Summary
Implantation von autologen und allogenen Knochentransplantaten bilden akzeptiert Ansätze zur Hauptgesichtsschädelknochenverlust zu behandeln. Doch die Wirkung der Transplantatzusammensetzung auf das Zusammenspiel zwischen den Neovaskularisation, Zelldifferenzierung und Knochenbildung, ist unklar. Wir präsentieren eine multimodale Bildgebungsprotokoll zum Ziel, die Angiogenese-Osteogenese Interdependenz im Transplantat Nähe aufzuklären.
Abstract
Ein wesentlicher Parameter für den Erfolg einer Knochentransplantation Verfahren ist Vaskularisierung der Umgebung des Transplantats. Wir vermuten, dass die Implantation eines Knochenautotransplantat würde größere Knochenregeneration durch reichliche Bildung von Blutgefäßen zu induzieren. Um die Wirkung des Implantats in Bezug auf Neovaskularisation an der Defektstelle zu untersuchen, einem Mikrocomputertomographie (μCT) Ansatz neu bildenden Blutgefäßen zu charakterisieren, die eine systemische Perfusion des Tieres mit einem polymerisierenden Kontrastmittel beinhaltet entwickelten wir. Diese Methode ermöglicht detaillierte Gefäßanalyse eines Organs in seiner Gesamtheit. Zusätzlich wurde die Durchblutung mit Fluoreszenz-Imaging (FLI) von durch Blut übertragene Fluoreszenzmittel beurteilt. Knochenbildung wurde von FLI quantifiziert unter Verwendung einer Hydroxyapatit-bezogene Sonde und μCT Analyse. Stammzellrekrutierung durch Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von transgenen Mäusen, die Luciferase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Osteocalcin überwacht.Hier beschreiben und demonstrieren die Herstellung des Allotransplantats Schädeldefekt Operation μCT Scanprotokolle für die Neovaskularisation Studie und Knochenbildungsanalyse (einschließlich der in vivo-Perfusion von Kontrastmittel) und Protokoll für die Datenanalyse.
Die hochauflösende 3D-Analyse der Vaskulatur, einen signifikant höheren Angiogenese bei Tieren mit implantierten Transplantaten, insbesondere im Hinblick auf die Bildung Arteriole. Dementsprechend war die Durchblutung in der Autograftgruppe signifikant höher nach dem 7. Tag nach der Operation. Wir beobachteten, überlegene Knochenmineralisierung und gemessen wird, größer Knochenbildung bei Tieren, die Autotransplantate erhalten. Autograft-Implantation induzierten ansässigen Stammzellrekrutierung, um das Transplantat-Wirt-Knochennaht, wobei die Zellen in knochenbildenden Zellen zwischen dem 7. und 10. postoperativen Tag differenziert. Dieses Ergebnis bedeutet, dass erhöhte Knochenbildung zugerechnet werden kanndas erweiterte Gefäß Fütterung, die Autograft-Implantation charakterisiert. Die Methoden dargestellt kann als optimales Werkzeug, um die Knochenregeneration in Bezug auf die dicht begrenzt Knochenbildung und Neovaskularisation studieren zu dienen.
Introduction
Kraniofazialen Knochenschwund aufgrund des Traumas, Tumorresektion decompressive Kraniotomie und Geburtsfehler selten heilt von selbst und stellt eine klare ungedeckten klinischen Bedarf. Autologen Knochentransplantaten und allogenen Knochentransplantate werden in großem Umfang verwendet werden, um diese Bedingungen zu 1 zu behandeln.
Es ist weithin anerkannt, dass die Osteogenese ist eng mit Angiogenese 2,3 gekoppelt. Somit sollte die gesamte Studie einer vorgeschlagenen Therapie zur Knochenregeneration eine umfassende Untersuchung des Gefäßbaumes bilden über die gesamte Defektstelle zu schließen. Es gibt mehrere Methoden, um die Vaskularisierung verfügbar in Forschungsmodelle zu charakterisieren. Das Gefäßbaum kann durch eine histologische Analyse untersucht werden. Da Histologie beruht auf Schnittgewebe, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass das sich ergebende Bild wird verzerrt. Um dieses Problem anzugehen, kann Intravitalmikroskopie für Bild in intakten Blutgefäße 4 durchgeführt werden; Jedoch ist dieses Verfahrenauf ein Ebenentechnik beschränkt. μCT Abtastung von Proben aus einem Tier mit Kontrastmittel durchströmt erhalten ermöglicht 3D-Bildgebung des Gefäßnetz, die die Regeneration Website 5-Feeds. Dieser Ansatz ermöglicht eine sehr detaillierte Demonstration des Gefäßsystems eines Organs als Ganzes, sowie eine sorgfältige Analyse der Blutgefäßverteilung. Darüber hinaus ermöglicht die μCT Unterscheidung zwischen abwechslungsreichen Durchmesser der Blutgefäße, die die verschiedenen Untertypen von Blutgefäßen zu charakterisieren.
Wir vermuten, dass die Implantation einer Schädelautograft größer Neovaskularisation als Implantation eines Allograft zu induzieren, und diese erhöhte Gefäßneubildung führen wird, die wiederum zu einer verbesserten Knochen formation.To diese Hypothese beschäftigten wir eine Vielzahl von Techniken zu verfolgen. Wir untersuchten Mustern des neugebildeten Gefäßbaum durch Ausführen einer μCT basierte Analyse. Wir messen die Durchblutung mit Hilfe eines Blutpool Fluoreszenzsonde. Als nächstes haben wir Ärschesed Knochengewebe Mineralisierung von FLI einer Hydroxyapatit-gerichteten Sonde und μCT Analyse. Schließlich überwacht wir Stammzellrekrutierung und Differenzierung, die Durchführung BLI in transgenen Mäusen, in denen Luciferase in Osteocalcin-positiven Zellen exprimiert.
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Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der Hebräischen Universität in Jerusalem, Israel (Antrag Nr MD-12-13524-4), ein AAALAC genehmigt Möglichkeiten und durch die Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Antrag Nr 3770). Die Tiere wurden in die strikte Einhaltung von NIH-Richtlinien behandelt.
1. Herstellung von Knochen Allografts
- Euthanize 7- bis 8 Wochen alte Balb / C-Mäuse, oder keine Belastung vom Empfänger unter Verwendung der Standardmethode von CO 2 Inhalation oder intraperitoneale Injektion von 50 & mgr; l Phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Bestätigen Sie die Abwesenheit von einem Herzschlag und führen Genickbruch. Alternativ ernten die Allotransplantate von Schlachtkörpern in -20 ° C gehalten und aufgetaut vor der Ernte wurden.
- Rasieren Sie die Schädelregion mit einer Haarschneidemaschine, ihre Anwendung gegen die Haarwuchsrichtung. Desinfizieren Sie die Karkasse Kopf durch die Anwendung 70% isopropanol. Schneiden Sie die Kopfhaut mit einem Skalpell Nr 11 und entfernen Sie die Knochenhaut.
- Mit Hilfe eines Dentalbohrer und eine 4,5-mm-Innendurchmesser trephine, lösen eine kreisförmige Fragment der Schädelknochen. Übertragen Sie das Knochenfragment an ein 100-mm-Kunststoffschale mit steriler Kochsalzlösung. An diesem Punkt zu beachten Blut und Weichgewebe an das Knochenfragment (1A) befestigt ist. Erhalten Knochenfragmente auf diese Weise von 22 Spendern.
- Halten Sie eine Knochenfragment in einer Zeit mit gebogenen Pinzette. Tupfer gründlich mit Wattestäbchen und entfernen Sie das Hirngewebe, Weichgewebe und Blut (1B). Nicht aufgeKnochenChips, die das Transplantat mit einer feinen Schere verbunden bleiben, so dass das Transplantat eine perfekte runde Form haben sanft geschnitten.
- Tauchen jedem Transplantat einmal in einer 15-ml-Röhrchen, das 70% Ethanol und zweimal in 15 ml Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um das Ethanol zu waschen.
- Frieren Sie die Allotransplantaten in einem -80 ° C Kühlschrank in Kryoröhrchen beimindestens 1 Woche. Zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die allogene Transplantate transparent (1C) angezeigt.
2. Schädeldachdefektchirurgie
- Für Empfänger verwenden transgenen Mäusen, die Luciferase unter der Kontrolle des Osteocalcinpromotor 6 auszudrücken.
- Sterilisieren Sie die Spitzen der chirurgische Instrumente unter Verwendung eines Glasperlen Heizung für 30 Sek. Bringen Sie die Werkzeuge, um ein Glas mit 70% Isopropanol, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie sterile Handschuhe.
- Betäuben einen 7- bis 8 Wochen alten weiblichen Maus durch intraperitoneale Injektion einer ketamine- Medetomidin Mischung (75 mg / kg und 1 mg / kg). Drücken Sie den Tierische Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief anästhesiert. Lassen Sie nicht ein Tier unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten.
- Rasieren Schädelbereich mit einer Haarschneidemaschine durch Anlegen gegen die Richtung des Haarwachstums. Bewerben Haarentfernungscreme, alle Pelzreste zu entfernen und wischen Sie es after nicht länger als 2 min mit trockenem Mull, gefolgt von Kochsalzlösung getränkter Gaze. Es sollte darauf geachtet werden, zu vermeiden, ist es in den Augen. Alternativ kann der Tierarzt, Augensalbe vor der Haarentfernung als zusätzlichen Schutz für die Augen aufgetragen werden. Es ist zwingend notwendig, dass alle Spuren der Enthaarungscreme, um mögliche Irritationen vor übermäßiger Belastung durch die chemischen Mittel zu vermeiden, entfernt werden. Desinfizieren Sie die Kopfhaut durch die Anwendung von 5% Chlorhexidin (1D).
- Injizieren subkutan 5 mg / kg Carprofen in 200 ul Kochsalzlösung verdünnt. Bewerben vet Augensalbe, um Trockenheit zu verhindern und halten das Tier auf einem Thermal-Pad zu jeder Zeit. Positionieren Sie das Tier unter dem Betriebsfernglas.
- Machen Sie einen 1 cm langen ovalen Schnitt in der Kopfhaut mit einer feinen Schere und Pinzette (1E). Halten Sie die Knochenhaut mit gebogenen Pinzette und schneiden Sie mit einer feinen Schere.
- Bohren Sie das Schädeldefekt 2 mm anterior der Lambdanaht mit Hilfe eines Zahnbohrers einnd 5 mm Außendurchmesser-Trepan (1F und G). Um das Eindringen der Dura mater zu vermeiden, bohren drei Viertel des Weges in den Knochen lösen, dann das Knochenfragment mit einem Spatel.
- Um ein Autograft implantiert werden, rufen Sie die Knochenfragment und waschen Sie ihn in einem 10 mm Kunststoffplatte, die 10 ml steriler Kochsalzlösung, um Schmutz zu entfernen. Die Weichteile nicht entfernen. Um eine Allograft, Tauwetter im Voraus zu implantieren eine Allograft und normalisieren es auf RT und dann waschen Sie.
- Legen Sie das Knochentransplantat in dem Defekt mit gebogenen Pinzette, so wird es nicht berühren die Defektränder (Abbildung 1H). Kleben Sie das Transplantat an den Wirtsknochen mit Fibrin-Gel (5 ul von 46 mg / ml Fibrinogen mit 5 & mgr; l von 25 U / ml Thrombin gemischt).
- Naht der Haut mit 4-0 Vicryl Nahtmaterial (1I). Bewerben PVP-Jod auf die chirurgische Schnitt. Vorsicht ist geboten, um die Kontamination des Fadens von Pelz zu verhindern. Markieren Sie die Mausohr und injizieren 0,25 mg / kg Antisedan to kehren die betäubende Wirkung von Medetomidin.
- Wenn das Tier nicht aufwachen in 10 min, sicherzustellen, dass es auf einem erwärmt Pad entfernt. Injizieren 200 ul steriler Kochsalzlösung, und wenn inject 0,1 mg / kg Antisedan notwendig. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.
- Halten Sie die Tiere in getrennten Käfigen für eine Woche, um sie das Öffnen der Nähte verhindern. Zeigen Mäusefutter in Wasser in einer Petrischale auf dem Käfigboden für ein paar Tage nach der Operation eingeweicht. Injizieren subkutan 200 ul 1 mg / ml-Lösung täglich Carprofen in steriler Salzlösung verdünnt, einmal für 3 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen, zu behandeln.
Abbildung 1. Schädeldecken Allograft Vorbereitung und Schädeldecken Defect Chirurgie. Das Knochenfragment wird aus dem Schädelbereich (A) isoliert. Weichgewebe, Knochenmark und Blut abgetupft (B) und das Transplantat wird in 70% Ethanol, gefolgt von zwei Waschungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (C, AG = Allotransplantat) gespült. Der Empfänger der Maus ist für die Chirurgie nach der Rasur und Desinfektion der Haut im Schädelbereich (D) hergestellt. Ein ovaler Schnitt wird in der Kopfhaut erstellt, und die Knochenhaut entfernt wird (E). Als nächstes wird der Schädeldefekt unter Verwendung einer 5 mm Durchmesser Trepan (F) gebohrt. Das Knochenfragment wird mit einem löffelförmigen Spatel abgelöst, so dass der Sinus sagittalis superior intakt (G). Allotransplantats wird dann in den Defekt eingebracht und unter Verwendung von Fibrin-Gel (H) befestigt ist. Schließlich wird die Haut vernäht (I). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Mikro-Computertomographie für die Charakterisierung vonGefäßbaumes
- Bereiten heparinisierter Kochsalzlösung. Gewicht 2.000 U Heparin-Natrium und legen Sie sie in 50 ml Kunststoffröhrchen. In 20 ml Kochsalzlösung und gut schütteln den Schlauch. Füllen Sie einen 20-ml-Luer-Lock-Spritze mit 15 ml erwärmt heparinisierter Kochsalzlösung, und schließen Sie die Spritze mit einer 23-G Kopfhaut Vene gesetzt. Befestigen Sie die Spritze mit einer Spritzenpumpe, und setzen Sie ihn auf 10 ml mit 1 ml / min zu pumpen.
- Sedieren eine Maus unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von 50 ul Phenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Klemmen Sie das Tier Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief sediert. Sichern Sie die Maus auf dem Rücken zu einer Fixationsplatte mit einer absorbierenden Oberfläche Liner (2A) gewickelt. Setzen Sie die Fest Maus in einem Abzug des Personals der Exposition gegenüber Rauch zu verhindern.
- Schneiden Sie die Haut aus dem Bauch bis zum Hals mit einer feinen Schere und Pinzette (2B). Schneiden Sie die Bauchwand bis zum Schwertfortsatz (Abbildung 2C). Schneiden Sie den Brustkorb entlang der lateralen Seite. Nicht zu verletzen, die Lunge eined Herz, und stellen Sie sicher, das Herz voll ausgesetzt ist. Verwenden Sie eine Gefäßklemme, um das Brustbein (2D) zurückzuziehen.
- Legen Sie die Butterfly-Nadel 3 mm in den linken Ventrikel (2E). Kleben Sie die Nadel, um das Herz und die Brustwand unter Verwendung von 3-sec Kleber (2F).
- Aktivieren Sie die Pumpe sofort. Nach einer Minute zu sezieren die untere Hohlvene, um das Gefäßsystem (2G) drucklos. Kippen Sie die Platine, so dass Flüssigkeiten vom Kopf weg fließen. Erfolgreiche Perfusion wird bei der Klärung der Leber und der Blutgefäße führen.
- Wenn die heparinisierter Kochsalzlösung Perfusion beendet ist, zu perfundieren 10 ml von 4% Formaldehyd. Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen in das Gefäßsystem und die Belastung durch Formaldehyd-Dämpfe zu vermeiden. Erfolgreiche Formaldehyd-Perfusion in Versteifung des Schwanzes führen. Spülen Sie die Formaldehyd mit 10 ml heparinisierter Kochsalzlösung.
- Bereiten Sie die röntgendichten Kontrastmittel nach manufacturer Anweisungen. Typischerweise wird es Mischen der Verbindung, Verdünnungsmittel und einem Härter erforderlich. Verwenden serologischen Pipetten und mischen Sie die Lösung in einer 15 ml Kunststoffröhrchen.
- Perfusion des Tieres mit der Kontrastmittel-Gemisch mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min. Beachten Sie die koronare, Darm- und Leberblutgefäße und sicherzustellen, dass sie werden gelb nach Perfusion von 2 - 3 ml, was eine erfolgreiche Perfusion (2H). Nach Beendigung der Perfusion, schneiden der Butterfly-Nadel Schläuche, erhalten den Kadaver allein und wickeln Sie es mit Toilettenpapier, um ein Auslaufen der Lösung des Schädelbereich zu verhindern. Erlauben Polymerisation in 4 ° CO / N.
- Präparieren Sie die Schädelregion (2I); Verwenden Sie zuerst ein Skalpell, um die Haut als seitliche wie möglich geschnitten, Vermeidung von Schäden an der Schädel Region von Interesse. Suchen Sie den Knochentransplantat und verwenden Sie dann feinen Schere, um die Schädelknochen 10 mm entfernt von der Pfropf geschnitten.
- Scannen Sie den getrennt Calvarial Knochenprobe unter Verwendung eines μCT-Scanner; eingestellt Sehfeld von 20,5 mm, der Röntgenenergie von 55 kVp, Intensität von 145 & mgr; A mit 1.000 Projektionen pro 360º und Integrationszeit von 200 ms. Passen μCT Parameter 7 bis Bild anderen Knochendefekt-Modelle.
- Beachten Sie die 2D rekonstruierten Schichten, die von der μCT-Software generiert wurden. Stellen Sie sicher zu scannen die Region von Interesse ist richtig und suchen Sie den Schädeldefekt. Bewerten Sie die Qualität der Durchblutung. Nach erfolgreicher Identifizierung von Blutgefäßen (2J), fortzusetzen und zu entkalken die Probe mit 6% Trichloressigsäure (TCA) in doppelt destilliertem Wasser (DDW) verdünnt.
- Rescan die Probe mit den in Abschnitt 3.10 genannten Parameter. Suchen Sie die Lambdanaht im rekonstruierten 2D-Schichten. Definieren einen zylindrischen interessierenden Volumen (VOI) in der Höhe von 2 mm und 8 mm Durchmesser ist, die tangential zu dem Nahtmaterial - dies ist die Lokalisation der Defekt.
- Segment the Knochengewebe aus Weichteile mit Hilfe eines globalen Schwellenwertverfahren; stellen Sie die untere Schwelle auf 130, und wenden Sie einen eingeschränkten 3D-Gauss-Filter (sigma [σ] = 2,0 und Support = 2), um teilweise Rauschen zu unterdrücken in den Bänden. Generieren Sie eine 3D-Rekonstruktion und sicherzustellen, dass der VOI richtig positioniert ist (Abbildung 2K).
- Generieren Sie eine Dickenkarte mit der IPL-Software und die Funktion "dt_object_param" (Abbildung 2 l).
Hinweis: Diese Funktion beschreibt die Gefäßvolumen für jeden Gefäßdurchmesser.
Abbildung 2. Perfusion mit einem röntgendichten Mittel über das Herz Ansatz. Die Maus wird mit dem Befestigungsplatte (A) befestigt ist, und die Haut wird entlang den Bauch bis zum Hals (B) geschnitten. Die Bauchdecke wird entlang der Mittellinie bis zum Schwertfortsatz proce geschnittenss (C) und der Brustkorb seitlich (D) schneiden. Ein Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel eingeführt, die Vermeidung Einführen in die rechte Herzkammer, die deutlich dunkler ist (E, wird der rechte Ventrikel durch die weiße gestrichelte Linie angedeutet), und die Nadel wird auf das Herz und Brustwand befestigt (F) . Heparinisierter Kochsalzlösung (2-3 ml) wird in das Herz gepumpt wird, und die untere Hohlvene seziert (G, weiße Pfeil zeigt die untere Hohlvene). Formaldehyd (4%) wird durchblutet und ausgewaschen; dies wird durch eine Perfusion von gelbgefärbten strahlenundurchlässigen Kontrastmittels folgt. Erfolgreiches Durchblutung wird durch Freigabe der Blutgefäße, die Farbe zu gelb (H) ändern verständlich sein. Nach der Polymerisation wird die Schädelregion isoliert (I, AG = Allograft) und abgebildet mit einem μCT-Scanner, um die ordnungsgemäße Durchblutung (J, interessierende Volumen wird mit orange markiert) zu bestätigen. dasProbe wird entkalkt und neu gescannt (K), gefolgt von der Erzeugung einer farbigen Dickenkarte (L). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Fluoreszenz-Imaging von Knochenmineralisierung und Durchblutung
- Rekonstituieren Sonden auf eine Konzentration von 2 nmol / 100 ul PBS in einem 1,5-ml-Röhrchen (mit einem Bisphosphonat-konjugierten Fluoreszenzsonde zur Knochenmineralisierung und einer durch Blut übertragbaren Fluoreszenzmittel zu überwachen, um die Durchblutung zu messen). Pipette mehrmals vorsichtig, um eine homogene Auflösung der Sonde gewährleistet ist.
- 24 Stunden vor dem vorgesehenen Imaging-Sitzung nehmen Sie ein Bild der Zeit von Null; betäuben 3 Mäuse mit 2 l / min Inhalation von Sauerstoff 100% medizinischem mit 3% Isofluran in einem Induktionskammer ergänzt. Nach entsprechender Anästhesie festgestellt wurde, senken Sie die Isofluran-Konzentration auf 1,5% - 2%.
- Bewerben vet Augensalbe bis zur Trockenheit zu verhindern und sicherzustellen, Thermal-Pad auf jederzeit umgeschaltet. Drücken Sie den Tierische Gliedmaßen, um sicherzustellen, dass es tief anästhesiert. Lassen Sie nicht ein Tier unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten.
- Rasieren Schädelbereich mit einer Haarschneidemaschine Auftragen gegen die Richtung des Haarwachstums. Fellreste mit Haarentfernungscreme zu entfernen. Alle Fellrest wird mit optischen Abbildungs stören. Nähte mit einer feinen Schere und Pinzette entfernen.
- Platzieren Sie drei Tiere auf dem IVIS Stufe erwärmt auf 37 ° C für jede Bildgebungssitzung. Stellen Sie die Belichtungszeit, um die automatische, Sichtfeld, um C und Filter anpassen. ZB für eine Bisphosphonat-konjugierten Fluoreszenzsonde mit maximaler Erregung gekennzeichnet, daß zuminLichtWellenLänge von 680 nm, verwenden Sie ein Anregungsfilter von 675 nm und einem Emissionsfilter von Cy5.5 . In ähnlicher Weise, wenn Sie eine durch Blut übertragene Fluoreszenzmittel mit Spitzen Anregung bei Lichtwellenlänge 750 nmverwenden ein Anregungsfilter von 710 nm und einem Emissionsfilter von 780 nm.
- Bild die Mäuse durch Wohnzimmer Bild-Software, indem Sie auf die Schaltfläche "Erfassen". Sicherstellen, dass die Schädelregion vollständig sichtbar ist (3B) Für eine umfassende Anleitung beraten Lim et al 2009 8.
- Lassen Sie die Maus zu erwachen Einatmen 100% Sauerstoff.
- Spritzen Sie die 2-nmol Fluoreszenzsonde über einen intravenösen Schwanz Injektion. An der bestimmten Bildgebungssitzung führen Bildgebung wie oben beschrieben.
5. Mikro-Computertomographie für die Knochenregeneration
- Zur Quantifizierung der Knochenbildung, zu betäuben die Maus durch Inhalation von 3% Isofluran, wie in Schritt 4.2 dargestellt - 4.3. Übertragen Sie die Maus an die μCT-Scanner-Bett, und legen Sie sie in den Scanner.
- Gesetzt Röntgenröhre potentielle Energie der μCT Scanners bis 55 kVp und Intensität von 145 & mgr; A mit mittlerer Auflösung. Mit einem Sichtfeld von 20,5 mm, führenein Scout (Einzel x-ray) zu scannen und eine Region von Interesse, die sich von den Augen der Maus auf die Rückseite seines Schädels zu definieren. Führen Sie einen CT-Scan mit 1000 Vorsprünge pro 360 ° und Integrationszeit von 200 ms.
- Rekonstruktion der 2D-Schichten mit einem Nominal räumlichen Auflösung von 20 um. Richten Sie die Defektränder auf eine standardisierte Position mit μCT-Software 9.
- Ähnlich wie in Schritt 3.20, definieren eine zylindrische Volumen von Interesse und Anwendung der eingeschränkten 3D-Gauss-Filter (σ = 0,8 und Support = 1), um teilweise Lärm in den Bänden unterdrücken. Segment das Knochengewebe aus Weichteile mit Hilfe eines globalen Schwellenwertverfahren.
- Bestimmen das Volumen der mineralisierten Knochengewebe in dem interessierenden Volumen.
6. Biolumineszenz-Bildgebung von Stem Cell Rekrutierung und Differenzierung
- Bereiten Sie die Maus für die Bildgebung wie in den Abschnitten 4,2 bis 4,4 dargestellt und wach die Mäuse durch Inhalation von 100% Sauerstoff.
- Verwalten 126 mg / kg Käfer Luciferin jeder Maus durch intraperitoneale Injektion, und gibt das Tier auf die Induktionskammer. Nach 2 min, betäuben die Tiere unter Verwendung von 3% Isofluran. Zeigen die Mäuse auf dem IVIS erwärmt Bühne.
- Via Wohnzimmer Bild-Software, stellen Sie die Belichtungszeit auf "auto", und das Sichtfeld zu C. Bild die Mäuse 5 min nach Luciferin Verwaltung. Bild die Tiere wie in Schritt 4.6 dargestellt, mit Hilfe der "Biolumineszenz" Modalität Regionen von Interesse zu definieren, da transgene Expression variiert zwischen Mäusen. Normalisieren die Schädel Signal an den Schwanz.
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Representative Results
Neovaskularisation wurde durch μCT Volumenanalyse und durch FLI unter Verwendung eines fluoreszierenden Blut übertragenen Mittel, um die Durchblutung zu quantifizieren bewertet. Sieben Tage nach der Operation zeigte μCT Scanning eine deutlich höhere Volumen der kleinen und mittleren Durchmessers der Blutgefäße bei Mäusen, die Autotransplantate als bei Mäusen, die Allotransplantate aus C57BL / 6 (3A) geerntet erhalten hatten. Interessant ist, dass in der Autograftgruppe die neu gebildete Gefäßbaum erscheint, um die gesamte Defektbereich zu erreichen, während im Allograftgruppe Blutgefäße schien die Defektstelle von den Außenkanten zu durchdringen und nach innen, um nur in begrenztem Umfang erweitert. Das FLI unterstützt diese Beobachtung, zeigt deutlich höhere Durchblutung im Autotransplantat behandelten Tieren (3B). Mit dem 14. Tag, in der Allograft-Gruppe der Gefäßbaum erreicht alle die Nähe des Transplantats, aber Gefäßvolumen deutlich niedriger vergleichenzu der Autograftgruppe in den meisten Gefäßdurchmesser, die wir untersucht (3C). Hinweis: Unterschiede in der Gefäßvolumen waren prominentesten bei Schiffen mit 0.08- bis 0.1 mm Durchmesser wurden verglichen. Achtundzwanzig Tage nach der Operation das Gefäßvolumen den Ausgangswert zurück (Figur 3D).
Sieben Tage nach der Operation, durchgeführt FLI mit dem Hydroxyapatit-gerichtete Sonde zeigte signifikant höhere Knochenmineralisierung in der Autograftgruppe (4A). Zu diesem Zeitpunkt hatte das ganze Knochentransplantat Nähe der Autograft-implantierten Tieren gebildet. Im Gegensatz dazu war in den Knochen-Allotransplantat-implantierten Mäusen nur an den Defekträndern gebildet und wurde von einer Ringform gekennzeichnet. Volumina von Knochenbildung quantifiziert wurden 56 Tage nach der Operation, am Endpunkt der Regenerationsprozess durch Ausführen μCT Analyse (Abbildung 4B). Knochenvolumen signifikant höher war (4C) und Pfropf thickness in den Tieren, die Transplantate (4D) aufgenommen deutlich größer. BLI wurde Osteocalcin-Luziferase transgene Mäuse verwendet werden, um Stammzellrekrutierung und die Differenzierung in Richtung der Osteoblastlinie (4E) zu überwachen. Bei Mäusen mit Allotransplantaten implantiert, die BLI Signal erreichte 4 - 7 Tage nach der Operation, wenn das gemessene Signal an der Schädeldecke war 15 mal höher als die, gemessen am Schwanz. In Autograft-implantierten Mäusen erreichte die BLI-Signal ein bisschen später, 7-10 Tage nach der Operation und war deutlich höher und erreichte ein 2-fach höhere Schädeldecken-Schwanz-Verhältnis (4F).
Abbildung 3. Autograft-Implantation Erleichtert Angiogenese. Schädeldachdefekte wurden in Mäusen erstellt. Die Hälfte der Tiere erhielt Allotransplantaten und die andere Hälfte erhielt Transplantaten. dasMäuse wurden mit einem polymerisierenden Kontrastmittel 7 Tage nach der Operation durchblutet. Die Schädel Region wurde isoliert, und die Proben wurden entkalkt und abgebildet mit einem μCT-Scanner. Ein Volumendickenkarte wurde mit IPL-Software erzeugt (A, n = 3, Balken stellen ± SE und Sternchen zeigen P-Wert <0,05). Mäuse wurden mit einem Fluoreszenz hämatogenen Sonde 6 Tage nach der Operation injiziert. 24 Stunden später wurden die Tiere FLI unterworfen und eine quantitative Analyse durchgeführt wurde (B, n = 5, Balken stellen ± SE, und die Sterne die P-Wert <0,05). Ein μCT-basierte Gefäßanalyse wurde durchgeführt 14 (C) und 28 (D) Tage nach der Operation (C und D: n = 3, Balken stellen ± SE und Sternchen zeigen P-Wert <0,05). Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern version dieser Figur.
Abbildung 4. Implantation einer Autograft Fördert Mehr Osteogenesis als Implantation einer Allograft. Die Mäuse erhielten Implantate von Schädelautotransplantaten oder Allotransplantaten. Die Mäuse wurden später mit einer Hydroxyapatit-bezogene Sonde durch IV-Injektion 6 Tage nach der Operation injiziert. 24 Stunden später FLI und eine qualitative Analyse durchgeführt (A, n = 5, Balken stellen ± SE und Sternchen zeigen P-Wert <0,05). In vivo μCT Analyse wurde 56 Tage nach der Operation durchgeführt wird, und ein zylindrisches Volumen von Interesse mit gekennzeichneten Orange definiert wurde (B). Knochenvolumen (C) und Transplantatdicke (D) wurden quantifiziert (n = 8, Balken stellen ± SE und Sternchen zeigen P-Wert <0,05) .Transgenic Mäusen Luciferase dri exprimierendurch die Osteocalcin-Promotor ven wurden Allotransplantate oder Autotransplantate angegeben. BLI wurde 10 Tage nach der Operation (E) sowie an weiteren bezeichneten Zeitpunkten durchgeführt. Die gemessen an der Schädelregion Signal normalisiert, weil das Expressionsniveau variiert zwischen den Mäusen (F, n = 8, Balken stellen ± SE und Sternchen zeigen P-Wert <0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Ziel der hier beschriebenen multimodale Bildgebung Ansätze ist es, sorgfältige Untersuchung der Angiogenese-Osteogenese Achse im Rahmen der Schädelknochentransplantation zu ermöglichen. Neovaskularisation wurde unter Verwendung eines μCT-Protokoll, das eine genaue hochauflösende 3D-Demonstration des Gefäßbaumes erlaubt Zuführen des gesamten Schädeldefekt abgebildet. μCT Daten können leicht analysiert werden mit Hilfe modernster Tools wie IPL-Software. Zum Beispiel kann die Dicke Analyse in 3C gezeigt ergab, daß die Hauptunterschiede zwischen Schädel autologe und Allotransplantat sind in Gefäßen im Bereich von 0,1 bis 0,08 mm im Durchmesser, die Blut Arteriolen 10 charakterisiert. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit Studien in Röhrenknochen-Modell 11 durchgeführt. Es sei darauf hingewiesen, daß die kleinste erkennbare Gefäße von 0,02 mm Durchmesser sind nicht vollständig aufgrund der Viskosität des strahlenundurchlässigen Mittels gegossen werden. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens ist die Tatsache, dass sie mit sich bringtEuthanasie der Tiere und damit Längs Bildgebung ist unmöglich. Mehrere radioopaken Sonden sind für in vivo Gefäß μCT Bildgebung zur Verfügung; sie sind jedoch nicht als strahlenundurchlässig als das dichte polymerisierenden Sonde und die Bildauflösung nicht erfüllt, dass durch die hier 12 dargestellt ex vivo-Verfahren bereitgestellt. μCT Auflösung ist begrenzt und wird nicht sinnvoll, Blutkapillaren zu untersuchen, zum Beispiel. Andere als die, durch eine geschickte Hand Aided diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik, um Knochengefäßsystem im Detail zu studieren.
Ein kritischer Schritt bei der dargestellten Protokolle ist die Bestimmung der Fehlerstelle (Schritt 2.7). Verletzung der Lambdanaht wird zu massiven Blutungen führen. Beim Bohren des Schädeldefekt, sollte darauf achten, dass die Untergebenen Dura und Sinus sagittalis superior stören werden. Schließlich Einführen der Butterfly-Nadel in die linke Herzkammer ist ein empfindliches Verfahren (Schritt 3.4). Wenn die Nadel Einsatzed in den rechten Ventrikel, wird das Kontrastmittel in die Lunge durchströmen und sich nach den Venen, was zu einer schlechten Durchblutung der Schädeldecke. Wenn die Nadel zu tief eingeschoben, wird sie die hinteren Herzwand zu perforieren; und wenn die Nadel nicht weit genug eingesteckt ist, kann es leicht reißen vom Herzen. Versuchen Sie nicht, neu zu justieren die Nadelposition wie Sie vielleicht mit der Durchblutung stören. Das Verfahren kann unter Verwendung eines Satzes von verfügbaren fluoreszierenden Sonden modifiziert werden; Integrin-α 3 β v -targeted Sonde kann verwendet werden, um neugebildeten Blutgefäßen zu betonen, während Cathepsin-K-bezogene Sonde kann verwendet werden, um die Aktivität der Osteoklasten zu quantifizieren werden.
In Übereinstimmung mit unserer Hypothese, beobachten wir, dass Calvaria Transplantaten haben eine höhere osteogene Potential als Allotransplantate. Dies gilt für die langen Knochen, sowie 13 und kann sich auf mehrere Faktoren zurückzuführen. Erstens enthält das Autotransplantat knochenbildenden Zellen, die Knochenmatrix während des Transplantats zu produzierenOberfläche, wie auf der Mineralisierung gerichteten FLI (4A) nachgewiesen; wohin Allotransplantaten induzieren knappen Knochenbildung nur an den Defekträndern. Zweitens BLI von Osteocalcin-luc Mäusen zeigten mehr osteogene Aktivität in der Autograft-Gruppe, die durch die Anwesenheit von Wachstumsfaktoren, die in dem Allotransplantat Herstellungsverfahren (4F) entfernt werden erklärt werden kann. Interessanterweise war die Knochenmineralisierung im Days 6 und 7, wenn die Hydroxyapatit-bezogene Sonde verabreicht wurde, signifikant höher, und die Zelldifferenzierung von BLI Aktivität vertreten war offensichtlich, später zwischen Tag 7 und Tag 10. Wir können daraus schließen, dass die umfassendere Knochenmineralisierung kann zumindest teilweise durch die günstige Gefäßsystem, die autologe Knochentransplantation charakterisiert erläutert.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Autograft hat die überlegene osteogene Kapazität; Allerdings muss man berücksichtigen, dass autogenen Knochentransplantation hat mehrere drawbacks. Knochenentnahme ist begrenzt in Umfang und bringt Morbidität der Entnahmestelle 14-16. Zusätzlich ist die Häufigkeit von Knochenautotransplantat Resorption nicht vernachlässigbar 17-19. Allografts sind hochverfügbare und präsentieren ein Off-the-shelf-Lösung für den Kliniker. Mehrere Arbeiten haben gezeigt, wie die Osteointegration kranialer Allotransplantate können durch verschiedene Mittel verbessert werden, die von der Beschichtung der Allotransplantat mit BMP2-encoding Adeno-assoziierten Virus 20,21 Adjuvans-Therapien wie intermittierende Therapie Parat 22. Am Ende, sobald der Allograft-Fähigkeit, mit dem Knochen zusammenführen wird perfektioniert, das Allograft wird die bevorzugte Ersatzmaterial geworden.
Im Lichte dieser Ergebnisse liegt ein besonderes Interesse an der Frage, wie die Neovaskularisierung an der Stelle der Knochenregeneration zu modulieren. Direkte Ansprache von VEGF-Überexpression wurde ineffizient gefunden, da die Bildung der Blutgefäße undicht und müssen eine functi bildenonal netto 23,24. Interessanterweise wurde gefunden, dass BMP Signaltransduktion führt zur gezielten Bildung von Blutgefäßen 25,26. Darüber hinaus wurden pharmazeutische Mittel 11 und Zelltherapie 27 gezeigt, um die Angiogenese Muster an Knochentransplantat Nähe zu verändern; beide Ansätze vorhanden vielversprechende Strategien zur Schädelknochendefektheilung zu verbessern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
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