Summary
Имплантация аутологичных и аллогенных трансплантатов костного представляют собой приняты подходы для лечения черепно-лицевой главную потерю костной массы. Тем не менее, эффект трансплантата состава на взаимодействии между неоваскуляризации, дифференциации клеток и формирования костной ткани остается неясным. Мы представляем мультимодального протокол изображения, направленный на выяснение ангиогенеза остеогенез взаимозависимость в привитой близости.
Abstract
Основным параметром, определяющим успех процедуры кости прививки васкуляризация окрестностях трансплантата. Мы предположили, что имплантация аутокостью бы побудить большее регенерации кости по образованию обильной кровеносных сосудов. Чтобы исследовать эффект трансплантата на неоваскуляризации в дефектной сайта, мы разработали микро-компьютерная томография (μCT) подход для характеристики вновь образующихся кровеносных сосудов, которая включает в себя системную перфузию животного с полимеризацию контрастного вещества. Этот метод позволяет подробную сосудов анализ органа во всей своей полноте. Кроме того, кровоснабжение оценивали с помощью флуоресцентной томографии (FLI) кровеносного происхождения люминесцентной агента. Формирование кости количественно с использованием гидроксиапатита, ориентированные проб и анализ μCT по FLI. Набор стволовых клеток контролировали с помощью биолюминесценции томографии (BLI) в трансгенных мышей, которые экспрессируют люциферазу под контролем промотора остеокальцина.Здесь мы описываем и продемонстрировать подготовку аллотрансплантата, свода черепа дефектов операцию, протоколы сканирования μCT для изучения неоваскуляризации и анализа остеогенеза (в том числе перфузии в естественных условиях контрастного вещества) и протокола для анализа данных.
Анализ 3D высокого разрешения сосудистой продемонстрировали значительно большую ангиогенез у животных с имплантированными аутотрансплантатов, особенно по отношению к образованию артериол. Соответственно, перфузии крови был значительно выше в группе аутотрансплантата 7-й день после операции. Мы наблюдали высокую минерализацию костной ткани и измеренное большее образование костной ткани у животных, получивших аутотрансплантатов. Аутотрансплантата имплантация индуцированной житель набор стволовых клеток в трансплантат костного шва принимающей, где клетки дифференцировались в клетки костной формирования между 7-й и 10-й день после операции. Это открытие означает, что образование костной ткани повышена, могут быть отнесены кдополненная кормления сосудистой, что характеризует аутотрансплантата имплантации. Методы изображен может служить в качестве оптимального инструмента для изучения регенерации кости в терминах плотно ограниченной остеогенеза и неоваскуляризации.
Introduction
Черепно потеря костной из-за травмы, резекции опухоли, декомпрессивной трепанации черепа, и врожденный дефект редко исцеляет сама по себе и представляет четкую клиническую неудовлетворенных потребностей. Аутологичные костные трансплантаты и аллогенных костные трансплантаты широко используются для лечения этих условий 1.
Это широко признано, что остеогенез тесно связан с ангиогенеза 2,3. Таким образом, полное исследование предложенной терапии для регенерации костной ткани должен включать в себя всестороннее расследование сосудистой дерева, образуя на всей территории дефекта. Есть несколько доступных методов характеризуют васкуляризации в научно-исследовательских моделей. Сосудистый дерево может быть исследована гистологического анализа. Так гистология полагается на срезов ткани, существует высокая вероятность того, что полученное изображение будет искажаться. Чтобы решить эту проблему, прижизненной микроскопии может быть выполнена, чтобы изображение без изменений сосудов 4; Однако, этот методограничивается одним-плоскости изображения. μCT сканирование образцов, полученных от животного перфузии контрастного вещества позволяет 3D изображений сосудистой сети, который питает сайт регенерации 5. Такой подход позволяет весьма детальное обоснование сосудистой органа в целом, а также тщательный анализ распределения кровеносных сосудов. Кроме того, μCT позволяет дифференциацию между различными диаметрами сосудов, которые характеризуют различные подтипы кровеносных сосудов.
Мы предположили, что имплантация свода черепа аутотрансплантата будет вызывать большее, чем образование новых сосудов имплантации аллотрансплантата, и это увеличение новых сосудов приведет, в свою очередь, к повышению кости formation.To продолжать эту гипотезу мы использовали различные методы. Мы исследовали образцы вновь образованной сосудистой дерева, выполняя анализ μCT основе. Мы измеряли кровоснабжение помощью крови бассейн флуоресцентный зонд. Далее, мы ослыSed минерализации костной ткани с помощью FLI из гидроксиапатита направленный зонда и анализа μCT. Наконец, мы провели мониторинг набор стволовых клеток и дифференцировки, выполняя BLI в трансгенных мышей, у которых люциферазы выражается в остеокальцина-позитивных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол следует руководящие принципы институционального ухода за животными и использование комитета (IACUC) из Еврейского университета в Иерусалиме, Израиль (Запрос Номер MD-12-13524-4), А.Н. AAALAC утвержден объект, и по Кедров-Sinai Medical Center IACUC (Запрос номер 3770). Животным вводили в строгом соответствии с руководящими принципами NIH.
1. Подготовка кости АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ
- Эвтаназии 7 до 8-недельных мышей BALB / C, или любой штамм, отличные от получателя, с использованием стандартного метода СО 2 ингаляции или внутрибрюшинной инъекцией 50 мкл фенобарбитала (65 мг / мл .; 100 мг / кг). Подтвердите отсутствие сердцебиения и выполнять шейки дислокации. Кроме того, урожай аллотрансплантаты от туш, которые были сохранены в -20 ° С и талых до сбора урожая.
- Бритье свода черепа область с помощью машинки для стрижки волос, применяя его в направлении против роста волос. Лечить глава каркаса с применением 70% isopropanoл. Разрежьте кожу головы с помощью скальпеля № 11 и удалите надкостницы.
- Использование бормашины и 4,5-мм внутренний диаметр-трепана, отсоединить круговой фрагмент свода черепа кости. Передача костного фрагмента в 100-мм пластиковой чашке, содержащей стерильного физиологического раствора. В этот момент, заметить, кровь и мягкие ткани, прикрепленный к кости (фрагмент фиг.1А). Получить костных фрагментов таким образом от 22 доноров.
- Держите фрагмент одной кости, в то время, используя изогнутые пинцет. Тампон его тщательно с использованием хлопка аппликатор и удалите мозговой ткани, мягкие ткани, и кровь (рис 1B). Аккуратно срежьте любые кости чипы, которые остаются прикрепленными к трансплантата с использованием тонких ножниц, так что трансплантат будет иметь идеальный округлую форму.
- Dip каждый трансплантат раз в 15 мл пробирку, содержащую 70% этанола и дважды в 15 мл пробирки, содержащие забуференный фосфатом физиологический раствор для промывания этанолом.
- Замораживание аллотрансплантаты в -80 ° C холодильник в криопробирок, по крайнейне менее 1 недели. На данный момент, убедитесь, что аллотрансплантаты выглядят прозрачными (рис 1С).
2. Дефект хирургии свода черепа
- Для получателей использовать трансгенных мышей, которые экспрессируют люциферазу под контролем промотора остеокальцина 6.
- Стерилизовать кончики хирургических инструментов, используя стеклянную шарик нагреватель в течение 30 сек. Перевести средства в банке, содержащей 70% изопропанола, чтобы поддерживать стерильные условия. Используйте стерильные перчатки.
- Обезболить 7- до 8-недельного возраста самок мышей внутрибрюшинным введением в ketamine- медетомидин смеси (75 мг / кг и 1 мг / кг, соответственно). Зажмите животных конечность, чтобы убедиться, что он глубоко под наркозом. Не оставляйте без присмотра животное, пока он не пришел в сознание достаточно, чтобы поддерживать грудины лежачее положение.
- Бритье свода черепа регион, используя машинку для стрижки волос, применяя его в направлении против роста волос. Применить удаления волос крем для удаления любых меховых остатки и протрите его отрядег не более 2 мин с использованием сухой марлей с последующим солевым пропитанной марли. Уход должны быть приняты, чтобы избежать ее в глазах. Кроме того, ветеринар глазная мазь можно применять до удаления волос в качестве дополнительного слоя защиты для глаз. Это необходимо, чтобы все следы депиляции кремом быть удалены для того, чтобы избежать возможного раздражения от чрезмерного воздействия химического агента. Лечить кожи головы с применением 5% хлоргексидин (рис 1D).
- Вводят подкожно 5 мг / кг карпрофен разводили в 200 мкл физиологического раствора. Применить ветеринар глазную мазь, чтобы предотвратить сухость и держать животное на тепловой площадку на все времена. Расположите животное под управлением операционных бинокль.
- Сделайте 1 см длиной овальным вырезом в волосистой части головы, используя кожу тонких ножниц и пинцета (рис 1E). Держите надкостницы, используя изогнутые пинцет и вырезать с помощью тонких ножниц.
- Просверлите свода черепа дефект 2 мм кпереди от ламбдовидного шва с помощью зубной просверлитьй 5-мм внешний диаметр Трепан (рис 1F и G). Чтобы избежать проникновения твердой мозговой оболочки, пробурить три четверти пути в кости и снять фрагмент кости с помощью шпателя.
- Для имплантации аутотрансплантата, извлечь фрагмент кости и промойте его в 10 мм пластиковой пластины, содержащей 10 мл стерильного физиологического раствора, чтобы удалить мусор. Не снимайте мягких тканей. Для имплантации аллотрансплантата, оттепель заранее аллотрансплантата и нормализовать его до комнатной температуры, а затем промойте его.
- Поместите костный трансплантат в дефекта с использованием криволинейных пинцет, чтобы он не коснется дефектов поля (рис 1П). Клей трансплантата кость хозяина с использованием фибрина гель (5 мкл 46 мг / мл фибриногена смешивают с 5 мкл 25 ед / мл тромбина).
- Шовный кожу, используя 4-0 викрил шов (рис 1I). Применение повидон-йода в хирургическое разреза. Уход должны быть приняты для предотвращения загрязнения шва мехом. Отметить ухо мыши и ввести 0,25 мг / кг Antisedan тО обратной обезболивающий эффект медетомидина.
- Если животное делает проснуться в 10 мин, убедитесь, что он находится на подогретое площадку. Вводят 200 мкл стерильного физиологического раствора, а при необходимости инъекционные 0,1 мг / кг Antisedan. Не возвращать животное, претерпела операцию на компании других животных до полного восстановления.
- Держите животных в клетках, разделенных на неделю, чтобы предотвратить их от открытия швов. Поместите мыши чау, смоченную в воде в чашке Петри на полу клетки на несколько дней после соч. Вводят подкожно 200 мкл 1 мг / мл раствора, разбавленного Carprofen в стерильном физиологическом растворе один раз в день в течение 3 дней после операции для лечения послеоперационной боли.
Рисунок 1. свода черепа аллотрансплантата Подготовка и свода черепа Дефект хирургии. Фрагмент кости изолирован от свода черепа области (А). Мягких тканей, Костного мозга, крови и мазок (В), и трансплантат промывают 70% этанолом с последующими двумя промывками в фосфатно-солевом буфере (С, AG = аллотрансплантата). Мышь получатель готовы к операции по бритья и дезинфекции кожи в области свода черепа (D). Овальный разрез создан в кожи головы и надкостница удаляется (E). Далее, свода черепа дефект пробурены с использованием 5-мм диаметра трепана A (F). Фрагмент кости отделяется с помощью ложки-образный шпатель, в результате чего верхнего сагиттального синуса нетронутыми (G). Аллотрансплантат помещают в дефект и закреплены с помощью гель фибрина (H). Наконец, кожа зашивается (я). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. Микро-компьютерной томографии для характеризациисосудистую
- Подготовка гепаринизированную физиологический раствор. Вес 2,000 U гепарина натрия и поместить его в 50 мл пластиковую трубку. Добавить 20 мл физиологического раствора и встряхнуть пробирку. Заполните 20 мл Luer замок шприц с 15 мл физиологического раствора нагревают гепаринизированной и соединить шприц с 23-G кожу головы вены набор. Прикрепите шприц в шприцевой насос, и установить его на насос 10 мл на 1 мл / мин.
- Седативный мыши с помощью инъекции внутрибрюшинно 50 мкл фенобарбитала (65 мг / мл .; 100 мг / кг). Pinch конечность животного, чтобы убедиться, что он глубоко седативные. Закрепите мыши на его спине к фиксации платы завернутый с абсорбирующим вкладышем поверхности (рис 2А). Поместите курсор фиксированный в вытяжном шкафу, чтобы предотвратить персонала воздействия дыма.
- Разрежьте кожу от живота к шее с помощью тонких ножниц и пинцета (рис 2б). Отрежьте брюшную стенку до мечевидного отростка (рис 2С). Вырезать грудную клетку вдоль ее боковой стороны. Избегайте ранив легкиеd сердце, и убедитесь, что сердце полностью открыты. Используйте кровоостанавливающего отказаться грудины (рис 2D).
- Вставьте иглу бабочка 3 мм в левом желудочке (рис 2E). Клей иглу в сердце и грудной стенки с использованием 3-сек клей (рис 2F).
- Немедленно включить насос. Через минуту, рассекают нижнюю полую вену, чтобы сбросить давление в сосудистой (рис 2G). Наклоните доску так, что жидкости будет течь от головы. Успешное перфузии приведет к очистке печени и кровеносных сосудов.
- Когда гепаринизированной солевой раствор перфузии завершена, заливать 10 мл 4% формальдегида. Избегать попадания пузырьков воздуха в сосудистой и избегать воздействия формальдегида дыма. Успешное формальдегида перфузии приведет к жесткости хвоста. Промойте формальдегида с 10 мл физиологического раствора гепаринизированные.
- Подготовка рентгеноконтрастных контрастного вещества в соответствии с ПроизводИнструкции urer. Как правило, это потребует смешивание соединения, разбавителем и отвердителем. Использование серологических пипеток и перемешать раствор в 15 мл пластиковую пробирку.
- Заливать животное с контрастного агента смеси со скоростью 1 мл / мин. Соблюдайте коронарных, кишечные и печеночные сосуды и убедиться, что они желтеют после перфузии 2 - 3 мл, с указанием успешного перфузии (рис 2H). После завершения перфузии, вырезать трубки на дроссельном иглы, получить тушку в одиночку и оберните его с туалетной бумагой, чтобы предотвратить утечку решения свода черепа регионе. Разрешить полимеризации в 4 ° CO / N.
- Рассеките свода черепа область (рис 2i); Во-первых использовать скальпель, чтобы вырезать кожу как боковое, насколько это возможно, избежать повреждения черепной области интереса. Найдите костный трансплантат, а затем использовать мелкие ножницы, чтобы вырезать кости черепа 10 мм от трансплантата.
- Сканирование изолированных calvArial образец костного помощью сканера μCT; установить поле зрения до 20,5 мм, рентгеновской энергии 55 кВп, интенсивность 145 мкА, используя 1000 проекции за 360 ° и временем интегрирования от 200 мс. Отрегулируйте параметры μCT 7 к фотографиям других моделей дефектов кости.
- Соблюдайте 2D реконструирован ломтики, которые были созданы с помощью программного обеспечения μCT. Убедитесь, что для сканирования области интереса правильно и найдите свода черепа дефект. Оценка качества перфузии. После успешной идентификации кровеносных сосудов (рис 2J), продолжать и известковые отложения образец, используя 6% трихлоруксусной кислотой (ТСА), разбавленного в двухместном дистиллированной воды (DDW).
- Повторное сканирование образца, используя параметры, указанные в разделе 3.10. Найдите ламбдовидного шов в реконструированных 2D ломтиками. Определить цилиндрический объем интереса (ВОИ) в высоту 2 мм и диаметром 8 мм, что является касательной к нити - это анатомическая дефекта.
- Сегмент-йе костной ткани из мягких тканей с использованием глобальной процедуры пороговой; установить нижний порог до 130, и применять ограниченного 3D фильтра Гаусса (сигма [σ] = 2,0 и поддержка = 2), чтобы частично подавить шум в объемах. Создание 3D реконструкции и убедитесь, что ВОИ правильно расположен (рис 2K).
- Создание толщина карту, используя программное обеспечение IPL и функцию "dt_object_param" (рис 2L).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция описывает объем резервуара для каждого диаметра сосуда.
Рисунок 2. перфузии с использованием рентгеноконтрастных агента с помощью сердечной подхода. Мышь прикреплен к фиксирующей плате (А), и кожа разрезается вдоль брюшка до шеи (B). Брюшная стенка разрезается вдоль медиальной линии до мечевидного процеSS (С), и грудная клетка разрезают в поперечном направлении (D). Бабочка игла вставлена в левый желудочек, избегая вставки в правый желудочек, который заметно темнее (Е, правый желудочек обозначено белой пунктирной линией), а игла прикрепляется к сердцу, и стенки грудной клетки (F) , Гепаринизированную физиологический раствор (2-3 мл) перекачивается в сердце, и нижней полой вены рассекают (G, белая стрелка указывает на нижнюю полую вену). Формальдегид (4%) перфузии и вымываются; это следует перфузии желто-окрашенные рентгеноконтрастного контрастного вещества. Успешное перфузии будет видно по оформлению кровеносных сосудов, которые изменяют цвет на желтый (H). После полимеризации свода черепа область изолирована (I, AG = аллотрансплантата) и визуализируют с помощью сканера μCT, чтобы подтвердить правильность перфузии (J, объем интерес обозначенному оранжевый).образец декальцифицировали и повторное сканирование (К), с последующим поколением цветной толщины карте (L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. флуоресценции Визуализация минерализации костей и крови перфузии
- Развести зондов в концентрации 2 нмоль / 100 мкл PBS в 1,5 мл пробирку (использование бисфосфонатов, конъюгированных флуоресцентного зонда для контроля минерализации костей и через кровь флуоресцентный агент для измерения кровоснабжение). Внесите мягко несколько раз, чтобы убедиться однородную растворение зонда.
- 24 ч до назначенного заседания изображений взять тайм-нулевой образ; обезболить мышей, используя 3 2 л / мин ингаляцию 100% медицинского класса кислорода с добавлением 3% изофлуран в индукции камеры. После надлежащего анестезии было установлено, снизить концентрацию изофлуран до 1,5% - 2%.
- Применить ветеринар глазную мазь, чтобы предотвратить сухость и убедитесь, что тепловая подушка включается во все времена. Зажмите животных конечность, чтобы убедиться, что он глубоко под наркозом. Не оставляйте без присмотра животное, пока он не пришел в сознание достаточно, чтобы поддерживать грудины лежачее положение.
- Бритье свода черепа область с помощью машинки для стрижки волос, применяя его в направлении против роста волос. Удалить остатки меха, используя удаления волос крем. Любой мех остаток будет мешать оптических изображений. Удалить швов, используя тонких ножниц и пинцета.
- Поместите три животных на стадии IVIS нагревают до 37 ° С для каждого сеанса визуализации. Установить время экспозиции авто, смотреть поле, С, а также настроить фильтры. Например, для бисфосфонатного-сопряженных флуоресцентного зонда характеризуется с максимальной возбуждения в длине световой волны 680 нм, использовать фильтр возбуждения 675 нм и эмиссии фильтра Cy5.5 , Аналогично, при использовании через кровь флуоресцентный агент с пиковой возбуждении на длине волны света 750 нмиспользовать фильтр возбуждения 710 нм и эмиссии фильтра 780 нм.
- Изображение мыши через программное обеспечение Жизнь изображение, нажав кнопку "Снимок". Убедитесь, что область свода черепа видно полностью (3В) Для всестороннего направляющей советуют Лим и др 2009 8.
- Разрешить мыши, чтобы проснуться вдыхая 100% кислорода.
- Вводите 2-нмоль флуоресцентного зонда с помощью внутривенной инъекции хвост. В назначенное сессии изображений, выполнить визуализацию, как описано выше.
5. Микро-компьютерной томографии для регенерация кости
- Для количественного определения остеогенеза, анестезию мыши при вдыхании 3% изофлуран, как показано в шаге 4.2 - 4.3. Перевести курсор к постели μCT сканера и поместите его в сканер.
- Установите Рентгеновская трубка потенциальную энергию сканера μCT до 55 кВп и интенсивность 145 мкА среднего разрешения. Использование поле зрения 20,5 мм, выполняютразведчик (один рентген) сканирования и определить область интереса, простирающейся от глаз мыши на задней его черепа. Выполнение КТ, используя 1000 проекции за 360 ° и временем интегрирования от 200 мс.
- Реконструировать ломтики 2D, используя номинальную пространственное разрешение 20 мкм. Совместите дефектов поля для стандартизированной положение с помощью программного обеспечения μCT 9.
- Подобно шаг 3.20, определить цилиндрический объем интересов и применить ограниченного 3D фильтра Гаусса (σ = 0,8 и поддержка = 1), чтобы частично подавить шум в объемах. Сегмент костная ткань из мягких тканей с использованием глобальной процедуры пороговой.
- Определить объем минерализованных костных тканей в объеме интерес.
6. Биолюминесценция изображений стволовых клеток вербовкой и дифференциации
- Подготовьте мышь для визуализации, как показано в разделах 4.2-4.4 и пробудить мышей при вдыхании 100% кислорода.
- Администрирование 126 мг / кг жука люциферин, чтобы каждой мыши через внутрибрюшинной инъекции, и вернуть животное к индукции камеры. Через 2 мин, обезболить животное, используя 3% изофлуран. Поместите мышей на ИВИС нагревали этап.
- Через Жизнь программное обеспечение изображения, установить время экспозиции "авто" и в поле зрения на C. изображения мышей 5 мин после введения люциферин. Изображение животных, как изображено на этапе 4.6, используя "биолюминесценции" модальность Определить регионы интерес, потому что трансгенная экспрессия изменяется между мышами. Нормализация свода черепа сигнал на хвосте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Неоваскуляризация оценивали μCT объемного анализа и FLI использованием флуоресцентного через кровь агент для количественной кровоснабжение. Семь дней после операции, сканирование μCT продемонстрировали значительно более высокий объем малого и среднего диаметра кровеносных сосудов у мышей, получивших аутотрансплантатов, чем у мышей, получивших аллотрансплантаты найденным C57BL / 6 (рис 3а). Интересно, что в аутотрансплантата группы вновь образованных сосудов дерево оказалось, чтобы достичь всю область дефекта, тогда как в группе аллотрансплантата кровеносные сосуды проникают явился дефект узел из внешних краев и расширена внутрь лишь в ограниченной степени. FLI поддерживает это наблюдение, показав значительно более высокую перфузии крови в аутотрансплантата обработке животных (рис 3b). К 14-й день, в аллотрансплантата группы сосудистой дерево достигло всех близости трансплантата, пока объем сосуда было значительно ниже по сравнениюв аутотрансплантата группы в большинстве диаметров сосудов, что мы рассмотрели (рис 3C). Примечание: различия в объеме сосуда были наиболее заметным, когда суда с диаметрами 0.08- до 0,1 мм были сопоставлены. Двадцать восемь дней после операции объем сосудистой сети возвращались к базовым (рис 3D).
Через семь дней после операции, FLI проводили с использованием гидроксиапатита-направленного зонда показали, значительно большее минерализации костной ткани у аутотрансплантата группы (фиг.4А). К этому времени, кости образовали по всей трансплантата близости в аутотрансплантата имплантированных животных. В отличие от этого, кости в Аллотрансплантация имплантированных мышам сформировали только на дефектных маржи и был отмечен круглой формы. Объемы образования костной ткани количественно 56 дней после операции, в конечной точке процесса регенерации, выполняя μCT анализ (фиг.4В). Объем кости была значительно выше (рис 4C) и привитой THIckness значительно больше у животных, получивших аутотрансплантатов (рис 4D). БЛИ был использован в остеокальцина-люциферазы трансгенных мышей контролировать набор и дифференцировки стволовых клеток в сторону остеобластов линии (рис 4E). У мышей, которым имплантировали аллотрансплантатов, сигнал БЛИ достиг максимума 4 - 7 дней после операции, когда сигнал измеряется на своде черепа в 15 раз выше, чем измеренное на хвосте. В аутотрансплантата имплантированных мышам, сигнал BLI достиг максимума чуть позже, 7 - 10 дней после операции, и был значительно выше, достигая в 2 раза выше свода черепа к хвосту соотношении (рис 4F).
Рисунок 3. аутотрансплантата Имплантация Облегчает ангиогенез. Свода черепа дефекты были созданы в мышей. Половина животных получала аллотрансплантатов, а другая половина получила аутотрансплантатов.Мышей перфузии контрастного вещества полимеризационной 7 дней после операции. Свода черепа область была выделена, и образцы были декальцифицировали и визуализируют с помощью μCT сканер. Объемный толщина карта генерируется с использованием IPL программное обеспечение (A, N = 3, бары представляют ± МП, и звездочки указывают значение Р <0,05). Мышам вводили с флуоресцентным через кровь зонда 6 дней после операции. 24 ч спустя животных подвергали FLI и количественный анализ проводили (B, N = 5, бары представляют ± МП, и звездочки указывают значение Р <0,05). ΜCT основе сосудистой анализ проводили 14 (С) и 28 (D) дней после операции (С и D: N = 3, бары представляют ± МП, и звездочки указывают значение Р <0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше веrsion этой фигуры.
Рисунок 4. Имплантация аутотрансплантата способствует более остеогенез, чем имплантация аллотрансплантата. Мыши получили имплантаты свода черепа аутотрансплантатов или аллотрансплантатов. Мышей позже вводили гидроксиапатита, ориентированные зонда путем инъекции IV 6 дней после операции. 24 ч спустя FLI и качественный анализ проводили (А, п = 5, бары представляют ± МП, и звездочки указывают значение Р <0,05). В естественных условиях μCT анализ проводили 56 дней после операции, и цилиндрический объем интерес, отмеченные оранжевый был определен (В). Объем кости (С) и толщина трансплантата (D), количественно (п = 8, бары представляют ± МП, и звездочки указывают значение <0,05 P) .Transgenic мышей выражения люциферазы DRIаже в остеокальцина промоутер дали аллотрансплантаты или аутотрансплантатов. БЛИ проводили через 10 дней после операции (Е), а также на дополнительных назначенных временных точках. Сигнал измеряется в регионе свода черепа нормализовалось, потому что уровень экспрессии изменяется среди мышей (F, N = 8, бары представляют ± МП, и звездочки указывают значение Р <0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью мультимодальных подходов, описанных здесь, изображений является обеспечение тщательного расследования оси ангиогенеза остеогенез в контексте черепной костной пластики. Неоваскуляризация была отображена с использованием протокола μCT, что позволило точную высоком разрешении 3D демонстрация сосудистую кормления весь черепной дефект. Данные μCT может быть легко проанализированы с использованием передовых инструментов, таких как программное обеспечение IPL. Например, анализ толщины показано на рисунке 3C показал, что основные различия между черепной аутотрансплантата и аллотрансплантата в судах, начиная от 0,1 до 0,08 мм в диаметре, которая характеризует артериол крови 10. Этот результат согласуется с результатами исследований, проведенных в модели длинных костей 11. Следует отметить, что узкие обнаруживаемые сосуды диаметром 0,02 мм не полностью литой из-за вязкости рентгеноконтрастного агента. Основным недостатком этого метода является то, что это влечет за собойэвтаназии животного, и, таким образом продольное изображений невозможно. Несколько рентгеноконтрастные зонды для в естественных условиях сосудистой μCT изображений; Однако, они не как радио-непрозрачного как густой полимеризующим зонда, и разрешение изображения не соответствует, что обеспечивается методом экс естественных условиях, изображенной здесь 12. разрешение μCT ограничено и не будет полезно изучить кровеносные капилляры, например. Кроме этого, опираясь на умелой рукой этот метод предлагает воспроизводимый метод для изучения костной сосудистую подробно.
Один важный шаг в изображенных протоколов определение местоположения дефекта (этап 2.7). Травма ламбдовидного шва приведет к массивным кровотечением. При бурении свода черепа дефект, следует позаботиться, чтобы не нарушать подчиненным твердую мозговую оболочку и верхнего сагиттального синуса. Последнее, вставка бабочки иглы в левом желудочке является деликатная процедура (шаг 3,4). Если игла вставкиред в правом желудочке, контрастное вещество будет заливать легкие и перейти к венам, что приводит к плохой перфузии свода черепа. Если игла вставлена слишком глубоко, то на задней перфорировать стенку сердца; и если игла не вставлен недостаточно далеко, это может легко оторвать от сердца. Не пытайтесь повторно отрегулируйте положение иглы, как вы можете помешать перфузии. Способ может быть модифицирован с помощью набора доступных флуоресцентных зондов; Интегринзависимая α β 3 v -targeted зонд может быть использован, чтобы подчеркнуть новообразованных сосудов, в то время как катепсин-K-мишенью зонд может быть использован для количественного активность остеокластов.
В соответствии с нашей гипотезой, мы обнаружили, что свода черепа аутографты имеют более высокий потенциал, чем остеогенной аллотрансплантатов. Это верно для длинных костей, а также 13 и может быть связано с несколькими факторами. Во-первых, аутотрансплантата содержит формирования костной клетки, которые производят костный матрикс всей трансплантатаПоверхность, о чем свидетельствует по минерализации направленный FLI (рис 4а); в то время как аллотрансплантатов индуцировать образование костной ткани дефицитный только на дефектных краями. Во-вторых, БЛИ остеокальцина-Luc мышей показали более остеогенной активности в аутотрансплантата группы, которая может быть объяснена наличием факторов роста, которые были удалены в процессе подготовки трансплантата (рис 4F). Интересно, минерализации костей было значительно выше в 6 дней и 7, когда гидроксиапатита, ориентированные зонд вводили, и дифференциация клеток представлена BLI деятельности была очевидна спустя, между 7-й день и День 10. Мы можем вывести из этого, что более обширные минерализации костей может быть, по крайней мере, частично объясняется благоприятной сосудистой, что характеризует аутологичных костной пластики.
Наши результаты показывают, что аутотрансплантата имеет превосходную способность остеогенной; Однако, надо учитывать, что аутогенная костная пластика имеет несколько DRAwbacks. Сбор костей ограничено в объеме и влечет за собой заболеваемость доноров сайта 14-16. Кроме того, частота аутокостью резорбции не является незначительным 17-19. Аллотрансплантаты весьма доступны и представить вне-полки решение для клинициста. Несколько работ продемонстрировали, как костно-интеграция черепных аллотрансплантатов может быть повышена с помощью других средств, начиная от покрытия аллотрансплантата с BMP2 кодирования аденоассоциированного вируса 20,21 адъювантной терапии, такие, как прерывистой терапии паращитовидной 22. В конце концов, когда-то способность аллотрансплантата о слиянии с костью до совершенства, Аллотрансплантат станет предпочтительным прививки материал.
В свете этих результатов, особый интерес лежит в вопросе, как модулировать образование новых сосудов в месте регенерации костной ткани. Прямая подход VEGF над-выражения были найдены неэффективными, так как образующие кровеносные сосуды неплотно и не образуют functiнальных чистая 23,24. Интересно, что было обнаружено, что сигнал ВМР приводит к трансдукции целевой формирования кровеносного сосуда 25,26. Кроме того, фармацевтические агенты 11 и клеточной терапии 27 Было показано, что ангиогенез изменить шаблоны на трансплантата костного близости; оба подхода, присутствующие перспективных стратегий для повышения черепной кости заживление дефекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5 mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20 ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3-sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| μCT40 scanner | Scanco | μCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
