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Chemistry

Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

doi: 10.3791/53462 Published: April 26, 2016

Introduction

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Chromatographie haute performance liquide (HPLC) couplée à la colonne après dérivatisation (PCD) est un outil puissant qui est utile dans la résolution d'un certain nombre de questions dans le laboratoire d'analyse. Il peut être utilisé pour détecter des composés qui sont par ailleurs indétectable à la série de détecteurs disponibles 1,2, augmenter le signal de l'analyte cible, ce qui permet aux limites inférieures de détection et la quantification ou de manière sélective 05/03 dérivatiser un analyte cible, afin d'éviter les effets de matrice 6. Les réactions PCD couramment utilisés comprennent la réaction des amines, telles que des acides aminés, avec l' ortho-phthaladehyde 7-9, ou ninhydrine 9,10 11,12 fluorescamine, la dérivatisation d'espèces réactives de l' oxygène (ERO) avec le 2,2-diphényl 1-picrylhydrazil radicaux DPPH (•) ou 13,14 2,2'-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) 15,16, et l'utilisation du réactif iodure azoture pour dériver du soufre ccomposés ontenant 17,18.

Il existe, cependant, de nombreux inconvénients à l'utilisation de réactions de PCD avec des systèmes HPLC 6. Parmi ceux - ci principalement l'utilisation de bobines de réaction entre le point d'addition du réactif de dérivatisation (s) et le détecteur, ce qui permet le temps de mélange et la réaction se produise 8. Ces réactions boucles ont souvent des volumes de 500 ul ou plus, ce qui est important par rapport au volume du reste du système HPLC 19. L'utilisation de ces réactions à volume élevé entraîne une augmentation de boucles élargissement du pic par rapport à celle qui serait observée en l'absence de la boucle de réaction. Il en résulte, des pics plus courts plus larges qui ont des limites plus élevées de quantification et de détection et négativement effets que la résolution chromatographique. Les figures 1 et 2 mettre en évidence la détérioration de la forme des pics qui résultent de l'addition de divers volumes de boucle de réaction post-colonne. cette analysea été réalisée avec une composition de phase mobile de 94% de methanol et de 6% d'eau Milli-Q. Le débit de la phase mobile d'écoulement était de 1 ml / min, le volume d'injection était de 20 ul et l'analyse de la longueur d'onde est de 265 nm. Des bobines de faire varier les volumes morts de 20 pi à 1000 pi ont été insérées entre la colonne et le détecteur pour simuler les effets de la boucle de réaction un volume mort dans les procédés de PCD. Ces boucles ont été préparés à partir d'un tube de diamètre intérieur 0,5 mm en acier inoxydable. L'expérience a été effectuée sur un système HPLC constitué d'un dispositif de commande (SCL-10Avp), un faible gradient de pression de soupape (LCM-10ALVP), une pompe (LC-20ad), un injecteur (SIL-10ADVP), et un détecteur (PDA SPD-M10ADVP). La phase mobile est pompée à travers un dégazeur avant l'introduction dans le système HPLC. La séparation a été effectuée en utilisant un x 4,6 mm id 5 um colonne de 250 mm. Les conditions expérimentales ont été choisies pour être typique de réactions PCD qui ont récemment été publiés dans la littérature.

lela plus simple, la configuration du réacteur à colonne de poste le plus commun est appelé un réacteur tubulaire non segmenté qui est effectivement un long tube mince à travers lequel le liquide peut couler et la réaction peut avoir lieu. Dans ce pic système élargissement dépend non seulement sur ​​le volume mort ajouté au système, mais aussi le diamètre intérieur du tube , comme mis en évidence par Iijima et al. , 8. En outre, la géométrie de la bobine joue un rôle dans la marque élargissement observée. Stewart a indiqué que 20 l' enroulement du réacteur modifie les profils d'écoulement secondaire, ce qui entraîne un meilleur mélange, ce qui signifie que le volume mort peut être réduite au minimum. Il a été déclaré que l' élargissement des pics est pas significative lors de l' utilisation d' un tube ouvert tricoté bobine 21. Lors de l'élargissement du pic est trop grande, d' autres types de réacteurs peuvent également être considérés 20,22. Ceux-ci peuvent comprendre des réacteurs à lit ou réacteurs à écoulement segmenté. Ces réacteurs sont particulièrement utiles pour des réactions lentes qui seraient autrement require grande réaction des boucles. Comme réacteurs tubulaires non-segmentés sont les types les plus courants de réacteurs utilisés dans les applications PCD, le reste de cet article traite de ce type de configuration du réacteur.

La conception de la colonne d'écoulement de réaction (RF) comprend un raccord d'extrémité à orifices multiples qui permet la phase mobile pour sortir (ou entrée) de la colonne à travers un seul port situé dans la zone centrale radiale de la colonne ou trois ports situés à l'extérieur région de paroi de la colonne (voir figure 3). Ces deux courants sont séparés au moyen d'un raccord d'extrémité contenant une fritte poreuse centrale qui est entourée par un anneau imperméable qui est à son tour entourée par une fritte poreuse externe qui se prolonge vers la paroi de la colonne. En raison de l'écoulement imperméable bague de croix centrale est pas possible entre les deux régions poreuses.

Au cours de la Chromatographie d'écoulement de réaction, le réactif (s) de dérivation sont pompés à l'encontre du sens d'écoulement de la phase mobile dans une ou two des orifices extérieurs de la colonne d'écoulement de réaction. L'éluant de la colonne est mélangée avec le réactif (s) de dérivatisation dans la fritte externe et transmis au détecteur à travers un orifice externe libre. écoulement de réaction peut être utilisé soit pour un dérivé réactif unique (1 port du réactif de dérivatisation, 1 port pour passer l'éluant de la colonne au détecteur et 1 port bloqué) ou d'un système réactif à deux (2 ports pour les réactifs de dérivatisation et 1 port passer la colonne éluant au détecteur). Le débit du courant central peut soit être utilisé pour détecter l'éluant de la colonne dérivatisé, la détection efficace de multiplexage 23, ou passé à perdre.

Une technique de réglage principal qui est disponible lors de l'exécution chromatographie RF-CPD est le rapport entre les flux centraux et périphériques. Le rapport optimal pour chaque dérivatisation dépend d'un certain nombre de facteurs, tels que l'écoulement central sera détecté ou transmis à déchets. Par conséquent, une fois que le rapport optimal a été déterminé, Il faut veiller à ce que le rapport de débit correct est réalisé avant chaque exécution en cours d'exécution.

Il a été constaté que l'utilisation d'une fritte pour mélanger le courant colonne d'éluant et le réactif de dérivatisation dans les résultats RF-CPD dans un mélange plus efficace par rapport à des techniques de mélange classiques qui emploient typiquement une pièce en T à zéro du volume mort ou de faible volume mort W- pièce à mélanger les deux courants. Ceci a permis l'utilisation de relativement petites boucles de réaction, voire la suppression de la boucle de réaction au total. La diminution des résultats de la taille de réaction en boucle pics plus par rapport aux méthodes traditionnelles de dérivatisation post-colonne. Cela signifie que, en dépit du fait que la totalité de l'éluant de la colonne est dérivatisé, un plus grand rapport signal sur bruit sont observés et donc des limites inférieures de détection et la quantification peut être réalisée.

Chromatographie d'écoulement de réaction a été mis au point pour surmonter les difficultés d'adaptation de la réaction de CPDs aux colonnes modernes de CLHP et de systèmes, en particulier la perte d'efficacité causée par l'élargissement de bande en raison de grands volumes morts après des colonnes causées par la nécessité d'employer la réaction de grand volume boucles. Les procédés de mélange plus efficaces RF-PCD PCD par rapport au conventionnel signifie que le volume de la boucle de réaction inférieures peuvent être employées conduisant à une augmentation de l'efficacité de la séparation observée. Par ailleurs Chromatographie RF-PCD montre à la fois le signal augmenté et diminué de bruit par rapport aux techniques de PCD classiques aboutissant à des limites inférieures de détection et la quantification par rapport aux méthodes de PCD classiques. Un autre avantage de la CPD-RF par rapport aux méthodes classiques de la CPD est la capacité à surveiller le courant dérivatisé qui est élué à partir de l'orifice central de la colonne HF ainsi que le courant dérivé qui est élué à partir de la région périphérique de la colonne. RF-PCD est relativement nouvelle mais prometteuse technique qui affiche de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles de PCD.

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Protocol

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Attention: S'il vous plaît se référer à des fiches de données de sécurité (FDS) pour tous les matériaux et réactifs avant utilisation (c. -à- FS pour le méthanol). Assurer l'utilisation de toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la manipulation des solvants et chromatographie liquide haute performance (HPLC) éluant. Veiller à l'utilisation appropriée des contrôles techniques de HPLC analytique équilibre et détecteur instrumentation, et d'assurer l'utilisation des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, et des chaussures fermées).

Remarque: Ce protocole décrit 3 méthodes de flux de réaction dérivatisation post-colonne (RF-PCD) techniques, chacune avec un réactif différent spécifique à la nature d'un composé chimique d'intérêt. Pour l'analyse des ROS passez à la section «1. Détection des ROS en utilisant DPPH •", pour l'analyse des amines primaires voir section "2. Détection des amines primaires en utilisant fluorescamine", et pour l'analyse des composés phénoliques passez à la section "3 . La détection des phénolsen utilisant 4-aminoantipyrine et ferricyanure de potassium ". Utiliser de l' eau ultra-pure (par exemple, l' eau Milli-Q) tout au long.

Remarque: la connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu'une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d'extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC.

1. Détection des ERO Utilisation DPPH

  1. Mise en place d'instrument HPLC
    1. Préparation de l'instrument HPLC avec 100% d'eau sur la ligne A et 100% de methanol à la ligne B en tant que phase mobile. Purger les pompes selon les exigences du fabricant.
    2. Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A.
    3. Régler le détecteur UV-Vis à analyser à une longueur d'onde de 520 nm.
  2. Mise en place decolonne RF
    1. Relier l'entrée de la colonne de RF à l'instrument CLHP.
    2. Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l'orifice de sortie central de la colonne HF.
    3. Connecter un orifice périphérique de sortie du détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id.
    4. Connectez la ligne de pompe DPPH à un port périphérique sur la sortie de la colonne de RF.
    5. Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne.
    6. Porter le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne B - 100% de methanol.
    7. Équilibrer la colonne avec la phase mobile 100% de methanol pendant 10 minutes pour une colonne de longueur mm 4,6 mm DI x 100. Ce temps doit être adapté en fonction des dimensions des autres colonnes, l'utilisateur peut employer.
  3. Préparation du DPPH réactif
    1. Préparer une solution / ml 0,1 mg de DPPH dans le méthanol. Soniquer le flacon contenant le DPPH réactif pendant 10 min.
    2. Couvrir le flacon dans du papier pour éviter l'exposition à la lumière.
    3. Purger le DPPH pompe avec le prêt DPPH réactif selon les exigences du fabricant.
  4. Réglage de la sortie de la colonne HF
    1. Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l'autre périphérique.
    2. Recueillir l'effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min.
    3. Repeser le récipient de port central et calculer le poids de l'écoulement depuis l'orifice central de la manière suivante:
      Poids de Port centrale (g) = Poids final de Port Central navire (g) - Poids initial de Port Central navire (g)
    4. Répéter les étapes 1.4.2 et 1.4.3 de l'effluent sortant de l'UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids du récipient de port périphérique quesuit:
      Poids du port périphérique (g) = Poids final du port périphérique navire (g) - poids initial du port périphérique navire (g)
    5. Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit:
      % Port Central = Poids de Port centrale (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100
      % Port périphérique = Poids du port périphérique (g) / (poids de Port centrale (g) + Poids du port périphérique (g)) x 100
    6. Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 30:70 (central: périphérique). Si l'écoulement central est supérieure à 30%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l'orifice central. Si l'écoulement central est inférieure à 30% diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central.
    7. Répétez l'étape 1.4.1 à 1.4.6 jusqu'à ce qu'un rapport de segmentation de 30:70 (central: périphérique) est atteint.
    8. Réglez le taux de la D d'écoulementPPH pompe de réactif à 0,5 ml min -1.
      Remarque: La colonne RF mis en place avec DPPH réactif est maintenant prêt pour l' analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés.
  5. Déposer exécuter des conditions d'arrêt
    1. Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter le débit de la pompe de réactif de dérivatisation.
    2. Retirez le DPPH ligne de pompe de réactif du port périphérique et boucher le port.
    3. Équilibrer la colonne avec la phase mobile dans laquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min.
    4. Arrêter l'écoulement de la pompe de la phase mobile de l'instrument CLHP.
    5. Remplacer le DPPH réactif avec du méthanol et purger la pompe supplémentaire.
      Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté.

2. Détection de Amines primaires Utilisation Fluorescamine

  1. Préparation de la phase mobile
    1. Préparer 1 L d'une solution 10 mM d'acétate d'ammonium, en ajustant le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d'hydroxyde d'ammonium avant la dilution au volume.
    2. Ajouter 52,6 ml d'acétonitrile (ACN) dans le tampon d'acétate d'ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95:05 (tampon: ACN).
  2. Mise en place d'instrument HPLC
    1. Préparation de l'instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon les exigences du fabricant.
    2. Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et la pompe de dérivation supplémentaire , comme illustré sur la figure 4A.
    3. Fixer une bobine impulsion de l'amortisseur à la pompe de dérivation.
    4. Mettre en place le détecteur de fluorescence (FLD) avec une longueur d'onde d'excitation de 390 nm et une longueur d'onde d'émission de 475 nm.
  3. Mise en place de la colonne RF
    1. Connectez el'entrée e de la colonne de RF à l'instrument CLHP.
    2. Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l'orifice de sortie central de la colonne HF.
    3. Connecter un port périphérique sortie de la colonne HF au détecteur FLD en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id.
    4. Connecter la ligne de la pompe à dérivatisation à un port périphérique sur la sortie de la colonne HF.
    5. Bloquer le port de périphérique utilisé sur la sortie de la colonne RF en utilisant un bouchon de colonne.
    6. Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 10 mM de tampon d'acétate d' ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% d' ACN.
    7. Equilibrer la colonne avec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l'échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l'utilisateur peut employer.
  4. Préparation du réactif à la fluorescamine
    1. Faire 100 ml d'un ml -1 fluorescamine réactif 0,1 mg.
    2. <li> Soniquer pendant 1 min.
    3. Couvrir de papier d'aluminium pour éviter l'exposition à la lumière.
    4. Purger la pompe de réactif avec le réactif fluorescamine préparé selon les exigences du fabricant.
  5. Réglage de la sortie de la colonne HF
    1. Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l'autre périphérique.
    2. Recueillir l'effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min.
    3. Peser le récipient central et calculer le poids de l'écoulement de l'orifice central de la manière suivante à l'étape 1.4.3.
    4. À répéter les étapes 2.5.2 2.5.3 de l'effluent sortant de la FLD qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l'étape 1.4.4.
    5. Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l'étape 1.4.5.
    6. Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et périphériquedébit est 43:57 (central: périphérique). Si l'écoulement central est supérieur à 43%, de diminuer la quantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm Tuyau identifiant à la sortie de l'orifice central. Si l'écoulement central est inférieure à 43%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central.
    7. Répétez l'étape 2.5.1 à 2.5.6 jusqu'à ce qu'un rapport de segmentation de 43:57 (central: périphérique) est atteint.
    8. Régler le débit de la pompe de la phase mobile de débit à 0,7 ml min -1.
    9. Réglez la pompe de dérivation à l' écoulement à 0,1 ml min -1.
      Remarque: La colonne RF mis en place avec le réactif fluorescamine est maintenant prêt pour l'analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés.
  6. Déposer exécuter des conditions d'arrêt
    1. Une fois que tous les échantillons ont été injectés, ce qui indique que la course est terminée, arrêter la pompe de dérivation.
    2. Retirer la ligne de pompe de dérivation du port périphérique et le bouchon.
    3. Équilibrer la colonne avec la phase mobilelaquelle il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min.
    4. Arrêter l'écoulement de la pompe de la phase mobile.
    5. Remplacer le réactif fluorescamine avec de l'acétonitrile et purger la pompe de dérivation.
      Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté.

3. Détection de Phénols Utilisation 4-aminoantipyrine et Potassium Ferricyanide

  1. Préparation de la phase mobile
    1. Préparer 1 L d'une solution d'acétate d'ammonium 100 mM, on ajuste le pH de la solution à 9,0 avec de 5 M d'hydroxyde d'ammonium avant la dilution au volume.
    2. Ajouter 52,6 ml de méthanol dans le tampon d'acétate d'ammonium pour obtenir une phase mobile prémélangée de 95: 5 (tampon: methanol).
  2. Mise en place d'instrument HPLC
    1. Préparation de l'instrument HPLC avec le tampon préparé préalablement mélangé à la ligne A en tant que phase mobile. Purger la pompe selon fabricant »; S exigences.
    2. Mettre en place les composants instrumentaux HPLC et les deux pompes de réactif supplémentaires , comme illustré sur la figure 4B.
    3. Fixer une bobine impulsion de l'amortisseur à chacune des pompes de réactif.
    4. Régler le détecteur UV-Vis pour analyser à une longueur d'onde de 500 nm.
  3. Mise en place de la colonne RF
    1. Relier l'entrée de la colonne de RF à l'instrument CLHP.
    2. Connecter une longueur de 15 cm de 0,13 mm id tube à l'orifice de sortie central de la colonne HF.
    3. Connecter un port périphérique sortie de la colonne RF au détecteur UV-Vis en utilisant une longueur de 15 cm de 0,13 mm Tuyau id.
    4. Connecter chaque réactif ( par exemple, la 4-aminoantipyrine et du ferricyanure de potassium) , la ligne de la pompe à un orifice périphérique à la sortie de la colonne HF.
    5. Amener le débit de la pompe HPLC de débit à 1 ml min -1 à 100% de la ligne A - 100 mM de tampon d'acétate d' ammonium à pH 9, prémélangée avec 5% de methanol.
    6. Équilibrer la colonne wvec la ligne A phase mobile 100% pendant 10 min pour une colonne de longueur mm 4,6 mm id x 100. Ce temps peut être mis à l'échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l'utilisateur peut employer.
  4. Préparation du réactif 4-aminoantipyrine
    1. Préparer un tampon d'acétate d'ammonium avec un pH de 9 par suite de l'étape 3.1.1.
    2. Peser 150 mg de 4-aminoantipyrine et le dissoudre dans 100 ml de tampon d'acétate d'ammonium préparé (pH 9).
    3. Sonication pendant 1 min.
    4. Couvrir de papier d'aluminium pour éviter l'exposition à la lumière.
    5. Purger la première pompe de réactif avec le réactif préparé 4-aminoantipyrine selon les exigences du fabricant.
  5. Préparation du réactif de potassium , le ferricyanure
    1. Peser 150 mg de ferricyanure de potassium et de se dissoudre dans 100 ml de tampon d'acétate d'ammonium (pH 9) préparés selon l'étape 3.1.1.
    2. Sonication pendant 1 min.
    3. Couvrir de papier d'aluminium pour éviter l'exposition à la lumière.
    4. Purge la seconde pompe de réactif avec le réactif de ferricyanure de potassium préparé selon les exigences du fabricant.
  6. Tuning de la colonne RF
    1. Peser deux navires propres et secs. Etiqueter un navire comme un élément central et l'autre périphérique.
    2. Recueillir l'effluent sortant du port central dans le récipient étiqueté central pour 1,0 min.
    3. Peser le récipient central et calculer le poids de l'écoulement de l'orifice central de la manière suivante à l'étape 1.4.3.
    4. Répéter les étapes 3.6.2 à 3.6.3 pour l'effluent sortant de l'UV-Vis qui est attaché au port périphérique de la colonne HF et de calculer le poids pour périphérique de la façon suivante à l'étape 1.4.4.
    5. Calculer le pourcentage du flux provenant des orifices centraux et périphériques comme suit dans l'étape 1.4.5.
    6. Assurer le rapport de segmentation entre le flux central et le flux périphérique est 50:50 (central: périphérique). Si l'écoulement central est supérieure à 50%, diminuer laquantité de flux sortant en ajoutant une longueur de 0,13 mm, un tube d'identification au centre port de sortie. Si l'écoulement central est inférieure à 50%, diminuer la longueur de 0,13 mm tube du port central.
    7. Répétez l'étape 3.6.1 à 3.6.6 jusqu'à ce qu'un rapport de segmentation de 50:50 (central: périphérique) est atteint.
    8. Régler le débit de la pompe 4-aminoantipyrine débit à 0,5 ml min -1.
    9. Régler le débit de la pompe de ferricyanure de potassium d'écoulement de 0,25 ml min -1.
      Remarque: La colonne RF mis en place avec les réactifs à deux composants est maintenant prêt pour l'analyse. Les échantillons peuvent maintenant être injectés.
  7. Déposer exécuter des conditions d'arrêt
    1. Une fois que tous les échantillons ont été injectés la course est terminée, ce qui indique que la course est terminée, arrêtez les deux pompes de réactif.
    2. Supprimer les lignes de pompe à réactif à partir des orifices périphériques et les remplacer par un morceau de 0,13 mm Tuyau 15 cm.
    3. Equilibrer la colonne avec la phase mobile dans which , il doit être stocké en permettant à la phase mobile de passer à travers la colonne à 1 ml min - 1 pendant 10 min.
    4. Arrêter l'écoulement de la pompe de la phase mobile de l'instrument CLHP.
    5. Remplacer les deux réactifs sur le réactif pompes avec du méthanol et purger les pompes supplémentaires selon l'exigence du fabricant.
      Remarque: Le système HPLC peut maintenant être arrêté.

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Representative Results

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La première méthode PCD qui a été adapté pour être utilisé par RF-PCD est la dérivatisation d'antioxydants en utilisant le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Cette réaction a été introduit par Koleva et al. , 25 et a été largement utilisée depuis. La détection repose sur la décoloration du DPPH radicalaire en présence d'espèces réactives de l' oxygène, d' où la présence d'anti - oxydants se traduit par une diminution de l'absorbance observée. DPPH réaction emploie souvent de grandes boucles de réaction de 500 ul ou plus 13-15, mais il a été constaté que l'utilisation de la colonne HF-PCD aucune boucle de réaction est nécessaire. La figure 5 montre deux chromatogrammes d'un échantillon de café ristretto dérivatisés en utilisant la DPPH radicale utilisant à la fois PCD classique et RF-PCD instrumentation.

La seconde méthode PCD qui a été adapté pour être utilisé par RF-PCD est la derivatization de quatre acides aminés (glycine, la leucine, la phénylalanine et le tryptophane) en utilisant la fluorescamine comme réactif de dérivatisation 23. La méthode a été adaptée de l'ouvrage de Udenfriend et al. 11 avec la composition mobiles de phase, la concentration fluorescamine et débit fluorescamine optimisé pour une utilisation avec des colonnes RF. Le procédé classique utilise un système de dérivation à deux réactifs où le pH 9,0 tampon a été ajouté au courant d'effluent avant l'addition du réactif à la fluorescamine, tandis que le procédé HF-PCD utilisé une phase mobile qui a déjà en mémoire tampon, ainsi qu'un système de transformation en dérivé réactif unique était nécessaire. Pour cette application, le flux dérivatisé a été analysé à 390 nm en utilisant un détecteur UV-visible, ce qui correspond à la longueur d'onde d'excitation utilisée pour la détection par fluorescence. Le courant dérivé peut être détectée en utilisant un détecteur de fluorescence, donnant plus de signal au bruit et aux limites donc inférieures de détection et quantitation, selon les travaux de Udenfriend et al. 11. En outre, l'éluant provenant de l'orifice central de la configuration RF-CPD a été contrôlée en utilisant un deuxième détecteur UV-visible.

La performance du procédé HF-PCD pour la dérivatisation des acides aminés a été comparée à la table PCD procédé classique. 1 énumère les limites calculées de quantification et de détection pour chacun des acides aminés analysés dans les deux RF-CPD et les modes de PCD classiques. La limite de détection a été définie comme la concentration à laquelle un rapport signal sur bruit de 2 a été obtenu alors que la limite de quantification a été définie comme la concentration à laquelle un rapport signal sur bruit de 10 a été obtenue. La figure 6 montre un chromatogramme de quatre les acides aminés analysés en utilisant la méthode conventionnelle de PCD, le procédé HF-PCD et le courant non dérivé à partir du procédé RF-CPD. la figure 7 est une comparaison des signaux obtenus pour le poisalk en raison de la glycine et de la leucine utilisant à la fois le procédé PCD classique et la méthode RF-CPD. La figure 8 compare la largeur du pic du pic du tryptophane lors de l' analyse selon la méthode de la CPD classique, le procédé RF-PCD et le courant non dérivé du RF- méthode PCD.

Le procédé de la CPD finale qui a été adapté pour être utilisé par RF-PCD 26 est la dérivatisation de quatre phénols (phénol, le 4-méthoxyphénol, le p - crésol et du tocopherol). La méthode a été adaptée du travail par Bigley et Grob 27 avec des modifications mineures pour optimiser la méthode pour une utilisation avec des colonnes RF. Ces travaux ont utilisé une réaction de dérivatisation à deux composants, dans lesquels des solutions de l'autre 4-amionantiprine et du ferricyanure de potassium ont été ajoutés à l'éluant de la colonne au niveau du raccord de la colonne HF d'extrémité. Il a été constaté que , lorsqu'on utilise une colonne RF pour la réaction des boucles de réaction post - colonne supplémentaires devaient être utilisées. La figure 9 montre un exemple d'un chromatogramme oùun échantillon d'essai de 21 composant qui contenait certains éléments qui montrent une réponse au régime de dérivatisation et d'autres qui ne sont pas, ont été séparés, dérivatisé et détecté (trace noire). Le même mélange a également été séparé et détecté dérivatisé pour la comparaison (trace rouge). Sur la figure 9 , la réponse RF-PCD a été affichée comme une réponse négative pour faciliter la distinction visuelle (la réponse du détecteur obtenu est positif). La figure 10 montre une comparaison de la forme du pic de p - crésol à la fois transformé en dérivé en utilisant la colonne HF-PCD et non dérivé.

Figure 1
Figure 1. chromatographiques de recouvrement hexylbenzène injecté dans un système HPLC avec diverses quantités ajoutées entre la colonne et le détecteur morts. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. chromatographique overlay de toluène, éthylbenzène et propylbenzène injecté sur un système HPLC avec différents volumes ajoutés entre la colonne et le détecteur morts. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Illustration de la conception de la colonne de réaction de débit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Instrumental mis en place des RF-PCD. (A) de réactif unique (c. -à- DPPH ou des réactifs de dérivatisation fluorescamine) et (B) à double réactif (c. -à- 4-aminoantipyrine et ferricyanure de potassium réactifs de dérivatisation). S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Chromatogrammes de la séparation du café ristretto avec détection après dérivatisation post-colonne en utilisant le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazil (DPPH •). La transformation en dérivé a été réalisée en utilisant une colonne classique avec une bobine de réaction de 500 ul (A) et une colonne d'écoulement de réaction (B rong>). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
La figure 6. chromatographiques superposition de quatre acides aminés (glycine (G), leucine (L), la phénylalanine (P) et le tryptophane (T)) dans la gamme de 10 à 1000 ppm détectée par postcolonne dérivatisation en utilisant la fluorescamine comme réactif après PCD séparation par HPLC. Les chromatogrammes sont les suivantes: (A) PCD classique, (B) RF-PCD, et (C) central (dérivatisé) Port de RF-PCD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 7. Comparaison des signaux obtenus pour la glycine (premier pic) et leucine (second pic) de PCD classique (trace rouge) et RF-PCD (de trace noire). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8. Pic Comparaison de la largeur du pic dû à tryptophane sur la base (A) temps de rétention et (B) le volume de pointe. La trace noire montre la méthode de PCD classique, la trace rouge indique la méthode RF-PCD et la trace verte indique la flux non dérivé du port central de la méthode de RF-PCD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

tente "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 9
Figure 9. La séparation chromatographique d'un échantillon artificiel. Les composants comprennent le phénol (P), de 4-méthoxyphénol (M), p - crésol (C) et le tocopherol (T) ainsi que de nombreuses alkylbenzènes, les hydrocarbures aromatiques polynucléaires, l' anisole, phentanole, la caféine, la phénylalanine et le benzamide. Les pics i étiquetés, ii et iii sont alkylbenzènes qui ont répondu de manière inattendue au régime de dérivatisation. La trace noire représente la réponse dérivatisé à l'aide d'un détecteur UV à 254 nm tandis que la trace rouge représente la réponse dérivatisé à 500 nm. Note pour la clarté visuelle la réponse dérivatisé a été inversée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10 Figure 10. réponse chromatographique de p - crésol. La trace noire représente la réponse dérivatisé à l' aide d' un détecteur UV à 254 nm tandis que la trace rouge représente le (RF-PCD) réponse dérivatisé à 500 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande ce chiffre.

Type de réaction Glycine leucine phénylalanine tryptophane
LOD (ppm) LQ (ppm) LOD (ppm) LQ (ppm) LOD (ppm) LQ (ppm) LOD (ppm) LQ (ppm)
RF-PCD 6 25 dix 100 25 250 50 250
Orifice central RF-CPD (non dérivé) Non-détecté Non-détecté Non-détecté 1 dix
PCD conventionnel dix 100 50 500 50 500 100 500

Tableau 1. Les limites de détection et la quantification de quatre acides aminés différents détectés par les différents systèmes de post colonne de dérivatisation en utilisant la fluorescamine comme réactif de dérivatisation après séparation par HPLC.

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Discussion

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RF-PCD permet le mélange efficace du réactif de dérivatisation avec le post-colonne HPLC effluent sans l'utilisation de bobines de réaction, minimisant ainsi les effets de l'élargissement de bande et améliorer la performance de séparation. Méthodes RF-CPD ont également montré l'amélioration de la réponse du signal par rapport au procédé de détection. Camenzuli et al. 28 a été le premier à signaler l'utilisation de colonnes de flux de réaction avec DPPH pour la détection de ROS dans un échantillon de café expresso. Leur étude a porté sur l'analyse et l' optimisation des conditions RF pour atteindre des performances optimales, tester une gamme de DPPH concentrations avec divers DPPH débits de réactif. Il a été conclu que DPPH concentration 0,1 mg ml -1 avec un DPPH débit de 0,5 ml min de réactif -1 était optimale pour une meilleure performance de séparation (ie, l' efficacité et la sensibilité) sous RF-PCDdes conditions par rapport à la méthode conventionnelle de PCD DPPH dérivatisation. La figure 5 montre deux chromatogrammes utilisant le DPPH dosage d'antioxydants dans un échantillon de café expresso. Particulièrement intéressants sont les pics d'intensité élevée avec des temps de rétention d'environ 5 minutes. On peut voir que , lorsqu'on utilise une boucle de réaction de 500 ul, ce qui est typique de DPPH Les méthodes traditionnelles de dérivatisation, un seul pic large peut être observée. Toutefois, lorsque le procédé HF-PCD est utilisé sans le besoin d'une boucle de réaction, il devient clair que le seul pic observé en utilisant une boucle de 500 ul est en effet deux pics. En outre, des détails supplémentaires peut être vu après 5,5 min lors de l'utilisation de la configuration RF-PCD. Ainsi, pour l'analyse des ERO dans les échantillons en utilisant le DPPH la technique de RF-CPD avérée être supérieure à celle des procédés classiques d'analyse des ROS en utilisant le DPPH •.

RF-CPD avecle réactif à la fluorescamine a été utilisée pour l'analyse des acides aminés primaires et par rapport aux formes classiques de PCD avec la fluorescamine 20. Etant donné que la colonne RF embout fournit également une plate-forme pour la détection multiplexée, l'écoulement central dérivatisé a été surveillée par UV-Vis, tandis que la dérivation entre les effluents et la fluorescamine a été effectuée dans la zone extérieure de l'embout RF et détecté par l'intermédiaire UV- vis. Une série de normes d'essai contenant au moins quatre acides aminés ont été analysés dans des conditions de RF-CPD multiplexés. La figure 6 compare le profil chromatographique pour la méthode conventionnelle de PCD (figure 6A) et RF-CPD (détection de dérivatisé (figure 6B) et non dérivé (Figure 6C)) de la série des acides aminés. la figure 7 est une superposition de deux acides aminés obtenus par des signaux classiques de PCD et RF-CPD. On peut constater que la séparation observée plus efficace en raison de til enlèvement de la boucle de réaction a conduit à une plus grande réponse du signal, en dépit du fait que la totalité de l'effluent de la colonne a été dérivatisé. En outre, le système de mélange de réactif de dérivatisation plus efficace a donné lieu à un bruit de fond plus faible, augmentant encore le rapport signal sur bruit. Cet effet est confirmé dans les limites inférieures de détection et de quantification calculé pour le procédé HF-PCD par rapport au procédé PCD classique dans le tableau 1. Cette tendance est également visible sur la figure 5 où la réponse anti - oxydant à DPPH est supérieure à la RF.Procédé-PCD par rapport à la méthode conventionnelle de PCD. Pic significatif détérioration peut être observé dans les chromatogrammes où une installation conventionnelle de PCD a utilisé ce qui conduit à la réponse de signal faible de cette méthode.

Figure 8 compare le profil de pic de tryptophane lorsqu'il est analysé par RF-PCD ( les deux courants dérivés et non dérivés) et PCD classique. Lorsque le profil de pic est tracée en fonction du temps les largeurs des pics apparaissent tout à peu près similaires (figure 8A). Les améliorations trouvées dans RF-PCD par rapport aux PCD classiques sont évidents lorsque le profil de pic est tracée en fonction du volume de pointe (figure 8B). Lorsqu'elle est tracée en fonction du volume des pics, il est clair que, bien que le pic de RF-CPD montre une petite quantité de dégradation par rapport au pic dérivatisé, la dégradation est cependant minime par rapport à celle observée à partir de la méthode conventionnelle de PCD. Les améliorations de l' efficacité de séparation des RF-PCD par rapport à PCD classique sont également démontré dans la figure 7 , qui compare les formes des pics de glycine et de la leucine après dérivatisation par deux PCD classique et RF-PCD. On peut voir que dans le mode DPC classique, la glycine et de la leucine pics sont à peine séparés de référence en mode RF-CPD le signal est au niveau de référence pendant une période beaucoup plus longue entre les deux pics.

Unavantage supplémentaire de RF-PCD PCD par rapport aux méthodes classiques est la possibilité de surveiller l'effluent non dérivé de l'orifice central de la colonne RF permettant une détection multiplexe. Ceci est rendu possible que la conception de la fritte à l'intérieur de l'embout RF ne permet pas l'écoulement dans la zone centrale radiale de se mélanger avec l'écoulement dans la zone périphérique de l'embout, permettant ainsi une surveillance du courant dérivé de la région extérieure de la mise en place ainsi que la surveillance du courant non dérivé du port central. Cette capacité est mise en évidence par les résultats obtenus pour le tryptophane dans le tableau 1, qui est connu pour avoir une réponse de signal faible après dérivatisation par la fluorescamine 20 Cependant, contrairement aux autres acides aminés , elle montre une réponse à un détecteur UV lorsque non dérivé (à 280 nm) . Pour les deux systèmes de dérivatisation les limites de détection et la quantification étaient relativement élevés, mais les limites de détection et la quantification étaient beaucoup plus faibles pour le til dérivatisés flux. Utilisation de la capacité de surveiller les deux courants dérivés et non dérivés des effluents les paramètres de détection peuvent être optimisés pour donner le plus haut niveau de performance pour chaque acide aminé.

La conception multiport du RF embout permet de double analyse de réactif de dérivatisation. Selim et al. 23 a étudié la performance de deux réactifs (4-aminoantipyrène et de ferricyanure de potassium) en utilisant des conditions RF-PCD pour l'analyse des composés phénoliques par rapport à la technique conventionnelle de PCD utilisant la 4-aminoantipyrine et du ferricyanure de potassium. Ce type de technique PCD nécessite deux pompes et de la réaction des boucles pour chaque réactif de dérivatisation par opposition à une pompe et de réaction en boucle pour DPPH •. Divers phénoliques et alkylbenzène composés ont été analysés dans des conditions classiques et RF PCD. Fait intéressant, les composés non phénoliques qui ne sont pas détectées par la méthode conventionnelle étaient en fait détecté nonder des conditions RF-PCD. Figure 9 montre la réponse chromatographique UV-Vis et la réponse colorimétrique RF-PCD à un mélange de test standard. RF-PCD a fourni une technique de PCD simplifiée en termes d'instrumentation, sans compromis de performance de séparation comme observé dans la figure 10. Figure 10 compare le profil de pic de p - crésol lorsqu'il est analysé par RF-PCD et aussi sans dérivatisation. On peut voir que la largeur du pic du chromatogramme RF-PCD est très similaire à celle du chromatogramme dérivatisé. La différence majeure entre les deux chromatogrammes est que le chromatogramme RF-PCD est légèrement plus large à la base. Cela montre qu'il ya peu ou pas de dispersion de pic dû à la technique RF-PCD. Une réponse similaire a été observée sur la figure 9 qui montre qu'il est non seulement le pic de p - crésol ayant la même largeur de pic lorsque dérivatisé par RF-CPD par rapport à son point culminant dérivatisé, mais tous les phénols et alkylbenzenes qui ont répondu au régime de dérivatisation ont montré la même tendance. Bien que, RF-PCD avec l'utilisation de deux réactifs de dérivatisation a obtenu une performance de séparation similaire à la méthode non dérivatisation classique, le RF-PCD a permis la détection sélective de composés phénoliques, dont une qui n'a pas été détecté dans des conditions non dérivatisés .

Comme RF-PCD est un développement des procédés de HPLC-PCD classiques, tous les outils de réglage disponibles dans des procédés de HPLC généraux tels que la composition de la phase mobile et le débit, le volume d'injection et une analyse de longueur d'onde sont applicables aux méthodes RF-CPD. En outre, les outils de réglage disponibles dans des procédés de HPLC-PCD classiques, telles que la phase mobile de CPD flux de réactif rapport de vitesse ainsi que la composition de réactif PCD sont applicables aux procédés RF-CPD. Un outil de réglage supplémentaire disponible pour l'utilisation de RF-CPD qui ne sont pas disponibles dans les procédés classiques de la CPD est le rapport du flux en provenance du central et périphérique,les ports de la colonne. Les débits sont contrôlés en modifiant la pression relative sur chacune des lignes en contrôlant la longueur et / ou le diamètre interne du détecteur de message (ou post colonne si le flux venant de l'orifice central n'a pas été détectée) tubulure. Le rapport optimal de la centrale aux flux périphériques dépend de la réaction en question, ainsi que d'autres facteurs, tels que, si l'orifice central est détecté ou non. Un rapport de débit de 60% périphérique et 40% central est souvent un bon point de départ.

Comme avec les paramètres de réglage, un grand nombre des problèmes qui peuvent survenir avec l'utilisation de la colonne RF-PCD sont également fréquents avec les méthodes de PCD classiques. Un paramètre particulier que le chromatographe doit être conscient lors de l'exécution des analyses RF-PCD est la stabilité de l'écoulement et de la pression dans le système, en particulier celui de la pompe (s) de réactif. Si le débit dans le système est stable, il peut entraîner une instabilité de base diminuant donc larapport signal sur bruit et par la suite les limites de quantification et de détection.

Chromatographie RF-PCD a été développé pour surmonter les difficultés d'adaptation des réactions PCD à des colonnes et des systèmes HPLC modernes. Le principal avantage de RF-PCD par rapport aux méthodes classiques de PCD est un mélange plus efficace en raison de ce qui se déroule à l'intérieur d'une fritte dans le raccord de la colonne RF de fin, et ce mélange est à une pression légèrement supérieure arrière. Cela permet de minimiser, voire d'éliminer les grandes boucles de réaction de volume qui sont utilisés dans de nombreux procédés classiques de CPD. Avec cette minimisation de la post colonne volume mort, des séparations plus efficaces avec une plus grande résolution chromatographique peut être effectuée.

le mode RF-PCD a permis d'améliorer l'efficacité de la séparation, la forme de pic et le signal au bruit par rapport aux méthodes classiques de PCD. Cependant, il est important de noter que les améliorations de signal dépendent de détecteur. Par exemple, les détecteurscet échantillon quantité dépendante ne peut pas présenter une augmentation de la réponse de signal RF dans des conditions PCD par rapport aux procédés classiques. Il en est ainsi parce que, selon les méthodes classiques 100% sur la colonne échantillon est détectée, où dans des conditions RF-PCD seulement un certain pourcentage de l'échantillon sur la colonne est détectée en fonction du rapport de segmentation. Il est cependant prévu que les réactions RF-PCD pourront être adaptés à un ou deux réactifs (à condition que les deux réactifs sont ajoutés en même temps) la réaction PCD avec un minimum de ré-optimisation, et que les bénéfices observés pour les trois réactions jusqu'à présent testés se traduira par toutes les autres réactions PCD.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

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References

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Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).More

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).

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