Introduction
Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) kombinert med innlegget kolonne derivatisering (PCD) er et kraftig verktøy som er nyttig i å løse en rekke problemer i analyselaboratoriet. Den kan brukes for å påvise forbindelser som er ellers umulig å oppdage med suite av detektorer er tilgjengelige 1,2, øker signal av målanalytten, som tillater nedre grense for påvisning og kvantifisering 3-5 eller selektivt å derivatisere en målanalytt for å unngå matrix effekter 6. Vanlig anvendte PCD reaksjoner omfatter omsetningen av aminer, slik som aminosyrer, med orto-phthaladehyde 7-9, ninhydrin- 9,10 eller fluorescamin 11,12, derivatiseringen av reaktive oksygenarter (ROS) med 2,2-difenyl- 1-picrylhydrazil radikal (DPPH •) 13,14 eller 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) 15,16, og bruk av den jodid-azidet reagens for å derivatisere svovel containing forbindelser 17,18.
Det finnes imidlertid en rekke ulemper til bruk av PCD reaksjoner med HPLC-system 6. Prinsipielt Blant disse er bruk av reaksjonsspoler mellom punktet for tilsetning av derivatiseringen reagens (er) og detektoren, som tillater tid for blanding og at reaksjonen skal opptre 8. Disse reaksjonssløyfer ofte ha volumer av 500 ul eller mer, noe som er signifikant sammenlignet med volumet av resten av HPLC-systemet 19. Bruken av disse høyt volum reaksjonssløyfer resulterer i øket topputvidelse sammenlignet med hva som ville bli observert uten tilstedeværelse av reaksjonssløyfen. Dette resulterer i kortere, bredere topper som har høyere grenser for kvantifisering og deteksjon og negativt påvirker kromatografisk oppløsning. Figur 1 og 2 fremheve forringelse av topp form som følge av tillegg av ulike innlegg kolonne reaksjon sløyfevolumer. denne analysenble utført med en mobilfaseblanding av 94% metanol og 6% Milli-Q-vann. Strømningshastigheten av den mobile fase var 1 ml / min, injeksjonsvolumet var 20 ul og analysen bølgelengden var 265 nm. Sløyfer av varierende dødvolumer fra 20 ul til 1 000 ul ble satt inn mellom søylen og detektoren for å simulere effektene av reaksjonssløyfe dødvolum i PCD metoder. Disse løkkene ble fremstilt fra rør av rustfritt stål med 0,5 mm indre diameter. Forsøket ble utført på et HPLC-system bestående av en styreenhet (SCL-10AVP), en lav trykkgradient ventil (FCL-10ALVP), en pumpe (LC-20AD), en injektor (SIL-10ADVP), og en PDA detektor ( SPD-M10ADVP). Den mobile fase ble pumpet gjennom en avgasser før innføring i HPLC-systemet. Separasjonen ble utført ved anvendelse av en 250 mm x 4,6 mm id 5 um-kolonne. Forsøksbetingelser ble valgt til å være typisk for PCD reaksjoner som nylig har blitt publisert i litteraturen.
Deenkleste, er mest vanlig post kolonnereaktoren oppsett betegnet som et ikke-segmentert rør-reaktoren som er effektivt en lang, tynn slange hvorigjennom væsken kan strømme, og reaksjonen kan finne sted. I dette systemet topputvidelse er avhengig ikke bare dødvolumet tilsettes til systemet, men også den innvendige diameter av røret som fremhevet av Iijimas et al. 8. Videre spiller spiral geometri en del i den observerte merkevare utvidelse. Stewart 20 uttalt at kveiling av reaktoren endrer den sekundære strømningsprofiler, noe som resulterer i bedre blanding, noe som betyr at de døde volumet kan bli minimalisert. Det har blitt sagt at peak utvidelse ikke er vesentlig når du bruker en åpen rundstrikkede spole 21. Når toppen utvidelsen er overdrevent stor, kan andre typer av reaktorer også vurderes 20,22. Disse kan omfatte sjiktreaktorer eller segmenterte strømningsreaktorer. Disse reaktorene er spesielt nyttige for sakte reaksjoner som ellers ville require stor reaksjon looper. Som ikke-segmenterte rørformede reaktorer er de vanligste typer reaktorer som brukes i PCD programmer, resten av denne artikkelen omhandler denne type reaktor oppsett.
Utformingen av reaksjonsstrømmen (RF) kolonne omfatter en multi-port endebeslag som gjør det mulig for mobilfase for å avslutte (eller enter) kolonnen gjennom enten en enkelt port lokalisert ved den radielle midtområdet av kolonnen eller tre åpninger som ligger ved den ytre veggområdet av kolonnen (se figur 3). Disse to strømmer er adskilt ved hjelp av et endefeste inneholdende en sentral porøs fritte som er omgitt av en ugjennomtrengelig ring som i sin tur er omgitt av en ytre porøs fritte som strekker seg ut til kolonneveggen. På grunn av den sentrale ugjennomtrengelige ring cross flow ikke er mulig mellom de to porøse områder.
Under reaksjonen strømnings kromatografi, blir derivatiseringen reagensen (e) pumpes mot retningen av mobil fasestrøm inn i en eller two av de ytre portene i reaksjonsstrømnings kolonnen. kolonne elueringsmiddel det blandes med derivatiseringen reagens (er) i den ytre fritte og føres til detektoren gjennom en fri ytre port. Reaksjonen strømningen kan brukes til enten et enkelt reagens derivatisering (en port for derivatisering reagens, til en port passere kolonnen elueringsmiddel til detektoren, og en port blokkert) eller et dobbelt-reagens-system (2 porter for derivatiseringen reagenser og en port for å passere kolonnen elueringsmiddel til detektoren). Strømningen fra den sentrale strømmen kan enten brukes til å detektere underivatized kolonne elueringsmiddel, effektivt multipleksing deteksjon 23, eller føres til avfall.
En stor tuning teknikk som er tilgjengelig når det kjøres RF-PCD-kromatografi er forholdet mellom de sentrale og perifere strømmer. Det optimale forhold for hvert derivatisering avhenger av en rekke faktorer, for eksempel om den sentrale strømnings vil bli oppdaget eller føres til avfall. Derfor når det optimale forholdet er fastsatt, Bør det sørges for at den riktige strømningsforhold blir oppnådd før hvert forsøk blir utført.
Det er funnet at anvendelse av en fritte for å blande kolonne elueringsmiddel strømmen og derivatisering reagens i RF-PCD resulterer i mer effektiv blanding sammenlignet med tradisjonell blandeteknikker som vanligvis benytter en null dødvolum T-stykke eller lavt dødvolum W- stykke å blande de to bekker. Dette har tillatt for bruk av relativt små reaksjons løkker, eller til og med eliminering av reaksjonssløyfen helt. Reduksjonen av reaksjons sløyfe størrelse resulterer i skarpere topper sammenlignet med tradisjonelle post kolonne derivatiseringsreaksjoner metoder. Dette betyr at til tross for det faktum at ikke alle av kolonnen elueringsmiddel det er derivatisert, er bedre signal til støyforhold observert og derfor nedre grense for påvisning og kvantifisering kan oppnås.
Reaksjon flyt kromatografi er utviklet for å overvinne vanskelighetene med tilpasning av PCD reaksjons til moderne HPLC-kolonner og systemer, spesielt tap i effektivitet som følge av bandet utvide på grunn av store etterkolonne døde volumer som følge av behovet for å ansette stort volum reaksjon looper. De mer effektive blandeprosesser i RF-PCD sammenlignet med konvensjonelle PCD bety at mindre reaksjonsvolumer løkke kan anvendes som fører til en økning i observert separasjonseffektivitet. Videre RF-PCD kromatografi viser både økt signal og redusert støy i forhold til konvensjonelle PCD teknikker som resulterer i nedre grense for deteksjon og kvantifisering sammenlignet med konvensjonelle PCD metoder. En ytterligere fordel med RF-PCD sammenlignet med konvensjonelle PCD metoder er evnen til å overvåke underivatized strømmen som eluerer fra den sentrale porten på RF-kolonnen, så vel som den derivatiserte strømmen som eluerer fra det perifere området av kolonnen. RF-PCD er en relativt ny, men lovende teknikk som viser mange fordeler fremfor tradisjonelle PCD metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsiktig: Se sikkerhetsdatablad (HMS) for alle materialer og reagenser før bruk (dvs. datablad for metanol). Sørg for bruk av alle nødvendige sikkerhetsrutiner ved håndtering av løsemidler og High Performance Liquid Chromatography (HPLC) elueringsmiddel. Sørg for riktig bruk av tekniske kontroller av HPLC, analytisk balanse og detektor instrumentering, og sikre bruk av personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk, full lengde bukser og lukket-toe sko).
Merk: Denne protokollen beskriver 3 metoder for reaksjon flyt post-kolonne derivatisering (RF-PCD) teknikker, hver med en annen reagent spesifikke karakter av en kjemisk forbindelse av interesse. For analyse av ROS gå til avsnittet "1. Påvisning av ROS hjelp DPPH •", for analyse av primære aminer se avsnittet "2. Påvisning av primære aminer ved hjelp fluorescaminanalyse", og for analyse av fenoliske forbindelser gå til avsnittet "3 . Påvisning av fenolerved hjelp av fire-aminoantipyrene og kalium ferricyanide ". Bruk ultrarent vann (f.eks Milli-Q vann) hele.
Merk: Tilkobling av RF-kolonne oppnås i nesten samme måte som en konvensjonell HPLC-kolonne med den store forskjellen er antall endebeslag på en RF-kolonne. Anordninger som brukes for å koble til en standard HPLC kolonne for å HPLC-systemet er i stand til å bli brukt til å koble en RF-kolonne for å HPLC-systemet.
1. Påvisning av ROS Bruke DPPH •
- Sett opp av HPLC instrument
- Klargjør HPLC-instrument med 100% vann på linje A og 100% metanol på linje B som den mobile fase. Rens pumpene som per produsentens krav.
- Sett opp HPLC-instrumentelle komponenter og ytterligere derivatisering pumpen som er vist på figur 4A.
- Still UV-Vis detektor for å analysere ved en bølgelengde på 520 nm.
- Sett opp avRF kolonne
- Koble innløpet til RF-kolonnen til HPLC-instrumentet.
- Koble en 15 cm lengde på 0,13 mm id slangen til uttaket sentrale porten på RF-kolonnen.
- Koble en utløpsperiferi port til den UV-Vis-detektor ved bruk av en 15 cm lengde av 0,13 mm ID-røret.
- Koble DPPH • pumpeledningen til en perifer port på utløpet av RF-kolonnen.
- Blokkere den ubrukte ytre port på utløpet av RF-kolonne ved å bruke en kolonne propp.
- Bringe strømningshastigheten av HPLC-pumpe til en ml min -1 ved 100% etter linjen B - 100% Metanol.
- Ekvilibrere kolonnen med 100% metanol mobil fase i 10 minutter for en 4,6 mm ID x 100 mm lengde kolonne. Denne tid bør dimensjoneres i forhold til dimensjonene av andre kolonner kan brukeren benytter.
- Utarbeidelse av DPPH • reagens
- Forbered en 0,1 mg / ml løsning av DPPH • i metanol. Sonikere kolbe som inneholdt den DPPH • reagensen i 10 minutter.
- Dekk kolben i folie for å hindre eksponering for lys.
- Tømme DPPH • pumpen med forberedt DPPH • reagens i henhold til produsentens krav.
- Tuning RF kolonne uttaket
- Nøyaktig veie to rene og tørre fartøy. Merk ett fartøy som sentral, og den andre som perifer.
- Samle effluenten som kommer ut av den sentrale åpning inn i beholderen merket sentral for 1,0 min.
- Re-veie den sentrale port fartøyet og beregne vekten av strømningen fra den sentrale port som følger:
Vekt av Central Port (g) = sluttvekt på Central Port Vessel (g) - startvekt på Central Port Vessel (g) - Gjenta trinn 1.4.2 og 1.4.3 til avløpet som forlater UV-Vis som er festet til den perifere port av RF-kolonne og beregne vekten for den perifere port Beholderfølger:
Vekt av Peripheral Port (g) = sluttvekt på Peripheral Port Vessel (g) - startvekt på Peripheral Port Vessel (g) - Beregne hvor stor andel av strømmen som kommer fra de sentrale og perifere porter som følger:
% Central Port = Weight of Central Port (g) / (vekt av Central Port (g) + vekt av Peripheral Port (g)) x 100
% Perifer Port = Vekten Peripheral Port (g) / (vekt av Central Port (g) + vekt av Peripheral Port (g)) x 100 - Sørg for at segmentering forholdet mellom den sentrale flyt og det perifere flyten er 30:70 (central: perifert). Dersom den sentrale strømnings er over 30%, reduserer mengden av strømningen som kommer ut ved tilsetning av en lengde på 0,13 mm id røret til utløpet av den sentrale port. Dersom den sentrale strømnings er under 30% minske lengden på 0,13 mm slange fra den sentrale port.
- Gjenta trinn 1.4.1 til 1.4.6 til en segmentering forhold på 30:70 (central: perifert) er oppnådd.
- Angi strømningshastigheten for DPPH • reagent pumpe til 0,5 ml min -1.
Merk: RF kolonnen satt opp med DPPH • reagens er nå klar for analyse. Prøvene kan nå bli injisert.
- Innlegg kjøre shutdown vilkår
- Når alle prøvene har blitt injisert, noe som indikerer at kjøringen er ferdig, stoppe derivatiseringen reagenset pumpetrykk.
- Fjern det DPPH • reagensen pumpe linje fra den perifere port og proppen porten.
- Ekvilibrere kolonnen med den mobile fase hvor det skal lagres ved å la den mobile fasen for å passere gjennom kolonnen med 1 ml min-1 i 10 min.
- Stoppe strømmen av den mobile fase pumpen på HPLC-instrument.
- Bytt DPPH • reagens med metanol og rense den ekstra pumpe.
Merk: HPLC-systemet kan nå være nedleggelse.
2. Påvisning av primære aminer Bruke fluorescerendeamin
- Fremstilling av mobil fase
- Fremstille 1 liter av en 10 mM ammoniumacetat-oppløsning, justering av oppløsningens pH-verdi til 9,0 med 5 M ammoniumhydroksyd før fortynning til volum.
- Legg 52,6 ml acetonitril (ACN) i ammoniumacetatbuffer for å oppnå en forhåndsblandet mobil fase 95:05 (buffer: ACN).
- Sett opp av HPLC instrument
- Klargjør HPLC-instrumentet med forblandet klare buffer på linje A som den mobile fase. Rens pumpen som per produsentens krav.
- Sett opp HPLC-instrumentelle komponenter og ytterligere derivatisering pumpen som er vist på figur 4A.
- Fest en pulsdemper spolen til derivatisering pumpen.
- Sette opp fluorescensdetektor (FLD) med en eksitasjonsbølgelengde på 390 nm og emisjonsbølgelengde på 475 nm.
- Sett opp av RF kolonne
- koble the innløp av RF-kolonnen til HPLC-instrumentet.
- Koble en 15 cm lengde på 0,13 mm id slangen til uttaket sentrale porten på RF-kolonnen.
- Koble en utløpsperiferi port av RF-kolonnen til FLD detektoren ved bruk av en 15 cm lengde av 0,13 mm ID-røret.
- Koble derivatisering pumpeledningen til en perifer port på utløpet av RF-kolonnen.
- Blokkere den ubrukte ytre port på utløpet av RF-kolonne ved å bruke en kolonne propp.
- Bringe strømningshastigheten av HPLC-pumpe til en ml min -1 ved 100% linje A - 10 mM ammoniumacetatbuffer pH 9, forblandet med 5% ACN.
- Ekvilibrere kolonnen med 100% mobilfase A linje i 10 minutter for en 4,6 mm ID x 100 mm lengde kolonne. Denne tid kan dimensjoneres i forhold til dimensjonene av andre kolonner kan brukeren benytter.
- Utarbeidelse av fluorescaminanalyse reagens
- Lag 100 ml av en 0,1 mg ml -1 fluorescamin reagens. <li> sonikere i 1 min.
- Dekk med folie for å hindre eksponering for lys.
- Rens reagenset pumpen med forberedt fluorescaminanalyse reagens i henhold til produsentens krav.
- Nøyaktig veie to rene og tørre fartøy. Merk ett fartøy som sentral, og den andre som perifer.
- Samle effluenten som kommer ut av den sentrale åpning inn i beholderen merket sentral for 1,0 min.
- Re-veie den sentrale fartøyet og beregne vekten av strømningen fra den sentrale port som følger i trinn 1.4.3.
- Gjenta trinn 2.5.2 til 2.5.3 for avløpet som forlater FLD som er festet til den perifere port av RF-kolonne og beregne vekten for perifer som følger i trinn 1.4.4.
- Beregn prosentandel av strømmen kommer fra de sentrale og perifere porter som følger i trinn 1.4.5.
- Sikre segmenter forholdet mellom den sentrale strømnings og den perifereflyt er 43:57 (central: perifert). Dersom den sentrale strømnings er over 43%, reduserer mengden av strømningen som kommer ut ved tilsetning av en lengde på 0,13 mm id røret til utløpet av den sentrale port. Dersom den sentrale strømnings er under 43%, redusere lengden av 0,13 mm slange fra den sentrale port.
- Gjenta trinn 2.5.1 til 2.5.6 til en segmentering forhold på 43:57 (central: perifert) er oppnådd.
- Angi strømningshastigheten for den mobile fase pumpen til 0,7 ml min-1.
- Still derivatisering pumpen til å flyte ved 0,1 ml min-1.
Merk: RF kolonnen satt opp med fluorescamin reagens er nå klar for analyse. Prøvene kan nå bli injisert.
- Når alle prøvene har blitt injisert, noe som indikerer at kjøringen er ferdig, stoppe pumpen derivatisering.
- Fjern derivatiseringen pumpeledningen fra den perifere port og stopperen.
- Ekvilibrere kolonnen med den mobile fasen isom den skal lagres ved å la den mobile fasen for å passere gjennom kolonnen med 1 ml min-1 i 10 min.
- Stoppe strømmen av den mobile fasen pumpen.
- Bytt fluorescaminanalyse reagens med acetonitril og rense derivatisering pumpen.
Merk: HPLC-systemet kan nå være nedleggelse.
3. Påvisning av Fenoler Bruke 4-Aminoantipyrene og Kalium Ferricyanide
- Fremstilling av mobil fase
- Fremstille 1 liter av en 100 mM ammoniumacetat-oppløsning, justering av oppløsningens pH-verdi til 9,0 med 5 M ammoniumhydroksyd før fortynning til volum.
- Legg 52,6 ml metanol til den ammoniumacetatbuffer for å oppnå en forhåndsblandet mobil fase av 95: 5 (buffer: metanol).
- Sett opp av HPLC instrument
- Klargjør HPLC-instrumentet med forblandet klare buffer på linje A som den mobile fase. Rens pumpen som per produsentens; S krav.
- Sett opp HPLC-instrumentelle komponenter og de to ekstra reagens-pumper som er vist på figur 4B.
- Fest en pulsdemper spole til hver av de reagens-pumpene.
- Still UV-Vis detektor for å analysere ved en bølgelengde på 500 nm.
- Sett opp av RF kolonne
- Koble innløpet til RF-kolonnen til HPLC-instrumentet.
- Koble en 15 cm lengde på 0,13 mm id slangen til uttaket sentrale porten på RF-kolonnen.
- Koble en utløpsperiferi port av RF-kolonnen til UV-Vis-detektor ved bruk av en 15 cm lengde av 0,13 mm ID-røret.
- Koble hver reagens (dvs. 4-aminoantipyrene og kaliumferricyanid) pumpe linje til en perifer port på utløpet av RF-kolonnen.
- Bringe strømningshastigheten av HPLC-pumpe til en ml min -1 ved 100% linje A - 100 mM ammoniumacetatbuffer pH 9, forblandet med 5% metanol.
- Balanser konsollen wed 100% etter linjen A mobilfase i 10 minutter for en 4,6 mm ID x 100 mm lengde kolonne. Denne tid kan dimensjoneres i forhold til dimensjonene av andre kolonner kan brukeren benytter.
- Fremstilling av 4-aminoantipyrene reagens
- Fremstille en ammoniumacetat-buffer med en pH-verdi på 9 ved å følge trinn 3.1.1.
- Veie 150 mg 4-aminoantipyrene og oppløses i 100 ml klare ammoniumacetat-buffer (pH 9).
- Sonikere i 1 min.
- Dekk med folie for å hindre eksponering for lys.
- Rens den første reagent pumpen med forberedt 4-aminoantipyrene reagens i henhold til produsentens krav.
- Utarbeidelse av kaliumferricyanid reagens
- Veier 150 mg kalium-ferricyanid og oppløses i 100 ml ammonium-acetat-buffer (pH 9) fremstilt i henhold til trinn 3.1.1.
- Sonikere i 1 min.
- Dekk med folie for å hindre eksponering for lys.
- Purge den andre reagent pumpen med forberedt kaliumferricyanid reagens i henhold til produsentens krav.
- Tuning av RF kolonne
- Nøyaktig veie to rene og tørre fartøy. Merk ett fartøy som sentral, og den andre som perifer.
- Samle effluenten som kommer ut av den sentrale åpning inn i beholderen merket sentral for 1,0 min.
- Re-veie den sentrale fartøyet og beregne vekten av strømningen fra den sentrale port som følger i trinn 1.4.3.
- Gjenta trinn 3.6.2 til 3.6.3 for avløpet som forlater UV-Vis som er festet til den perifere port av RF-kolonne og beregne vekten for perifer som følger i trinn 1.4.4.
- Beregn prosentandel av strømmen kommer fra de sentrale og perifere porter som følger i trinn 1.4.5.
- Sørg for at segmentering forholdet mellom den sentrale flyt og det perifere flyten er 50:50 (central: perifert). Dersom den sentrale strømnings er over 50%, redusereMengden av strømning som kommer ut ved tilsetning av en lengde på 0,13 mm id slangen til uttaket sentrale port. Dersom den sentrale strømnings er under 50%, redusere lengden av 0,13 mm slange fra den sentrale port.
- Gjenta trinn 3.6.1 til 3.6.6 til en segmentering forhold på 50:50 (central: perifert) er oppnådd.
- Angi strømningshastigheten for den 4-aminoantipyrene pumpe til 0,5 ml min-1.
- Angi strømningshastigheten av kaliumferricyanid pumpen til 0,25 ml min-1.
Merk: RF kolonnen satt opp med to-komponent-reagenser er nå klar for analyse. Prøvene kan nå bli injisert.
- Innlegg kjøre shutdown vilkår
- Når alle prøvene har blitt injisert rømmen er ferdig, noe som indikerer at kjøringen er ferdig, stoppe begge de reagens-pumpene.
- Fjern reagens pumpeledninger fra de perifere porter og erstatte dem med en 15 cm stykke 0,13 mm rør.
- Ekvilibrere kolonnen med den mobile fasen i WHIch det er å bli lagret ved å la den mobile fasen for å passere gjennom kolonnen med 1 ml min-1 i 10 min.
- Stoppe strømmen av den mobile fase pumpen på HPLC-instrument.
- Bytt begge reagensene på reagent pumper med metanol og rense de ekstra pumper som per produsent kravet.
Merk: HPLC-systemet kan nå være nedleggelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den første PCD metode som ble tilpasset for bruk av RF-PCD var den derivatisering av antioksidanter ved hjelp av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil radikal (DPPH •) 24. Denne reaksjonen ble introdusert av Koleva et al., 25 og har vært mye brukt siden. Påvisnings avhengig av avfarging av DPPH • radikal, i nærvær av reaktive oksygenforbindelser, derav nærvær av antioksidanter resulterer i et fall i den observerte absorbans. Den DPPH • Reaksjons ofte anvender store reaksjons løkker av 500 ul eller mer 13-15, men det ble funnet at ved bruk av RF-PCD kolonne ingen reaksjon sløyfe var nødvendig. Figur 5 viser to kromatogrammer av en prøve av Ristretto kaffe derivatiserte hjelp av DPPH • radikal med både konvensjonell PCD og RF-PCD instrumentering.
Den andre PCD metode som har blitt tilpasset for bruk av RF-PCD er det derivatization av fire aminosyrer (glycin, leucin, fenylalanin tryptofan) ved anvendelse av fluorescamin som derivatiseringen reagens 23. Metoden ble tilpasset fra arbeidet ved Udenfriend et al., 11 med den mobile fase sammensetning, fluorescamin konsentrasjon og fluorescamin strømningshastighet optimalisert for bruk med RF-kolonner. Den konvensjonelle metoden benyttet en to-reagens derivatisering system hvor pH 9,0-buffer ble tilsatt til avløpsstrømmen før tilsetning av fluorescamin reagens, mens RF-PCD-metoden benyttet en mobil fase som allerede er bufret, og dermed bare en enkelt reagens derivatisering system var nødvendig. For denne anvendelse av derivatisert strømmen ble analysert ved 390 nm ved hjelp av et UV-synlig detektor, som svarer til eksitasjonsbølgelengden som brukes for deteksjon av fluorescens. Den derivatiserte strømmen kunne detekteres ved anvendelse av en fluorescens-detektor, som gir bedre signal-til-støy og dermed lavere påvisningsgrenser og Quant-utfelling, som per arbeidet ved Udenfriend et al. 11. Videre ble det elueringsmiddel som kommer fra den sentrale porten på RF-PCD oppsett overvåket ved bruk av en andre UV-synlig detektor.
Ytelsen til RF-PCD fremgangsmåte for derivatisering av aminosyrer ble sammenlignet med den konvensjonelle PCD-metoden. Tabell 1 viser de beregnede grenser for kvantifisering og påvisning for hver av aminosyrene ble analysert i begge RF-PCD og konvensjonelle PCD-modi. Deteksjonsgrensen ble definert til å være den konsentrasjon hvor et signal til støyforhold på 2, ble oppnådd under grensen for kvantifisering ble definert til å være den konsentrasjon hvor et signal til støy-forhold på 10 ble oppnådd. Figur 6 viser et kromatogram av de fire aminosyrene analyseres ved hjelp av den konvensjonelle metode PCD, RF-PCD-metoden og den underivatized strømmen fra RF-PCD-metoden. Figur 7 er en sammenligning av de signaler som oppnås for den peaks på grunn av glycin og leucin ved bruk av både konvensjonelle PCD-metoden og den RF-PCD-metoden. Figur 8 sammenligner toppbredden av tryptofan-peak ved analyse ved hjelp av den konvensjonelle metode PCD, RF-PCD-metoden og den underivatized strømmen fra RF- PCD-metoden.
Den endelige PCD metode som har blitt tilpasset for bruk av RF-PCD 26 er derivatisering av fire fenoler (fenol, 4-metoksyfenol, p-kresol og tokoferol). Metoden ble tilpasset fra arbeid med Bigley og Grob 27 med mindre endringer for å optimalisere fremgangsmåten for bruk sammen med RF-kolonner. Dette arbeidet anvendes en to-komponent derivatisering reaksjon hvor oppløsninger av både 4-amionantiprine og kaliumferricyanid ble tilsatt til kolonnen elueringsmiddel det ved enden montering av RF-kolonnen. Det ble funnet at når man bruker en RF-kolonne for reaksjonen uten ytterligere etterkolonnereaksjons løkker som trengs for å bli brukt. Figur 9 viser et eksempel på et kromatogram deren 21-komponent testprøve som inneholdt noen komponenter som viser en respons på derivatiseringen ordningen og noen som ikke ble separert, derivatisert og detektert (svart kurve). Den samme blanding ble også separert og detektert underivatized for sammenligning (rød kurve). I figur 9 RF-PCD respons er vist som en negativ reaksjon for enklere visuelle forskjellen (detektorresponsen oppnådd var positiv). Figur 10 viser en sammenligning av toppen form av p-kresol både derivatisert ved hjelp av RF-PCD-kolonne og underivatized.
Figur 1. Kromatografisk overlapping av heksylbenzen injisert på en HPLC-system med forskjellige dødvolumer lagt mellom stammen og detektoren. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kromatografiske overlegg toluen, etylbenzen og propylbenzene injisert på et HPLC system med ulike døde volumer lagt mellom stammen og detektoren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Illustrasjon av Reaction Flow kolonne design. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
tp_upload / 53462 / 53462fig4.jpg "/>
Figur 4. Instrumental satt opp av RF-PCD. (A) enkelt reagens (dvs. DPPH • eller fluorescaminrapportørgrupper derivatiseringsreaksjoner reagenser) og (B) dual reagens (dvs. 4-aminoantipyrene og kalium ferricyanide derivatiseringsreaksjoner reagenser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Kromatogrammer av separasjon av Ristretto kaffe med deteksjon etter post-kolonne derivatisering ved bruk av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil radikal (DPPH •). Derivatiseringen ble utført ved anvendelse av en konvensjonell kolonne med en 500 ul reaksjon pole (A) og en reaksjonsstrømningskolonne (B rong>). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Kromatografisk overlapping av fire aminosyrer (glycin (G), leucin (L), fenylalanin (P) og tryptofan (T)) over området fra 10 til 1000 ppm detektert av post-kolonne derivatisering ved bruk av fluorescamin som en PCD reagens etter separasjon ved HPLC. Kromatogrammene er som følger: (A) konvensjonell PCD, (B) RF-PCD, og (C) sentral (underivatized) port fra RF-PCD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
_upload / 53462 / 53462fig7.jpg "/>
Figur 7. Sammenligning av de signaler som oppnås for glysin (første topp) og leucin (andre peak) fra konvensjonell PCD (rød kurve) og RF-PCD (svart kurve). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Peak bredde sammenligning av toppen på grunn av tryptofan basert på (A) retensjonstid og (B) topp volum. Den svarte trase viser den konvensjonelle PCD metode, viser det røde spor RF-PCD-metoden og den grønne kurven viser underivatized stream fra den sentrale porten på RF-PCD-metoden. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Kromatografisk separering av en kunstig prøven. Komponentene omfatter fenol (P), 4-metoksyfenol (M), p-kresol (C) og tokoferol (T) samt en rekke alkylbenzener, polynukleære aromatiske hydrokarboner, anisol, phentanole, koffein, fenylalanin og benzamide. Toppene merket I, II og III er alkylbenzener som uventet svart på derivatisering ordningen. Den svarte trase representerer underivatized responsen ved bruk av en UV-detektor ved 254 nm, mens det røde trase representerer den derivatiserte responsen ved 500 nm. Merknad for visuell klarhet derivatisert svar er invertert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
![Figur 10]("/files/ftp_upload/53462/53462fig10.jpg")
Figur 10. Kromatografiske respons p-kresol. Den svarte spor representerer underivatized respons ved bruk av en UV-detektor ved 254 nm, mens den røde spor representerer derivatiserte (RF-PCD) respons ved 500 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| reaksjonstype | glysin | leucin | fenylalanin | tryptofan | ||||
| LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | |
| RF-PCD | 6 | 25 | 10 | 100 | 25 | 250 | 50 | 250 |
| RF-PCD sentral port (underivatized) | Ikke funnet | Ikke funnet | Ikke funnet | 1 | 10 | |||
| konvensjonell PCD | 10 | 100 | 50 | 500 | 50 | 500 | 100 | 500 |
Tabell 1. Grenseverdier for påvisning og kvantifisering av fire forskjellige aminosyrer som oppdages av ulike post kolonne derivatiseringsreaksjoner systemer som bruker fluorescaminanalyse som derivatisering reagens etter separasjon ved HPLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RF-PCD gir mulighet for effektiv blanding av derivatiseringen reagens med HPLC avløpet post-kolonne uten bruk av reaksjonsspoler, minimere effekten av båndet bredere og bedre ytelse ved separering. RF-PCD fremgangsmåter har også vist forbedringer i signalrespons med hensyn til påvisningsmetoden. Camenzuli et al. 28 var den første til å rapportere bruken av reaksjonen strømnings kolonner med DPPH • for deteksjon av ROS i en espresso prøve. Deres studie involverte analyse og optimalisering av RF betingelser for å oppnå maksimal ytelse, teste et utvalg av DPPH • konsentrasjoner med ulike DPPH • reagent strømningsrater. Det ble konkludert med at en DPPH • konsentrasjon på 0,1 mg ml -1 med DPPH • reagens strømningshastighet på 0,5 ml min-1 var optimale for en forbedret separasjon ytelse (dvs. effektivitet og følsomhet) under RF-PCDforhold sammenlignet med den konvensjonelle metoden for PCD DPPH • derivatdannelse. Figur 5 viser to kromatogrammer som anvender DPPH • analysen av antioksidanter i en espressoprøve. Spesielt interessante er de høye intensitetstopper med retensjonstider på ca 5 min. Det kan sees at ved bruk av en 500 ul reaksjon løkke, som er typisk for tradisjonelle DPPH • derivatiseringsreaksjoner metoder, kan en enkelt, bred topp observeres. Når imidlertid RF-PCD metoden brukes uten behov for en reaksjonssløyfe, blir det klart at den enkelt topp observert ved anvendelse av en 500 pl sløyfe er i virkeligheten to topper. Videre kan flere detaljer ses etter 5,5 min ved bruk av RF-PCD oppsett. Således, for analyse av ROS i prøver ved hjelp av DPPH •, teknikken for RF-PCD vist seg å være overlegne i forhold til de konvensjonelle metoder for ROS-analyse ved bruk av DPPH •.
RF-PCD medfluorescamin reagens har blitt brukt for analyse av primære aminosyrer og sammenlignet med de konvensjonelle former for PCD med fluorescamin 20. Siden RF-kolonnen ende-fitting også tilveiebrakt en plattform for multiplekset deteksjons ble underivatized sentrale strømnings overvåket via UV-Vis, mens den derivatisering mellom avløpet og fluorescamin ble foretatt i det ytre området av RF-ende-fitting og detektert via UV- Vis. En serie av teststandarder som inneholder fire aminosyrer ble analysert under multipleksede RF-PCD betingelser. Figur 6 sammenligner den kromatografiske profilen for den konvensjonelle metoden for PCD (figur 6A) og RF-PCD (påvisning av derivatisert (figur 6B) og underivatized (figur 6C)) av serien av aminosyrer. Figur 7 er en overlapping av to aminosyrer signaler som oppnås gjennom konvensjonelle PCD og RF-PCD. Det kan sees at jo mer effektiv observerte separering på grunn av than fjernelse av reaksjonssløyfen har ført til større signal reaksjon, til tross for det faktum at ikke alle av kolonneeffluenten ble derivatisert. Videre er den mer effektiv derivatiseringen reagens blandeordning resulterte i lavere referansestøy, noe som ytterligere øker signal-til-støy-forholdet. Denne effekten er båret ut i de nedre grensene for påvisning og kvantifisering beregnet for RF-PCD-metoden sammenlignet med den konvensjonelle PCD-metoden i tabell 1. Kan denne trenden også fremgår av figur 5, hvor antioksydant-responsen på DPPH • er større for RF-PCD-metoden sammenlignet med den konvensjonelle metode PCD. Betydelig forringelse topp kan observeres i kromatogrammene, hvor en konvensjonell PCD oppstillingen ble anvendt som fører til den nedre signalresponsen ved denne metode.
Figur 8 sammenligner toppen profilen av tryptofan når analysert ved hjelp av RF-PCD (begge derivatiserte og underivatized strømmene) og konvensjonelle PCD. Når peak profilen er plottet mot tiden peak bredder alt ser ut til å være stort sett det samme (figur 8A). Forbedringene som finnes i RF-PCD sammenlignet med konvensjonell PCD er åpenbare når toppen profilen er plottet mot topp volum (figur 8B). Når plottet mot topp volum, er det klart at mens RF-PCD peak viser en liten mengde degradering i forhold til underivatized topp, nedbrytning, men er minimal i forhold til det som ble observert fra den konvensjonelle metode PCD. Forbedringene i separasjonseffektivitet av RF-PCD sammenlignet med konvensjonelle PCD er også vist i figur 7 som sammenligner de mest aktive former av glycin og leucin etter derivatisering av både konvensjonelle PCD og RF-PCD. Det kan sees at i konvensjonelle PCD-modus glycin og leucin-toppene er knapt baseline separert mens i RF-PCD-modus signalet er ved utgangspunktet for en mye lengre periode mellom de to topper.
enytterligere fordel ved RF-PCD sammenlignet med konvensjonelle PCD metoder er evnen til å overvåke underivatized avløpet fra den sentrale porten på RF-kolonne muliggjør multiplekset deteksjons. Dette er mulig som utformingen av fritten innenfor RF-endestykket ikke tillater strømningen i den radielle sentrale område for å blande seg med strømmen i det perifere området av endestykket, og dermed muliggjør overvåking av derivatisert strømmen fra det ytre området av beslaget samt overvåkning av underivatized strømmen fra den sentrale port. Denne evnen er markert med resultatene oppnådd for tryptofan i tabell 1, som er kjent for å ha dårlig signal respons etter derivatisering med fluorescamin 20, men i motsetning til de andre aminosyrene det viser en reaksjon på en UV-detektor ved underivatized (ved 280 nm) . For begge derivatiseringsreaksjoner systemer grensene for påvisning og kvantifisering var relativt høy, men grensene for påvisning og kvantifisering var mye lavere for than underivatized stream. Ved hjelp av muligheten til å overvåke både derivatiserte og underivatized avløpsstrømmer deteksjonsparametere kan bli optimalisert for å gi størst mulig ytelse for hver aminosyre.
Den multi Utformingen av RF ende montering gjør det mulig for dual derivatisering reagens analyse. Selim et al. 23 undersøkte resultatene for to reagenser (4-aminoantipyrene og kalium-ferricyanid) ved hjelp av RF-PCD betingelser for analyse av fenoliske forbindelser sammenlignet med den konvensjonelle teknikk av PCD ved anvendelse av 4-aminoantipyrene og kaliumferricyanid. Denne type PCD teknikk krever to pumper og reaksjonssløyfer for hver derivatisering reagens i motsetning til en pumpe og reaksjonssløyfen for DPPH •. Ulike fenoliske og alkylbenzen forbindelser ble analysert under konvensjonelle og RF PCD forhold. Interessant, ikke-fenoliske forbindelser som ikke ble oppdaget i henhold til den konvensjonelle metode ble faktisk oppdaget under RF-PCD betingelser. Figur 9 viser UV-Vis kromatografisk respons og den RF-PCD kolorimetrisk respons på en standard test blanding. RF-PCD gitt en forenklet PCD teknikk i form av instrumentering, uten kompromiss av separasjon ytelse som observert i figur 10. Figur 10 sammen toppen profilen til p-kresol ved analyse ved RF-PCD og også uten derivatisering. Det kan sees at toppbredden av RF-PCD-kromatogram er meget lik den for den underivatized kromatogram. Den største forskjellen mellom de to kromatogrammene er at RF-PCD-kromatogram er noe bredere ved roten. Dette viser at det er liten eller ingen topp dispersjon på grunn av den RF-PCD teknikk. En lignende respons ble observert i figur 9 som viser at det ikke bare er den p-kresol toppen som har lignende toppens bredde når derivatisert med RF-PCD i forhold til sin underivatized topp, men alle fenoler og alkylbenzenes som svarte på derivatisering ordningen viste samme trend. Selv om RF-PCD med bruk av to derivatiseringsreaksjoner reagenser oppnås en lignende separasjonsevne til de konvensjonelle ikke-derivatisering metode, RF-PCD er tillatt for selektiv deteksjon av fenoliske forbindelser, hvorav den ene som ikke ble detektert under ikke-derivatiserte betingelser .
Ettersom RF-PCD er en utvikling av konvensjonelle HPLC-PCD metoder, er alle de tuning verktøy som er tilgjengelige i alminnelige HPLC-metoder så som mobile fasesammensetning og strømningshastighet, injeksjonsvolum og analyse bølgelengde er anvendelig til RF-PCD metoder. Videre tuning verktøy som er tilgjengelig i konvensjonelle HPLC-PCD metoder, slik som den mobile fasen til PCD-reagens strømningsmengde-forholdet, så vel som PCD-reagenssammensetningen er anvendelig til RF-PCD metoder. En ekstra tuning verktøyet tilgjengelig når du bruker RF-PCD som ikke er tilgjengelig i konvensjonelle PCD metoder er forholdet mellom strømmene som kommer fra det sentrale og perifereporter av kolonnen. Strømmene blir styrt ved å endre den relative mottrykk på hver av linjene ved regulering av lengden og / eller indre diameter av innlegget detektor (eller post-kolonne hvis strømmen som kommer fra den sentrale porten ikke blir detektert) røret. Det optimale forholdet mellom den sentrale til perifere strømmer er avhengig av den aktuelle reaksjon, så vel som andre faktorer, slik som hvorvidt den sentrale port blir detektert eller ikke. En strøm andel på 60% perifer og 40% sentrale er ofte et godt utgangspunkt.
Som med justeringsparametere, mange av de problemer som kan oppstå ved bruk av RF-PCD kolonne er også vanlig med konvensjonelle metoder PCD. En spesiell parameter som den chromatographer må være oppmerksom på ved utførelse av RF-PCD-analyser er stabiliteten av strømningen og trykket i systemet, særlig det av reagenset pumpen (e). Hvis strømningen i systemet ikke er stabilt, kan det føre til at referanse ustabilitet derfor reduseresignal til støyforhold og senere grensene for kvantifisering og gjenkjenning.
RF-PCD-kromatografi har blitt utviklet for å overvinne vanskelighetene med å tilpasse PCD reaksjoner til moderne HPLC kolonne og systemer. Den store fordelen med RF-PCD, sammenlignet med konvensjonelle fremgangsmåter PCD er mer effektiv blanding på grunn av det som finner sted inne i en fritte innenfor endestykket av RF-kolonne, og denne blanding er på et litt høyere mottrykk. Dette gjør det mulig å minimalisere eller til og med eliminering av de store volum reaksjonssløyfer som er brukt i mange konvensjonelle metoder PCD. Med denne minimering av post kolonne dødt volum, mer effektive separasjoner med større kromatografisk oppløsning utføres.
RF-PCD-modus har resultert i forbedringer i separasjonseffektivitet, peak form og signal til støy forhold til konvensjonelle PCD metoder. Det er imidlertid viktig å merke seg at signal forbedringer detektor avhengig. For eksempel detektorerat prøven mengde avhengig kanskje ikke oppvise en økning i signalrespons i henhold til RF-PCD forhold sammenlignet med konvensjonelle metoder. Dette er slik fordi i henhold til konvensjonelle metoder som 100% av den kolonne prøve detekteres, der henhold til RF-PCD betingelser bare en viss prosent av den på kolonnen prøven blir detektert, avhengig av segmenterforholdet. Det er imidlertid forventet at RF-PCD reaksjoner vil være i stand til å bli tilpasset til en hvilken som helst ett eller to-reagens (så lenge begge reagensene blir tilsatt samtidig) PCD omsetning med minimal gjen optimalisering og at fordelene observert for alle tre reaksjoner så langt testet vil oversette til alle andre PCD reaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
| Additional Pump(s) for derivatization system | Shimadzu | LC-20A | |
| RF colum | Non-commercial | ||
| PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
| Column stoppers | Provided with column | ||
| PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
| Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
| Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
| Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials | ||
| HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
| Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
| General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method. | ||
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
| Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
| 4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
| Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |
References
- Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
- Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
- Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
- Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
- Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
- Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
- Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
- Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
- Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
- Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
- Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
- Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
- Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
- Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
- Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
- Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
- Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
- Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
- Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
- Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
- Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
- Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
- Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
