Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

गणना टोमोग्राफी और अस्थिजनन-एंजियोजिनेसिस युग्मन के ऑप्टिकल इमेजिंग कपाल अस्थि autografts और allografts की एकता का आकलन करने के लिए

Published: December 22, 2015 doi: 10.3791/53459
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 1, 4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3
1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

ऑटोलॉगस और अल्लोजीनिक हड्डी ग्राफ्ट का आरोपण प्रमुख craniofacial हड्डी के झड़ने का इलाज करने के लिए दृष्टिकोण को स्वीकार कर लिया गठन। फिर भी neovascularization, सेल भेदभाव और हड्डी गठन के बीच परस्पर क्रिया पर भ्रष्टाचार रचना का प्रभाव स्पष्ट नहीं है। हम भ्रष्टाचार निकटता में एंजियोजिनेसिस-अस्थिजनन अन्योन्याश्रय स्पष्ट करने के उद्देश्य से एक बहुविध इमेजिंग प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

एक बोन ग्राफ्टिंग प्रक्रिया की सफलता का निर्धारण एक प्रमुख पैरामीटर भ्रष्टाचार आसपास के क्षेत्र के vascularization है। हम प्रचुर मात्रा में रक्त वाहिनियों के गठन से अधिक से अधिक हड्डी पुनर्जनन उत्पन्न करेगा एक हड्डी ऑटोग्राफ़्ट की है कि आरोपण धारणा। दोष स्थल पर neovascularization पर भ्रष्टाचार के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम एक polymerizing विपरीत एजेंट के साथ पशु के प्रणालीगत छिड़काव शामिल है जो रक्त वाहिकाओं के गठन, नव चिह्नित करने के लिए एक सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (μCT) दृष्टिकोण विकसित किया है। इस विधि को अपनी संपूर्णता में एक अंग की विस्तृत संवहनी विश्लेषण में सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, रक्त छिड़काव एक रक्त जनित फ्लोरोसेंट एजेंट के प्रतिदीप्ति इमेजिंग (FLI) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। हड्डी गठन एक हाइड्रॉक्सियापटाइट-लक्षित जांच और μCT विश्लेषण का उपयोग FLI द्वारा मात्रा था। स्टेम सेल भर्ती osteocalcin प्रमोटर के नियंत्रण के तहत luciferase व्यक्त कि ट्रांसजेनिक चूहों की bioluminescence इमेजिंग (BLI) द्वारा नजर रखी थी।यहाँ हम का वर्णन है और allograft की तैयारी, calvarial दोष सर्जरी का प्रदर्शन, neovascularization अध्ययन और (इसके विपरीत एजेंट के vivo छिड़काव सहित) हड्डी गठन विश्लेषण और डेटा विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के लिए μCT स्कैनिंग प्रोटोकॉल।

वाहिका की 3 डी उच्च संकल्प विश्लेषण विशेष रूप से धमनिका गठन के लिए सम्मान के साथ, प्रत्यारोपित autografts के साथ पशुओं में काफी अधिक angiogenesis को प्रदर्शन किया। तदनुसार, रक्त छिड़काव सर्जरी के बाद 7 वें दिन से ऑटोग्राफ़्ट समूह में काफी अधिक था। हम autografts प्राप्त किया है कि जानवरों में बेहतर अस्थि खनिज और मापा अधिक से अधिक हड्डी गठन मनाया। कोशिकाओं 7 वें और 10 वें पश्चात दिन के बीच की हड्डी कोशिकाओं के गठन में भेदभाव जहां भ्रष्टाचार मेजबान हड्डी सीवन, के लिए ऑटोग्राफ़्ट आरोपण प्रेरित निवासी स्टेम सेल भर्ती। यह निष्कर्ष बढ़ाया हड्डी गठन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि इसका मतलब हैऑटोग्राफ़्ट आरोपण की विशेषता है कि संवर्धित संवहनी खिला। तरीकों कस घिरा हड्डी गठन और neovascularization के मामले में हड्डी पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं दर्शाया।

Introduction

आघात के कारण, ट्यूमर लकीर, डिकम्प्रेसिव craniotomy, और जन्मजात दोष को Craniofacial हड्डी हानि शायद ही कभी अपने आप से भर देता है और एक स्पष्ट unmet नैदानिक ​​जरूरत को प्रस्तुत करता है। ऑटोलॉगस हड्डी ग्राफ्ट और अल्लोजीनिक हड्डी ग्राफ्ट बड़े पैमाने पर इन शर्तों के 1 के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है।

यह व्यापक रूप से अस्थिजनन कसकर angiogenesis 2,3 के साथ युग्मित है कि स्वीकार किया जाता है। इस प्रकार, हड्डी के उत्थान के लिए एक प्रस्तावित चिकित्सा का पूरा अध्ययन पूरे दोष साइट भर के गठन संवहनी पेड़ की एक व्यापक जांच में शामिल करना चाहिए। अनुसंधान मॉडल में vascularization चिह्नित करने के लिए कई उपलब्ध तरीके हैं। संवहनी पेड़ ऊतकीय विश्लेषण द्वारा जांच की जा सकती है। ऊतक विज्ञान ऊतक सेक्शनिंग पर निर्भर है, जिसके परिणामस्वरूप छवि विकृत हो जाएगा कि वहाँ एक उच्च संभावना है। इस समस्या का समाधान करने के लिए, intravital माइक्रोस्कोपी छवि बरकरार रक्त वाहिकाओं 4 करने के लिए किया जा सकता है; हालांकि, इस पद्धति हैएक विमान इमेजिंग के लिए सीमित। इसके विपरीत एजेंट के साथ भरकर रखा एक जानवर से प्राप्त नमूनों की μCT स्कैनिंग उत्थान साइट 5 खिलाती है कि संवहनी नेटवर्क के 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण एक पूरे के रूप में एक अंग की वाहिका का एक अत्यंत विस्तृत प्रदर्शन, साथ ही रक्त वाहिका वितरण की एक सावधानीपूर्वक विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा, μCT रक्त वाहिकाओं के विभिन्न उपप्रकार विशेषताएँ जो रक्त वाहिकाओं के विभिन्न व्यास, के बीच भेदभाव सक्षम बनाता है।

हम एक allograft का आरोपण से अधिक से अधिक neovascularization प्रेरित करेगा एक calvarial ऑटोग्राफ़्ट की है कि आरोपण धारणा है, और यह है कि हम तकनीक की एक किस्म कार्यरत इस परिकल्पना को आगे बढ़ाने formation.To बढ़ाया हड्डी के लिए, बारी में, neovascularization नेतृत्व करेंगे वृद्धि हुई है। हम एक μCT आधारित विश्लेषण प्रदर्शन से नवगठित संवहनी पेड़ के पैटर्न की जांच की। हम एक रक्त पूल फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग रक्त छिड़काव मापा। अगला, हम गधेएक हाइड्रॉक्सियापटाइट निर्देशित जांच और μCT विश्लेषण के FLI द्वारा एसईडी हड्डी के ऊतकों खनिज। अंत में, हम luciferase osteocalcin पॉजिटिव कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जिसमें ट्रांसजेनिक चूहों में BLI प्रदर्शन, स्टेम सेल भर्ती और भेदभाव पर नजर रखी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल यरूशलेम, इजराइल (अनुरोध सं एमडी 12-13524-4), एक AAALAC मंजूरी दे दी सुविधा, और देवदार-सिनाई मेडिकल सेंटर के हिब्रू विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों के बाद IACUC (अनुरोध सं 3770)। जानवरों एनआईएच दिशा निर्देशों का कड़ाई से पालन में इलाज किया गया।

अस्थि allografts की 1. तैयारी

  1. सीओ 2 साँस लेना या 50 μl phenobarbital (65 मिलीग्राम / एमएल .; 100 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal इंजेक्शन के मानक विधि का उपयोग कर, प्राप्तकर्ता से अलग 7 से 8 सप्ताह पुराने / Balb सी चूहों, या किसी भी तनाव euthanize। एक दिल की धड़कन के अभाव की पुष्टि करें और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, -20 डिग्री सेल्सियस में रखा है और फसल के लिए पहले thawed कर दिया है कि शवों से allografts फसल।
  2. बाल विकास की दिशा के खिलाफ इसे लागू करने, एक बाल क्लिपर का उपयोग calvarial क्षेत्र दाढ़ी। 70% लगाने से शव सिर कीटाणुरहित isopropanoएल। एक नंबर 11 छुरी का उपयोग कर सिर की त्वचा में कटौती और periosteum हटा दें।
  3. एक दंत ड्रिल और एक 4.5 मिमी भीतरी व्यास trephine का उपयोग करना, calvarial हड्डी के एक परिपत्र टुकड़ा अलग। बाँझ खारा युक्त एक 100 मिमी प्लास्टिक डिश के लिए हड्डी टुकड़ा स्थानांतरण। इस बिंदु पर, रक्त और अस्थि टुकड़ा (चित्रा 1 ए) से जुड़ी नरम ऊतक निरीक्षण करते हैं। 22 दाताओं से इस तरीके से हड्डी के टुकड़े प्राप्त करते हैं।
  4. घुमावदार चिमटी का उपयोग कर एक समय में एक हड्डी टुकड़ा पकड़ो। अच्छी तरह से कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर इसे झाड़ू और किसी भी मस्तिष्क के ऊतकों, कोमल ऊतक, और रक्त (चित्रा 1 बी) को हटा दें। धीरे भ्रष्टाचार एक आदर्श गोल आकार होगा कि इतना ठीक कैंची का उपयोग भ्रष्टाचार से जुड़े रहने वाले किसी भी हड्डी चिप्स दूर काटा।
  5. 70% इथेनॉल और इथेनॉल धोने के लिए फॉस्फेट बफर खारा युक्त दो बार में 15 मिलीलीटर ट्यूबों युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक बार प्रत्येक भ्रष्टाचार डुबकी।
  6. पर के लिए cryotubes में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में allografts रुककम से कम एक सप्ताह। इस बिंदु पर, allografts (चित्रा 1 सी) पारदर्शी दिखाई सुनिश्चित करें।

2. calvarial दोष सर्जरी

  1. प्राप्तकर्ताओं के लिए osteocalcin प्रमोटर 6 के नियंत्रण में luciferase व्यक्त कि ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करें।
  2. 30 सेकंड के लिए एक गिलास मनका हीटर का उपयोग कर सर्जिकल उपकरण के सुझावों जीवाणुरहित। बाँझ की स्थिति बनाए रखने के लिए 70% isopropanol युक्त एक जार करने के लिए उपकरण स्थानांतरण। बाँझ दस्ताने का प्रयोग करें।
  3. एक ketamine- medetomidine मिश्रण (75 मिलीग्राम / किग्रा और 1 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा एक 7 से 8 सप्ताह पुराने महिला माउस anesthetize। यह गहरा anesthetized है सुनिश्चित करने के लिए पशु अंग पिंच। यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ पहुंच से बाहर है, जब तक एक जानवर को मत छोड़ो।
  4. बाल विकास की दिशा के खिलाफ यह लागू करने से एक बाल क्लिपर का उपयोग कर calvarial क्षेत्र दाढ़ी। किसी भी फर अवशेष निकालने और यह afte सफाया करने के लिए बालों को हटाने क्रीम लगाओआर खारा लथपथ धुंध के द्वारा पीछा सूखी धुंध का उपयोग कर कोई अब से 2 मिनट। देखभाल आँखों में यह हो रहा से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, पशु चिकित्सक आंख मरहम आंखों के लिए सुरक्षा के एक अतिरिक्त परत के रूप में पूर्व बालों को हटाने के लिए लागू किया जा सकता है। यह लोमनाशक क्रीम के सभी निशान रासायनिक एजेंट को अत्यधिक जोखिम से संभव जलन से बचने के लिए हटाया जा आवश्यक है। 5% chlorhexidine (चित्रा -1) को लागू करने से खोपड़ी कीटाणुरहित।
  5. Subcutaneously 5 मिलीग्राम / किग्रा carprofen 200 μl खारा में पतला इंजेक्षन। सूखापन को रोकने और हर समय एक थर्मल पैड पर पशु रखने के लिए पशु चिकित्सक नेत्र मरहम लागू करें। संचालन दूरबीन के तहत पशु स्थिति।
  6. ठीक कैंची और चिमटी (चित्रा 1E) का उपयोग कर सिर की त्वचा में 1 सेमी लंबे अंडाकार कटौती करें। घुमावदार चिमटी का उपयोग कर periosteum पकड़ो और ठीक कैंची का उपयोग दूर काटा।
  7. एक दंत ड्रिल एक का उपयोग करके lambdoid सिवनी को calvarial दोष 2 मिमी पूर्वकाल ड्रिलएन डी 5 मिमी बाहरी व्यास trephine (चित्रा 1F और जी)। ड्यूरा मेटर के प्रवेश से बचने के लिए, हड्डी में जिस तरह की तीन-चौथाई ड्रिल और एक रंग का उपयोग हड्डी टुकड़ा अलग।
  8. एक ऑटोग्राफ़्ट समाविष्ट करने के लिए, हड्डी टुकड़ा पुनः प्राप्त करने और मलबे को हटाने के लिए 10 मिलीलीटर बाँझ खारा युक्त एक 10 मिमी प्लास्टिक की प्लेट में धो। मुलायम ऊतकों न निकालें। अग्रिम में एक allograft एक allograft, पिघलना प्रत्यारोपण और आरटी के लिए यह मानक के अनुसार, और फिर इसे धोने के लिए।
  9. इसलिए यह दोष मार्जिन (चित्रा 1H) नहीं छू जाएगा घुमावदार चिमटी का उपयोग कर दोष में हड्डी भ्रष्टाचार रखें। आतंच जेल का उपयोग मेजबान हड्डी को भ्रष्टाचार (25 यू / एमएल थ्रोम्बिन के 5 μl के साथ मिश्रित / एमएल फाइब्रिनोजेन 46 मिलीग्राम की 5 μl) गोंद।
  10. 4-0 Vicryl सिवनी (चित्रा 1 मैं) का उपयोग त्वचा सीवन। शल्य कटौती करने के लिए povidone आयोडीन लागू करें। देखभाल फर द्वारा सिवनी के प्रदूषण को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए। मार्क माउस कान और इंजेक्षन 0.25 मिलीग्राम / किग्रा Antisedan टीओ medetomidine की संवेदनाहारी प्रभाव रिवर्स।
  11. पशु 10 मिनट में जगा देता है, तो यह एक गरम पैड पर स्थित है सुनिश्चित करें। बाँझ खारा 200 μl इंजेक्षन, और 0.1 मिलीग्राम / किग्रा Antisedan इंजेक्षन अगर जरूरत है। पूरी तरह से ठीक है, जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि एक जानवर नहीं लौटते।
  12. टांके खोलने से रोकने के लिए उन्हें एक सप्ताह के लिए अलग पिंजरों में जानवरों को रखने के। कुछ दिनों के बाद सेशन के लिए पिंजरे फर्श पर एक पेट्री डिश में पानी में भिगो माउस चाउ रखें। Subcutaneously शल्य चिकित्सा के बाद दर्द के इलाज के लिए सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए एक दिन में एक बार बाँझ खारा में पतला 1mg / एमएल Carprofen समाधान के 200 μl इंजेक्षन।

आकृति 1
चित्रा 1. calvarial Allograft तैयारी और calvarial दोष सर्जरी। हड्डी टुकड़ा calvarial क्षेत्र (ए) से अलग है। नरम टिशूअस्थि मज्जा, और रक्त (बी) swabbed रहे हैं, और भ्रष्टाचार फॉस्फेट बफर खारा (सी, एजी = allograft) में दो washes के द्वारा पीछा 70% इथेनॉल में rinsed है। प्राप्तकर्ता माउस calvarial क्षेत्र (डी) में हजामत बनाने का काम और त्वचा की कीटाणुशोधन द्वारा शल्य चिकित्सा के लिए तैयार किया जाता है। एक अंडाकार कटौती सिर की त्वचा में बनाया जाता है, और periosteum (ई) निकाल दिया जाता है। इसके बाद, calvarial दोष एक 5 मिमी व्यास trephine (एफ) का उपयोग drilled है। हड्डी टुकड़ा बरकरार बेहतर बाण साइनस (जी) छोड़ रहा है, एक चम्मच के आकार रंग का उपयोग अलग है। allograft तो दोष में रखा गया है और आतंच जेल (एच) का उपयोग कर सुरक्षित है। अंत में, त्वचा (आई) सिलाई की जाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

की विशेषता के लिए 3. माइक्रो गणना टोमोग्राफीसंवहनी ट्री

  1. Heparinized खारा तैयार करें। भार 2,000 यू सोडियम हेपरिन और 50ml प्लास्टिक ट्यूब में जगह है। 20 मिलीलीटर खारा जोड़ें और अच्छी तरह से ट्यूब हिला। 15 मिलीलीटर के साथ एक 20 मिलीलीटर Luer ताला सिरिंज heparinized खारा गरम भरें और एक 23-जी खोपड़ी नस सेट करने के लिए सिरिंज कनेक्ट। एक सिरिंज पंप के लिए सिरिंज प्रत्यय, और / मिनट 1 मिलीलीटर में 10 मिलीलीटर पंप करने के लिए निर्धारित किया है।
  2. 50μl phenobarbital (65 मिलीग्राम / एमएल .; 100 मिलीग्राम / किग्रा) के एक intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग शांत एक माउस। यह गहराई से बेहोश है सुनिश्चित करने के लिए पशु के अंग पिंच। एक शोषक सतह लाइनर (2A चित्रा) के साथ लिपटे एक निर्धारण बोर्ड को अपनी पीठ पर माउस सुरक्षित। धूआं करने के लिए कर्मियों के प्रदर्शन को रोकने के लिए एक धूआं हुड में तय माउस रखें।
  3. ठीक कैंची और चिमटी (चित्रा 2 बी) का उपयोग करते हुए गर्दन को पेट से त्वचा कट। असिरूप प्रक्रिया (चित्रा -2) तक पेट की दीवार काट लें। अपने पार्श्व पहलू के साथ रिब पिंजरे में कटौती। फेफड़ों एक घायल से बचनेघ दिल, और दिल पूरी तरह से सामने आ रहा है सुनिश्चित करें। उरोस्थि (चित्रा 2 डी) वापस लेना एक hemostat का प्रयोग करें।
  4. तितली सुई बाएं वेंट्रिकल (चित्रा 2 ई) में 3 मिमी डालें। 3-सेक गोंद (चित्रा 2 एफ) का उपयोग कर दिल और सीने में दीवार के लिए सुई गोंद।
  5. तुरंत पंप को सक्रिय करें। एक मिनट के बाद, वाहिका (चित्रा 2 जी) depressurize करने के लिए अवर रग Cava काटना। तरल पदार्थ सिर से दूर बहेगा तो यह है कि बोर्ड झुकाएँ। सफल छिड़काव जिगर और रक्त वाहिकाओं को साफ करने में परिणाम होगा।
  6. Heparinized खारा छिड़काव पूरा हो गया है, 4% formaldehyde के 10 मिलीलीटर छिड़कना। वाहिका में हवा के बुलबुले के प्रवेश करने से बचें और formaldehyde धुएं के संपर्क में आने से बचें। सफल formaldehyde के छिड़काव पूंछ के stiffening में परिणाम होगा। खारा heparinized 10 मिलीलीटर के साथ formaldehyde बाहर निकलवाने।
  7. Manufact के अनुसार रेडियो अपारदर्शी विपरीत एजेंट तैयारurer निर्देश। आमतौर पर, यह यौगिक, मंदक, और एक इलाज एजेंट के मिश्रण की आवश्यकता होगी। सीरम वैज्ञानिक pipettes का उपयोग और एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में समाधान का मिश्रण।
  8. / मिनट 1 मिलीलीटर की दर से विपरीत एजेंट के मिश्रण के साथ पशु छिड़कना। कोरोनरी आंतों और यकृत रक्त वाहिकाओं का निरीक्षण करें और वे 2 के छिड़काव के बाद पीले रंग बदल रहे हैं सुनिश्चित करें - सफल छिड़काव (चित्रा 2H) का संकेत, 3 मिलीग्राम। छिड़काव के पूरा होने पर, तितली सुई के ट्यूबिंग कटौती अकेले शव प्राप्त करने और calvarial क्षेत्र के लिए समाधान के रिसाव को रोकने के लिए टॉयलेट पेपर के साथ लपेट। 4 डिग्री सीओ / एन में polymerization की अनुमति दें।
  9. Calvarial क्षेत्र (चित्रा 2I) काटना; सबसे पहले ब्याज की कपाल क्षेत्र को नुकसान पहुँचाए से परहेज है, संभव के रूप में पार्श्व के रूप में त्वचा में कटौती करने के लिए एक छुरी का उपयोग करें। 10 मिमी दूर भ्रष्टाचार से कपाल की हड्डी में कटौती करने के लिए ठीक कैंची का उपयोग तो हड्डी भ्रष्टाचार का पता लगाने और।
  10. पृथक calv स्कैनएक μCT स्कैनर का उपयोग कर एरियल हड्डी नमूना; 200 मिसे के 360 डिग्री और एकीकरण समय के अनुसार 1000 के अनुमानों का उपयोग कर, 20.5 मिमी, 55 केवीपी की एक्स-रे ऊर्जा, 145 μA की तीव्रता को देखने के क्षेत्र निर्धारित किया है। छवि अन्य अस्थि दोष मॉडल के लिए μCT मानकों को 7 समायोजित करें।
  11. ΜCT सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न किया गया है कि 2 डी खंगाला स्लाइस को ध्यान से देखें। हित के क्षेत्र ठीक है स्कैन और फिर calvarial दोष का पता लगाने के लिए सुनिश्चित करें। छिड़काव की गुणवत्ता का आकलन। रक्त वाहिकाओं के सफल पहचान (चित्रा 2J) के बाद, जारी है और दोहरा आसुत जल (DDW) में पतला 6% trichloroacetic एसिड (टीसीए) का उपयोग नमूना अम्लो व्दारा कैल्सियम।
  12. धारा 3.10 में संकेत मापदंडों का उपयोग नमूना फिर स्कैन। खंगाला 2 डी स्लाइस में Lambdoid सीवन का पता लगा। 2 मिमी और 8 मिमी व्यास की ऊंचाई में ब्याज (VOI) के एक बेलनाकार मात्रा को परिभाषित करें, कि सिवनी को स्पर्श है - इस दोष के संरचनात्मक साइट है।
  13. खंड वेंएक वैश्विक thresholding प्रक्रिया का उपयोग कर मुलायम ऊतकों से ई हड्डी के ऊतकों; 130 के लिए कम सीमा निर्धारित करते हैं, और एक विवश 3 डी गाऊसी फिल्टर (सिग्मा [σ] = 2.0 और समर्थन = 2) आंशिक रूप से खंडों में शोर को दबाने के लिए लागू होते हैं। एक 3 डी पुनर्निर्माण पैदा करते हैं और VOI ठीक से (चित्रा 2K) तैनात है सुनिश्चित करें।
  14. आईपीएल सॉफ्टवेयर और "dt_object_param" समारोह (चित्रा 2L) का उपयोग कर एक मोटाई नक्शा उत्पन्न।
    नोट: इस समारोह में प्रत्येक पोत व्यास के लिए पोत मात्रा का वर्णन है।

चित्र 2
हृदय दृष्टिकोण के माध्यम से एक रेडियो अपारदर्शी एजेंट का उपयोग चित्रा 2. छिड़काव। माउस निर्धारण बोर्ड (ए) से चिपका है, और त्वचा गर्दन (बी) के लिए पेट के साथ काटा जाता है। पेट की दीवार असिरूप प्रक्रिया को औसत दर्जे का लाइन अप के साथ काटा हैएस एस (सी) और पसलियों laterally (डी) कट जाता है। एक तितली सुई (ई, सही वेंट्रिकल सफेद धराशायी लाइन ने संकेत दिया है) स्पष्ट रूप से गहरा है, जो सही वेंट्रिकल में प्रविष्टि से परहेज, बाएं वेंट्रिकल में डाला जाता है, और सुई दिल और छाती की दीवार पर चिपका है (एफ) । Heparinized खारा (2-3 एमएल) के दिल में पंप है, और अवर रग Cava विच्छेदित है (जी, सफेद तीर अवर रग Cava इंगित करता है)। Formaldehyde (4%) भरकर रखा जाता है और बाहर धोया जाता है; इस पीले रंगे रेडियो अपारदर्शी विपरीत एजेंट के छिड़काव के बाद है। सफल छिड़काव पीला (एच) के लिए रंग बदलने के लिए है, जो रक्त वाहिकाओं, की निकासी से स्पष्ट हो जाएगा। Polymerization के बाद, calvarial क्षेत्र (मैं, एजी = allograft) पृथक और (जम्मू, ब्याज की मात्रा नारंगी के साथ चिह्नित है) उचित छिड़काव की पुष्टि के लिए एक μCT स्कैनर का उपयोग imaged है।नमूना (कश्मीर) decalcified और rescanned है, एक रंग मोटाई नक्शा (एल) की पीढ़ी द्वारा पीछा किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अस्थि खनिज और रक्त छिड़काव 4. प्रतिदीप्ति इमेजिंग

  1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 2 nmol / 100 μl पीबीएस के एक एकाग्रता (रक्त छिड़काव को मापने के लिए अस्थि खनिज और एक रक्त जनित फ्लोरोसेंट एजेंट की निगरानी के लिए एक बिसफ़ॉस्फ़ोनेट संयुग्मित फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करें) के लिए जांच Reconstitute। धीरे कई बार पिपेट जांच के समरूप भंग सुनिश्चित करने के लिए।
  2. नामित इमेजिंग सत्र से पहले 24 घंटे के लिए एक समय-शून्य छवि ले; एक प्रेरण कक्ष में 3% isoflurane के साथ पूरक 100% चिकित्सा ग्रेड ऑक्सीजन के 2 एल / मिनट साँस लेना का उपयोग कर 3 चूहों anesthetize। उचित संज्ञाहरण स्थापित किया गया है, के बाद 1.5% isoflurane एकाग्रता कम - 2%।
  3. सूखापन को रोकने और यकीन है कि थर्मल पैड हर समय पर बंद है बनाने के लिए पशु चिकित्सक नेत्र मरहम लागू करें। यह गहरा anesthetized है सुनिश्चित करने के लिए पशु अंग पिंच। यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ पहुंच से बाहर है, जब तक एक जानवर को मत छोड़ो।
  4. बाल विकास की दिशा के खिलाफ इसे लागू करने से एक बाल क्लिपर का उपयोग calvarial क्षेत्र दाढ़ी। बाल हटाने क्रीम का उपयोग फर अवशेष निकालें। किसी भी फर बचे हुए ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा। ठीक कैंची और चिमटी का उपयोग कर टांके निकालें।
  5. IVIS मंच पर तीन जानवरों की जगह प्रत्येक इमेजिंग सत्र के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम। ऑटो के लिए जोखिम समय सेट सेल्सियस के लिए क्षेत्र को देखने के लिए, और फिल्टर समायोजित करें। उदाहरण के लिए, 680 एनएम के प्रकाश तरंग दैर्ध्य में अधिक से अधिक उत्तेजना के साथ होती एक बिसफ़ॉस्फ़ोनेट संयुग्मित फ्लोरोसेंट जांच के लिए, 675 एनएम के एक उत्तेजना फिल्टर और Cy5.5 के एक उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग । इसी तरह, प्रकाश तरंग दैर्ध्य में 750 एनएम पीक उत्तेजना के साथ एक रक्त जनित फ्लोरोसेंट एजेंट का उपयोग करते समय710 एनएम के एक उत्तेजना फिल्टर और 780 एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करें।
  6. छवि "मोल" बटन दबाकर छवि सॉफ्टवेयर लिविंग के माध्यम से चूहों। यकीन calvarial क्षेत्र एक व्यापक गाइड सलाह लिम एट अल 2009 के लिए 8 (3B चित्रा) पूरी तरह से दृश्यमान है।
  7. चूहों 100% ऑक्सीजन inhaling जाग करने की अनुमति दें।
  8. एक अंतःशिरा पूंछ इंजेक्शन के माध्यम से 2-nmol फ्लोरोसेंट जांच इंजेक्षन। ऊपर वर्णित के रूप में नामित इमेजिंग सत्र में, इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।

हड्डी पुनर्जनन के लिए 5. माइक्रो गणना टोमोग्राफी

  1. 4.3 - 4.2 कदम के रूप में दर्शाया हड्डी गठन की मात्रा का ठहराव के लिए, 3% isoflurane की साँस लेना द्वारा माउस anesthetize। ΜCT स्कैनर बिस्तर पर माउस स्थानांतरण, और स्कैनर में जगह है।
  2. ΜCT स्कैनर के एक्स-रे ट्यूब संभावित 55 केवीपी करने के लिए ऊर्जा और 145 μA माध्यम संकल्प की तीव्रता सेट करें। 20.5 मिमी देखने का एक क्षेत्र का उपयोग करना, प्रदर्शनएक स्काउट (एकल एक्स-रे) स्कैन और अपनी खोपड़ी के पीछे करने के लिए माउस की आँखों से देने ब्याज की एक क्षेत्र को परिभाषित। 200 मिसे के 360 डिग्री और एकीकरण समय के अनुसार 1000 के अनुमानों का उपयोग कर, एक सीटी स्कैन प्रदर्शन।
  3. 20 माइक्रोन की एक नाममात्र स्थानिक संकल्प का उपयोग कर 2 डी स्लाइस पुनर्निर्माण किया। ΜCT सॉफ्टवेयर 9 का उपयोग कर एक मानकीकृत स्थिति को दोष मार्जिन संरेखित करें।
  4. इसी प्रकार, 3.20 कदम ब्याज की एक बेलनाकार मात्रा को परिभाषित करने और विवश 3 डी गाऊसी फिल्टर लागू करने के लिए (σ = 0.8 और समर्थन = 1) आंशिक रूप से खंडों में शोर को दबाने के लिए। खंड एक वैश्विक thresholding प्रक्रिया का उपयोग कर मुलायम ऊतकों से हड्डी के ऊतकों।
  5. ब्याज की मात्रा में mineralized हड्डी के ऊतकों की मात्रा का निर्धारण करें।

स्टेम सेल भर्ती और भेदभाव के 6. bioluminescence इमेजिंग

  1. धारा 4.2-4.4 में दिखाया गया है और 100% ऑक्सीजन की साँस लेना द्वारा चूहों जाग के रूप में इमेजिंग के लिए माउस को तैयार है।
  2. 1 से प्रशासन26 मिलीग्राम / intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्येक माउस किलो बीटल luciferin, और प्रेरण कक्ष के लिए जानवरों की वापसी। 2 मिनट के बाद, 3% isoflurane का उपयोग पशु anesthetize। IVIS पर चूहों चरण गरम रखें।
  3. छवि सॉफ्टवेयर लिविंग के माध्यम से, जोखिम समय के लिए "ऑटो," और सी छवि को देखने के क्षेत्र luciferin प्रशासन के बाद चूहों 5 मिनट निर्धारित किया है। Transgene अभिव्यक्ति चूहों के बीच होती है, क्योंकि छवि "Bioluminescence" साधन का उपयोग कर 4.6 कदम के रूप में दर्शाया पशुओं, हित के क्षेत्रों को परिभाषित करें। पूंछ के लिए calvarial संकेत मानक के अनुसार।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neovascularization रक्त छिड़काव यों की एक फ्लोरोसेंट रक्त जनित एजेंट का उपयोग μCT बड़ा विश्लेषण के द्वारा और FLI द्वारा मूल्यांकन किया गया था। सात दिनों सर्जरी के बाद, μCT स्कैनिंग C57BL 6 / (चित्रा 3) से काटा allografts प्राप्त किया था कि चूहों की तुलना में autografts प्राप्त किया था कि चूहों में छोटे और मध्यम व्यास रक्त वाहिकाओं के एक काफी अधिक मात्रा का प्रदर्शन किया। दिलचस्प बात यह है ऑटोग्राफ़्ट समूह में नवगठित संवहनी पेड़ allograft समूह में रक्त वाहिकाओं बाहरी किनारों से दोष साइट घुसना करने के लिए दिखाई दिया और केवल एक सीमित हद तक आवक बढ़ाया है, जबकि पूरे दोष क्षेत्र तक पहुँचने के लिए दिखाई दिया। FLI ऑटोग्राफ़्ट इलाज जानवरों (चित्रा 3 बी) में काफी अधिक रक्त छिड़काव दिखा रहा है, इस अवलोकन का समर्थन किया। 14 वें दिन तक, allograft समूह में संवहनी पेड़ भ्रष्टाचार की निकटता के सभी पर पहुंच गया, अभी तक पोत मात्रा की तुलना में काफी कम थीहम जांच की है कि सबसे पोत व्यास में ऑटोग्राफ़्ट समूह (चित्रा 3 सी) के लिए। नोट: 0.08- करने के लिए 0.1 एमएम व्यास के साथ जहाजों की तुलना में थे जब पोत मात्रा में मतभेद सबसे प्रमुख थे। अट्ठाईस दिन सर्जरी के बाद वाहिका मात्रा आधारभूत (चित्रा 3 डी) के लिए लौट आए।

सात दिनों सर्जरी के बाद, FLI हाइड्रॉक्सियापटाइट निर्देशित जांच ऑटोग्राफ़्ट समूह (चित्रा 4 ए) में काफी अधिक अस्थि खनिज प्रदर्शन का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया। उस समय तक, हड्डी ऑटोग्राफ़्ट प्रत्यारोपित पशुओं में भ्रष्टाचार निकटता भर का गठन किया था। इसके विपरीत, allograft प्रत्यारोपित चूहों में हड्डी केवल दोष हाशिये पर गठन किया था और एक अंगूठी के आकार द्वारा चिह्नित किया गया था। हड्डी गठन के खंड μCT विश्लेषण (चित्रा 4 बी) के प्रदर्शन से, पुनर्योजी प्रक्रिया के अंत बिंदु पर, 56 दिनों सर्जरी के बाद मात्रा गया। हड्डी की मात्रा काफी (चित्रा 4C) उच्च और भ्रष्टाचार में थी थाautografts (चित्रा 4D) प्राप्त किया है कि पशुओं में काफी अधिक ckness। BLI osteoblastic वंश (चित्रा 4E) की ओर स्टेम सेल भर्ती और भेदभाव की निगरानी के लिए osteocalcin-luciferase ट्रांसजेनिक चूहों में इस्तेमाल किया गया था। Calvaria पर मापा संकेत पूंछ पर मापा जाता है कि अधिक से 15 गुना अधिक था, जब सर्जरी के बाद 7 दिनों - allografts साथ प्रत्यारोपित चूहों में, BLI संकेत 4 नुकीला। ऑटोग्राफ़्ट प्रत्यारोपित चूहों में, BLI संकेत थोड़ा बाद में नुकीला, 7-10 दिनों सर्जरी के बाद, और पहुँच रहा है, काफी अधिक था एक 2 गुना अधिक है calvaria से पूंछ अनुपात (चित्रा 4F)।

चित्र तीन
चित्रा 3. ऑटोग्राफ़्ट आरोपण की सुविधा एंजियोजिनेसिस। Calvarial दोष चूहों में बनाया गया था। जानवरों के आधा allografts प्राप्त किया और दूसरे आधे autografts प्राप्त किया।चूहों 7 दिन सर्जरी के बाद एक polymerizing विपरीत एजेंट के साथ भरकर रखा गया था। calvarial क्षेत्र अलग किया गया था, और नमूने decalcified थे और एक μCT स्कैनर का उपयोग imaged। एक बड़ा मोटाई नक्शा आईपीएल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न (ए, एन = 3, सलाखों ± सत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं, और तारों के पी मूल्य 0.05 <संकेत मिलता है) किया गया था। चूहे 6 दिन सर्जरी के बाद एक फ्लोरोसेंट रक्त जनित जांच के साथ इंजेक्शन थे। 24 घंटा बाद में जानवरों FLI के अधीन थे और एक मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन किया गया था (बी, एन = 5, सलाखों ± सत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं, और तारों के पी मूल्य 0.05 <संकेत मिलता है)। एक μCT आधारित संवहनी विश्लेषण किया गया था 14 (सी) और 28 (डी) के दिनों सर्जरी के बाद।: (सी और डी एन = 3, सलाखों ± सत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं, और तारों के पी मूल्य 0.05 <संकेत मिलता है) एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें veयह आंकड़ा की rsion।

चित्रा 4
एक ऑटोग्राफ़्ट चित्रा 4 आरोपण एक Allograft। चूहे की अधिक अस्थिजनन की तुलना में आरोपण calvarial autografts या allografts का प्रत्यारोपण प्राप्त बढ़ावा देता है। चूहों बाद में 6 दिन सर्जरी के बाद चतुर्थ इंजेक्शन द्वारा एक हाइड्रॉक्सियापटाइट-लक्षित जांच के साथ इंजेक्शन थे। 24 घंटा बाद में FLI और एक गुणात्मक विश्लेषण में विवो μCT विश्लेषण 56 दिनों सर्जरी के बाद किया गया था। (ए, एन = 5, सलाखों ± सत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं, और तारों के पी मूल्य 0.05 <संकेत मिलता है) प्रदर्शन किया गया है, और ब्याज की एक बेलनाकार मात्रा के साथ चिह्नित नारंगी (बी) में परिभाषित किया गया था। हड्डी की मात्रा (सी) और भ्रष्टाचार मोटाई (डी) (8, सलाखों ± सत्र का प्रतिनिधित्व एन =, और तारों के पी मूल्य 0.05 <संकेत मिलता है) मात्रा निर्धारित किया गया luciferase डीआरआई व्यक्त .Transgenic चूहोंosteocalcin प्रमोटर द्वारा उपक्रम allografts या autografts दिए गए थे। BLI 10 दिनों सर्जरी (ई) के बाद के रूप में अच्छी तरह के रूप में अतिरिक्त नामित समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया गया था। अभिव्यक्ति के स्तर (एन = 8, सलाखों ± सत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं, और तारों के पी मूल्य <0.05 से संकेत मिलता है, एफ) चूहों के बीच बदलता है क्योंकि calvarial क्षेत्र में मापा संकेत। सामान्यीकृत था यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ वर्णित बहुविध इमेजिंग दृष्टिकोण का उद्देश्य कपाल बोन ग्राफ्टिंग के संदर्भ में angiogenesis-अस्थिजनन अक्ष की सावधानीपूर्वक जांच के लिए सक्षम है। Neovascularization पूरे कपाल दोष खिला संवहनी पेड़ की एक सटीक उच्च संकल्प 3 डी प्रदर्शन की अनुमति दी है, जो एक μCT प्रोटोकॉल का उपयोग उतारी थी। μCT डेटा आसानी से इस तरह आईपीएल सॉफ्टवेयर के रूप में उन्नत उपकरणों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा -3 सी में दिखाया गया मोटाई विश्लेषण कपाल ऑटोग्राफ़्ट और allograft के बीच मुख्य अंतर 0.1 से रक्त धमनियों को 10 की विशेषता है जो व्यास में 0.08 मिमी, को लेकर वाहिकाओं में हैं कि पता चला। यह परिणाम लंबी हड्डी मॉडल 11 में प्रदर्शन के अध्ययन के साथ संगत है। यह 0.02 मिमी व्यास के सबसेसंकरेमें पता लगाने योग्य वाहिकाओं को पूरी तरह से कारण रेडियो अपारदर्शी एजेंट की चिपचिपाहट के लिए casted नहीं कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इस विधि के मुख्य नुकसान यह जरूरत पर जोर देता है कि तथ्य यह हैजानवर की इच्छामृत्यु, और इस तरह अनुदैर्ध्य इमेजिंग असंभव है। कई रेडियो अपारदर्शी जांच में विवो संवहनी μCT इमेजिंग के लिए उपलब्ध हैं; हालांकि, वे रेडियो अपारदर्शी घने polymerizing जांच के रूप में के रूप में नहीं कर रहे हैं, और छवि संकल्प यहां 12 में दर्शाया पूर्व vivo विधि द्वारा प्रदान की गई है कि पूरा नहीं करता है। μCT संकल्प सीमित है और उदाहरण के लिए, रक्त केशिकाओं अध्ययन करने के लिए उपयोगी नहीं होगा। एक निपुण हाथ से सहायता प्राप्त, उसके अलावा इस विधि को विस्तार से हड्डी वाहिका अध्ययन करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक प्रदान करता है।

दर्शाया प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम दोष स्थान (कदम 2.7) का दृढ़ संकल्प है। Lambdoid सिवनी को चोट भारी रक्तस्राव को बढ़ावा मिलेगा। Calvarial दोष जब ड्रिलिंग, देखभाल अधीनस्थ ड्यूरा मेटर और बेहतर बाण साइनस को बाधित करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। बाएं वेंट्रिकल में तितली सुई की अंतिम, प्रविष्टि एक नाजुक प्रक्रिया (3.4 कदम) है। सुई डालने हैएड सही वेंट्रिकल में, इसके विपरीत एजेंट फेफड़ों छिड़कना जाएगा और calvaria के गरीब छिड़काव करने के लिए अग्रणी, नसों पर चलते हैं। सुई भी गहरी डाला जाता है, यह पीछे दिल की दीवार छेदना जाएगा; सुई काफी दूर तक नहीं डाला जाता है, तो यह आसानी से दूर दिल से आंसू सकता है। आप छिड़काव के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में सुई की स्थिति फिर से समायोजित करने के लिए प्रयास न करें। विधि उपलब्ध फ्लोरोसेंट जांच का एक सेट का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है; Integrin-α 3 β वी -targeted जांच cathepsin-कश्मीर लक्षित जांच अस्थिशोषक गतिविधि यों इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि नवगठित रक्त वाहिकाओं पर बल प्रयोग किया जा सकता है।

हमारी परिकल्पना के अनुसार, हम calvarial autografts allografts तुलना में एक उच्च osteogenic क्षमता है कि मनाया। इस के साथ ही लंबी हड्डियों के लिए 13 से सच है और कई कारकों को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। सबसे पहले, ऑटोग्राफ़्ट भ्रष्टाचार के दौरान हड्डी मैट्रिक्स का उत्पादन जो अस्थि कोशिकाओं के गठन होता है,सतह, खनिज निर्देशित FLI (चित्रा 4 ए) पर सबूत के रूप में; allografts जबकि केवल दोष हाशिये पर दुर्लभ हड्डी गठन को प्रेरित। दूसरा, osteocalcin ल्यूक चूहों के BLI allograft तैयार करने की प्रक्रिया (चित्रा 4F) में हटा रहे हैं कि विकास के कारकों की उपस्थिति से समझाया जा सकता है, जो ऑटोग्राफ़्ट समूह में अधिक osteogenic गतिविधि का पता चला। दिलचस्प है, अस्थि खनिज हाइड्रॉक्सियापटाइट-लक्षित जांच दिलाई दिन जब 6 और 7, कम से काफी अधिक था, और BLI गतिविधि का प्रतिनिधित्व करती सेल भेदभाव हम इस से अनुमान कर सकते हैं 7 दिन और दिन 10 के बीच है, बाद में स्पष्ट किया गया था और अधिक व्यापक है कि अस्थि खनिज कम से कम आंशिक रूप से ऑटोलॉगस बोन ग्राफ्टिंग की विशेषता है कि अनुकूल वाहिका से समझाया जा सकता है।

हमारे परिणाम ऑटोग्राफ़्ट बेहतर osteogenic क्षमता है कि संकेत मिलता है; हालांकि, एक गैस से झाल लगाना बोन ग्राफ्टिंग कई नाटकीय है कि ध्यान में रखना चाहिएwbacks। अस्थि कटाई मात्रा में सीमित है और दाता साइट 14-16 को रुग्णता पर जोर देता। इसके अलावा, हड्डी ऑटोग्राफ़्ट अवशोषण की घटनाओं को 17-19 नगण्य नहीं है। Allografts अत्यधिक उपलब्ध हैं और चिकित्सक के लिए एक मुस्तैद समाधान प्रस्तुत करते हैं। कई काम करता है कपाल allografts की आस्टियो-एकीकरण सहायक उपचार के लिए BMP2 एन्कोडिंग एडिनो से जुड़े वायरस 20,21 साथ allograft कोटिंग से इस तरह रुक-रुक कर पैराथायराइड चिकित्सा के रूप में 22 लेकर विभिन्न तरह से बढ़ाया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शन किया है। हड्डी के साथ विलय करने के लिए allograft की क्षमता सिद्ध हो जाने के बाद अंत में, allograft वरीय ग्राफ्टिंग सामग्री बन जाएगा।

इन परिणामों के प्रकाश में, एक विशेष रुचि हड्डी उत्थान के स्थल पर neovascularization मिलाना के लिए कैसे सवाल में निहित है। गठन रक्त वाहिकाओं टपकाया कर रहे हैं और एक कामकाज फार्म नहीं है के रूप में अधिक अभिव्यक्ति वीईजीएफ़ का प्रत्यक्ष दृष्टिकोण, अक्षम पाया गया था23,24 शुद्ध onal। दिलचस्प बात यह है कि यह बीएमपी संकेत पारगमन रक्त वाहिका 25,26 के लक्षित गठन की ओर जाता है कि पाया गया था। इसके अलावा, दवा एजेंटों 11 और सेल थेरेपी 27 हड्डी भ्रष्टाचार निकटता में angiogenesis के पैटर्न को बदलने के लिए दिखाया गया था; दोनों कपाल अस्थि दोष चिकित्सा बढ़ाने के लिए वर्तमान होनहार रणनीतियों दृष्टिकोण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5 mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20 ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3-sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
μCT40 scanner Scanco μCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
  2. Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
  3. Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
  4. Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
  5. Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
  6. Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
  7. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  8. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
  9. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
  10. Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
  11. Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
  12. Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
  13. Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
  14. Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
  15. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
  16. Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
  17. Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
  18. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
  19. Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
  20. Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
  21. Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
  22. Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
  23. Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
  24. Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
  25. Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
  26. Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
  27. Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 106 हड्डी पुनर्जनन कपाल हड्डी allograft गैर संघ अस्थि दोष neovascularization नाड़ी संरचनात्मक विश्लेषण सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी।
गणना टोमोग्राफी और अस्थिजनन-एंजियोजिनेसिस युग्मन के ऑप्टिकल इमेजिंग कपाल अस्थि autografts और allografts की एकता का आकलन करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W.,… More

Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., Gazit, D., Gazit, Z. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter