Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

הודעת הטור derivatization שימוש ביצועים גבוהים תזרים תגובת עמודות נוזלת כרומטוגרפיה

doi: 10.3791/53462 Published: April 26, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב עם פוסט טור derivatization (PCD) היא כלי רב עצמה כי הוא שימושי בפתרון מספר בעיות במעבדה האנליטית. זה יכול לשמש כדי לזהות תרכובות שאינן אחר לגילוי עם החבילה של גלאי זמין 1,2, להגדיל את האות של אנליטי היעד, המאפשר גבולות נמוכים של גילוי quantitation 3-5 או סלקטיבי derivatize אנליטי יעד על מנת למנוע תופעות מטריקס 6. בשימוש נפוץ התגובות PCD כוללים התגובה של אמינים, כגון חומצות אמינו, עם-phthaladehyde אורתו 7-9, ninhydrin 9,10 או fluorescamine 11,12, את derivatization של מינים חמצן תגובתי (ROS) עם 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil הרדיקלי (DPPH •) 13,14 או 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic חומצה (ABTS) 15,16, ושימוש מגיב-אזיד יודיד כדי derivatize ג גופריתתרכובות ontaining 17,18.

יש, עם זאת, חסרונות רבים לשימוש תגובות PCD עם מערכות HPLC 6. בעיקר בקרב אלה הוא השימוש סליל תגובה בין נקודת תוספת של מגיב derivatization (ים) ו הגלאי, המאפשר זמן לערבוב והתגובה להתרחש 8. יש תגובה אלה לולאות לעתים קרובות כרכים של 500 μl או יותר, אשר גבוה משמעותית לעומת היקף שאר המערכת HPLC 19. שימוש תגובה בנפח גבוה אלה לולאות תוצאות רחבות שיא גדל לעומת מה יהיה ציין ללא הנוכחות של לולאת התגובה. התוצאה היא קצרות, פסגות רחבות יותר כי יש גבולות גבוהים של quantitation וזיהוי ואפקטים שלילי רזולוצית chromatographic. איורי 1 ו -2 להדגיש את ההידרדרות של צורת שיא הנגרמות כתוצאה מהתוספת של כרכי לולאת תגובה שונים פוסט עמודה. ניתוח זהבוצע באמצעות רכב שלב נייד של מתנול 94% ו -6% מי מילי- Q. קצב הזרימה של השלב הנייד היה 1 מ"ל / דקה, את עוצמת הזריקה היה 20 μl ואת אורך הגל הניתוח היה 265 ננומטר. סלילי של כמויות משתנות מת מ -20 μl 1,000 μl הוכנסו בין הטור לבין הגלאי כדי לדמות את ההשפעה של נפח מת לולאת תגובה בשיטות PCD. לולאות אלה הוכנו מ צינורות נירוסטה של ​​קוטר פנימי 0.5 מ"מ. הניסוי בוצע על מערכת HPLC המורכבת של בקר (SCL-10AVP), בלחץ נמוך Gradient Valve (FCL-10ALVP), משאבה (LC-20AD), מזרק (SIL-10ADVP), וגלאי PDA ( SPD-M10ADVP). השלב הנייד נשאב באמצעות מסלק גזים לפני המבוא למערכת HPLC. ההפרדה בוצעה באמצעות טור 250 מ"מ x 4.6 מ"מ id 5 מיקרומטר. תנאי הניסוי נבחרו להיות אופייני של תגובות PCD אשר פורסמו לאחרונה בספרות.

הפשוט, התקנת כור טור פוסט הנפוץ ביותר נקראת כור צינורי הלא מפולח אשר הוא למעשה צינור ארוך, דק שדרכו הנוזל יכול לזרום ואת התגובה יכולה להתרחש. בשנת שיא במערכת זו רחבה תלויה לא רק את הנפח מת להוסיף למערכת, אלא גם את הקוטר הפנימי של הצינור כפי מודגש על ידי Iijima et al. 8. יתר על כן, גיאומטרית סליל ממלא תפקיד הרחבת המותג ציינה. סטיוארט 20 נאמר כי התפתלות של הכור משנה את פרופילי זרימה משני, וכתוצאה מכך ערבוב טוב יותר, כלומר הנפח המת יכול להיות ממוזער. זה כבר נאמר כי הרחבת השיא הוא לא משמעותי בעת שימוש צינורי פתוח סרוגים סליל 21. כאשר הרחבת השיא היא גדולה מדי, סוגים אחרים של כורים יכולים גם להיחשב 20,22. אלה עשויים לכלול כורי מיטה או כורי תזרים מפולחים. כורים אלה הם שימושיים במיוחד עבור תגובות איטיות שאחרת requirלולאות התגובה הגדולה הדואר. כמו כורי צינורי הלא מפולחים הם הסוגים הנפוצים ביותר של כורים המשמשים ליישומי PCD, שאר מאמר זה עוסק בסוג זה של התקנת כור.

העיצוב של זרימת תגובה (RF) טור משלבת הולמת סוף מרובה יציאות מאפשרת בשלב נייד כדי לצאת (או להיכנס) בעמודה או דרך יציאה אחת הממוקמת באזור המרכז הרדיאלי של העמודה או שלוש יציאות הממוקמים בחלק החיצוני קיר באזור של הטור (ראה איור 3). זרמים אלה שני מופרדים באמצעות הולם סוף המכיל frit נקבובי מרכזי מוקפת טבעת חדירה כי הוא בתורו המוקף frit הנקבובי חיצוני המשתרע החוצה אל קיר העמודה. בשל זרימת צלב טבעת המרכזית החדירה אינו אפשרי בין שני האזורים הנקבוביים.

במהלך כרומטוגרפיה זרימת תגובה, מגיב derivatization (ים) נשאבים נגד כיוון זרימה בשלב נייד לאחת או TWo הנמלים החיצוניים של טור זרימת תגובה. Eluent הטור הוא מעורבב עם מגיב derivatization (הים) frit החיצוני והעביר אל הגלאי דרך יציאה חיצונית בחינם. זרימת תגובה יכולה לשמש אחת מעמד derivatization מגיב יחיד (1 נמלית מגיב derivatization, 1 יציאה להעביר את eluent העמודה אל הגלאי ו -1 היציאה החסומה) או מערכת מגיב כפולה (2 יציאות עבור ריאגנטים derivatization ו -1 יציאה להעביר את eluent עמודה אל הגלאי). תזרים מן הזרם המרכזי או שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את eluent טור underivatized, ריבוב ביעילות זיהוי 23, או עבר לבזבז.

טכניקת כוונון אחד עיקרית זמינה בעת הפעלת כרומטוגרפיה RF-PCD הוא היחס של התזרים המרכזי ואת הפריפריה. היחס האופטימלי עבור כל derivatization תלוי במספר גורמים כגון האם הזרם המרכזי יזוהו או עבר לבזבז. לכן פעם היחס האופטימלי נקבע, יש להבטיח את זה כי יחס התזרים הנכון מושגת לפני כל סיבוב מתבצע.

זה כבר נמצא כי השימוש של frit לערבב את זרם eluent עמודה מגיב derivatization בתוצאות RF-PCD ב ערבוב יעיל יותר לעומת טכניקות ערבוב המסורתי שבדרך כלל להעסיק נפח מת אפס מת נפח T-piece או נמוך פ- חתיכה לערבב שני הזרמים. זו אפשרה את השימוש של לולאות תגובה קטנות יחסית, או אפילו החיסול של לולאת התגובה כלילה. צמצום תוצאות גודל לולאת תגובת פסגות חדות בהשוואה לשיטות derivatization טור פוסט מסורתיות. משמעות דבר היא כי, על אף העובדה כי לא כל eluent העמודה derivatized, אות גדולה יחס רעש הם נצפו ולכן גבולות נמוכים של גילוי quantitation יכולים להיות מושגת.

כרומטוגרפיה זרימת תגובה פותחה כדי להתגבר על קשיים עם התאמת תגובת PCD ים לעמודות ומערכות HPLC מודרניים, במיוחד מההפסד היעיל הנגרם על ידי להקת הרחבה בשל כרכים מתו טור פוסט גדולים הנובעים מהצורך להעסיק תגובת נפח גדולה לולאות. תהליכי הערבוב היעילים יותר ב RF-PCD לעומת PCD הקונבנציונלי אומרים כרכי לולאת תגובה קטנה יכולים להיות מועסקים מובילים לעלייה יעילה הפרדה נצפית. יתר על כן כרומטוגרפיה RF-PCD מראה הן גדלו אות וירידת רעש לעומת טכניקות PCD קונבנציונליות וכתוצאה מכך גבולות נמוכים של גילוי quantitation בהשוואה לשיטות PCD קונבנציונליים. יתרון נוסף של RF-PCD בהשוואה לשיטות PCD קונבנציונאלי היא היכולת לנטר את זרם underivatized כי elutes מהנמל המרכזי של הטור RF כמו גם את זרם derivatized כי elutes מאזור הפריפריה של הטור. RF-PCD היא טכניקה חדשה יחסית אך מבטיח המציג יתרונות רבים על פני שיטות PCD המסורתית.

> חיבור של טור RF מושג כמעט באותו אופן כמו טור HPLC קונבנציונלי עם ההבדל העיקרי להיות מספר אבזרי קצה על עמודת RF. אבזרים המשמשים לחיבור טור HPLC תקן למערכת HPLC מסוגלים לשמש לחיבור טור RF למערכת HPLC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זהירות: עיין גיליונות נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל החומרים ריאגנטים לפני השימוש (כלומר, MSDS עבור מתנול). להבטיח את השימוש של כל נהלי הבטיחות המתאימים בעת טיפול ממסים בעל ביצועים גבוהים eluent הנוזל כרומטוגרפיה (HPLC). ודא שימוש נאות של בקרות הנדסה של HPLC, מכשור איזון גלאי אנליטיים, ולהבטיח את השימוש בציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, ונעליים סגורות).

הערה: פרוטוקול זה מתאר 3 שיטות derivatization שלאחר טור זרימת תגובה (RF-PCD) טכניקות, כל אחד עם מגיב שונה ספציפי לאופי תרכובת כימית של עניין. לניתוח של ROS עבור לפרק "1. איתור של ROS באמצעות DPPH •", לניתוח של אמינים ראשוניים ראה סעיף "2. איתור של אמינים ראשוניים באמצעות fluorescamine", ועבור ניתוח של תרכובות פנוליות עבור לפרק "3 . איתור של פנוליםבאמצעות ferricyanide 4-aminoantipyrene ואשלגן ". השתמש במים טהורים (למשל, מים-Q מילי) לאורך כל הדרך.

הערה: חיבור של טור RF מושג כמעט באותו אופן כמו טור HPLC קונבנציונלי עם ההבדל העיקרי להיות מספר אבזרי קצה על עמודת RF. אבזרים המשמשים לחיבור טור HPLC תקן למערכת HPLC מסוגלים לשמש לחיבור טור RF למערכת HPLC.

1. איתור של ROS באמצעות DPPH

  1. גדר של מכשיר HPLC
    1. הכן את מכשיר HPLC במי 100% על קו A, מתנול 100% על קו B כשלב הנייד. טהר את משאבות לפי דרישות היצרן.
    2. הגדרת רכיבי אינסטרומנטלי HPLC ואת משאבת derivatization הנוספת כפי שמודגם באיור 4 א.
    3. הגדר את גלאי UV-Vis לנתח באורך גל של 520 ננומטר.
  2. גדר שלטור RF
    1. חבר את כניסת טור RF אל מכשיר HPLC.
    2. חבר אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ לשקע הנמל המרכזי של הטור RF.
    3. חבר יציאת היקפי מוצא אל גלאי UV-Vis באמצעות אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ.
    4. חבר את קו משאבת DPPH ליציאת פריפריה על היציאה של טור RF.
    5. חסום את היציאה ההיקפית בשימוש על היציאה של טור RF באמצעות פקק עמודה.
    6. תביאו את קצב הזרימה של המשאבה HPLC עד 1 מ"ל דקות -1 ב- B 100% קו - 100% מתנול.
    7. לאזן את העמודה עם השלב הנייד 100% מתנול למשך 10 דקות עבור טור באורך 4.6 מ"מ id x 100 מ"מ. הפעם צריך להיות מדורג על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
  3. הכנת מגיב DPPH
    1. הכן פתרון 0.1 מ"ג / מ"ל של DPPH מתנול. Sonicate את הבקבוק המכיל את מגיב DPPH במשך 10 דקות.
    2. מכסים את הבקבוק בנייר כדי למנוע חשיפה לאור.
    3. טהר את משאבת DPPH עם מגיב DPPH מוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  4. כוונון לשקע העמודה RF
    1. במדויק לשקול שני כלי נקי ויבש. לייבל שיט אחד כמרכזי ושני כמו פריפריה.
    2. אסוף הקולחים היוצאים בנמל המרכזי לתוך הכלי שכותרתו מרכזי 1.0 דקות.
    3. לשקול מחדש את הספינה לנמל המרכזית ולחשב את המשקל של הזרימה מהנמל המרכזי כדלקמן:
      משקל של מרכז פורט (g) = משקל סופי של כלי המרכזי הפורט (ז) - משקל ההתחלתי של כלי המרכזי פורט (ז)
    4. חזור על שלבי 1.4.2 ו 1.4.3 עבור הקולחים היוצאים UV-Vis המחובר ליציאה ההיקפית של טור RF ולחשב משקל עבור כלי היציאה ההיקפי כמוכדלקמן:
      משקל של היקפיים פורטים (g) = משקל סופי של כלים היקפיים פורטים (ז) - משקל ההתחלתי של כלים היקפיים פורטים (ז)
    5. חישוב אחוזי הזרם מגיע מהנמלים המרכזיות והיקפיות כדלקמן:
      במרכז פורט% = משקל של מרכז פורט (ז) / (משקל של מרכז פורט (g) + משקל של היקפיים פורט (ז)) x 100
      היקפי נמל% = משקל של היקפיים פורטים (ז) / (משקל של מרכז פורט (g) + משקל של היקפיים פורטים (ז)) x 100
    6. ודא יחס הסגמנטציה בין לזרם המרכזי ואת זרימת הפריפריה הוא 30:70 (מרכזי: פריפריה). אם הזרימה המרכזית היא מעל 30%, להפחית את כמות זרימת יציאה על ידי הוספה באורך של צינורות מזהים 0.13 מ"מ לשקע של הנמל המרכזי. אם הזרימה המרכזית היא מתחת ל -30% מקטין את האורך של צינורות 0.13 מ"מ מהנמל המרכזי.
    7. חזור על שלב 1.4.1 כדי 1.4.6 עד יחס פילוח 30:70 (מרכזי: היקפי) מושגת.
    8. הגדר את קצב הזרימה של Dמשאבת מגיב PPH 0.5 מ"ל דקות -1.
      הערה: עמודת RF להגדיר עם מגיב DPPH עכשיו הוא מוכן לניתוח. דוגמאות ניתן להזריק עכשיו.
  5. תנאים כיבוי להפעיל הודעה
    1. לאחר כל הדגימות כבר מוזרק, המציין כי בטווח סיים, להפסיק את זרימת משאבת מגיב derivatization.
    2. הסר את שורת משאבת מגיב DPPH מנמל פריפרית פקק הנמל.
    3. לאזן את העמודה עם השלב הנייד בה יאוחסן בכך שהוא מאפשר בשלב הנייד לעבור דרך העמודה ב 1 מיליליטר דקות -1 למשך 10 דקות.
    4. עצור את הזרימה של משאבת השלב הניידת על מכשיר HPLC.
    5. החלף מגיב DPPH עם מתנול ולטהר את המשאבה הנוספת.
      הערה: מערכת HPLC יכול עכשיו להיות הכיבוי.

2. איתור של אמינים ראשוניים בעזרת Fluorescאמין

  1. הכנת שלב הנייד
    1. הכן 1 ליטר של פתרון אצטט 10 מ"מ אמוניום, התאמת ה- pH של התמיסה ל 9.0 עם 5 M אמוניום הידרוקסיד לפני דילול נפח.
    2. הוסף 52.6 מ"ל של אצטוניטריל (ACN) למאגר אמוניום אצטט להשיג בשלב ניידים מעורבבים מראש של 95:05 (חיץ: ACN).
  2. גדר של מכשיר HPLC
    1. הכן את מכשיר HPLC עם למאגר מוכן מראש מעורב על קו כשלב הנייד. טהר את המשאבה לפי דרישות היצרן.
    2. הגדרת רכיבי אינסטרומנטלי HPLC ואת משאבת derivatization הנוספת כפי שמודגם באיור 4 א.
    3. צרף סליל dampener הדופק למשאבה derivatization.
    4. הגדרת גלאי הקרינה (FLD) עם גל עירור של 390 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​475 ננומטר.
  3. גדר של עמודת RF
    1. חבר הכניסת דואר טור RF אל מכשיר HPLC.
    2. חבר אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ לשקע הנמל המרכזי של הטור RF.
    3. חבר יציאה היקפית לשקע של טור RF אל גלאי FLD באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות מזהים 0.13 מ"מ.
    4. חבר את קו משאבת derivatization ליציאת פריפריה על היציאה של טור RF.
    5. חסום את היציאה ההיקפית בשימוש על היציאה של טור RF באמצעות פקק עמודה.
    6. תביאו את קצב הזרימה של המשאבה HPLC עד 1 מ"ל דקות -1 ב 100% קו - 10 חיץ מ"מ אמוניום אצטט pH 9, premixed עם 5% ACN.
    7. לאזן את העמודה עם השלב הנייד 100% קו A למשך 10 דקות עבור טור באורך 4.6 מ"מ id x 100 מ"מ. זמן זה עשוי להיות מדורג על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
  4. הכנת מגיב fluorescamine
    1. הפוך 100 מ"ל של ריאגנט 0.1 מ"ג מ"ל -1 fluorescamine.
    2. <li> Sonicate דקות 1.
    3. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור.
    4. טהר את המשאבה מגיב עם ריאגנט fluorescamine המוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  5. כוונון לשקע העמודה RF
    1. במדויק לשקול שני כלי נקי ויבש. לייבל שיט אחד כמרכזי ושני כמו פריפריה.
    2. אסוף הקולחים היוצאים בנמל המרכזי לתוך הכלי שכותרתו מרכזי 1.0 דקות.
    3. לשקול מחדש את הספינה המרכזית ולחשב את המשקל של הזרימה מהנמל המרכזי כדלקמן בשלב 1.4.3.
    4. חזור על שלבי 2.5.2 עד 2.5.3 עבור קולחי יציאת FLD המחובר ליציאה ההיקפית של טור RF ולחשב משקל היקפי כדלקמן בשלב 1.4.4.
    5. חישוב אחוזי הזרם מגיע מהנמלים המרכזיות והיקפיות כדלקמן בשלב 1.4.5.
    6. ודא יחס הסגמנטציה בין לזרם המרכזי ואת הפריפריההזרימה היא 43:57 (מרכזית: פריפריה). אם הזרימה המרכזית היא מעל 43%, להפחית את כמות זרימת יציאה על ידי הוספה באורך של צינורות מזהים 0.13 מ"מ לשקע של הנמל המרכזי. אם הזרימה המרכזית היא מתחת 43%, מקטין את האורך של צינורות 0.13 מ"מ מהנמל המרכזי.
    7. חזור על שלב 2.5.1 כדי 2.5.6 עד יחס פילוח 43:57 (מרכזי: היקפי) מושגת.
    8. הגדר את קצב הזרימה של משאבת השלב הניידת 0.7 מיליליטר דקות -1.
    9. הגדר את משאבת derivatization לזרום ברמה של 0.1 מ"ל דקות -1.
      הערה: עמודת RF להגדיר עם מגיב fluorescamine מוכנה כעת לניתוח. דוגמאות ניתן להזריק עכשיו.
  6. תנאים כיבוי להפעיל הודעה
    1. לאחר כל הדגימות כבר מוזרק, המציין כי בטווח סיים, להפסיק את משאבת derivatization.
    2. הסר את שורת משאבת derivatization מנמל פקק הפריפריה.
    3. לאזן את העמודה עם השלב סלולריבו יאוחסן בכך שהוא מאפשר בשלב הנייד לעבור דרך העמודה ב 1 מיליליטר דקות -1 למשך 10 דקות.
    4. עצור את הזרימה של המשאבה בשלב הניידת.
    5. החלף מגיב fluorescamine עם אצטוניטריל ולטהר את משאבת derivatization.
      הערה: מערכת HPLC יכול עכשיו להיות הכיבוי.

3. איתור של פנולים בעזרת 4-Aminoantipyrene ואשלגן Ferricyanide

  1. הכנת שלב הנייד
    1. הכן 1 ליטר של פתרון אמוניום אצטט 100 מ"מ, התאמת ה- pH של התמיסה ל 9.0 עם 5 M אמוניום הידרוקסיד לפני דילול נפח.
    2. הוסף 52.6 מיליליטר של מתנול למאגר אמוניום יצטט להשיג בשלב נייד מעורבב מראש של 95: 5 (חיץ: מתנול).
  2. גדר של מכשיר HPLC
    1. הכן את מכשיר HPLC עם למאגר מוכן מראש מעורב על קו כשלב הנייד. טהר את המשאבה לפי יצרן "; S דרישות.
    2. הגדרת רכיבי אינסטרומנטלי HPLC ואת שתי המשאבות מגיבות נוספות כפי שמודגם באיור 4B.
    3. צרף סליל dampener הדופק לכל אחת המשאבות מגיב.
    4. הגדר את גלאי UV-Vis לנתח באורך גל של 500 ננומטר.
  3. גדר של עמודת RF
    1. חבר את כניסת טור RF אל מכשיר HPLC.
    2. חבר אורך 15 ס"מ של צינורות מזהה 0.13 מ"מ לשקע הנמל המרכזי של הטור RF.
    3. חבר יציאה היקפית לשקע של טור RF אל גלאי UV-Vis באמצעות אורך 15 סנטימטר של צינורות מזהים 0.13 מ"מ.
    4. חבר אחד מגיב (כלומר, 4-aminoantipyrene ו ferricyanide אשלגן) קו משאבה ליציאת פריפריה על היציאה של טור RF.
    5. תביאו את קצב הזרימה של המשאבה HPLC עד 1 מ"ל דקות -1 ב 100% קו - 100 מ"מ אמוניום אצטט חיץ pH 9, premixed עם 5% מתנול.
    6. לאזן את העמודה wה- i בשלב ניידים 100% קו A למשך 10 דקות עבור טור באורך 4.6 מ"מ id x 100 מ"מ. זמן זה עשוי להיות מדורג על פי המידות של עמודות אחרות המשתמש רשאי להעסיק.
  4. הכנה מגיב 4-aminoantipyrene
    1. הכן חיץ אמוניום אצטט עם pH של 9 על ידי ביצוע צעד 3.1.1.
    2. לשקול 150 מ"ג 4-aminoantipyrene ו להתמוסס 100 מ"ל של חיץ אמוניום אצטט מוכן (pH 9).
    3. Sonicate דקות 1.
    4. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור.
    5. טהר את משאבת המגיב הראשונה עם מגיב 4-aminoantipyrene המוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  5. הכנת מגיב אשלגן ferricyanide
    1. לשקול 150 מ"ג של ferricyanide אשלגן מתמוססים 100 מ"ל של חיץ אמוניום אצטט (pH 9) הכין לפי צעד 3.1.1.
    2. Sonicate דקות 1.
    3. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור.
    4. Purgדואר המשאבה מגיבה השנייה עם מגיב אשלגן ferricyanide המוכן בהתאם לדרישות היצרן.
  6. כוונון של עמודת RF
    1. במדויק לשקול שני כלי נקי ויבש. לייבל שיט אחד כמרכזי ושני כמו פריפריה.
    2. אסוף הקולחים היוצאים בנמל המרכזי לתוך הכלי שכותרתו מרכזי 1.0 דקות.
    3. לשקול מחדש את הספינה המרכזית ולחשב את המשקל של הזרימה מהנמל המרכזי כדלקמן בשלב 1.4.3.
    4. חזור על שלבי 3.6.2 עד 3.6.3 עבור הקולחים היוצאים UV-Vis המחובר ליציאה ההיקפית של טור RF ולחשב משקל היקפי כדלקמן בשלב 1.4.4.
    5. חישוב אחוזי הזרם מגיע מהנמלים המרכזיות והיקפיות כדלקמן בשלב 1.4.5.
    6. ודא יחס הסגמנטציה בין לזרם המרכזי ואת זרימת הפריפריה הוא 50:50 (מרכזי: פריפריה). אם הזרימה המרכזית היא מעל 50%, להפחית אתכמות זרימת יציאה על ידי הוספה באורך של צינורות מזהים 0.13 מ"מ ליציאה המרכזית לשקע. אם הזרימה המרכזית היא מתחת ל -50%, להפחית את האורך של צינורות 0.13 מ"מ מהנמל המרכזי.
    7. חזור על שלב 3.6.1 כדי 3.6.6 עד יחס פילוח 50:50 (מרכזי: היקפי) מושגת.
    8. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה 4-aminoantipyrene 0.5 מ"ל דקות -1.
    9. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה אשלגן ferricyanide 0.25 מ"ל דקות -1.
      הערה: עמודת RF להגדיר עם ריאגנטים דו רכיבים מוכנה כעת לניתוח. דוגמאות ניתן להזריק עכשיו.
  7. תנאים כיבוי להפעיל הודעה
    1. לאחר כל הדגימות כבר מוזרק בטווח סיים, המציין כי בטווח סיים, להפסיק הן של המשאבות המגיבות.
    2. הסר את קווי משאבה מגיב מהנמלים ההיקפיים ולהחליף אותם עם חתיכת 15 סנטימטר של צינורות 0.13 מ"מ.
    3. לאזן את העמודה עם השלב הנייד WHIch זה יאוחסן על ידי מתן אפשרות לשלב הנייד לעבור דרך העמודה ב 1 מ"ל דקות -1 למשך 10 דקות.
    4. עצור את הזרימה של משאבת השלב הניידת על מכשיר HPLC.
    5. החלף את שני ריאגנטים על הגיב משאבות עם מתנול ולטהר את המשאבות נוספות על פי דרישת יצרן.
      הערה: מערכת HPLC יכול עכשיו להיות הכיבוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיטת PCD הראשונה הותאמה לשימוש על ידי RF-PCD הייתה derivatization של נוגדי חמצון באמצעות 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil הרדיקלי (DPPH •) 24. תגובה זו הונהגה על ידי ואח Koleva. 25 כבר בשימוש נרחב מאז. הגילוי מסתמך על הַדהָיָה של DPPH הרדיקלי בנוכחות של מיני חמצן תגובתי, ומכאן הנוכחות של תוצאות נוגדות חמצון טיפה הספיגה ציינה. תגובת DPPH לעתים קרובות מעסיקה לולאות תגובה גדולות של 500 μl או יותר 13-15, אולם נמצא כי בעת השימוש בעמודת RF-PCD לא לולאת תגובה נדרשה. איור 5 מראה שני chromatograms של מדגם של קפה Ristretto derivatized באמצעות DPPH רדיקלי הוא באמצעות PCD קונבנציונלי ומכשור RF-PCD.

שיטת PCD השנייה הותאמה לשימוש על ידי RF-PCD היא דרivatization של ארבע חומצות אמינו (גליצין, לאוצין, פנילאלנין ו טריפטופן) באמצעות fluorescamine כמו מגיב derivatization 23. השיטה הותאמה מהעבודה ידי Udenfriend et al. 11 עם רכב השלב הנייד, ריכוז fluorescamine ואת קצב זרימת fluorescamine המותאם לשימוש עם עמודות RF. השיטה המקובלת מנוצלת מערכת derivatization שתי מגיב שבו pH 9.0 חיץ התווסף הנחל בשפכים לפני התוספת של מגיב fluorescamine, בעוד שיטת RF-PCD מנוצלת שלב נייד שהיה שנאגר כבר, ובכך רק מערכה derivatization מגיב יחידה היה צורך. עבור יישום זה הנחל derivatized נותח בבית 390 ננומטר באמצעות גלאי Visible-UV, אשר תואם את גל העירור משמש לגילוי על ידי קרינה. זרם derivatized ניתן היה לזהות באמצעות גלאי קרינה, מתן אות יותר לרעש ולכן גבולות נמוכים של גילוי קוואנטitation, על פי יצירתו של Udenfriend et al. 11. יתר על כן, eluent הקרוב מהנמל המרכזי של התקנת RF-PCD היה פיקוח באמצעות גלאים UV-Visible שניים.

המופע של שיטת RF-PCD עבור derivatization של חומצות אמינו הושווה שיטת PCD הקונבנציונלי. טבלת 1 מפרט את הגבולות המחושבים של quantitation וזיהוי עבור כל אחד חומצות אמינו נתחו בשני RF-PCD מצבי PCD קונבנציונליים. המגבלה של זיהוי הוגדרה להיות הריכוז שבו יחס אות לרעש של 2 הושגה בעוד שההגבלה של quantitation הוגדרה להיות הריכוז שבו יחס אות לרעש של 10 הושגה. איור 6 מציג הכרומתוגרמה של הארבעה חומצות אמינו נתחו בשיטת PCD הקונבנציונלית, שיטת RF-PCD וזרם underivatized משיטת RF-PCD. איור 7 הן השוואה של האותות שהתקבלה עבור האפונהks בשל גליצין לאוצין הן באמצעות שיטת PCD קונבנציונאלי שיטת RF-PCD. איור 8 משווה את רוחב השיא של השיא טריפטופן בעת ניתוח בשיטת PCD קונבנציונאלי, שיטת RF-PCD והזרם underivatized מן RF- שיטת PCD.

שיטת PCD הסופית הותאמה לשימוש על ידי RF-PCD 26 היא derivatization של ארבעה פנולים (פנול, 4-methoxyphenol, p -cresol ו טוקופרול). השיטה הותאמה מעבודה של ביגלי ו גרוב 27 עם שינויים קלים כדי לייעל את השיטה לשימוש עם עמודות RF. עבודה זו מנוצלת תגובת derivatization דו רכיבים שבו פתרונות של שני ferricyanide 4-amionantiprine ואשלגן נוספו eluent הטור ב הולם בסוף טור RF. נמצא כי בעת שימוש בעמודה RF עבור התגובה לא לולאות תגובה נוספת פוסט העמודה צריכה לשמש. איור 9 מציג דוגמה של הכרומתוגרמה שםמדגם הבדיקה 21-מרכיב שהכיל כמה רכיבים להראות תגובה לתוכנית derivatization וכמה שאינם, הופרדו, derivatized ואובחנה (זכר שחור). באותה התערובת גם הופרדה ואובחנה underivatized להשוואה (זכר אדום). באיור 9 התגובה RF-PCD הוצגה כתגובה שלילית עבור הבחנה חזותית קלה (תגובת גלאי המתקבל הייתה חיובית). איור 10 מציג השוואה של צורת השיא של p -cresol הוא derivatized שימוש בעמודת RF-PCD ו underivatized.

איור 1
איור 1. זיהוי תכונות חומרי כיסוי של hexylbenzene מוזרק על מערכת HPLC עם כרכים מתים שונים הוסיפו בין הטור לבין הגלאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. כיסוי זיהוי תכונות חומרים של טולואן, ethylbenzene ו propylbenzene מוזרק על מערכת HPLC עם כרכים מתים שונים הוסיפו בין הטור לבין הגלאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איור של עיצוב עמודת זרימת תגובה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

tp_upload / 53,462 / 53462fig4.jpg "/>
איור 4. Instrumental להגדיר של RF-PCD. (א) מגיב יחיד (כלומר, DPPH או חומרים כימיים derivatization fluorescamine) ו- (ב) מגיב כפול (כלומר, 4-aminoantipyrene ואשלגן ferricyanide ריאגנטים derivatization). אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. chromatograms הפרדת קפה Ristretto עם זיהוי לאחר derivatization פוסט העמודה באמצעות 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil הרדיקלי (DPPH •). Derivatization בוצע באמצעות טור קונבנציונלי עם סליל התגובה μl 500 (א) ו טור זרימת תגובה (B רונג>). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. כיסוי זיהוי תכונות החומרים של ארבע חומצות אמינו (גליצין (G), לאוצין (L), פנילאלנין (P) ו טריפטופן (T)) על פני טווח של 10 עד 1,000 עמודים לדקה זוהה על ידי פוסט טור derivatization באמצעות fluorescamine בתור מגיב PCD לאחר הפרדה על ידי HPLC. Chromatograms הן כדלקמן: (א) PCD קונבנציונאלי, (B) RF-PCD, ו- (ג) מרכזי (underivatized) יציאת מ- RF-PCD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

_upload / 53,462 / 53462fig7.jpg "/>
איור 7. השוואת האותות המתקבלים עבור גליצין (השיא הראשון) ו לאוצין (שיא שני) מ PCD הקונבנציונלי (זכר אדום) ו- RF-PCD (זכר שחור). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8. שיא רוחב השוואה של השיא עקב טריפטופן מבוסס על (א) זמן שמירה ו- (ב) נפח שיא. לעקב השחור מראה את שיטת PCD הקונבנציונלית, העקבות האדומות מציגה את שיטת RF-PCD ואת העקבות הירוקות מראות את זרם underivatized מהנמל המרכזי של שיטת RF-PCD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אוהל "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 9
איור 9. פרדת chromatographic של מדגם מלאכותי. הרכיבים כוללים פנול (P), 4-methoxyphenol (M), עמ '-cresol (C) טוקופרול (T) וכן alkylbenzenes רב, פחמימנים ארומטיים polynuclear, anisole, phentanole, קפאין, פנילאלנין ו benzamide. פסגות שכותרתו I, II ו- III הם alkylbenzenes שענו במפתיע לתוכנית derivatization. העקב השחור מייצג את התגובה underivatized באמצעות גלאי UV ב 254 ננומטר בעוד זכר אדום מייצג את התגובה derivatized ב 500 ננומטר. הערה כדי לקבל בהירות חזותית תגובת derivatized כבר הפוכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10 איור 10. זיהוי תכונות החומרים התגובה של p -cresol. העקב השחור מייצג את התגובה underivatized באמצעות גלאי UV ב 254 ננומטר בעוד זכר אדום מייצג את התגובה derivatized (RF-PCD) ב 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סוג התגובה גליצין לאוצין פנילאלנין טריפטופן
לוד (ppm) LOQ (ppm) לוד (ppm) LOQ (ppm) לוד (ppm) LOQ (ppm) לוד (ppm) LOQ (ppm)
RF-PCD 6 25 10 100 25 250 50 250
הנמל המרכזי RF-PCD (underivatized) לא זוהה לא זוהה לא זוהה 1 10
PCD קונבנציונלי 10 100 50 500 50 500 100 500

טבלה 1. גבולות איתור quantitation של ארבע חומצות אמינו שונות זוהו על ידי מערכות derivatization טור פוסט שונות באמצעות fluorescamine כמו הגיב derivatization לאחר הפרדה על ידי HPLC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RF-PCD מאפשר ערבוב יעיל של מגיב derivatization עם הפוסט-טור בשפכים HPLC ללא שימוש סלילי התגובה, למזער את ההשפעות של הרחבת הלהקה ושיפור ביצועים ההפרדה. שיטות RF-PCD גם הראו שיפורים בתגובה האות ביחס שיטת הזיהוי. Camenzuli et al. 28 היה הראשון לדווח על השימוש בעמודי זרימת תגובה עם DPPH לצורך זיהוי של ROS ב מדגם קפה אספרסו. המחקר כלל ניתוח ואופטימיזציה של תנאי RF כדי להשיג ביצועים מרביים, בדיקות טווח הריכוזים DPPH עם ספיקות DPPH מגיב שונים. זה היה להסיק כי ריכוז DPPH של 0.1 מ"ג מיליליטר -1 עם קצב זרימה מגיב DPPH של 0.5 מיליליטר דקות -1 היה אופטימלי עבור ביצועי הפרדה משופרת (כלומר, יעיל ורגיש) תחת RF-PCDתנאים בהשוואה לשיטת PCD הקונבנציונלית של derivatization DPPH •. איור 5 מראה שני chromatograms ניצול assay DPPH של נוגדי חמצון מדגם קפה אספרסו. מעניין במיוחד הפסגות בעצמה הגבוהות עם פעמי שמירה של כ 5 דקות. ניתן לראות כי כאשר באמצעות לולאת תגובת 500 μl, אשר אופייני של שיטות derivatization המסורתיות DPPH •, לשיא יחיד, רחבה ניתן לצפות. עם זאת, כאשר מיושם שיטת RF-PCD משמשת ללא צורך לולאת תגובה, מתברר כי שיאו היחיד נצפה באמצעות לולאת 500 μl היא למעשה שני שיאים. יתר על כן, פירוט נוסף ניתן לראות לאחר 5.5 דקות כאשר באמצעות הגדרת RF-PCD. לכן, לצורך הניתוח של ROS בדגימות באמצעות DPPH •, הטכניקה של RF-PCD התברר עדיף על השיטות הקונבנציונליות של ניתוח ROS באמצעות DPPH •.

RF-PCD עםמגיב fluorescamine נוצל לניתוח של חומצות אמינו עיקריות ובהשוואה בצורות המקובלות של PCD עם fluorescamine 20. מאז הטור RF סוף הולם גם נתן במה לגילוי מרובב, הזרימה המרכזי underivatized היה פיקוח באמצעות UV-Vis, בעוד derivatization בין בשפכים fluorescamine נערך באזור החיצוני של RF סוף-ראויה ולא לאתר באמצעות UV- Vis. סדרת תקני בדיקה המכיל ארבע חומצות אמינו נותחו בתנאי RF-PCD מרובב. איור 6 משווה את פרופיל chromatographic עבור השיטה המקובלת של PCD (איור 6 א) ו- RF-PCD (זיהוי של derivatized (איור 6) ואת underivatized (איור 6C)) של הסדרה של חומצות אמינו. איור 7 הוא כיסוי של שני אותות חומצות אמינו שהושגו באמצעות PCD הקונבנציונלי RF-PCD. ניתן לראות כי ההפרדה הנצפית יעילה יותר בשל tהוא הסרת לולאת התגובה הובילה תגובת אות גדולה, למרות העובדה שלא כל קולחי הטור derivatized. יתר על כן, את ערכת הערבוב מגיב derivatization היעיל יותר הביאה רעש בסיס נמוך, נוסף להגדיל את יחס האות לרעש. אפקט זה הוא מובל החוצה את הגבולות התחתונים של איתור quantitation שחושב שיטת RF-PCD לעומת שיטת PCD הקונבנציונלית בטבלת 1. מגמה זו גם ניתן לראות באיור 5 שבו התגובה הנוגדת חמצון DPPH גדולה עבור שיטת RF-PCD לעומת שיטת PCD הקונבנציונלית. ניתן לצפות להידרדרות שיא משמעותית chromatograms שבו התקנה קונבנציונלית PCD שמשה אשר מובילה את תגובת האות הנמוכה של שיטה זו.

איור 8 משווה את פרופיל השיא של טריפטופן כאשר נותחו על ידי RF-PCD (שני הזרמים derivatized ו underivatized) ו PCD קונבנציונאלי. כשפרופיל השיא הוא זמם נגד הזמן רוחבי שיא כל להיראות (איור 8 א) דומה רחב. השיפורים נמצאים RF-PCD לעומת PCD הקונבנציונלי ברורים כאשר פרופיל השיא זמם נגד נפח שיא (האיור 8B). כאשר זממו נגד נפח שיא, ברור כי בעוד שיא RF-PCD תערוכות כמות קטנה של שפלה לעומת שיא underivatized, השפלה, לעומת זאת, היא מזערית לעומת מה שנצפה משייטת PCD הקונבנציונלית. השיפורים יעילים הפרדת RF-PCD לעומת PCD הקונבנציונלי גם הם הפגינו איור 7 אשר משווה את צורות השיא של גליצין לאוצין לאחר derivatization ידי שני PCD הקונבנציונלי RF-PCD. ניתן לראות כי במצב PCD קונבנציונלי פסגות גליצין לאוצין הן בקושי בסיס מתפצלות בעת במצב RF-PCD האות בתחילת מחקר עבור תקופה ארוכה יותר בין שתי הפסגות.

יתרון נוסף של RF-PCD בהשוואה לשיטות קונבנציונליות PCD הוא היכולת לנטר שפכי underivatized מהנמל המרכזי של טור RF המאפשר זיהוי מרובב. זה אפשרי כמו העיצוב של frit בתוך הולם סוף RF אינו מאפשר את הזרימה באזור מרכז רדיאלי לערבב עם הזרם באזור הפריפריה של הסוף ההולם, ובכך לאפשר ניטור של נחל derivatized מהאזור החיצוני של הולם וכן ניטור של הנחל underivatized מהנמל המרכזי. יכולת זו מודגשת על ידי התוצאות שהתקבלו עבור טריפטופן בטבלה 1, אשר ידוע יש תגובה עם קליטה חלשה אחרי derivatization ידי fluorescamine 20, לעומת זאת, שלא כמו חומצות אמינו אחרות זה מראה בתגובה גלאי UV כאשר underivatized (ב 280 ננומטר) . עבור שתי מערכות derivatization את גבולות איתור quantitation היו גבוהים יחסית, אולם את גבולות איתור quantitation היו נמוכות בהרבה עבור tהוא underivatized זרם. באמצעות היכולת לנטר שני זרמי שפכי derivatized ו underivatized פרמטרי זיהוי ניתן שנועדו להעניק את הרמה הגדולה ביותר של ביצועים עבור כל חומצת אמינו.

עיצוב multiport של הולם סוף RF המאפשר ניתוח מגיב derivatization כפול. סלים ואח '. 23 חקרו את הביצועים של שני חומרים כימיים (4-aminoantipyrene ו ferricyanide אשלגן) באמצעות תנאי RF-PCD לניתוח של תרכובות פנוליות לעומת הטכניקה המקובלת של PCD באמצעות ferricyanide 4-aminoantipyrene ואשלגן. סוג זה של טכניקת PCD דורש שתי משאבות ותגובת לולאות לכל מגיב derivatization בניגוד לולאת משאבה ותגובה אחת עבור DPPH •. תרכובות פנוליות ו alkylbenzene שונות נותחו בתנאים קונבנציונליים RF PCD. מעניין, תרכובות פנוליות שאינם כי לא אותרו תחת השיטה המקובלת היו למעשה מזוהות unדר התנאים RF-PCD. איור 9 מציג את התגובה chromatographic-Vis UV והתגובה colorimetric-PCD RF כדי שילוב מבחן סטנדרטי. RF-PCD ספק טכניקת PCD פשוטה מבחינת מכשור, ללא פשרות של ביצועי הפרדה כפי שנצפה באיור 10. איור 10 משווים את פרופיל השיא של -cresol p כאשר נותחו על ידי RF-PCD וגם ללא derivatization. ניתן לראות כי רוחב השיא של chromatogram RF-PCD דומה מאוד לזה של chromatogram underivatized. ההבדל העיקרי בין שני chromatograms הוא כי הכרומתוגרמה RF-PCD היא מעט רחבה יותר בבסיס. זה מראה כי יש לא מעט על מנת פיזור שיא עקב טכניקת RF-PCD. תגובה דומה נצפתה איור 9 שמראה שזה לא רק השיא p -cresol כי יש רוחב השיא דומה כאשר derivatized על ידי RF-PCD לעומת השיא underivatized שלה, אבל כל פנולים alkylbenzenes שהשיב את ערכת derivatization הראה מגמה זו זהה. אמנם, RF-PCD עם השימוש בשני ריאגנטים derivatization השיג ביצועי הפרדה דומה לשיטה הלא-derivatization הרגילה, RF-PCD מותר לצורך זיהוי סלקטיבי של תרכובות פנוליות, שאחד מהם כי לא זוהה בתנאים שאינם derivatized .

כפי RF-PCD הוא פיתוח שיטות HPLC-PCD קונבנציונליים, כל כלי הכוונון זמינים שיטות HPLC כלליות כמו רכב שלב נייד וספיקה, נפח הזרקה ואורך גל ניתוח החלות על שיטות RF-PCD. יתר על כן, כלי כוונון זמינים שיטות HPLC-PCD קונבנציונליים, כגון השלב הנייד יחס קצב זרימה מגיב PCD וכן הרכב מגיב PCD החלות על שיטות RF-PCD. כלי כוונון נוספים זמינים בעת שימוש RF-PCD שאינו זמין בשיטות PCD קונבנציונליות הוא היחס בין תזרים המאגף המרכזי והיקפייציאות של הטור. התזרימים נשלטים על ידי שינוי הלחץ חזרה יחסית על כל אחד המקווים ידי שליטה על האורך ו / או הקוטר פנימי של הגלאי פוסט (או לפרסם טור אם זרימת קרובים מהנמל המרכזי אינה שתראה) צינורות. היחס האופטימלי של מרכזי תזרים פריפריה תלוי התגובה מדוברת, כמו גם גורמים אחרים, כגון, האם הנמל המרכזי שיראה או לא. יחס תזרים של 60% היקפיים ו -40% מרכזיים הוא לעתים קרובות נקודת התחלה טובה.

כמו במקרה של פרמטרי הכוונון, רבים מהנושאים שיכולים להתעורר עם השימוש של טור RF-PCD גם הם נפוצים עם שיטות PCD קונבנציונליות. פרמטר אחד מסוים כי chromatographer צריך להיות מודע בעת ביצוע RF-PCD המנתח הוא היציבות של הזרימה לחץ במערכת, במיוחד זה של המשאבה הגיב (ים). אם הזרימה במערכת אינה יציבה, זה יכול לגרום לחוסר יציבות בסיס ולכן הפחתהיחס אות לרעש ובהמשך גבולות quantitation וזיהוי.

כרומטוגרפיה RF-PCD פותחה כדי להתגבר על קשיים בהתאמת תגובות PCD לעמודות ומערכות HPLC מודרניות. היתרון העיקרי של RF-PCD בהשוואה לשיטות PCD מקובלות הוא ערבוב יעיל יותר בגלל זה מתרחש בתוך frit בתוך הולם בסוף טור RF, ערבוב זה בלחץ גבוה מעט לאחור. זה מאפשר המזעור או אפילו החיסול של לולאות תגובת נפח הגדולות המשמשות שיטות PCD קונבנציונליות רבות. עם מזעור זה של נפח מת טור פוסט, הפרדות יעילות יותר עם רזולוצית chromatographic יותר יכולות להתבצע.

מצב RF-PCD הביא והתייעלות הפרדה, צורת שיא אות לרעש בהשוואה לשיטות PCD קונבנציונליות. עם זאת, חשוב לציין כי שיפורי אות הם גלאים תלויים. עבור גלאי לדוגמאכי כמות המדגם תלויה לא יכולה להציג גידול בתגובת אות בתנאי RF-PCD בהשוואה לשיטות קונבנציונליות. זה כל כך כי תחת שיטות קונבנציונליות 100% של המדגם על עמודה מזוהה, שבו בתנאי RF-PCD אחוז מסוים רק על המדגם בעמודה מזוהה בהתאם יחס פילוח. הוא לעומת זאת, צפוי כי תגובות RF-PCD תוכלנה להיות מותאם לכל מגיב אחד או שניים (כל עוד שני ריאגנטים מתווספים בעת ובעונה האחת) תגובת PCD עם מחדש אופטימיזציה מינימאלי שההטבות שנצפו עבור כל השלושה תגובות עד כה נבדקות תתרגמנה כל תגובות PCD האחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Srijaranai, S., et al. Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples. Microchem. J. 99, 152-158 (2011).
  2. Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions. J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).
  3. Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).
  4. Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction. Water Res. 47, 4893-4903 (2013).
  5. Niu, Y., et al. Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization. Food Res Int. 48, 528-537 (2012).
  6. Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries. Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).
  7. Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde. J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).
  8. Iijima, S., et al. Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines. Anal Sci. 29, 539-545 (2013).
  9. Cunico, R. L., Schlabach, T. Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino. J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).
  10. Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection. J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).
  11. Udenfriend, S., et al. Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range. Science. 1972, 871-872 (1972).
  12. Samejima, K. Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).
  13. Zhang, Y., et al. Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay. Food Res Int. 53, 847-856 (2013).
  14. Niu, Y., et al. Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system. Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).
  15. Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations. J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).
  16. Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).
  17. Zakrzewski, R. Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction. J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).
  18. Zakrzewski, R. Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine. J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).
  19. Gritti, F., Guiochon, G. Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column. J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).
  20. Stewart, J. T. Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC). Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).
  21. Rigas, P. G. Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).
  22. Frei, R. W. Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography. Chromatographia. 15, 161-166 (1982).
  23. Pravadil-Cekic, S., et al. Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent. Microchem. J. (Accepted Manuscript) (2015).
  24. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
  25. Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures. Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).
  26. Selim, M., et al. A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography. Microchem. J. 116, 87-91 (2014).
  27. Bigley, F. P., Grob, R. L. Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).
  28. Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products. J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).
הודעת הטור derivatization שימוש ביצועים גבוהים תזרים תגובת עמודות נוזלת כרומטוגרפיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).More

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter