiering av blodkärl (Figur 2J), fortsätta och kalkar provet med 6% triklorättiksyra (TCA) utspätt i dubbeldestillerat vatten (DDW).
- Scanna provet med hjälp av de parametrar som anges i avsnitt 3.10. Leta upp lambdoid sutur i rekonstruerade 2D skivor. Definiera en cylindrisk volym av intresse (VOI) i höjd av 2 mm och 8 mm diameter, är det tangerar suturen - detta är den anatomiska platsen för defekten.
- Segment: tee benvävnad från mjuka vävnader med hjälp av ett globalt tröskelförfarande; ställa in den nedre tröskeln till 130, och tillämpa en begränsad 3D Gaussfiltret (sigma [σ] = 2.0 och stöd = 2) för att delvis dämpa buller i volymerna. Skapa en 3D-rekonstruktion och se till att VOI är korrekt placerad (figur 2K).
- Skapa en tjocklek kartan med hjälp av IPL programvaran och "dt_object_param" funktion (figur 2L).
OBS: Denna funktion beskriver kärlets volym för varje diameter fartyg.
Figur 2. Perfusion med användning av ett röntgentätt medel via hjärt tillvägagångssätt. Musen är fäst vid fixeringskortet (A), och huden skärs längs buken upp till halsen (B). Bukväggen skärs längs den mediala linjen upp till xiphoid förfass (C), och bröstkorgen skärs sidled (D). En fjärilsnål sätts in i vänstra ventrikeln, undvika insättning i den högra ventrikeln, vilket är märkbart mörkare (E, är den högra ventrikeln som indikeras av den vita streckad linje), och nålen är fäst till hjärtat och bröstväggen (F) . Hepariniserad saltlösning (2-3 ml) pumpas in i hjärtat, och den nedre hålvenen dissekeras (G, vit pil anger den nedre hålvenen). Formaldehyd (4%) är perfusion och tvättas ut; detta följs av en perfusion av gul-färgade radioopak kontrastmedlet. Framgångsrik perfusion kommer att framgå av avslut av blodkärl, som ändrar färg till gult (H). Efter polymerisering calvarial regionen isolerades (I, AG = allograft) och avbildas med en μCT scanner för att bekräfta rätt perfusion (J, volym intresse är markerad med orange). Deprovet är avkalkades och återläst (K), följt av generering av en färgad tjocklek karta (L). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Fluorescens avbildning av benmineralisering och blod perfusion
- Rekonstituera prober till en koncentration av 2 nmol / 100 | il PBS i en 1,5 ml rör (använd en bisfosfonat-konjugerad fluorescerande sond för att övervaka benmineralisering och en blodburen fluorescerande medlet för att mäta blodgenomströmningen). Pipettera försiktigt flera gånger för att säkerställa homogen upplösning av sonden.
- 24 timmar före den angivna avbildning session tar tid noll bild; söva 3 möss med 2 L / min inandning av 100% medicinsk kvalitet syre kompletterat med 3% isofluran i en induktionskammare. Efter korrekt anestesi har etablerats, sänker isofluran koncentrationen till 1,5% - 2%.
- Applicera veterinär ögonsalva att förhindra torrhet och se till att värmedynan är påslagen hela tiden. Nyp djuret lem för att se till att det är djupt sövd. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills det återfått tillräckligt medvetandet att upprätthålla sternala VILA.
- Raka calvarial regionen med hjälp av en hårtrimmer tillämpa den mot hårets växtriktning. Ta bort pälsrester som använder hårborttagningskräm. Alla päls rest kommer att störa med optisk avbildning. Ta bort suturer med fina sax och pincett.
- Placera tre djur på IVIS scenen värms till 37 ° C för varje bildsession. Ställ in exponeringstiden till auto, visa fältet till C, och justera filter. T ex för en bisfosfonat-konjugerad fluorescerande prob karakteriseras med maximal excitering vid ljusvåglängd av 680 nm, använda en excitationsfilter av 675 nm och en emissionsfilter av Cy5.5 . På samma sätt, när du använder en blodburen fluorescerande agent med toppexcitering vid ljusvåglängd 750 nmanvända en exciteringsfilter av 710 nm och en emissionsfilter av 780 nm.
- Bild mössen genom Living bildbehandlingsprogram genom att trycka på knappen "Hämta". Se till att calvarial regionen är helt synlig (Figur 3B) För en omfattande guide råd Lim et al 2009 8.
- Låt mössen att vakna andas in 100% syre.
- Injicera 2-nmol fluorescerande sond via en intravenös svans injektion. Vid den angivna avbildning session, utför avbildning som beskrivits ovan.
5. Micro-Datortomografi för benuppbyggnad
- För kvantifiering av benbildning, söva musen genom inhalation av 3% isofluran, såsom visas i steg 4,2 - 4,3. Överför musen till μCT skannern och placera den i skannern.
- Ställ μCT scannerns röntgenröret potentiella energin till 55 kVp och intensitet av 145 pA mellangod upplösning. Med hjälp av ett synfält på 20,5 mm, utföraen scout (enda x-ray) skanna och definiera en region av intresse som sträcker sig från mus ögon på baksidan av sin skalle. Utför en datortomografi, med hjälp av 1000 projektioner per 360 ° och integration tid på 200 ms.
- Rekonstruera 2D skivor med hjälp av en nominell rumslig upplösning på 20 nm. Rikta in defekta marginalerna till en standardiserad position med hjälp μCT programvara 9.
- I likhet med steg 3,20, definierar en cylindrisk volym av intresse och tillämpa den begränsade 3D Gaussfiltret (σ = 0,8 och stöd = 1) att delvis dämpa buller i volymerna. Segment benvävnaden från mjuka vävnader med hjälp av ett globalt tröskelförfarande.
- Bestämma volymen av mineraliserad benvävnad i volymen av intresse.
6. Bioluminescence avbildning av stamcells Rekrytering och differentiering
- Förbered musen för avbildning som visas i avsnitten 4,2-4,4 och vakna mössen genom inandning av 100% syre.
- Administrera 126 mg / kg skalbagge luciferin till varje mus via intraperitoneal injektion, och tillbaka djuret till induktionskammaren. Efter 2 minuter, söva djur med användning av 3% isofluran. Placera möss på IVIS värmde scenen.
- Via Living bildbehandlingsprogram, ställa in exponeringstiden till "auto" och synfältet till C. Bild mössen 5 min efter luciferin administrationen. Bild djuren som visas i steg 4.6, med hjälp av "Bioluminescence" modalitet Definiera områden av intresse eftersom transgenuttryck varierar mellan möss. Normalisera calvarial signalen till svansen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neovaskularisation bedömdes av μCT volymetriska analyser och FLI hjälp av en fluorescerande blodburen agent för att kvantifiera blodperfusionen. Sju dagar efter operationen, μCT scanning visade en betydligt högre volym av små och medel diameter blodkärl hos möss som hade fått auto än hos möss som hade fått allografter skördas från C57BL / 6 (figur 3A). Intressant i gruppen med autologt bentransplantat det nybildade vaskulära trädet tycktes nå hela defekta området, medan det i allograftet grupp blodkärl verkade penetrera det defekta stället från de yttre kanterna och utvidgas inåt för att endast i begränsad omfattning. Den FLI stödde denna observation, visar signifikant högre blodgenomströmningen i autograft-behandlade djur (Figur 3B). Genom den 14: e dagen, i allograftet gruppen det vaskulära trädet nådde alla av transplantatet närhet, men kärlvolymen var signifikant lägre jämföratill autograft gruppen i de flesta fartygs diametrar som vi undersökte (Figur 3C). Obs: skillnader i kärlvolymen var mest framträdande när fartyg med 0.08- till 0,1 mm diameter jämfördes. Tjugoåtta dagar efter operationen kärlvolymen återvände till baslinjen (Figur 3D).
Sju dagar efter det kirurgiska ingreppet, FLI utfördes med användning av hydroxiapatit-riktad sond uppvisade signifikant större benmineralisering i gruppen med autologt bentransplantat (Figur 4A). Vid det laget hade ben bildas hela transplantatet närhet av det kroppsegna-implanterade djur. Däremot hade ben i allograft-implanterade möss bildas endast vid defekt marginaler och präglades av en ringform. Volymer av benbildning kvantifierades 56 dagar efter operation, vid slutpunkten av den regenerativa processen, genom att utföra μCT-analys (fig 4B). Benvolymen var signifikant högre (figur 4C) och transplantat thickness betydligt större i de djur som fick auto (Figur 4D). BLI användes i osteokalcin-luciferas transgena möss för att övervaka stamcells rekrytering och differentiering mot osteoblastisk härstamning (Figur 4E). Hos möss implanterade med allo, nådde en topp på BLI signalen 4 - 7 dagar efter operationen, när signalen mäts vid calvaria var 15 gånger högre än vad som uppmätts i svansen. I autograft-implanterade möss, nådde en topp i BLI-signalen lite senare, 7 - 10 dagar efter operationen, och var betydligt högre och nådde en två gånger högre calvaria-to-tail förhållande (Figur 4F).
Figur 3. Autograft implantation Underlättar Angiogenes. Calvarial defekter skapades i möss. Hälften av djuren fick allograft och den andra hälften fick autotransplantat. Demöss perfunderades med en polymeriserande kontrastmedel 7 dagar efter operationen. Den calvarial regionen isolerades och proverna var avkalkades och avbildas med en μCT skanner. En volumetrisk tjocklek karta alstrades med användning IPL-programvara (A, n = 3, staplar representerar ± SE-bolag, och asterisker indikerar P-värde <0,05). Möss injicerades med en fluorescerande blodburen sond 6 dagar efter operationen. 24 timmar senare djuren utsattes för FLI och en kvantitativ analys genomfördes (B, n = 5, staplar representerar ± SE, och asterisker indikerar P-värde <0,05). En μCT-baserade kärl analys utfördes 14 (C) och 28 (D) dagar efter operationen (C och D: n = 3, staplar representerar ± SE, och asterisker indikerar P-värde <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Implantation av en Autograft främjar mer Osteogenesis än implantation av en Allograft. Möss erhöll implantat av calvarial auto eller allografter. Mössen senare injiceras med en hydroxiapatit-riktad sond genom IV-injektion 6 dagar efter operationen. 24 h senare FLI och en kvalitativ analys utfördes (A, n = 5, staplar representerar ± SE-bolag, och asterisker indikerar P-värde <0,05). In vivo-μCT analys utfördes 56 dagar efter det kirurgiska ingreppet, och en cylindrisk volym av intresse är märkt med apelsin definierades (B). Benvolymen (C) och transplantat tjocklek (D) kvantifierades (n = 8, staplar representerar ± SE, och asterisker indikerar p-värde <0,05) .Transgenic möss som uttrycker luciferas driven av osteokalcin promotorn gavs allografter eller autotransplantat. BLI utfördes 10 dagar efter operationen (E) samt på ytterligare utsedda tidpunkter. Den signal som mäts vid calvarial regionen normaliserades eftersom uttrycksnivån varierar mellan möss (F, n = 8, staplar representerar ± SE, och asterisker indikerar P-värde <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med de multimodala avbildning som beskrivs här är att möjliggöra noggrann undersökning av angiogenes-osteogenesis axel i samband med hjärn bentransplantation. Neovaskularisation avbildades med hjälp av en μCT protokoll, vilket möjliggjorde en exakt högupplösta 3D-demonstration av kärlträdet mata hela hjärn defekten. μCT data kan lätt analyseras med hjälp av avancerade verktyg såsom IPL programvara. Till exempel, tjockleken analys visas i figur 3C visade att de viktigaste skillnaderna mellan hjärnauto och allograft är i kärl som sträcker sig från 0,1 till 0,08 mm i diameter, som kännetecknar blod arterioler 10. Detta resultat är i linje med studier utförda på lång benmodellen 11. Det bör noteras att de smalaste detekterbara fartyg på 0,02 mm diameter som inte är fullständigt gjutna på grund av viskositeten hos radioopaka medel. Den största nackdelen med denna metod är det faktum att den medfördödshjälp av djuret, och sålunda längsgående avbildning är omöjligt. Flera radioopaka sonder finns för in vivo kärl μCT imaging; men de är inte lika radioopakt som den täta polymeriserande sond och bildupplösningen inte uppfyller det som tillhandahålls av ex vivo-metoden visas här 12. μCT resolutionen begränsad och kommer inte att vara till nytta för att studera blod kapillärer, till exempel. Annat än att, med hjälp av en skicklig handen denna metod ger en reproducerbar teknik för att studera ben kärl i detalj.
Ett kritiskt steg i de avbildade protokollen är fastställandet av felet plats (steg 2,7). Skador på lambdoid suturen kommer att leda till en massiv blödning. När borrning calvarial defekt, bör man inte störa huggare dura mater och överlägsen sagittal sinus. Slutligen införing av fjärilsnål i den vänstra ventrikeln är en känslig procedur (steg 3,4). Om nålen är insatsened i höger kammare, kommer kontrastmedlet BEGJUTA lungorna och gå vidare till venerna, vilket leder till dålig perfusion av calvaria. Om nålen sätts in för djupt, kommer det att perforera den bakre hjärtväggen; och om nålen inte sitter tillräckligt långt, kan det lätt slita bort från hjärtat. Försök inte att åter justera nålens position när du kan störa perfusion. Metoden kan modifieras med hjälp av en uppsättning av tillgängliga fluorescerande prober; Grin-α 3 β v -targeted sond kan användas för att understryka nybildade blodkärl, medan cathepsin-K-riktade sond kan användas för att kvantifiera osteoklastaktivitet.
I enlighet med vår hypotes, observerade vi att calvarial auto har en högre osteogen potential än allografter. Detta gäller för långa ben samt 13 och kan tillskrivas flera faktorer. För det första innehåller den autograft benbildande celler, som producerar benmatris under hela transplantatetyta, vilket framgår på mineralisering riktad FLI (Figur 4A); medan allografter inducerar knappa benbildning endast vid defekta marginalerna. För det andra, BLI av osteokalcin-luc möss visade mer osteogen aktivitet av det kroppsegna gruppen, vilket kan förklaras av närvaron av tillväxtfaktorer som tas bort i allograftet förberedelseprocessen (Figur 4F). Intressant, benmineralisering var signifikant högre på Days 6 och 7, när hydroxyapatit inriktade sond administrerades, och celldifferentiering som representeras av BLI aktivitet var uppenbar senare, mellan dag 7 och dag 10. Vi kan dra slutsatsen av detta att ju mer omfattande benmineralisering kan åtminstone delvis förklaras av det gynnsamma kärl som präglar autolog bentransplantation.
Våra resultat tyder på att autograft har överlägsen osteogen kapacitet; Men måste man ta hänsyn till att autogen bentransplantation har flera drawbacks. Bone skörd är begränsad i volym och innebär sjuklighet till givarstället 14-16. Dessutom är förekomsten av ben autograft resorption inte försumbar 17-19. Allografter är hög tillgänglighet och presentera en off-the-shelf lösning för läkaren. Flera verk har visat hur bensammanväxt av skall allografter kan förbättras på olika sätt, från belägga allograftet med BMP2-kodning adenoassocierat virus 20,21 till adjuvant behandling såsom intermittent parat terapi 22. I slutändan, när allograftet förmåga att gå samman med ben är fulländad kommer allograftet bli det föredragna ympning materialet.
Mot bakgrund av dessa resultat, ett särskilt intresse ligger i frågan hur man modulera neovaskularisation vid platsen för benuppbyggnad. Direkt inställning VEGF överuttryck befanns ineffektiva, eftersom de bildar blodkärl är läckande och inte bildar en functional netto 23,24. Intressant nog visade det sig att BMP signalomvandling leder till riktade bildning av blodkärlet 25,26. Dessutom har farmaceutiska medel 11 och cellterapi 27 visat sig förändra angiogenesmönster på bentransplantat närhet; båda tillvägagångssätten nuvarande lovande strategier för att förbättra hjärn bendefekten healing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
