Introduction
Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) i kombination med efterkolonn derivatisering (PCD) är ett kraftfullt verktyg som är användbar för att lösa ett antal frågor i analyslaboratoriet. Det kan användas för att detektera föreningar som annars är omöjlig att upptäcka med suite av detektorer tillgängliga 1,2, öka signal av målanalyten, som tillåter lägre gränser för detektering och kvantifiering 3-5 eller selektivt derivatisera en målanalyt i syfte att undvika matriseffekter 6. Vanligen använda PCD reaktioner innefattar reaktionen av aminer, såsom aminosyror, med orto-phthaladehyde 7-9, ninhydrin 9,10 eller fluorescamin 11,12, derivatiseringen av reaktiva syreradikaler (ROS) med 2,2-difenyl- 1-picrylhydrazil radikala (DPPH •) 13,14 eller 2,2'-azino-bis (3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra (ABTS) 15,16, och användningen av jodiden-azid-reagens för att derivatisera svavel containing föreningar 17,18.
Det finns emellertid flera nackdelar med användningen av PCD-reaktioner med HPLC-system 6. Huvudsakligen bland dessa är användningen av reaktionsspolar mellan punkten för tillsats av derivatisering reagens (er) och detektorn, vilket medger tid för blandning och att reaktionen ska ske 8. Dessa reaktion slingor ofta har volymer av 500 l eller mer, vilket är signifikant jämfört med volymen av resten av HPLC-systemet 19. Användningen av dessa stora volymer reaktions slingor resulterar i ökad toppbreddning jämfört med vad som skulle observeras utan närvaro av reaktionsslingan. Detta resulterar i kortare, bredare toppar som har högre gränser för kvantifiering och detektion och negativt påverkar kromatografiska upplösning. Figurerna 1 och 2 belysa försämringen av topp form som resulterar från tillsatsen av olika postkolonnreaktion loop volymer. denna analysutfördes med en mobil fas sammansättning 94% metanol och 6% Milli-Q-vatten. Flödeshastigheten för den mobila fasen var 1 ml / min, injektionsvolymen var 20 | il och analysen våglängden var 265 nm. Spolar av varierande dödvolymer från 20 ^ till 1000 pl infördes mellan kolonnen och detektorn för att simulera effekterna av reaktionsslinga dödvolym i PCD metoder. Dessa slingor framställdes från slang av rostfritt stål på 0,5 mm innerdiameter. Experimentet utfördes på en HPLC-system bestående av en styrenhet (SCL-10AVP), en Low Pressure Gradient Ventil (FCL-10ALVP), en pump (LC-20AD), en injektor (SIL-10ADVP), och en PDA-detektor ( SPD-M10ADVP). Den mobila fasen pumpades genom en avgas före införandet i HPLC-systemet. Separationen utfördes med användning av en 250 mm x 4,6 mm id 5 ^ m kolonn. Experimentella betingelser valdes för att vara typiska för PCD reaktioner som nyligen har publicerats i litteraturen.
Deenklaste, är vanligast efterkolonnreaktor inställnings benämns en icke-segmenterad rörformig reaktor, som är effektivt en lång, tunn slang genom vilken vätskan kan strömma och reaktionen kan äga rum. I detta system toppbreddning är beroende av inte bara den döda volymen sattes till systemet, utan också den inre diametern hos röret som belysts av Iijima et al. 8. Dessutom spelar spole geometri en del i den observerade varumärkesbreddning. Stewart 20 uppgav att linda av reaktorn ändrar de sekundära flödesprofiler, vilket resulterar i bättre blandning, vilket innebär att dödvolymen kan minimeras. Det har sagts att toppbreddning är inte signifikant vid användning av en öppen rundstickad spolen 21. När toppbreddning är överdrivet stor, kan andra typer av reaktorer också övervägas 20,22. Dessa kan inkludera bäddsreaktorer eller segmenterade flödesreaktorer. Dessa reaktorer är särskilt användbara för långsamma reaktioner som annars require stor reaktion loopar. Som icke-segmenterade rörformiga reaktorer är de vanligaste typerna av reaktorer som används i PCD-program, resten av denna artikel handlar om denna typ av reaktor setup.
Utformningen av kolonnen reaktionsflödet (RF) innefattar ett med flera portar ändbeslag som tillåter mobil fas för att avsluta (eller enter) kolonnen genom antingen en enda port placerad vid den radiella mittområdet av kolonnen eller tre portar belägna vid den yttre väggområde av kolonnen (se figur 3). Dessa två strömmar är separerade med användning av en ändanslutning som innehåller en central porös fritta som är omgiven av ett ogenomträngligt ring som är i sin tur omgiven av en yttre porös fritta, som sträcker sig ut till kolonnväggen. Tack vare det centrala ogenomträngliga ringen tvärflöde är inte möjlig mellan de två porösa regioner.
Under reaktionsflödes kromatografi är derivatiseringen reagens (s) pumpas mot riktningen för mobilflödes fas i en eller two av de yttre hamnar i kolumn reaktionsflödet. Kolonneluenten blandas med derivatisering reagens (er) i den yttre fritta och ledes till detektorn genom en fri ytterport. Reaktionsflödes kan användas för antingen en enda reagens derivatisering (en port för derivatisering reagens, till en port passera kolonnen elueringsmedel till detektorn och en port blockerade) eller ett dubbelt reagenssystem (2 portar för derivatiseringen reagens och en port för att passera kolonnen elueringsmedel till detektorn). Flödet från den centrala strömmen kan antingen användas för att detektera oderivatiserade Kolonneluenten effektivt multiplexering upptäckt 23, eller gått till spillo.
En stor tuning teknik som är tillgänglig när du kör RF-PCD kromatografi är förhållandet mellan de centrala och perifera flöden. Det optimala förhållandet för varje derivatisering beror på ett antal faktorer såsom huruvida centralflödet kommer att upptäckas eller gått till spillo. Därför när det optimala förhållandet har bestämts, Bör man se till att rätt flödesförhållandet uppnås före varje körning utförs.
Det har visat sig att användning av en fritta för att blanda Kolonneluenten strömmen och derivatisering reagens i RF-PCD resulterar i mer effektiv blandning jämfört med traditionella blandningsmetoder som typiskt använder en noll dödvolym T-stycke eller låg dödvolym W- bit för att blanda de två strömmarna. Detta har gjort för användning av relativt små reaktions loopar, eller till och med eliminering av reaktionsslingan helt och hållet. Reduktionen av reaktionsslinga storlek resulterar i skarpare toppar jämfört med traditionella postkolonn derivatisering metoder. Detta innebär att trots det faktum att inte alla Kolonneluenten derivatiseras är större signal till brusförhållanden observeras och kan uppnås därmed lägre detektionsgränser och kvantifiering.
Reaktionsflödes kromatografi har utvecklats för att övervinna svårigheter med anpassningen av PCD reaktions till moderna HPLC-kolonner och system, särskilt de effektivitetsförluster som orsakas av bandbreddning på grund av stora postkolonn dödvolymer som orsakas av behovet att använda stora volymer reaktions loopar. De mer effektiva blandningsprocesser i RF-PCD jämfört med konventionella PCD betyda att mindre reaktions loop volymer kan användas vilket leder till en ökning av observerad separationseffektivitet. Dessutom RF-PCD kromatografi visar både ökad signal och minskat buller jämfört med konventionella PCD tekniker resulterar i lägre detektionsgränser och kvantifiering jämfört med konventionella PCD metoder. En ytterligare fördel med RF-PCD jämfört med konventionella PCD-metoder är förmågan att övervaka oderivatiserade strömmen som eluerar från den centrala porten på RF-kolonn såväl som den derivatiserade strömmen som eluerar från det perifera området av kolonnen. RF-PCD är en relativt ny men lovande teknik som visar många fördelar jämfört med traditionella PCD metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Se säkerhetsdatablad (SDB) för alla material och reagenser före användning (dvs SDB för metanol). Säkra användningen av alla lämpliga säkerhetsåtgärder vid hantering av lösningsmedel och High Performance Liquid Chromatography (HPLC) elueringsmedel. Säkerställa en lämplig användning av tekniska kontroller av HPLC analytisk balans och detektor instrumentering, och säkra användningen av personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, skyddsrock, fullängds byxor, och sluten tå skor).
Obs: Detta protokoll beskriver 3 metoder för reaktionsflödesefterkolonn derivatisering (RF-PCD) tekniker, alla med olika reagens specifika för den typ av en kemisk förening av intresse. För analys av ROS gå till avsnittet "1. Upptäckt av ROS med hjälp av DPPH •", för analys av primära aminer se avsnitt "2. Upptäckt av primära aminer med hjälp av fluorescamin", och för analys av fenolföreningar gå till avsnittet "3 . Detektion av fenoleranvändning av 4-aminoantipyren och kaliumferricyanid ". Använd ultrarent vatten (t.ex. Milli-Q-vatten) under hela.
Obs: Anslutning av RF-kolonnen uppnås på nästan samma sätt som en konventionell HPLC-kolonn med den stora skillnaden är antalet ändbeslag på en RF-kolonn. Beslag som används för att ansluta en standard-HPLC-kolonn till HPLC-systemet har möjlighet att användas för att ansluta en RF-kolumn till HPLC-systemet.
1. Upptäckt av ROS Använda DPPH •
- Inrättas av HPLC-instrument
- Förbered HPLC-instrument med 100% vatten på linje A och 100% metanol på linje B som den mobila fasen. Rensa pumparna enligt tillverkarens krav.
- Ställ in HPLC instrumentala komponenter och ytterligare derivatisering pumpen som visas i figur 4A.
- Ställa in UV-Vis-detektor för att analysera vid en våglängd av 520 nm.
- Ställ uppRF-kolonn
- Ansluta inloppet till RF-kolumnen till HPLC-instrument.
- Anslut en 15 cm längd av 0,13 mm id slang till utlopps central port RF kolumnen.
- Ansluta ett utlopp perifer port till UV-Vis detektor med användning av en 15 cm längd av 0,13 mm id slang.
- Anslut DPPH • pumpkanalen till en perifer port på utloppet av RF-kolonnen.
- Blockera den oanvända perifera porten på utloppet av RF-kolonn med användning av en kolonn propp.
- Bringa flödeshastigheten för HPLC-pump till en ml min -1 vid 100% linjen B - 100% metanol.
- Jämvikta kolonnen med 100% metanol mobil fas för 10 min för en 4,6 mm id x 100 mm längd kolonn. Denna tid bör skalas enligt måtten på andra kolumner användaren kan använda.
- Framställning av DPPH • reagens
- Förbered en 0,1 mg / ml lösning av DPPH • i metanol. Sonikera kolven innehållande DPPH • reagens för 10 minuter.
- Täck kolven i folie för att förhindra exponering för ljus.
- Rensa DPPH • pump med den förberedda DPPH • reagens enligt tillverkarens krav.
- Tuning kolonnutloppet RF
- Noggrant väga två rena och torra fartyg. Märk ett fartyg som central och den andra som perifera.
- Samla upp utflödet lämnar den centrala hamnen i kärlet märkt centralt för 1,0 minuter.
- Åter väga centrala hamnkärlet och beräkna vikten av flödet från den centrala hamnen enligt följande:
Vikt Central Port (g) = slutvikt Central Hamn Fartygs (g) - Initial vikt Central Hamn Fartygs (g) - Upprepa steg 1.4.2 och 1.4.3 för effluenten som lämnar UV-Vis som är fäst vid den perifera porten på RF-kolonnen och beräkna vikten för periferiporten kärl såsomföljande sätt:
Vikt av perifera Port (g) = Slutlig vikt av perifera Hamn Fartygs (g) - Initial vikt av perifera Hamn Fartygs (g) - Beräkna procentandelen av flödet som kommer från de centrala och perifera portar på följande sätt:
% Centrala Port = vikt Central Port (g) / (vikt Central Port (g) + vikt Peripheral Port (g)) x 100
% Perifer Port = vikt Peripheral Port (g) / (vikt Central Port (g) + vikt Peripheral Port (g)) x 100 - Se till att segmente förhållandet mellan den centrala flödet och det perifera flödet är 30:70 (central: perifert). Om den centrala flödet är över 30%, minska mängden flödet utträder genom tillsats av en längd av 0,13 mm id slangen till utloppet av den centrala porten. Om den centrala flödet är lägre än 30% minska längden på 0,13 mm rör från den centrala porten.
- Upprepa steg 1.4.1 till 1.4.6 tills en segmenteförhållande på 30:70 (central: perifert) uppnås.
- Ställa in flödeshastigheten för DPPH • reagenspump till 0,5 ml min -1.
Obs: Den RF-kolonn inställd med DPPH • reagens är nu klar för analys. Prover kan nu injiceras.
- Placera sina kör stängning
- När alla prover har injicerats, vilket indikerar att körningen är klar, stoppa derivatisering reagenspumpflöde.
- Avlägsna reagenspump DPPH • linje från perifera hamnen och tillslut hamnen.
- Jämvikta kolonnen med den rörliga fasen, i vilken den skall lagras genom att låta den mobila fasen för att passera genom kolonnen vid en ml min -1 under 10 min.
- Stoppa flödet av den mobila fasen pumpen på HPLC-instrument.
- Byt DPPH • reagens med metanol och rensa ytterligare en pump.
Notera: HPLC-systemet kan nu vara avstängning.
2. Detektion av primära aminer Använda fluoresceramin
- Framställning av mobilfas
- Förbereda ett L av en av 10 mM ammoniumacetatlösning, justering av pH hos lösningen till 9,0 med 5 M ammoniumhydroxid före spädning till volym.
- Lägga 52,6 ml acetonitril (ACN) till ammoniumacetatbuffert för att uppnå en förblandad mobil fas av 95:05 (buffert: ACN).
- Inrättas av HPLC-instrument
- Förbered HPLC-instrument med den förblandade beredd buffert på linjen A som den mobila fasen. Rensa pumpen enligt tillverkarens krav.
- Ställ in HPLC instrumentala komponenter och ytterligare derivatisering pumpen som visas i figur 4A.
- Fäst en pulsdämpare polen till derivatisering pumpen.
- Ställt upp fluorescensdetektorn (FLD) med en excitationsvåglängd av 390 nm och emissionsvåglängd av 475 nm.
- Ställ in RF-kolonn
- ansluta the inlopp av RF kolumnen till HPLC-instrument.
- Anslut en 15 cm längd av 0,13 mm id slang till utlopps central port RF kolumnen.
- Anslut en utlopps perifer port RF kolumnen till FLD detektorn med en 15 cm längd på 0,13 mm id slang.
- Anslut derivatisering pumpledning till en perifer port på utloppet av RF-kolonnen.
- Blockera den oanvända perifera porten på utloppet av RF-kolonn med användning av en kolonn propp.
- Bringa flödeshastigheten för HPLC-pump till en ml min -1 vid 100% linjen A - 10 mM ammoniumacetatbuffert pH 9, förblandas med 5% ACN.
- Jämvikta kolonnen med 100% linjen A mobil fas för 10 min för en 4,6 mm id x 100 mm längd kolonn. Den här gången kan skalas i enlighet med dimensionerna hos andra kolumner användaren kan använda.
- Framställning av fluorescamin reagens
- Gör 100 ml av en 0,1 mg ml -1 fluorescamin reagens. <li> Sonikera under 1 min.
- Täck med folie för att förhindra exponering för ljus.
- Rensa reagenspump med det färdiga fluorescamin reagens enligt tillverkarens krav.
- Noggrant väga två rena och torra fartyg. Märk ett fartyg som central och den andra som perifera.
- Samla upp utflödet lämnar den centrala hamnen i kärlet märkt centralt för 1,0 minuter.
- Åter väga centrala kärl och beräkna vikten av flödet från den centrala porten som följer i steg 1.4.3.
- Upprepa steg 2.5.2 till 2.5.3 för effluenten som lämnar FLD som är ansluten till den perifera porten på RF-kolonnen och beräkna vikten för perifer på följande sätt i steg 1.4.4.
- Beräkna procentandelen av flödet som kommer från de centrala och perifera hamnar enligt följande i steg 1.4.5.
- Säkerställa segmenteförhållandet mellan den centrala flödet och det periferaflöde är 43:57 (central: perifert). Om den centrala flödet är över 43%, minska mängden flödet utträder genom tillsats av en längd av 0,13 mm id slangen till utloppet av den centrala porten. Om den centrala flödet är lägre än 43%, minska längden på 0,13 mm rör från den centrala porten.
- Upprepa steg 2.5.1 till 2.5.6 tills en segmenteförhållande på 43:57 (central: perifert) uppnås.
- Ställa in flödeshastigheten för fasen pumpen mobil för att 0,7 ml min -1.
- Ställa in derivatisering pumpen mot flytning vid 0,1 ml min -1.
Obs: Den RF-kolonn inställd med fluorescamin reagens är nu klar för analys. Prover kan nu injiceras.
- När alla prover har injicerats, vilket indikerar att körningen är klar, stoppa derivatisering pumpen.
- Avlägsna derivatisering pumpledning från perifera hamnen och propp.
- Jämvikta kolonnen med den rörliga fasen ivilket det skall lagras genom att låta den mobila fasen för att passera genom kolonnen vid en ml min -1 under 10 min.
- Stoppa flödet av faspump mobil.
- Byt ut fluorescamin reagens med acetonitril och rensa derivatisering pumpen.
Notera: HPLC-systemet kan nu vara avstängning.
3. Detektion av fenoler användning av 4-aminoantipyren och kaliumferricyanid
- Framställning av mobilfas
- Förbereda ett L av en av 100 mM ammoniumacetatlösning, justering av pH hos lösningen till 9,0 med 5 M ammoniumhydroxid före spädning till volym.
- Lägga 52,6 ml metanol till ammoniumacetatbuffert för att uppnå en förblandad mobil fas av 95: 5 (buffert: metanol).
- Inrättas av HPLC-instrument
- Förbered HPLC-instrument med den förblandade beredd buffert på linjen A som den mobila fasen. Rensa pumpen enligt tillverkarens; S krav.
- Ställ in HPLC instrumentala komponenter och ytterligare två reagenspumparna som visas i figur 4B.
- Bifoga en pulsdämpare pole till var och en av reagenspumparna.
- Ställa in UV-Vis-detektor för att analysera vid en våglängd av 500 nm.
- Ställ in RF-kolonn
- Ansluta inloppet till RF-kolumnen till HPLC-instrument.
- Anslut en 15 cm längd av 0,13 mm id slang till utlopps central port RF kolumnen.
- Ansluta ett utlopp perifer sport hos RF-kolumnen till UV-Vis detektor med användning av en 15 cm längd av 0,13 mm id slang.
- Ansluta varje reagens (dvs., 4-aminoantipyren och kaliumferricyanid) pumpledning till en perifer port på utloppet av RF-kolonnen.
- Bringa flödeshastigheten för HPLC-pump till en ml min -1 vid 100% linjen A - 100 mM ammoniumacetatbuffert pH 9, förblandas med 5% metanol.
- Jämvikta kolonnen wed 100% linjen A mobil fas för 10 min för en 4,6 mm id x 100 mm längd kolonn. Den här gången kan skalas i enlighet med dimensionerna hos andra kolumner användaren kan använda.
- Framställning av 4-aminoantipyren reagens
- Framställa en ammoniumacetatbuffert med ett pH av 9 genom att följa steg 3.1.1.
- Väg upp 150 mg 4-aminoantipyren och lös upp i 100 ml av beredd ammoniumacetatbuffert (pH 9).
- Sonikera under 1 min.
- Täck med folie för att förhindra exponering för ljus.
- Rensa den första reagenspump med den framställda 4-aminoantipyren reagens enligt tillverkarens krav.
- Framställning av kalium-ferricyanid reagens
- Väg 150 mg kaliumferricyanid och lös i 100 ml ammoniumacetatbuffert (pH 9) framställda enligt steg 3.1.1.
- Sonikera under 1 min.
- Täck i folie för att förhindra exponering för ljus.
- Purge den andra reagenspump med det färdiga kaliumferricyanid reagens enligt tillverkarens krav.
- Tuning av RF-kolonn
- Noggrant väga två rena och torra fartyg. Märk ett fartyg som central och den andra som perifera.
- Samla upp utflödet lämnar den centrala hamnen i kärlet märkt centralt för 1,0 minuter.
- Åter väga centrala kärl och beräkna vikten av flödet från den centrala porten som följer i steg 1.4.3.
- Upprepa steg 3.6.2 till 3.6.3 för effluenten som lämnar UV-Vis som är fäst vid den perifera porten på RF-kolonnen och beräkna vikten för perifer på följande sätt i steg 1.4.4.
- Beräkna procentandelen av flödet som kommer från de centrala och perifera hamnar enligt följande i steg 1.4.5.
- Se till att segmente förhållandet mellan den centrala flödet och det perifera flödet är 50:50 (central: perifert). Om den centrala flödet är över 50%, minskarflödesmängd utträder genom tillsats av en längd av 0,13 mm id slangen till utloppet centrala porten. Om den centrala flödet är lägre än 50%, minska längden på 0,13 mm rör från den centrala porten.
- Upprepa steg 3.6.1 till 3.6.6 tills en segmenteförhållande på 50:50 (central: perifert) uppnås.
- Ställa in flödeshastigheten för den 4-aminoantipyren pumpen till 0,5 ml min -1.
- Ställa in flödeshastigheten för kaliumferricyanid pumpen till 0,25 ml min -1.
Obs: Den RF-kolonn inställd med två-komponent reagens är nu klar för analys. Prover kan nu injiceras.
- Placera sina kör stängning
- När alla prover har injicerats körningen är klar, vilket indikerar att körningen är klar, stoppa båda av reagenspumparna.
- Ta bort reagenspump linjerna från de perifera hamnar och ersätta dem med en 15 cm stycke av 0,13 mm slang.
- Balansera kolonnen med den mobila fasen i which den skall lagras genom att låta den mobila fasen för att passera genom kolonnen vid en ml min -1 under 10 min.
- Stoppa flödet av den mobila fasen pumpen på HPLC-instrument.
- Ersätta både de reagens på reagenspumparna med metanol och rensa extra pumpar enligt tillverkarens krav.
Notera: HPLC-systemet kan nu vara avstängning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den första PCD metod som var anpassad för att användas av RF-PCD var derivatiseringen av antioxidanter med användning av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil radikalen (DPPH •) 24. Denna reaktion introducerades av Koleva et al. 25, och har använts i stor utsträckning sedan. Detekteringen förlitar sig på avfärgning av den DPPH • radikal i närvaro av reaktiva syretyper, därav närvaron av antioxidanter resulterar i en nedgång i den observerade absorbansen. Den DPPH • reaktionen sysselsätter ofta stora reaktions slingor av 500 | il eller mera 13-15, men det visade sig att vid användning av RF-PCD-kolonn ingen reaktion loop krävdes. Figur 5 visar två kromatogram för ett prov av Ristretto kaffe derivatiserade med användning av den DPPH • radikal med både konventionella PCD och RF-PCD instrumentering.
Den andra PCD metod som har anpassats för användning av RF-PCD är derivatization av fyra aminosyror (glycin, leucin, fenylalanin och tryptofan) med fluorescamin som derivatisering reagens 23. Metoden anpassades från arbetet genom Udenfriend et al. 11 med den mobila fasen kompositionen, fluorescamin koncentration och fluorescamin flödeshastighet optimeras för användning med RF-kolonner. Den konventionella metoden använde en två-reagens derivatisering system där pH 9,0-buffert sattes till utflödesströmmen före tillsats av den fluorescamin reagens, medan RF-PCD-metoden använde en mobil fas som redan buffrades, således endast ett enda reagens derivatisering systemet behövdes. För denna tillämpning den derivatiserade strömmen analyserades vid 390 nm med användning av en UV-Visible-detektor, vilket motsvarar excitationsvåglängden användes för detektion av fluorescens. Den derivatiserade strömmen kunde detekteras med hjälp av en fluorescensdetektor, ger större signal-brus och därmed lägre detektionsgränser och quantitation, enligt arbetet av Udenfriend et al. 11. Dessutom var elueringsmedlet som kommer från den centrala porten på RF-PCD inställning övervakas med användning av en andra UV-Synlig detektor.
Prestandan för den RF-PCD förfarande för derivatisering av aminosyror jämfördes med den konventionella PCD-metoden. Tabell 1 listar de beräknade gränserna för kvantifiering och detektion för var och en av aminosyrorna analyserades i både RF-PCD och konventionella PCD lägen. Detektionsgränsen definierades vara koncentrationen där ett signalbrusförhållande på 2 erhölls medan gränsen för kvantifiering definierades vara koncentrationen där ett signalbrusförhållande på 10 uppnåddes. Figur 6 visar ett kromatogram av de fyra aminosyror analyseras med hjälp av konventionella PCD-metoden, RF-PCD-metoden och oderivatiserad strömmen från RF-PCD-metoden. Figur 7 är en jämförelse av de signaler som erhölls för ärtaks grund av glycin och leucin med både konventionella PCD metoden och RF-PCD-metoden. Figur 8 jämför toppbredden av tryptofan topp vid analys med hjälp av konventionella PCD-metoden, RF-PCD-metoden och oderivatiserad strömmen från RF- PCD-metoden.
Den slutliga PCD metod som har anpassats för att användas av RF-PCD 26 är derivatiseringen av fyra fenoler (fenol, 4-metoxifenol, p-kresol och tokoferol). Metoden anpassades från arbetet av Bigley och Grob 27 med smärre ändringar för att optimera metoden för användning med RF-kolumner. Detta arbete använde en två-komponent derivatisering reaktion där lösningar av både 4-amionantiprine och kaliumferricyanid tillsattes till kolonnen elueringsmedel vid ändbeslaget hos RF-kolonnen. Det visade sig att vid användning av en RF-kolonn för reaktionen inga ytterligare efterkolonnreaktions slingor som behövs för att kunna användas. Figur 9 visar ett exempel på ett kromatogram dären 21-komponenttestprov som innehöll en del komponenter som visar ett svar på derivatiseringen systemet och några som inte gör det, separerades, derivatiseras och detekteras (svart spår). Samma blandningen också separeras och detekteras oderivatiserad för jämförelse (röd spår). I figur 9 RF-PCD svar har visats som ett negativt svar för att underlätta visuell skillnad (detektorresponsen erhölls positiv). Figur 10 visar en jämförelse av topp form av p-kresol båda derivatiserade med hjälp av RF-PCD-kolonn och oderivatiserad.
Figur 1. Kromatografisk lagring av hexylbensen injiceras på ett HPLC-system med olika döda tillsatta volymerna mellan kolonnen och detektorn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kromatografisk lagring av toluen, etylbensen och propylbensen injicerades på en HPLC-system med olika döda tillsatta volymerna mellan kolonnen och detektorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Illustration av reaktions Flow-kolonn design. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
tp_upload / 53462 / 53462fig4.jpg "/>
Figur 4. Instrumental installation av RF-PCD. (A) enda reagens (dvs DPPH • eller fluorescamin derivatiseringsreagens) och (B) två reagens (dvs 4-aminoantipyren och kaliumferricyanid derivatiseringsreagens). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Kromatogram av separation mellan Ristretto kaffe med detektion efter efterkolonn derivatisering med användning av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil radikalen (DPPH •). Derivatiseringen genomfördes med användning av en konventionell kolonn med en 500 | il reaktionsslinga (A) och en reaktionsflödeskolonn (B Rong>). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Kromatografisk överlagring av fyra aminosyror (glycin (G), leucin (L), fenylalanin (P) och tryptofan (T)) över intervallet av 10 till 1000 ppm som detekteras av efterkolonn derivatisering med användning av fluorescamin som ett PCD-reagens efter separation genom HPLC. Kromatogrammen är följande: (A) konventionell PCD, (B) RF-PCD, och (C) central port (oderivatiserad) från RF-PCD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
_upload / 53462 / 53462fig7.jpg "/>
Figur 7. Jämförelse av signalerna som erhålls för glycin (första toppen) och leucin (andra topp) från konventionell PCD (röd spår) och RF-PCD (svart spår). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Peak jämförelse bredden av toppen på grund av tryptofan baserad på (A) retentionstid och (B) toppen volym. Den svarta trace visar den konventionella PCD-metoden, visar det röda spåret RF-PCD-metoden och den gröna kurvan visar den oderivatiserad ström från den centrala porten på RF-PCD metod. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Kromatografisk separation av en konstgjord prov. Komponenterna innefattar fenol (P), 4-metoxifenol (M), p-kresol (C) och tokoferol (T) samt ett flertal alkylbensener, polycykliska kolväten, anisol, phentanole, koffein, fenylalanin och bensamid. Topparna märkta I, II och III är alkylbensener som oväntat svarade på derivatisering systemet. Den svarta kurvan representerar oderivatiserade svaret med hjälp av en UV-detektor vid 254 nm medan den röda kurvan representerar den derivatiserade svar vid 500 nm. Anmärkning för visuell skärpa den derivatiserade svar har vänts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
![Figur 10]("/files/ftp_upload/53462/53462fig10.jpg")
Figur 10. Kromatografisk svar av p-kresol. Den svarta kurvan representerar oderivatiserade svaret med hjälp av en UV-detektor vid 254 nm medan den röda kurvan representerar den derivatiserade (RF-PCD) respons vid 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| reaktionstyp | glycin | leucin | fenylalanin | tryptofan | ||||
| LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | LOD (ppm) | LOQ (ppm) | |
| RF-PCD | 6 | 25 | 10 | 100 | 25 | 250 | 50 | 250 |
| RF-PCD central port (oderivatiserad) | ej bestämd | ej bestämd | ej bestämd | 1 | 10 | |||
| konventionella PCD | 10 | 100 | 50 | 500 | 50 | 500 | 100 | 500 |
Tabell 1. Gränser för detektering och kvantifiering av fyra olika aminosyror som upptäckts av olika efterkolonn derivatisering system med fluorescamin som derivatiseringen reagens efter separation genom HPLC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RF-PCD möjliggör effektiv blandning av derivatiseringen reagens med HPLC utflödet efterkolonn utan användning av reaktionsspolar, minimera effekterna av bandbreddning och förbättra separationsprestanda. RF-PCD metoder har också visat förbättringar i signalsvaret med avseende på detektionsmetoden. Camenzuli et al. 28 var den första att rapportera användning av reaktionsflödeskolonner med DPPH • för detektion av ROS i en espressoprov. Deras studie involverade analys och optimering av RF förutsättningar för att uppnå maximal prestanda, testa en rad DPPH • koncentrationer med olika DPPH • reagensflödeshastigheter. Det konstaterades att en DPPH • koncentration av 0,1 mg ml -1 med DPPH • reagensflödeshastighet av 0,5 ml min -1 var optimal för en förbättrad separationsprestanda (dvs effektivitet och känslighet) under RF-PCDvillkor jämfört med den konventionella PCD metoden för DPPH • derivatisering. Figur 5 visar två kromatogram som utnyttjar DPPH • analys av antioxidanter i en espressoprov. Särskilt intressanta är de höga intensitetstoppar med retentionstider av ca 5 min. Det framgår att vid användning av en 500 ul reaktionsslinga, som är typisk för traditionella DPPH • derivatisering metoder, kan observeras en enda bred topp. Men när RF-PCD metod används utan behovet av en reaktionsslinga, blir det tydligt att den enda topp observerades med användning av en 500 | il slinga är i själva verket två toppar. Dessutom kan ytterligare detaljer ses efter 5,5 minuter vid användning av RF-PCD setup. Således, för analys av ROS i prover med hjälp av DPPH •, tekniken av RF-PCD visade sig vara överlägsen de konventionella metoder för ROS analys med hjälp av DPPH •.
RF-PCD medfluorescamin reagens har använts för analys av primära aminosyror och jämfört med konventionella former av PCD med fluorescamin 20. Eftersom RF kolumnen ändinpassningen också en plattform för multiplex detektion, var oderivatiserade centrala flödet övervakas via UV-Vis, medan derivatiseringen mellan utflödet och fluorescamin genomfördes i det yttre området av RF slut montering och detekteras via UV- Vis. En serie av teststandarder som innehåller fyra aminosyror analyserades enligt multiplexerade RF-PCD förhållanden. Figur 6 jämför kromatografiska profilen för den konventionella metoden för PCD (figur 6A) och RF-PCD (detektering av derivatiserad (figur 6B) och oderivatiserad (figur 6C)) av serien av aminosyror. Figur 7 är en överlagring av två aminosyror signaler erhållna genom konventionella PCD och RF-PCD. Det kan ses att den mer effektiva observerad separation på grund than avlägsnande av reaktionsslingan har lett till större signalsvar, trots det faktum att inte alla av kolonnutflödet derivatiserades. Dessutom, desto effektivare derivatisering reagensblandningsschema resulterade i lägre baseline brus, vilket ytterligare ökar signal-brusförhållandet. Denna effekt bekräftas i den undre gränsen för detektering och kvantifiering beräknats för den RF-PCD-metoden jämfört med den konventionella PCD-metoden i tabell 1. Denna trend kan också ses i figur 5, där antioxidanten svar på DPPH • är större för RF-PCD-metoden jämfört med den konventionella PCD-metoden. Signifikant topp försämring kan observeras i kromatogrammen där en konventionell PCD inställning användes som leder till lägre signalsvaret för denna metod.
Figur 8 jämför toppprofilen för tryptofan vid analys av RF-PCD (både derivatiserade och oderivatiserade strömmar) och konventionella PCD. När topp profil plottas mot tiden toppbredder alla verkar vara i stort sett lika (Figur 8A). De förbättringar som finns i RF-PCD jämfört med konventionell PCD är uppenbart när topp profil är avsatt mot toppvolymen (figur 8B). När de plottas mot toppvolym, är det tydligt att medan RF-PCD topp visar en liten mängd nedbrytning jämfört med den oderivatiserade topp, nedbrytningen, är dock minimal jämfört med den som observerades från den konventionella PCD-metoden. Förbättringarna i separationseffektivitet av RF-PCD jämfört med konventionell PCD är också visat i figur 7 som jämför topp former av glycin och leucin efter derivatisering av både konventionella PCD och RF-PCD. Det framgår att i konventionella PCD läge glycin och leucin toppar är knappt baslinjen åtskilda medan RF-PCD läge signalen är vid baslinjen under en mycket längre tid mellan de två topparna.
EnYtterligare en fördel med RF-PCD jämfört med konventionella PCD-metoder är förmågan att övervaka oderivatiserade utflödet från den centrala porten på RF-kolonnen möjliggör multiplexerade detektering. Detta är möjligt som utformningen av frittan i RF-ändbeslaget inte tillåter flödet i den radiella mittområdet för att blandas med flödet i det perifera området av ändbeslaget, vilket möjliggör övervakning av den derivatiserade strömmen från det yttre området av montering samt övervakning av oderivatiserad strömmen från centrala hamnen. Denna förmåga är markerad av de resultat som erhölls för tryptofan i tabell 1, som är känd för att ha dålig signalsvar efter derivatisering med fluorescamin 20, men till skillnad från de andra aminosyrorna den visar ett svar på en UV-detektor vid oderivatiserad (vid 280 nm) . För båda derivatisering system gränserna för detektering och kvantifiering var relativt hög, men detektionsgränser och kvantifiering var mycket lägre för than oderivatiserad ström. Använda möjlighet att övervaka både derivatiserade och oderivatiserade avloppsströmmar parametrar detektions kan optimeras för att ge största möjliga prestanda för varje aminosyra.
Den multi utformningen av RF slut montering tillåter dubbla derivatisering reagens analys. Et al. Selim 23 undersöktes prestandan av två reagenser (4-aminoantipyren och kaliumferricyanid) med användning av RF-PCD betingelser för analys av fenoliska föreningar i jämförelse med den konventionella tekniken av PCD med användning av 4-aminoantipyren och kaliumferricyanid. Denna typ av PCD tekniken kräver två pumpar och reaktion slingor för varje derivatisering reagens i motsats till en pump och reaktionsslinga för DPPH •. Olika fenol och alkylbensen föreningar analyserades under konventionella och RF PCD villkor. Intressant, icke-fenolföreningar som inte upptäckts enligt den konventionella metoden i själva verket upptäckt under RF-PCD betingelser. Figur 9 visar UV-Vis kromatografisk respons och RF-PCD kolorimetriskt svar på ett standardtest mix. RF-PCD försedd ett förenklat PCD teknik i termer av instrumentering, utan kompromisser separationsprestanda såsom observeras i Figur 10. Figur 10 jämför toppprofilen för p-kresol vid analys genom RF-PCD och även utan derivatisering. Det kan ses att toppbredden av RF-PCD kromatogram är mycket lik den för den oderivatiserad kromatogrammet. Den stora skillnaden mellan de två kromatogrammen är att RF-PCD kromatogram är något bredare vid basen. Detta visar att det finns liten eller ingen topp spridning på grund av RF-PCD teknik. Ett liknande svar observerades i figur 9 som visar att det inte bara är den p-kresol topp som har liknande toppbredd när derivatiseras genom RF-PCD jämfört med dess oderivatiserade topp, men alla fenoler och alkylbenzenes som svarade på derivatisering systemet visade samma trend. Även om, RF-PCD med användning av två derivatiseringsreagens erhålls en liknande separationsprestanda till den konventionella icke-derivatisering metoden, RF-PCD tillåtet för selektiv detektering av fenolföreningar, en av vilka som inte detekterades under icke-derivatiserade betingelser .
RF-PCD är en vidareutveckling av konventionella metoder HPLC-PCD, alla justeringsverktyg som finns i allmänhet HPLC-metoder såsom mobila fasen och flödeshastighet, injektionsvolym och analys våglängd gäller för RF-PCD metoder. Dessutom tuning verktyg som finns i konventionella metoder HPLC-PCD, såsom den mobila fasen till PCD reagensflödesförhållande hastighet samt PCD-reagenskompositionen är tillämpliga på RF-PCD metoder. En extra tuning verktyg tillgängliga vid användning av RF-PCD som inte finns i konventionella PCD metoder är förhållandet mellan flöden som kommer från centrala och periferahamnar i kolonnen. Flödena styrs genom att förändra den relativa mottryck på var och en av ledningarna genom reglering av längden och / eller innerdiameter av inlägget detektor (eller post-kolonn om flödet som kommer från den centrala porten inte identifieras) slang. Det optimala förhållandet mellan den centrala till perifera flödena är beroende av reaktionen i fråga, såväl som andra faktorer, såsom, oavsett om den centrala porten håller på att detekteras eller inte. En flödesförhållande av 60% perifer och 40% centrala är ofta en bra utgångspunkt.
Som med avstämningsparametrar, många av de frågor som kan uppstå vid användning av RF-PCD-kolonn är också vanligt med konventionella PCD metoder. En särskild parameter som den chromatographer måste vara medveten om när man utför RF-PCD-analyser är stabiliteten av flödet och trycket i systemet, i synnerhet den hos reagenspump (ar). Om flödet i systemet är inte stabilt, kan det orsaka baslinjen instabilitet därför minskarsignal-brusförhållande och därefter gränser för kvantifiering och detektion.
RF-PCD kromatografi har utvecklats för att övervinna svårigheter i att anpassa PCD reaktioner på moderna HPLC-kolonner och system. Den stora fördelen med RF-PCD jämfört med konventionella PCD-metoder är mer effektiv blandning på grund av att det äger rum inuti en fritta inom ändbeslaget av RF-kolonnen, och denna blandning är på en något högre mottryck. Detta gör det möjligt för minimering eller till och med eliminering av de stora volymreaktionsslingor som används i många konventionella PCD metoder. Med denna minimering av efterkolonn dödvolym, kan effektivare separationer med större kromatografiska upplösning utföras.
RF-PCD-läget har lett till förbättringar i separationseffektivitet, toppform och signal-brus jämfört med konventionella PCD metoder. Det är dock viktigt att notera att signal förbättringar är detektor beroende. Exempelvis detektoreratt provmängd beroende kanske inte uppvisa en ökning av signalsvar enligt RF-PCD betingelser jämfört med konventionella metoder. Detta beror enligt konventionella metoder 100% av den kolonn provet detekteras, där enligt RF-PCD förhållanden endast en viss procentsats av den på kolonnen provet detekteras beroende på segmenteförhållandet. Det är dock förutsett att RF-PCD reaktioner kommer att kunna anpassas till vilken som helst eller två reagens (så länge båda reagens tillsätts samtidigt) PCD reaktion med minimal återoptimering och att fördelarna som observerats för alla tre reaktioner hittills testats kommer att översätta till alla andra PCD reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
| Additional Pump(s) for derivatization system | Shimadzu | LC-20A | |
| RF colum | Non-commercial | ||
| PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
| Column stoppers | Provided with column | ||
| PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
| Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
| Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
| Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials | ||
| HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
| Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
| General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method. | ||
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
| Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
| 4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
| Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |
References
- Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
- Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
- Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
- Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
- Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
- Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
- Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
- Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
- Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
- Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
- Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
- Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
- Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
- Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
- Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
- Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
- Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
- Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
- Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
- Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
- Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
- Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
- Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
- Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
- Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
