Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

آخر العمود اشتقاق عن طريق رد الفعل أعمدة تدفق عالية الأداء اللوني السائل

Published: April 26, 2016 doi: 10.3791/53462
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1School of Science and Health, University of Western Sydney, 2Van′t Hoff Institute for Molecular Sciences, University of Amsterdam

Introduction

عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) إلى جانب آخر عمود اشتقاق (PCD) هو أداة قوية يمكن أن يكون مفيدا في حل عدد من القضايا في المختبر التحليلي. ويمكن استخدامه للكشف عن المركبات التي لا يمكن اكتشافها إلا مع مجموعة من أجهزة كشف المتاحة 1،2، وزيادة إشارة الحليلة الهدف، والذي يسمح الحدود الدنيا للكشف وتحديد الكميات 3-5 أو انتقائي derivatize على الحليلة المستهدفة من أجل تجنب آثار مصفوفة 6. وتشمل يشيع استخدامها ردود الفعل PCD رد فعل الأمينات، مثل الأحماض الأمينية، مع أورثو-phthaladehyde 7-9، النينهيدرين 9،10 أو fluorescamine 11،12، واشتقاق من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) لدى ديفينيل 2،2 1-picrylhydrazil المتطرفة (DPPH •) 13،14 أو 2،2'-azino مكرر (حمض 3-ethylbenzothiazoline-6-السلفونيك (ABTS) 15،16، واستخدام كاشف يوديد-أزيد إلى derivatize الكبريت جمركبات ontaining 17،18.

هناك، ومع ذلك، العديد من المآخذ على استخدام ردود الفعل PCD مع أنظمة HPLC 6. أساسا بين هذه هو استخدام لفائف رد فعل بين نقطة إضافة كاشف اشتقاق (ق) وكاشف، مما يتيح الوقت لخلط ورد فعل لتحدث 8. هذه رد فعل الحلقات غالبا ما يكون حجم 500 ميكرولتر أو أكثر، وهو أمر مهم مقارنة مع حجم ما تبقى من نظام HPLC 19. استخدام هذه ارتفاع حجم رد الفعل حلقات النتائج في زيادة الذروة توسيع بالمقارنة مع ما سيتم الاحتفال به بدون وجود حلقة رد فعل. هذه النتائج في أقصر، قمم الأوسع نطاقا التي لها حدود أعلى من الكميات والكشف وسلبيا يؤثر قرار الكروماتوغرافي. أرقام 1 و 2 تسليط الضوء على تدهور ذروة الشكل الذي ينتج من إضافة المختلفة بعد العمود كميات رد فعل حلقة. هذا التحليلوقد أجريت مع تكوين مرحلة المحمول من 94٪ الميثانول و 6٪ من المياه الملة-Q. وكان معدل تدفق الطور المتحرك 1 مل / دقيقة، وكان حجم حقن 20 ميكرولتر وكان الطول الموجي تحليل 265 نانومتر. أدرجت لفائف من مختلف أحجام الميتة من 20 ميكرولتر إلى 1000 ميكرولتر بين العمود وكاشف لمحاكاة آثار رد فعل حلقة حجم القتلى في أساليب PCD. تم إعداد هذه الحلقات من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها الداخلي 0.5 ملم. تم إجراء تجربة على نظام HPLC تتكون من وحدة تحكم (SCL-10AVP)، وانخفاض ضغط متدرجة صمام (FCL-10ALVP)، مضخة (LC-20AD)، والحاقن (SIL-10ADVP)، وكاشف المساعد الشخصي الرقمي ( SPD-M10ADVP). تم ضخ الطور المتحرك من خلال الغاز الراحل قبل إدخالها في نظام HPLC. تم إجراء فصل باستخدام س 4.6 ملم معرف 5 ميكرون العمود 250 ملم. وقد تم اختيار الظروف التجريبية لتكون نموذجية من ردود الفعل PCD أن تم مؤخرا نشرت في الأدب.

الأبسط، ويطلق آخر الأكثر شيوعا الإعداد مفاعل العمود مفاعل أنبوبي غير مجزأة والتي هي بالفعل طويلة، أنبوب رفيع من خلالها السائل يمكن أن تتدفق ورد فعل يمكن أن يحدث. في هذه الذروة نظام توسيع يعتمد على ليس فقط حجم القتلى إضافتها إلى النظام، ولكن أيضا القطر الداخلي للأنبوب نحو ما أبرزته إيجيما وآخرون. 8. وعلاوة على ذلك، لفائف الهندسة تلعب دورا في توسيع العلامة التجارية لوحظ. ستيوارت 20 ذكر أن اللف المفاعل يغير ملامح تدفق الثانوية، مما أدى إلى أفضل خلط، وهذا يعني أن حجم القتلى قد يكون الحد الأدنى. وقد ذكر أن ذروة توسيع ليس كبيرا عند استخدام أنبوبي مفتوحة محبوك لفائف 21. عندما ذروة توسيع هو كبير جدا، ويمكن أيضا اعتبار أنواع أخرى من المفاعلات 20،22. ويمكن أن تشمل هذه المفاعلات السرير أو مفاعلات تدفق مجزأة. هذه المفاعلات هي مفيدة بشكل خاص لردود الفعل البطيئة التي من شأنها أن اشتراطات غير ذلكحلقات رد فعل ه كبير. كما المفاعلات الأنبوبية غير مجزأة هي الأنواع الأكثر شيوعا من المفاعلات المستخدمة في التطبيقات PCD، والباقي من هذه الصفقات المادة مع هذا النوع من الإعداد المفاعل.

تصميم العمود تدفق رد فعل (RF) يشتمل على نهاية المناسب متعددة المنفذ الذي يسمح الطور المتحرك للخروج (أو دخول) العمود إما من خلال منفذ واحد يقع في المنطقة المركزية الشعاعية للعمود أو ثلاثة الموانئ الواقعة على الخارجي منطقة جدار العمود (انظر الشكل 3). يتم فصل هذين التيارين باستخدام المناسب نهاية تحتوي على فريت التي يسهل اختراقها المركزي الذي تحيط به حلقة كتيمة التي هي بدورها محاطة فريت التي يسهل اختراقها الخارجي الذي يمتد إلى جدار العمود. بسبب تدفق حلقة عبر المركزي كتيمة غير ممكن بين المناطق التي يسهل اختراقها اثنين.

خلال رد فعل اللوني التدفق، وضخ كاشف اشتقاق (ق) ضد اتجاه تدفق مرحلة المحمول إلى واحد أو TWس من الموانئ الخارجية للعمود تدفق رد فعل. يتم خلط شاطف عمود مع كاشف اشتقاق (ق) في فريت الخارجي وتمريرها إلى كشف من خلال منفذ خارجي خال. يمكن استخدام تدفق رد فعل إما لاشتقاق كاشف واحد (1 منفذ للكاشف اشتقاق، 1 منفذ لتمرير شاطف العمود إلى كشف و 1 منفذ سدت) أو نظام كاشف المزدوج (2 الموانئ لالكواشف اشتقاق و 1 منفذ ل تمرير شاطف العمود إلى كاشف). إما أن تدفق من التيار المركزي أن تستخدم للكشف عن شاطف العمود underivatized وفعالية الكشف عن الإرسال المتعدد 23، أو تمريرها إلى النفايات.

أسلوب واحد ضبط الرئيسية المتوفرة عند تشغيل RF-PCD اللوني هو نسبة التدفقات المركزية والطرفية. النسبة المثلى لكل اشتقاق يعتمد على عدد من العوامل مثل ما إذا كان سيتم الكشف عن تدفق المركزي أو تمريرها إلى النفايات. لذلك مرة واحدة وقد تم تحديد النسبة المثلىيجب التأكد من أن نسبة تدفق الصحيحة يتحقق قبل كل تشغيل التي يتم تنفيذها.

وقد وجد أن استخدام فريت لخلط تيار العمود شاطف وكاشف اشتقاق في نتائج RF-PCD في خلط أكثر كفاءة مقارنة مع تقنيات خلط التقليدية التي عادة ما تستخدم صفر حجم القتلى T-قطعة أو حجم القتلى منخفض W- قطعة لمزيج من التيارين. وقد سمح ذلك لاستخدام الحلقات رد فعل صغيرة نسبيا، أو حتى القضاء على حلقة رد فعل تماما. الحد من نتائج رد الفعل حجم حلقة في قمم أكثر وضوحا بالمقارنة مع الطرق التقليدية اشتقاق آخر عمود. وهذا يعني أنه على الرغم من حقيقة أن ليس كل من شاطف عمود وderivatized، لوحظ أكبر إشارة إلى نسب الضوضاء وحدود وبالتالي أقل الكشف والكميات لا يمكن أن يتحقق.

وقد وضعت تدفق رد فعل اللوني للتغلب على الصعوبات مع التكيف من رد فعل PCD الصورة الأعمدة الحديثة HPLC والأنظمة، لا سيما الخسارة في الكفاءة الناجمة عن الفرقة توسيع بسبب آخر عمود كميات كبيرة ميتة الناجمة عن الحاجة إلى توظيف رد الفعل حجم كبير حلقات. عمليات خلط أكثر كفاءة في RF-PCD مقارنة PCD التقليدي يعني أن أحجام التداول حلقة رد فعل أصغر قد تكون عاملة مما يؤدي إلى زيادة في كفاءة الفصل المرصودة. وعلاوة على ذلك يظهر RF-PCD اللوني على حد سواء زيادة إشارة وانخفاض الضوضاء بالمقارنة مع التقنيات التقليدية PCD مما أدى إلى الحدود الدنيا من الكشف والكميات بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD. ميزة إضافية لRF-PCD بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD هي القدرة على رصد تيار underivatized أن elutes من الميناء الرئيسي للعمود RF فضلا عن تيار derivatized أن elutes من المنطقة الطرفية من العمود. RF-PCD هي تقنية جديدة نسبيا ولكنها واعدة أن يعرض مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية PCD.

> ويتحقق اتصال العمود RF في تقريبا بنفس طريقة عمود HPLC التقليدية مع فارق كبير يجري عدد من التجهيزات نهاية على عمود RF. التجهيزات المستخدمة لربط عمود HPLC القياسية لنظام HPLC هي قادرة على أن تستخدم لربط عمود الترددات اللاسلكية لنظام HPLC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: يرجى الرجوع إلى بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد والكواشف قبل الاستخدام (أي، MSDS من الميثانول). ضمان استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند التعامل مع المذيبات وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) شاطف. ضمان الاستخدام الملائم للضوابط هندسية من HPLC والتحليلية التوازن وكشف عن الأجهزة، وضمان استخدام معدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل، وأحذية مغلقة اصبع القدم).

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول 3 طرق تدفق رد فعل آخر عمود اشتقاق (RF-PCD) تقنيات، مع كل كاشف مختلفة محددة لطبيعة مركب كيميائي من الفائدة. لتحليل ROS انتقل إلى قسم "1. الكشف عن ROS باستخدام DPPH •"، لتحليل الأمينات الأولية انظر القسم "2. الكشف عن الأمينات الأولية باستخدام fluorescamine"، ولتحليل المركبات الفينولية انتقل إلى قسم "3 . الكشف عن الفينولاتباستخدام 4-aminoantipyrene وفيري سيانيد البوتاسيوم ". استخدام مياه نقي للغاية (على سبيل المثال، ميلي-Q المياه) في جميع أنحاء.

ملاحظة: يتم تحقيق اتصال العمود RF في تقريبا بنفس طريقة عمود HPLC التقليدية مع فارق كبير يجري عدد من التجهيزات نهاية على عمود RF. التجهيزات المستخدمة لربط عمود HPLC القياسية لنظام HPLC هي قادرة على أن تستخدم لربط عمود الترددات اللاسلكية لنظام HPLC.

1. الكشف عن ROS باستخدام DPPH •

  1. إعداد صك HPLC
    1. إعداد الصك HPLC بالماء٪ 100 على خط والميثانول٪ 100 على خط B كما الطور المتحرك. تطهير المضخات وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
    2. إعداد مكونات مفيدة HPLC ومضخة اشتقاق إضافية كما هو موضح في الشكل رقم 4A.
    3. تعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس لتحليل عند طول موجي 520 نانومتر.
  2. إعداد لالعمود RF
    1. ربط مدخل العمود RF في الصك HPLC.
    2. توصيل طول 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ المركزي للعمود RF.
    3. قم بتوصيل منفذ الطرفية منفذ للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
    4. ربط DPPH • خط ضخ إلى منفذ الطرفية على منفذ العمود RF.
    5. منع ميناء الطرفية غير المستخدمة على منفذ العمود RF باستخدام سدادة العمود.
    6. جعل معدل تدفق المضخة HPLC إلى 1 مل دقيقة -1 في 100٪ خط B - 100٪ الميثانول.
    7. تتوازن العمود مع الطور المتحرك الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقيقة للحصول على 4.6 ملم معرف × 100 عمود طول مم. يجب تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
  3. إعداد DPPH • كاشف
    1. إعداد محلول / مل 0.1 ملغ من DPPH • في الميثانول. يصوتن القارورة التي تحتوي على DPPH • كاشف لمدة 10 دقيقة.
    2. تغطية قارورة في احباط لمنع التعرض للضوء.
    3. تطهير DPPH • مضخة مع استعداد DPPH • كاشف وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
  4. ضبط العمود مخرج RF
    1. بدقة تزن سفينتين نظيفة وجافة. تسمية سفينة واحدة مركزية وأخرى هامشية.
    2. جمع النفايات السائلة التي تخرج من ميناء المركزي في الإناء المسمى المركزية ل 1.0 دقيقة.
    3. إعادة تزن السفينة ميناء المركزية وحساب وزن التدفق من ميناء المركزي على النحو التالي:
      الوزن من ميناء الوسطى (ز) = الوزن النهائي من ميناء الوسطى سفينة (ز) - الوزن الأولي من ميناء الوسطى سفينة (ز)
    4. كرر الخطوات من 1.4.2 و 1.4.3 لمياه الصرف الصحي التي تخرج من الأشعة فوق البنفسجية فيس التي يتم تركيبها إلى ميناء الطرفية العمود الترددات اللاسلكية وحساب الوزن للسفينة ميناء الطرفية والتالي:
      الوزن من ميناء الطرفية (ز) = الوزن النهائي من ميناء الطرفية السفينة (ز) - الوزن الأولي من ميناء الطرفية السفينة (ز)
    5. حساب نسبة تدفق القادمة من موانئ المركزية والطرفية كما يلي:
      ٪ المركزي ميناء = الوزن من ميناء الوسطى (ز) / (وزن ميناء الوسطى (ز) + وزن الطرفية ميناء (ز)) × 100
      ٪ الطرفية ميناء = الوزن من ميناء الطرفية (ز) / (وزن ميناء الوسطى (ز) + وزن الطرفية ميناء (ز)) × 100
    6. ضمان نسبة تجزئة بين تدفق المركزي وتدفق المحيطي هو 30:70 (المركزي: الطرفية). إذا كان تدفق المركزي هو فوق 30٪، وانخفاض كمية تدفق الخروج بإضافة بطول 0.13 ملم معرف أنابيب إلى منفذ ميناء المركزي. إذا كان تدفق المركزي هو أقل من 30٪ تخفيض طول 0.13 ملم أنابيب من ميناء المركزي.
    7. كرر الخطوة 1.4.1 إلى 1.4.6 حتى نسبة تجزئة 30:70: ويتحقق (وسط الطرفية).
    8. ضبط معدل تدفق DPPH • مضخة كاشف ل-1 0.5 مل دقيقة.
      ملاحظة: عمود RF اقامة مع DPPH • كاشف هو الآن على استعداد لتحليلها. يمكن الآن حقن عينات.
  5. آخر تشغيل شروط الاغلاق
    1. مرة واحدة كل من العينات تم حقنها، مشيرا إلى أن على المدى قد انتهت، ووقف تدفق مضخة اشتقاق كاشف.
    2. إزالة DPPH • خط ضخ الكاشف من ميناء الطرفية وسدادة الميناء.
    3. تتوازن العمود مع الطور المتحرك الذي يجب ان يكون لتخزينها عن طريق السماح للمرحلة النقالة بالمرور عبر العمود في 1 مل دقيقة -1 لمدة 10 دقيقة.
    4. وقف تدفق المضخة الطور المتحرك على الصك HPLC.
    5. استبدال DPPH • كاشف مع الميثانول وتطهير مضخة إضافية.
      ملاحظة: نظام HPLC يمكن أن يكون الآن الاغلاق.

2. الكشف عن الأمينات الأولية عن طريق Fluorescأمين

  1. إعداد الطور المتحرك
    1. إعداد 1 لتر من 10 ملي حل خلات الأمونيوم، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 9.0 مع 5 هيدروكسيد الأمونيوم M قبل التخفيف إلى وحدة تخزين.
    2. إضافة 52.6 مل من الأسيتونتريل (إيه سي) إلى المخزن المؤقت خلات الأمونيوم لبلوغ مرحلة الجوالة خلط من 95:05 (المخزن المؤقت: ACN).
  2. إعداد صك HPLC
    1. إعداد الصك HPLC مع العازلة استعداد قبل مختلطة على خط كمرحلة النقالة. تطهير مضخة وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
    2. إعداد مكونات مفيدة HPLC ومضخة اشتقاق إضافية كما هو موضح في الشكل رقم 4A.
    3. إرفاق ملف نبض يستمتع إلى المضخة اشتقاق.
    4. انشاء كاشف مضان (الكبد الدهني) مع الطول الموجي الإثارة من 390 نانومتر الطول الموجي وانبعاث 475 نانومتر.
  3. إعداد العمود RF
    1. ربط الالبريد مدخل العمود RF في الصك HPLC.
    2. توصيل طول 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ المركزي للعمود RF.
    3. قم بتوصيل منفذ الطرفية منفذ العمود الترددات اللاسلكية لكشف الكبد الدهني باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
    4. ربط خط ضخ اشتقاق إلى منفذ الطرفية على منفذ العمود RF.
    5. منع ميناء الطرفية غير المستخدمة على منفذ العمود RF باستخدام سدادة العمود.
    6. جعل معدل تدفق المضخة HPLC إلى 1 مل دقيقة -1 في 100٪ ألف خط - 10 ملي الأمونيوم خلات درجة الحموضة عازلة 9، خلط مع 5٪ ACN.
    7. تتوازن العمود مع خط المرحلة أ النقالة 100٪ لمدة 10 دقيقة للحصول على 4.6 ملم معرف × 100 عمود طول مم. يمكن تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
  4. إعداد كاشف fluorescamine
    1. جعل 100 مل من 0.1 ملغ مل -1 fluorescamine كاشف.
      2. <لى> يصوتن لمدة 1 دقيقة.
    2. مع تغطية احباط لمنع التعرض للضوء.
    3. تطهير مضخة كاشف مع كاشف fluorescamine استعداد وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
  5. ضبط العمود مخرج RF
    1. بدقة تزن سفينتين نظيفة وجافة. تسمية سفينة واحدة مركزية وأخرى هامشية.
    2. جمع النفايات السائلة التي تخرج من ميناء المركزي في الإناء المسمى المركزية ل 1.0 دقيقة.
    3. إعادة تزن السفينة المركزية وحساب وزن التدفق من ميناء المركزي على النحو التالي في الخطوة 1.4.3.
    4. كرر الخطوات من 2.5.2 إلى 2.5.3 لمياه الصرف الصحي التي تخرج من الكبد الدهني التي يتم تركيبها إلى ميناء الطرفية العمود الترددات اللاسلكية وحساب الوزن لالطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.4.
    5. حساب نسبة تدفق القادمة من موانئ المركزية والطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.5.
    6. ضمان نسبة تجزئة بين تدفق المركزي والطرفيالتدفق 43:57 (المركزي: الطرفية). إذا كان تدفق المركزي هو فوق 43٪، وانخفاض كمية تدفق الخروج بإضافة بطول 0.13 ملم معرف أنابيب إلى منفذ ميناء المركزي. إذا كان تدفق المركزي أقل من 43٪، وتقليل طول 0.13 ملم أنابيب من ميناء المركزي.
    7. كرر الخطوة 2.5.1 إلى 2.5.6 حتى نسبة تجزئة 43:57: ويتحقق (وسط الطرفية).
    8. ضبط معدل تدفق المضخة الطور المتحرك إلى 0.7 مل دقيقة -1.
    9. ضبط مضخة اشتقاق في التدفق في 0.1 مل دقيقة -1.
      ملاحظة: عمود RF اقامة مع كاشف fluorescamine هو الآن على استعداد لتحليلها. يمكن الآن حقن عينات.
  6. آخر تشغيل شروط الاغلاق
    1. مرة واحدة كل من العينات تم حقنها، مشيرا إلى أن على المدى قد انتهت، ووقف ضخ اشتقاق.
    2. إزالة السطر مضخة اشتقاق من ميناء الطرفية وسدادة.
    3. تتوازن العمود مع الطور المتحرك فيالتي هي ليتم تخزينها من خلال السماح للمرحلة النقالة بالمرور عبر العمود في 1 مل دقيقة -1 لمدة 10 دقيقة.
    4. وقف تدفق المضخة الطور المتحرك.
    5. استبدال كاشف fluorescamine مع الأسيتونتريل وتطهير مضخة اشتقاق.
      ملاحظة: نظام HPLC يمكن أن يكون الآن الاغلاق.

3. الكشف عن الفينولات باستخدام 4-Aminoantipyrene والبوتاسيوم فيري سيانيد

  1. إعداد الطور المتحرك
    1. إعداد 1 لتر من 100 ملي حل خلات الأمونيوم، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 9.0 مع 5 هيدروكسيد الأمونيوم M قبل التخفيف إلى وحدة تخزين.
    2. إضافة 52.6 مل من الميثانول إلى المخزن المؤقت خلات الأمونيوم لبلوغ مرحلة الجوالة خلط من 95: 5 (المخزن المؤقت: الميثانول).
  2. إعداد صك HPLC
    1. إعداد الصك HPLC مع العازلة استعداد قبل مختلطة على خط كمرحلة النقالة. تطهير مضخة حسب الشركة المصنعة؛ ق المتطلبات.
    2. إعداد مكونات مفيدة HPLC واثنين من مضخات كاشف إضافية كما هو موضح في الشكل رقم 4B.
    3. إرفاق ملف نبض يستمتع كل من المضخات كاشف.
    4. تعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس لتحليل عند طول موجي 500 نانومتر.
  3. إعداد العمود RF
    1. ربط مدخل العمود RF في الصك HPLC.
    2. توصيل طول 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ المركزي للعمود RF.
    3. قم بتوصيل منفذ الطرفية منفذ العمود الترددات اللاسلكية لكشف أشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام طول 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
    4. ربط كل كاشف (أي 4 aminoantipyrene وفيري سيانيد البوتاسيوم) خط ضخ إلى منفذ الطرفية على منفذ العمود RF.
    5. جعل معدل تدفق المضخة HPLC إلى 1 مل دقيقة -1 في 100٪ ألف خط - 100 ملي الأمونيوم خلات درجة الحموضة عازلة 9، خلط مع 5٪ الميثانول.
    6. تتوازن العمود ثإيث خط الطور المتحرك 100٪ ولمدة 10 دقيقة للحصول على 4.6 ملم معرف × 100 عمود طول مم. يمكن تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
  4. إعداد كاشف 4 aminoantipyrene
    1. إعداد العازلة خلات الأمونيوم مع الرقم الهيدروجيني من 9 باتباع الخطوة 3.1.1.
    2. تزن 150 ملغ 4 aminoantipyrene وتذوب في 100 مل من استعداد عازلة خلات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 9).
    3. يصوتن لمدة 1 دقيقة.
    4. مع تغطية احباط لمنع التعرض للضوء.
    5. تطهير أول مضخة كاشف مع استعداد كاشف 4 aminoantipyrene وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
  5. إعداد البوتاسيوم فيري سيانيد كاشف
    1. تزن 150 ملغ من فيري سيانيد البوتاسيوم وتذوب في 100 مل من العازلة خلات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 9) التي أعدت وفقا للخطوة 3.1.1.
    2. يصوتن لمدة 1 دقيقة.
    3. تغطية في احباط لمنع التعرض للضوء.
    4. Purgالبريد مضخة كاشف الثانية مع استعداد كاشف فيري سيانيد البوتاسيوم وفقا لمتطلبات الشركة الصانعة.
  6. ضبط العمود RF
    1. بدقة تزن سفينتين نظيفة وجافة. تسمية سفينة واحدة مركزية وأخرى هامشية.
    2. جمع النفايات السائلة التي تخرج من ميناء المركزي في الإناء المسمى المركزية ل 1.0 دقيقة.
    3. إعادة تزن السفينة المركزية وحساب وزن التدفق من ميناء المركزي على النحو التالي في الخطوة 1.4.3.
    4. كرر الخطوات من 3.6.2 إلى 3.6.3 لمياه الصرف الصحي التي تخرج من الأشعة فوق البنفسجية فيس التي يتم تركيبها إلى ميناء الطرفية العمود الترددات اللاسلكية وحساب الوزن لالطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.4.
    5. حساب نسبة تدفق القادمة من موانئ المركزية والطرفية على النحو التالي في الخطوة 1.4.5.
    6. ضمان نسبة تجزئة بين تدفق المركزي وتدفق المحيطي هو 50:50 (المركزي: الطرفية). إذا كان تدفق المركزي هو فوق 50٪، وانخفاضكمية تدفق الخروج بإضافة بطول 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء المركزي منفذ. إذا كان تدفق المركزي هو أقل من 50٪، وتقليل طول 0.13 ملم أنابيب من ميناء المركزي.
    7. كرر الخطوة 3.6.1 إلى 3.6.6 حتى نسبة تجزئة 50:50: ويتحقق (وسط الطرفية).
    8. ضبط معدل تدفق المضخة 4 aminoantipyrene إلى 0.5 مل دقيقة -1.
    9. ضبط معدل تدفق المضخة فيري سيانيد البوتاسيوم و 0.25 مل دقيقة -1.
      ملاحظة: عمود RF اقامة مع الكواشف اثنين من عناصر جاهز الآن للتحليل. يمكن الآن حقن عينات.
  7. آخر تشغيل شروط الاغلاق
    1. مرة واحدة كل من العينات تم حقنها على المدى قد انتهت، مشيرا إلى أن على المدى قد انتهت، ووقف كل من المضخات كاشف.
    2. إزالة خطوط ضخ الكاشف من الموانئ الطرفية واستبدالها مع 15 سم قطعة من 0.13 ملم أنابيب.
    3. تتوازن العمود مع الطور المتحرك في مبادرة الخوذ البيضاءالفصل هو ليتم تخزينها من خلال السماح للمرحلة النقالة بالمرور عبر العمود في 1 مل دقيقة -1 لمدة 10 دقيقة.
    4. وقف تدفق المضخة الطور المتحرك على الصك HPLC.
    5. استبدال كل من الكواشف على كاشف مضخات مع الميثانول وتطهير مضخات إضافية وفقا لمتطلبات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: نظام HPLC يمكن أن يكون الآن الاغلاق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت الطريقة PCD الأولى التي تم تكييفها للاستخدام من قبل RF-PCD في اشتقاق من المواد المضادة للاكسدة باستخدام 2،2-ثنائي-1-picrylhydrazil الراديكالي (DPPH •) 24. وقدم هذا رد فعل من جانب Koleva وآخرون. 25 واستخدمت على نطاق واسع منذ ذلك الحين. يعتمد الكشف على إزالة اللون من DPPH و• جذري في وجود أنواع الاكسجين التفاعلية، وبالتالي وجود نتائج المواد المضادة للاكسدة في انخفاض الامتصاصية لوحظ. وDPPH • رد فعل في كثير من الأحيان توظف حلقات رد فعل كبيرة من 500 ميكرولتر أو أكثر 13-15، لكن تبين أنه عند استخدام العمود RF-PCD كان هناك حاجة حلقة رد فعل الشكل 5 يظهر اثنين الاستشرابية لعينة من القهوة Ristretto derivatized باستخدام DPPH • جذرية باستخدام كل PCD التقليدية وRF-PCD الأجهزة.

طريقة PCD الثانية التي تم تكييفها للاستخدام من قبل RF-PCD هو ديرivatization من أربعة الأحماض الأمينية (الجلايسين، ليسين، ألانين والتربتوفان) باستخدام fluorescamine كما كاشف اشتقاق 23. وقد تم تكييف طريقة من العمل من قبل Udenfriend وآخرون. 11 لتكوين المحمول المرحلة، وتركيز fluorescamine ومعدل التدفق fluorescamine الأمثل للاستخدام مع الأعمدة RF. تستخدم الطريقة التقليدية نظام اشتقاق-كاشف اثنين حيث تم إضافة درجة الحموضة 9.0 عازلة للتيار النفايات السائلة قبل إضافة الكاشف fluorescamine، في حين أن طريقة RF-PCD المستخدمة مرحلة النقالة التي كانت مخزنة بالفعل، وبالتالي فقط كاشف نظام الاشتقاق واحد كانت هناك حاجة. لهذا التطبيق تم تحليل تيار derivatized في 390 نانومتر باستخدام كاشف للأشعة فوق البنفسجية المرئية، والتي تتطابق مع الطول الموجي الإثارة المستخدمة في الكشف عن طريق مضان. يمكن أن يتم الكشف عن تيار derivatized باستخدام كاشف مضان، وإعطاء قدر أكبر من إشارة إلى الضوضاء، وبالتالي الحدود الدنيا من الكشف وضليع في الرياضياتitation، وفقا للعمل من قبل Udenfriend وآخرون. 11. وعلاوة على ذلك، تم رصد شاطف قادمة من ميناء المركزي من الإعداد RF-PCD باستخدام الثاني كاشف للأشعة فوق البنفسجية المرئية.

وتمت مقارنة أداء طريقة RF-PCD لاشتقاق من الأحماض الأمينية إلى جدول التقليدية PCD الأسلوب. 1 قوائم حدود محسوبة من الكميات والكشف عن كل من الأحماض الأمينية التي تم تحليلها في كلا RF-PCD وسائط PCD التقليدية. تم تعريف الحد من الكشف أن يكون الاعتقال حيث تم الحصول على إشارة إلى نسبة الضوضاء من 2 في حين تم تعريف الحد من الكميات ليكون الاعتقال حيث تم التوصل إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء من 10 الشكل 6 يظهر اللوني الأربعة تحليل الأحماض الأمينية باستخدام طريقة PCD التقليدية، وطريقة RF-PCD وتيار underivatized من أسلوب RF-PCD الشكل 7 مقارنة بين الإشارات التي تم الحصول عليها البازلاءكانساس بسبب الجلايسين ويسين باستخدام كل من طريقة PCD التقليدية وطريقة RF-PCD الشكل 8 يقارن عرض ذروة الذروة التربتوفان عند تحليل باستخدام طريقة PCD التقليدية، وطريقة RF-PCD وتيار underivatized من RF- طريقة PCD.

طريقة PCD النهائي التي تم تكييفها للاستخدام من قبل RF-PCD 26 هو اشتقاق من أربعة الفينول (الفينول، 4 methoxyphenol، ص -cresol وتوكوفيرول). تم تعديل طريقة من العمل من قبل بيغلي وجروب 27 مع تغييرات طفيفة لتحسين طريقة للاستخدام مع الأعمدة RF. هذا العمل الاستفادة من ردود الفعل اشتقاق اثنين من المكونات التي أضيفت حلول كل 4 amionantiprine والبوتاسيوم فيري سيانيد إلى شاطف عمود في تركيب نهاية العمود RF. وقد وجد أنه عند استخدام عمود RF للتفاعل أية مقالة العمود رد فعل الحلقات الإضافية اللازمة لاستخدامها. ويبين الشكل 9 مثالا على اللوني حيثعينة الاختبار 21 المكونة التي تحتوي على بعض المكونات التي تظهر استجابة لمخطط اشتقاق وبعض لا، فصلت، derivatized والكشف عن (تتبع السوداء). تم فصل الخليط نفسه أيضا والكشف عن underivatized للمقارنة (تتبع الأحمر). في الشكل 9 تم عرض استجابة RF PCD كرد فعل سلبية على التمييز البصري أسهل (كانت استجابة كاشف حصلت إيجابية). يوضح الشكل رقم 10 مقارنة بين ذروة شكل ص -cresol كلا derivatized باستخدام عمود RF-PCD و underivatized.

الشكل 1
الشكل 1. الكروماتوغرافي تراكب hexylbenzene حقن على نظام HPLC مع مختلف أحجام الميتة المضافة بين العمود وكاشف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الكروماتوغرافي تراكب التولوين، إيثيل بنزين وpropylbenzene حقن على نظام HPLC مع مختلف أحجام الميتة المضافة بين العمود وكاشف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. رسم توضيحي لتصميم عمود تدفق رد الفعل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

tp_upload / 53462 / 53462fig4.jpg "/>
تحديد الشكل 4. دور فعال يتكون من RF-PCD. (A) كاشف واحد (أي DPPH • أو الكواشف اشتقاق fluorescamine) و (ب) كاشف المزدوج (أي 4 aminoantipyrene وفيري سيانيد البوتاسيوم الكواشف اشتقاق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الاستشرابية فصل القهوة Ristretto مع الكشف بعد اشتقاق آخر عمود باستخدام 2،2-ثنائي-1-picrylhydrazil الراديكالية (DPPH •). وقد أجريت اشتقاق باستخدام عمود التقليدي مع 500 لفائف رد فعل ميكرولتر (A) وعمود تدفق رد فعل (B رونغ>). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. الكروماتوغرافي تراكب من أربعة الأحماض الأمينية (الجلايسين (G)، ليسين (L)، فينيل ألانين (P) والتربتوفان (T)) على مجموعة من 10 إلى 1000 جزء في المليون الكشف عنها من قبل آخر عمود اشتقاق باستخدام fluorescamine بمثابة كاشف PCD بعد فصل من قبل HPLC. والاستشرابية هي كما يلي: (أ) PCD التقليدي، (ب) RF-PCD، و (C) المركزية (underivatized) المنفذ من RF-PCD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

_upload / 53462 / 53462fig7.jpg "/>
الرقم 7. مقارنة الإشارات التي تم الحصول عليها عن الجلايسين (الذروة الأولى) ويسين (الذروة الثانية) من PCD التقليدي (تتبع الأحمر) وRF-PCD (تتبع السوداء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8. الذروة مقارنة عرض الذروة بسبب التربتوفان على أساس (أ) الوقت الاحتفاظ و (ب) ذروة حجم ويبين أثر أسود طريقة PCD التقليدية، ويظهر أثر أحمر طريقة RF-PCD ويظهر أثر الاخضر تيار underivatized من الميناء الرئيسي للطريقة RF PCD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خيمة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الرقم 9
الرقم 9. الفصل الكروماتوغرافي من عينة الاصطناعية. وتشمل مكونات الفينول (P)، 4-methoxyphenol (M)، ص -cresol (C) وفيتامين إي (T)، فضلا عن العديد من alkylbenzenes، الحلقية الهيدروكربونية، الأنيسول، phentanole، الكافيين، الفنيل الأنين وبينزاميد. قمم صفت الأول والثاني والثالث هي alkylbenzenes التي استجابت بشكل غير متوقع لنظام الاشتقاق. يمثل أثر أسود الاستجابة underivatized باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر بينما يمثل التتبع الحمراء استجابة derivatized في 500 نانومتر. ملاحظة للضوح بصرية تم مقلوب استجابة derivatized. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10 الرقم 10. استجابة الكروماتوغرافي من ص -cresol. ويمثل أثر أسود الاستجابة underivatized باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر بينما يمثل التتبع الحمراء derivatized استجابة (RF-PCD) في 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نوع رد الفعل الجلايسين يسين الفنيل الأنين التربتوفان
اللد (جزء في المليون) LOQ (جزء في المليون) اللد (جزء في المليون) LOQ (جزء في المليون) اللد (جزء في المليون) LOQ (جزء في المليون) اللد (جزء في المليون) LOQ (جزء في المليون)
RF-PCD 6 25 10 100 25 250 50 250
RF-PCD ميناء المركزية (underivatized) لم يتم الكشف عن لم يتم الكشف عن لم يتم الكشف عن 1 10
PCD التقليدية 10 100 50 500 50 500 100 500

الجدول 1. حدود الكشف وتحديد الكميات من أربعة الأحماض الأمينية المختلفة الكشف عنها من قبل أنظمة آخر عمود اشتقاق مختلفة باستخدام fluorescamine كما كاشف اشتقاق بعد الانفصال من قبل HPLC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RF-PCD يسمح لخلط الفعال للكاشف اشتقاق مع النفايات السائلة بعد عمود HPLC دون استخدام لفائف رد فعل، والتقليل من آثار توسيع نطاق وتحسين أداء الانفصال. وقد أظهرت أساليب RF-PCD أيضا التحسينات في الاستجابة إشارة فيما يتعلق طريقة الكشف. كان Camenzuli وآخرون. 28 أول من أشار إلى استخدام الأعمدة تدفق رد فعل مع DPPH • للكشف عن ROS في عينة صنع قهوة اسبريسو. وشملت الدراسة تحليل وتحسين ظروف الترددات اللاسلكية لتحقيق أقصى قدر من الأداء، واختبار مجموعة من DPPH • تركيزات مع مختلف DPPH • معدلات تدفق كاشف. وخلص إلى أن DPPH • تركيز 0.1 مجم مل -1 مع DPPH • معدل تدفق كاشف من 0.5 مل دقيقة -1 كان الأمثل لتحسين أداء فصل (أي والكفاءة والحساسية) تحت RF-PCDشروط بالمقارنة مع الطريقة التقليدية PCD من DPPH • اشتقاق ويبين الشكل 5 اثنين الاستشرابية الاستفادة من DPPH • فحص المواد المضادة للاكسدة في عينة صنع قهوة اسبريسو. خاصة للاهتمام هي قمم كثافة عالية مع الاحتفاظ مرات من حوالي 5 دقائق. ويمكن ملاحظة أنه عند استخدام رد فعل الحلقة 500 ميكرولتر، وهو الأمر المعهود في DPPH • أساليب اشتقاق التقليدية، واحد، والذروة واسعة ويمكن ملاحظة. ومع ذلك، عند استخدام طريقة RF PCD دون الحاجة إلى وجود حلقة رد الفعل، يصبح من الواضح أن ذروة واحدة لاحظت باستخدام حلقة 500 ميكرولتر هي في الواقع اثنين من القمم. وعلاوة على ذلك، يمكن رؤية تفاصيل إضافية بعد 5.5 دقيقة عند استخدام الإعداد RF-PCD. وبالتالي، لتحليل ROS في العينات باستخدام DPPH • وتقنية RF-PCD ثبت لتكون متفوقة على الطرق التقليدية للتحليل ROS باستخدام DPPH •.

RF-PCD معوقد استخدمت كاشف fluorescamine لتحليل الأحماض الأمينية الأساسية وبالمقارنة مع الأشكال التقليدية للPCD مع fluorescamine 20. منذ العمود RF نهاية المناسب وفرت منصة للكشف عن المضاعفة أيضا، تم رصد تدفق المركزي underivatized عبر أشعة فوق البنفسجية فيس، في حين أجري في اشتقاق بين السائلة وfluorescamine في المنطقة الخارجية للRF نهاية المناسب والكشف عن طريق الأشعة فوق البنفسجية فيس. وقد تم تحليل سلسلة من المعايير اختبار تحتوي على أربعة الأحماض الأمينية في ظروف RF PCD المضاعفة الشكل 6 يقارن الشخصي الكروماتوغرافي للطريقة التقليدية من PCD (الشكل 6A) وRF-PCD (الكشف عن derivatized (الشكل 6B) وunderivatized (الشكل 6C)) من سلسلة من الأحماض الأمينية الشكل 7 هو تراكب إشارتين الأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها من خلال PCD التقليدية وRF-PCD. ويمكن ملاحظة أن الفصل الملحوظ أكثر كفاءة بسبب رلقد قاد إزالة حلقة رد فعل على أكبر استجابة إشارة، على الرغم من حقيقة أنه ليس كل من النفايات السائلة عمود وderivatized. وعلاوة على ذلك، أدى نظام أكثر كفاءة خلط اشتقاق كاشف في ضجيج خط الأساس أقل، الأمر الذي يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ويتضح هذا الأثر في الحد الأدنى لكشف وتحديد الكميات المحسوبة لطريقة RF-PCD بالمقارنة مع طريقة PCD التقليدية في الجدول 1. ويمكن أيضا أن ينظر إلى هذا الاتجاه في الشكل (5) حيث الاستجابة المضادة للأكسدة DPPH • أكبر ل طريقة RF-PCD بالمقارنة مع طريقة PCD التقليدية. كبير ذروة التدهور يمكن ملاحظتها في الاستشرابية حيث تم استخدام الإعداد PCD التقليدي الذي يؤدي إلى استجابة إشارة أقل من هذا الأسلوب.

الشكل 8 يقارن ذروة الملف الشخصى التربتوفان عند تحليلها من قبل RF-PCD (كلا النوعين من derivatized وunderivatized) وPCD التقليدية. عندما يتم رسم الشخصية الذروة مع الزمن بعرض الذروة تظهر كافة لتكون مشابهة على نطاق واسع (الشكل 8A). التحسينات الموجودة في RF-PCD مقارنة PCD التقليدي واضحة عندما يتم رسم الشخصية الذروة ضد ذروة حجم (الشكل 8B). عندما تآمر ضد ذروة حجم، فمن الواضح أنه في حين تظهر ذروة RF PCD كمية صغيرة من تدهور مقارنة مع ذروة underivatized، وتدهور، ومع ذلك، هو الحد الأدنى بالمقارنة مع تلك التي لوحظت من الأسلوب التقليدي PCD. وأظهرت التحسينات في كفاءة فصل RF-PCD مقارنة PCD التقليدية أيضا في الشكل 7 الذي يقارن بين الأشكال ذروة الجلايسين ويسين بعد اشتقاق كل من PCD التقليدية وRF-PCD. ويمكن ملاحظة أنه في وضع PCD التقليدية والجلايسين ويسين القمم هي بالكاد الأساس المنفصلة في وضع RF-PCD إشارة هي في الأساس لفترة أطول من ذلك بكثير بين القمتين.

لفائدة إضافية تتمثل في RF-PCD بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD هي القدرة على رصد النفايات السائلة underivatized من الميناء الرئيسي للعمود RF تمكين الكشف المضاعفة. وهذا ممكن تصميم فريت في نهاية تركيب RF لا يسمح تدفق في المنطقة الوسطى شعاعي لخلط مع تدفق في المنطقة المحيطية من نهاية مناسبة، مما يتيح رصد تيار derivatized من المنطقة الخارجية لل تركيب وكذلك رصد تيار underivatized من ميناء المركزي. ومن أبرز هذه القدرة من خلال النتائج التي تم الحصول عليها التربتوفان في الجدول رقم 1، والذي يعرف لديهم ضعف استجابة إشارة بعد اشتقاق من fluorescamine 20، ولكن، على عكس الأحماض الأمينية الأخرى التي تظهر استجابة لكاشف الأشعة فوق البنفسجية عند underivatized (280 نانومتر) . لكلا النظامين اشتقاق كانت حدود الكشف والكميات العالية نسبيا، إلا أن حدود الكشف والكميات كانت أقل من ذلك بكثير لرانه underivatized تيار. باستخدام القدرة على رصد كل تيارات النفايات السائلة derivatized وunderivatized قد يكون الأمثل المعلمات الكشف لإعطاء أعلى مستوى من الأداء لكل الأحماض الأمينية.

تصميم متعدد المنافذ للRF نهاية المناسب يسمح للتحليل اشتقاق كاشف المزدوج. سليم وآخرون. 23 التحقيق في أداء اثنين من الكواشف (4 aminoantipyrene وفيري سيانيد البوتاسيوم) باستخدام الظروف RF-PCD لتحليل المركبات الفينولية مقارنة مع تقنية التقليدية من PCD باستخدام 4-aminoantipyrene وفيري سيانيد البوتاسيوم. هذا النوع من تقنية PCD يتطلب اثنين من مضخات ورد فعل حلقات لكل كاشف اشتقاق بدلا من مضخة ورد فعل واحد حلقة لDPPH •. وقد تم تحليل مختلف المركبات الفينولية والألكايل بنزين في ظل الظروف التقليدية وRF PCD. ومن المثير للاهتمام، وكانت المركبات غير الفينولية التي لم تكتشف في ظل الطريقة التقليدية في الواقع الكشف عن الامم المتحدةدير الظروف RF-PCD الشكل 9 يبين استجابة الكروماتوغرافي أشعة فوق البنفسجية فيس واستجابة RF PCD اللونية إلى مزيج الاختبار المعياري. قدمت RF-PCD تقنية PCD مبسطة من حيث القياس، من دون أية تنازلات من أداء الانفصال كما لوحظ في الشكل 10 الشكل 10 يقارن ذروة الملف الشخصى ص -cresol عند تحليلها من قبل RF-PCD وأيضا من دون اشتقاق. ويمكن ملاحظة أن عرض ذروة اللوني RF-PCD هي مشابهة جدا لتلك التي اللوني underivatized. والفرق الرئيسي بين الاثنين هو أن الاستشرابية اللوني RF-PCD هو أوسع قليلا في القاعدة. وهذا يدل على أن هناك شيئا يذكر لولا الذروة تشتت بسبب تقنية RF PCD. ولوحظ وجود استجابة مماثلة في الشكل 9 مما يدل على أنه ليس فقط ع -cresol الذروة التي لديها ذروة عرض مماثل عندما derivatized التي كتبها RF-PCD بالمقارنة مع ذروته underivatized، ولكن كل الفينولات وalkyأظهرت lbenzenes التي ردت على مخطط اشتقاق هذا الاتجاه نفسه. وعلى الرغم من RF-PCD مع استخدام اثنين من الكواشف اشتقاق حصل على الأداء فصل مماثل لأسلوب غير اشتقاق التقليدية، يسمح للRF-PCD للكشف انتقائي من المركبات الفينولية، واحدة منها أن لم يتم الكشف في ظل ظروف غير derivatized .

كما RF-PCD هو تطوير أساليب HPLC PCD التقليدية، كل من أدوات ضبط المتاحة في أساليب HPLC العامة مثل تكوين مرحلة المحمول ومعدل التدفق، وحجم الحقن وتحليل الطول الموجي قابلة للتطبيق لأساليب RF-PCD. وعلاوة على ذلك، وأدوات ضبط المتاحة في أساليب HPLC PCD التقليدية، مثل الطور المتحرك PCD نسبة معدل تدفق كاشف لوكذلك تكوين كاشف PCD قابلة للتطبيق على أساليب RF-PCD. أداة ضبط الإضافية المتاحة عند استخدام RF-PCD غير متوفر في أساليب PCD التقليدية هي نسبة التدفقات القادمة من وسط والطرفيةموانئ العمود. يتم التحكم في التدفقات عن طريق تغيير الضغط الخلفي النسبي في كل من الأسطر عن طريق التحكم في طول و / أو القطر الداخلي للآخر كشف (أو نشر عمود إذا لم يتم الكشف عن تدفق قادمة من ميناء المركزي) أنابيب. النسبة المثلى من السلطة المركزية إلى تدفقات هامشية تعتمد على رد الفعل في المسألة، فضلا عن عوامل أخرى، مثل ما إذا كان يتم الكشف عن ميناء المركزي أم لا. وهناك نسبة تدفق 60٪ الطرفية و 40٪ المركزية وغالبا ما يكون نقطة انطلاق جيدة.

كما هو الحال مع معلمات التوليف، العديد من القضايا التي يمكن أن تنشأ مع استخدام العمود RF-PCD شائعة أيضا مع أساليب PCD التقليدية. واحد المعلمة خاصة أن chromatographer أن تكون على علم عند تنفيذ RF-PCD يحلل هو استقرار تدفق وضغط في النظام، ولا سيما أن من المضخة كاشف (ق). إذا كان تدفق في النظام ليست مستقرة، فإنه يمكن أن يسبب بالتالي عدم الاستقرار الأساسي في التناقص لإشارة إلى نسبة الضوضاء وبعد ذلك حدود الكميات والكشف.

وقد وضعت RF-PCD اللوني للتغلب على الصعوبات في التكيف مع ردود الفعل PCD إلى الأعمدة HPLC الحديثة ونظم. والميزة الرئيسية لRF-PCD بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD هو خلط أكثر كفاءة نظرا لأنها تجري داخل فريت داخل المناسب نهاية العمود الترددات اللاسلكية، وهذا الخلط هو عند ضغط أعلى قليلا إلى الوراء. وهذا يسمح للتقليل أو حتى القضاء على الحلقات رد فعل كبيرة الحجم التي تستخدم في العديد من الطرق PCD التقليدية. مع هذا التقليل من آخر عمود حجم القتلى، فصل أكثر كفاءة مع مزيد من قرار الكروماتوغرافي لا يمكن أن يؤديها.

وقد أدى الوضع RF-PCD تحسينات في كفاءة الفصل، ذروة الشكل والإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع الطرق التقليدية PCD. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن التحسينات إشارة وكاشف يعتمد. على سبيل المثال للكشف عنهذا المبلغ عينة تعتمد قد لا تظهر زيادة في استجابة إشارة في ظل ظروف RF-PCD بالمقارنة مع الطرق التقليدية. وهذا هو الحال لأنه في ظل الأساليب التقليدية تم الكشف عن 100٪ من عينة على العمود، حيث ظل ظروف RF-PCD سوى نسبة معينة من على عمود عينة تم الكشف اعتمادا على نسبة تجزئة. ولكن، من المتوقع أن ردود الفعل RF-PCD سوف تكون قادرة على أن تتكيف مع أي كاشف واحد أو اثنين (طالما يتم إضافة كل من الكواشف في نفس الوقت) PCD رد فعل مع الحد الأدنى من إعادة الأمثل وأن الفوائد لاحظ لجميع ثلاثة ردود الفعل اختبار حتى الآن سوف تترجم إلى جميع ردود الفعل PCD أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
  4. Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
  5. Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
  6. Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
  7. Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
  8. Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
  9. Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
  10. Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
  11. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
  12. Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
  13. Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
  14. Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
  15. Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
  16. Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
  17. Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
  18. Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
  19. Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
  20. Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
  21. Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
  22. Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
  23. Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. , (Accepted Manuscript) (2015).
  24. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
  25. Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
  26. Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
  27. Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
  28. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).

Tags

الكيمياء، العدد 110، عالية الأداء اللوني السائل، مشاركة العمود اشتقاق، رد الفعل التدفق اللوني، عمود التكنولوجيا، ومضادات الأكسدة، DPPH، الفينولات، الأحماض الأمينية، fluorescamine
آخر العمود اشتقاق عن طريق رد الفعل أعمدة تدفق عالية الأداء اللوني السائل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, … More

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter